CN110387335A - 一种北虫草菌丝体发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种北虫草菌丝体发酵生产方法。该方法以燕麦作为培养基，以三价铁离子作为刺激物，采用固体发酵方法制成。本发明北虫草菌丝体发酵生产方法，采用燕麦作为发酵原料，使得发酵收获的菌丝体口味好，且含有燕麦自身的营养物质，通过三价铁离子的刺激，使得发酵产物中虫草酸和虫草素含量提升。
Description
技术领域
本发明属于北虫草菌丝体制备技术领域，具体涉及一种北虫草菌丝体发酵生产方法。
背景技术
北虫草为子囊菌门，肉座目，麦角菌科，虫草属的模式种。学名为Cordycepsmilitaris，又名蛹虫草。 北虫草世界性分布，天然资源数量很少。1950年，德国科学家Cunningham观察到被北虫草寄生的昆虫组织不易腐烂，进而从中分离出一种抗菌性物质，3'-脱氧腺苷，定名为虫草素。北虫草还含有虫草酸，中医认为，虫草酸入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。
北虫草的发酵制备菌丝体方法相对于冬虫夏草来说比较容易，多种培养基均能培养出北虫草的菌丝体，但营养物质含量普遍较低。燕麦为禾本科植物,《本草纲目》中称之为雀麦、野麦子。燕麦是一种低糖、高营养、高能食品。燕麦性味甘平，能益脾养心、敛汗，有较高的营养价值，可用于体虚自汗、盗汗或肺结核病人，燕麦富含膳食纤维，能促进肠胃蠕动，利于排便，热量低，升糖指数低，降脂降糖。采用燕麦培养基培养的北虫草口味好，还有少量燕麦本身的营养物质，但是虫草酸和虫草素含量偏低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种北虫草菌丝体发酵生产方法，以燕麦为基础培养基，培养高虫草酸和虫草素含量的菌丝体。
一种北虫草菌丝体发酵生产方法，按照如下步骤进行：
（1）在冷冻管中取北虫草菌种，接入液体培养基，于24-26℃条件下摇瓶培养4-6d，制成种子培养液；
（2）按质量比3-5％接种种子培养液至发酵罐作放大培养，发酵温度为 24-26℃，转速为100-200r/min，发酵时间为5-8d，得到北虫草固态发酵用的液体菌种；
（3）将燕麦浸没于水中浸泡8-12h，置于80-120℃条件下蒸煮20-40min，沥出水分，直到无水渗出；加入0.01-0.08%质量的三价铁盐，混合均匀，于115℃或121℃下高压蒸汽灭菌30-45min，制成发酵原料；
（4）将步骤（2）制备的固态发酵用的液体菌种接种至装有发酵原料的发酵瓶，震荡摇匀，于24-26℃ 条件下避光培养14-18 天，肉眼观察菌丝呈橙黄色并出现红色原基，终止发酵。
所述北虫草菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.17799。
所述液体培养基配方如下：葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母粉2g，补充水份至1000mL，pH6.5-7.5。
所述三价铁盐为氯化铁，硫酸铁或硝酸铁。
所述步骤（4）发酵过程中震荡摇匀1-3次。
步骤（4）发酵后收获菌丝体，烘干至产物含水量小于5％，冷却，在无菌条件下真空包装，所得即为北虫草固态发酵产物干品。
本发明的有益效果：本发明北虫草菌丝体发酵生产方法，采用燕麦作为发酵原料，使得发酵收获的菌丝体口味好，且含有燕麦自身的营养物质，通过三价铁离子的刺激，使得发酵产物中虫草酸和虫草素含量提升。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
本发明所述北虫草菌株的保藏说明：菌株名称为蛹虫草Co53 2019YZ513,该菌株已于2019年6月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.17799；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例1
一种北虫草菌丝体发酵生产方法，按照如下步骤进行：
（1）在冷冻管中取北虫草菌种，接入液体培养基，于25℃条件下摇瓶培养5d，制成种子培养液；所述液体培养基配方如下：葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母粉2g，补充水份至1000mL，调pH至7.0；
（2）按质量比4%接种种子培养液至发酵罐作放大培养，发酵温度为 25℃，转速为150r/min，发酵时间为6d，得到北虫草固态发酵用的液体菌种；
（3）将燕麦浸没于水中浸泡10h，置于100℃条件下蒸煮30min，沥出水分，直到无水渗出；加入0.04%质量的氯化铁，混合均匀，于121℃下高压蒸汽灭菌 35min，制成发酵原料；
（4）将步骤（2）制备的固态发酵用的液体菌种接种至装有发酵原料的发酵瓶，接种量5%，震荡摇匀，于25℃ 条件下避光培养16天，发酵过程中震荡摇匀2次，肉眼观察菌丝呈橙黄色并出现红色原基，终止发酵。
实施例2
一种北虫草菌丝体发酵生产方法，按照如下步骤进行：
（1）在冷冻管中取北虫草菌种，接入液体培养基，于24℃条件下摇瓶培养6d，制成种子培养液；所述液体培养基配方如下：葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母粉2g，补充水份至1000mL，调pH至6.5；
（2）按质量比5%接种种子培养液至发酵罐作放大培养，发酵温度为 24℃，转速为100r/min，发酵时间为8d，得到北虫草固态发酵用的液体菌种；
（3）将燕麦浸没于水中浸泡12h，置于120℃条件下蒸煮20min，沥出水分，直到无水渗出；加入0.02%质量的硫酸铁，混合均匀，于121℃下高压蒸汽灭菌 30min，制成发酵原料；
（4）将步骤（2）制备的固态发酵用的液体菌种接种至装有发酵原料的发酵瓶，接种量6%，震荡摇匀，于24℃ 条件下避光培养18 天，发酵过程中震荡摇匀3次，肉眼观察菌丝呈橙黄色并出现红色原基，终止发酵。
实施例3
一种北虫草菌丝体发酵生产方法，按照如下步骤进行：
（1）在冷冻管中取北虫草菌种，接入液体培养基，于26℃条件下摇瓶培养4d，制成种子培养液；所述液体培养基配方如下：葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母粉2g，补充水份至1000mL，调pH至7.5；
（2）按质量3%接种种子培养液至发酵罐作放大培养，发酵温度为 26℃，转速为200r/min，发酵时间为5d，得到北虫草固态发酵用的液体菌种；
（3）将燕麦浸没于水中浸泡9h，置于120℃条件下蒸煮20min，沥出水分，直到无水渗出；加入0.06%质量的硝酸铁，混合均匀，于115℃下高压蒸汽灭菌 45min，制成发酵原料；
（4）将步骤（2）制备的固态发酵用的液体菌种接种至装有发酵原料的发酵瓶，震荡摇匀，于26℃条件下避光培养14 天，发酵过程中震荡摇匀1次，肉眼观察菌丝呈橙黄色并出现红色原基，终止发酵。
对比例1
一种北虫草菌丝体发酵生产方法，按照如下步骤进行：
（1）在冷冻管中取北虫草菌种，接入液体培养基，于25℃条件下摇瓶培养5d，制成种子培养液；所述液体培养基配方如下：葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母粉2g，补充水份至1000mL，调pH至7.0；
（2）按质量比4%接种种子培养液至发酵罐作放大培养，发酵温度为 25℃，转速为150r/min，发酵时间为6d，得到北虫草固态发酵用的液体菌种；
（3）将燕麦浸没于水中浸泡10h，置于100℃条件下蒸煮30min，沥出水分，直到无水渗出；于121℃下高压蒸汽灭菌 35min，制成发酵原料；
（4）将步骤（2）制备的固态发酵用的液体菌种接种至装有发酵原料的发酵瓶，接种量5%，震荡摇匀，于25℃ 条件下避光培养16天，发酵过程中震荡摇匀2次，肉眼观察菌丝呈橙黄色并出现红色原基，终止发酵。
实验例1：虫草菌丝体中甘露醇的测定
称取1g的甘露醇于大烧杯中，量取1L去离子水配制成1mg/mL的甘露醇溶液， 取7支试管分别编号为1-7， 向其中加入0mL、0.1mL、 0.2mL、 0.3mL、 0.4mL、0.5mL、0.6mL的1mg/mL的甘露醇溶液， 再加入去离子水， 使各试管中的甘露醇浓度分别为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL。将配置得到的溶液分别取1mL至新的试管，试管对应标记1-7。 再向各 试管中加入1mL高碘酸钠溶液，室温放置10min。 10min后向其中加入2mL0.01％L-鼠李酸，最后加入1mL的Nash试剂， 53℃水浴加热15min。
实验测得甘露醇含量的标准曲线， 其回归方程为y＝68.882x+0.0398， R2＝0.9919。
取实施例1-4北虫草菌丝，置于干燥灭菌的培养皿中，放在60℃的烘箱中烘干过夜。称取烘干后的北虫草菌丝0.5g置于50mL的离心管中超声15min， 离心取上清，再次离心后取上清置于5mL的离心管中， 加入去离子水定容至5mL即 0.1g/mL待用。 取7支试管，向其中加入0mL、 0.1mL、 0.2mL、 0.3mL、 0.4mL、 0.5mL、0.6mL的 0.1g/mL的虫草液，再加入去离子水，使各试管中的虫草液浓度分别为0mg/mL、1mg/mL、 2mg/mL、3mg/ mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL。将配置得到的溶液分别取1mL至新的试管，试管对应标记1-7。再向各试管中加入1mL高碘酸钠溶液，室温放置10min。10min后向其中加入2mL 0.01％L-鼠李酸，最后加入1mL的Nash试剂， 53℃水浴加热15min。
将实验得到的虫草菌的样品中测得的OD值带入到回归方程中，测得实施例1-4实验组甘露醇的含量，见表1：
表1
注：*代表与实施例1比较P<0.05。
实验例2：虫草菌丝体中虫草素的测定
采用液相色谱法进行虫草素的测定，色谱柱为 ODS-3(4.6mm×250mm，5μm)，柱温30℃。检测器为二极管阵列紫外检测器，检测波长260nm。流动相乙腈：水＝80:20，流速0.8ml/min。测试结果见表2：
表2
注：*代表与实施例1比较P<0.05。
Claims (6)
1.一种北虫草菌丝体发酵生产方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
（1）在冷冻管中取北虫草菌种，接入液体培养基，于24-26℃条件下摇瓶培养4-6d，制成种子培养液；
（2）按质量比3-5％接种种子培养液至发酵罐作放大培养，发酵温度为 24-26℃，转速为100-200r/min，发酵时间为5-8d，得到北虫草固态发酵用的液体菌种；
（3）将燕麦浸没于水中浸泡8-12h，置于80-120℃条件下蒸煮20-40min，沥出水分，直到无水渗出；加入0.01-0.08%质量的三价铁盐，混合均匀，于115℃或121℃下高压蒸汽灭菌30-45min，制成发酵原料；
（4）将步骤（2）制备的固态发酵用的液体菌种接种至装有发酵原料的发酵瓶，震荡摇匀，于24-26℃ 条件下避光培养14-18 天，肉眼观察菌丝呈橙黄色并出现红色原基，终止发酵。
2.根据权利要求1所述北虫草菌丝体发酵生产方法，其特征在于，所述北虫草菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.17799。
3. 根据权利要求1所述北虫草菌丝体发酵生产方法，其特征在于，所述液体培养基配方如下：葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母粉2g，补充水份至1000mL， pH6.5-7.5。
4.根据权利要求1所述北虫草菌丝体发酵生产方法，其特征在于，所述三价铁盐为氯化铁，硫酸铁或硝酸铁。
5.根据权利要求1所述北虫草菌丝体发酵生产方法，其特征在于，所述步骤（4）发酵过程中震荡摇匀1-3次。
6.根据权利要求1所述北虫草菌丝体发酵生产方法，其特征在于，步骤（4）发酵后收获菌丝体，烘干至产物含水量小于5％，冷却，在无菌条件下真空包装，所得即为北虫草固态发酵产物干品。
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Non-Patent Citations (3)
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| MASOOD SHAH KHAN ET AL.: "Determination of nucleosides in Cordyceps", 《JOURNAL OF PHARMACY AND BIOALLIED SCIENCES》 * |
| 胡景霞等: "以固态发酵制备蛹虫草燕麦粉的研究", 《食品与发酵科技》 * |
| 许方雪: "基于均与设计法分析铁元素对虫草产量的影响", 《辽宁中医杂志》 * |
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