CN101245361A - 一种生产虫草素的方法及高产蛹虫草菌株byb-08的选育与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物技术领域。具体涉及一种生产虫草素的方法，高产蛹虫草菌株的选育与应用。本发明通过诱变选育得到一株高产蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株BYB－08，该菌株作为专利程序已于申请日前保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏号为：CCTCC NO：M207091)。本发明公开了本发明获得的蛹虫草菌株BYB－08在优化的深层发酵和静置表层发酵培养相结合的方法中的成功实施例，本发明所获得的发酵液中虫草素含量比现有专利文献和非专利文献报道的方法所获得的虫草素生物学产量有非常明显的提高。

Description

一种生产虫草素的方法及高产蛹虫草菌株BYB-08的选育与应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域。具体涉及一种虫草素的生产方法以及用于该方法的蛹虫草菌株的选育与应用。

背景技术

蛹虫草[Cordyceps militaris]，又名北冬虫夏草(简称北虫草)、蚕虫草，属子囊菌亚门(Ascomycotina)核菌纲(Pyrenomycetes)球壳目(Sphaerinles)麦角菌科(Claviticpitaceae)虫草属(Coedyceps)，是我国名贵中药材之一。蛹虫草无性型是蛹虫草拟青霉(Paecilomyces militarisLiang)，其无性型在单孢子菌株水平上，菌落特征、有性子实体形成能力、产孢结构等方面差异较大。蛹虫草和冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]都是虫草属真菌的模式种，是由子座与菌核(即昆虫蛹或幼虫的尸体部分)两部分组成的复合体。蛹虫草宿主主要是鳞翅目蚕蛾科、舟蛾科、天蚕蛾科等科的昆虫，这些昆虫冬季蛰居土里，菌类寄生其中吸收营养，最后昆虫体内充满菌丝而死亡。春末夏初气温转暖后，从其尸体上长出子座，形似草，夏至前后采集菌核和子座复合体而得。主要分布在吉林、辽宁、陕西、广东等地。除我国之外，亚洲、欧洲、北美洲等很多国家和地区都有分布。国内外报道虫草种类计300多种，我国有57种以上，是虫草资源分布最多最广的国家之一。中医常用的冬虫夏草主产于我国青海、云贵高原、横断山脉及祁连山等高寒灌丛或草甸地带，然而其产量却极为有限。国内外对冬虫夏草虽作了多方面的培养研究，但至今未能实现有效的子实体人工培养及规模化生产。

国内外对已经成功诱导形成的虫草子实体研究表明，蛹虫草食用和药用价值可与天然冬虫夏草相媲美，不仅具有营养滋补功能，而且能有效地抑制肿瘤生长和病毒繁殖，并具有其它多种药用功能，而蛹虫草中的虫草素含量远高于冬虫夏草中虫草素的含量，是冬虫夏草最理想的替代品，这一发现导致世界各地对蛹虫草的需求量激增，但野生蛹虫草与野生冬虫夏草一样，在自然界中极为稀少且价格昂贵。液体深层发酵培养可以有效提高蛹虫草代谢产物的产量，如初级代谢产物(氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、类脂、多糖类、有机酸类等)和次级代谢产物(抗菌素、生物碱、色素、植物生长因子等)。这两大类物质在营养和医药上都有重要作用，特别是虫草素所具有的对人体抗肿瘤细胞和治疗白血病的功效，被许多医学研究所证实，其治疗白血病的功能在美国已经进入第三期临床验证。如果从药用菌子实体中提取代谢产物，不仅生产环节多，耗时多，而且成本高，产量底，而液体培养可以克服以上缺点。因此，人工培育具有自然形态的蛹虫草子实体和液体培养蛹虫草菌丝体发酵液具有特殊意义。

由于虫草素将有可能投入药用，其需求量的上升将给虫草素的生产带来契机。国内已有的生产虫草素的专利中，申请号为01124109.8的专利申请公开了一种发酵培养生产虫草素的方法，利用20L生物反应器中进行大规模培养生产虫草素，发酵结束后发酵液中虫草素含量为7.1μg/L。由于该文献没有公开用于发酵的菌株来源，也没有提交用于专利程序的生物材料样品的保藏，导致该专利申请公开不充分。申请号为01133167.7的生产虫草素的专利文献，涉及一种液体培养虫草菌体及利用其培养液制备虫草素的方法，但该申请的说明书未说明液体培养基中虫草素的含量，人们无法评价其发明效果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，研制一种提高虫草素产量的生产方法以及选育用于该方法的蛹虫草菌株。本发明还包括将本发明选育的蛹虫草菌株应用于发酵生产虫草素及其制品生产上。本发明的特点是采用深层发酵培养和表层静止发酵培养相结合的发酵方法提高虫草素的产量。本发明的方法能很好地控制蛹虫草菌丝体的生长及代谢过程，以达到缩短培养周期，降低成本，从而有效提高了发酵液中虫草素的含量。

本发明通过以下技术方案实现：

一种生产虫草素的方法，采用液体深层发酵和表层发酵相结合的方法进行发酵，其步骤如下：

(1)将保藏号为CCTCC NO：M207091的蛹虫草菌株BYB-08，接种于固体培养基的平皿内，于20～28℃避光培养15d，再用散射光培养5d，用无菌水洗下分生孢子制成分生孢子悬液，备用；

(2)将步骤(1)得到的分生孢子悬液接入发酵罐的液体发酵培养基中，接种量按孢子悬液与液体培养基体积比为1～2％的量接入；

(3)按照所述的液体深层发酵和表层发酵相结合的方法培养步骤(2)的培养物：在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为120～170ml/min，搅拌速度为150rpm～200rpm，温度为23℃～27℃，培养3～4d后，待发酵液中还原糖浓度为0.05～0.09g/L时停止深层搅拌发酵，将发酵液转移至容器口盖有灭菌纱布的广口容器中，控制发酵温度为23～27℃，静止表层发酵16～20d后停止发酵，得到含虫草素的发酵原液；

(4)将步骤(3)得到的虫草素发酵原液以3000rpm，25℃离心30分钟，取上清液，将该上清液经减压浓缩至发酵原液体积的1/10左右，加入3倍体积的95％乙醇，去除其中的沉淀物，将剩余的发酵原液贮藏在2℃条件下，采用5000rpm离心10min后取上清，再经减压蒸出乙醇，将其浓缩至发酵原液体积的1/5左右，除去其中的蛋白，得到初步提纯的虫草素溶液，

其中：

步骤(1)所述的固体培养基组分为：(按重量体积计)马铃薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.5g，V_B1 10mg，琼脂粉20g，补充自来水至1000ml，调pH

步骤(2)在发酵罐中的液体培养基按照重量体积计为：葡萄糖2％，豆粕8％，马铃薯浸出粉2％，腺苷0.6％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.1％，补充自来水至100％，调pH至6.5～7.0，备用。

为了获得高产蛹虫草菌株，申请人经过大量试验获得了1株蛹虫草菌株(Cordycepsmilitaris)BYB-08，该菌株于2007年6月29日送交中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称；CCTCC)保藏，获得保藏号为：CCTCC NO：M207091(具体选育方法参见实施例)。

蛹虫草菌株BYB-08的生物学特征：

菌丝管状、无色、透明、有隔，菌丝体顶端可形成分生孢子梗，分生孢子球形或椭圆形，表面有刺状突起，2×3.2μm×1.5～3μm，分生孢子梗独生或在轮生部上分枝，30～40μm×1～2μm，前端稍膨大。在蛹虫草栽培培养基(大米50g，蛋白胨15.625g，葡萄糖20g，酵母膏6.25g，马铃薯200g，加水定容至1000mL)上，菌落白色，见光后转色呈淡黄或橙黄。菌丝体长满栽培瓶后，每天10h以上200lux左右光照，同时给予不少于6h的10℃以上的温差刺激时，菌丝体开始分化扭结形成原基，原基继续生长形成子座。子座单生或丛生，橙黄色，幼嫩的子座呈圆锥状，成熟的子座呈棒状，多为双叉分枝，常有纵沟或略扭曲，粗壮，生长整齐，长20～100mm，粗0.5～4.5mm，平均鲜重0.41g，平均长度4.2cm。子实体子座上部外围有子囊壳环状排列，子囊壳突出呈卵形或瓶型，孔口向外半埋生于子座中，侧壁由拟薄壁组织形成，厚10～20μm。子囊壳内有多个圆柱形子囊，1～8个子囊孢子在子囊内线状排列，多隔，成熟后断裂成次生子囊。在人工栽培条件下，成熟的子座外周会长出许多白色营养菌丝。

上述蛹虫草菌株BYB-08已经成功地应用本发明的发酵生产中，获得良好的生产效果。

与现有技术相比，本发明具有以下积极效果：

申请号为01124109.8的发明是利用20L生物反应器中大规模生产虫草素，发酵结束时发酵液中虫草素含量为7.1μg/L。本发明生产的发酵原液中，虫草素的含量远远超过用其它培养方法和培养基发酵获得发酵原液中虫草素的含量，所获得的发酵原液中虫草素产量达到3028μg/mL。与申请号为01124109.8的方法的产量相比，本发明发酵液中虫草素含量是其专利文献所报导的420多倍，是蛹虫草液体发酵生产虫草素取得的重大突破。

附图说明

图1：本发明的技术路线图；

图2：是本发明制备的蛹虫草53个原生质体再生菌株酯酶同工酶模式图。图2A是蛹虫草亲本菌株NO4(SHN4)、NO8(B1-01)和25个原生质体再生菌株酯酶同工酶模式图，图2B是蛹虫草28个原生质体再生菌株酯酶同工酶模式图；

图3：是本发明制备的引物P6对蛹虫草53个原生质体再生菌株PCR扩增的结果。图3A是引物P6对蛹虫草亲本菌株NO4(SHN4)、NO8(B1-01)和26个原生质体再生菌株PCR扩增结果，图3B是引物P6对蛹虫草亲本菌株NO4(SHN4)、NO8(B1-01)和31个原生质体再生菌株PCR扩增结果；

图4：是本发明制备的虫草素标准品及菌株BYB-08菌丝体的HPLC色谱图。图4A是虫草素标样HPLC色谱图，图4B是菌株BYB-08HPLC色谱图；

图5：虫草素标准品的标准曲线；

图6：本发明的实施例中表层发酵时间对虫草素产量的影响；

图7：本发明的实施例中深层发酵时间对虫草素产量的影响；

图8：虫草素标准品高效液相色谱图；

图9：本发明实施例中不同发酵阶段蛹虫草发酵液中腺苷和虫草素含量的色谱对照图；

图10：本发明实施例中发酵终止时蛹虫草发酵液的高效液相色谱图；

图11：本发明实施例中不同发酵初始pH对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。

具体实施方法

实施例1：蛹虫草高产菌株BYB-08的选育

本发明生产工艺所用的菌株为申请人所在的华中农业大学应用真菌研究所采用灭活原生质体融合法选育的1株高产蛹虫草菌株，申请者将该菌株命名为BYB-08。该株蛹虫草菌株(Cordyceps militaris)BYB-08于2007年6月29日送交中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，获得保藏号为：CCTCC NO：M207091。具体步骤如下：

(1)原生质体融合亲本菌株筛选

从全国各地收集9个蛹虫草菌株，分别编号为NO1～NO9。制备以下培养基：(1)菌丝体培养基(配方如下：葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏20g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 0.46g，K₂HPO₄·3H₂O 1.0g，琼脂18g，补充自来水至1000mL，pH6.5～7.5)，(2)栽培培养基(容量为1.5L的玻璃瓶每瓶装商品大米50g，蛋白胨15.625g，葡萄糖20g，酵母膏6.25g，马铃薯200g，补充自来水至1000mL，pH6.5～7.5)，(3)固体再生培养基(配方：麦芽糖10g，葡萄糖4g，酵母粉4g，琼脂18g，补充蒸馏水至1000ml；稳渗剂为0.6M蔗糖；硫酸链霉素和青霉素钠各5万单位，pH6.5～7.5)，(4)半固体再生培养基(配方同上述固体再生培养基，但琼脂含量减半，pH6.5～7.5)进行栽培(按照常规湿热灭菌法灭菌，即在121℃高压蒸汽下灭菌40分钟至1小时)，观察其农艺性状，并采用通用的高效液相法(HPLC)测定菌丝体胞内虫草素、腺苷和尿苷的含量。结果表明蛹虫草菌株SHN4(上海市农业科学院食用菌研究所提供)原基分化早，分化率高；菌株B1-01(贵州大学真菌资源研究室提供)子实体粗壮、生长整齐，虫草素及胞内糖含量高于其它菌株。因此选定SHN4和B1-01菌株作为灭活原生质体的亲本。

(2)灭活原生质体融合

原生质体的亲本菌株酶解条件和融合条件按参考文献(Liang ZR，An MP，Tong ZY.Polarized protoplast fusion between Pleurotus sajorcaju and Schizophyllum commune[J].Mycosystema.2001.20(1)：111～115)；菌株SHN4采用紫外线(30W紫外灯，置于距超净工作台台面上原生质体悬浮液30cm处)灭活8min，将菌株B1-01采用60℃热水浴灭活14min。将浓度为10⁸个/ml的两个亲本菌株灭活原生质体悬浮液等量混合，3000rpm离心10分钟，去上清液，加30％PEG(聚乙二醇)，30℃保温10min；再加Ca²⁺缓冲液(0.05MCaCl₂·2H₂O，0.05M氨基乙酸，0.6M蔗糖，pH7～9)稀释，静置15min，3000rpm离心10min，去上清液，渗透压稳定剂(0.6M MgSO₄)洗涤沉淀3次，加适量渗透压稳定剂(0.6M MgSO₄)悬浮沉淀后培养。灭活原生质体融合后，25℃培养4d，随机挑取228个再生菌株。

(3)融合子鉴定

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和ISSR～PCR反应，对再生菌株进行融合子鉴定，筛选出真正的融合子。

聚丙烯酰胺凝胶电泳采用浓缩胶5.0％，分离胶8.0％，菌丝体培养20d，操作方法参照边银丙等报道的方法(边银丙等，木耳栽培菌株酯酮同工酶的酶谱多样性研究[J]，菌物系统，2000，19(1)：91～96)。将随机挑取的228个再生菌株进行酯酶同工酶电泳分析，同时具有亲本菌株SHN4和B1-01特有带Rf0.225和Rf0.75的再生菌株共53个菌株。根据酯酶同工酶酶谱，初步判定这53个再生菌株为融合子(见图2A，图2B)。

ISSR～PCR反应条件与唐利华等报道的方法(参见：唐利华，肖扬，边银丙，黑木耳ISSR～PCR反应体系的正交优化[J]，菌物研究，2005，3(4)：15～18)基本相同，但每条引物扩展时退火温度不同，采用的13条ISSR引物进行PCR扩增，引物的序列和退火温度见表1。

表1  供试的13条引物编号及序列

引物编号	序列(5`→3`)sequence	Tm(℃)
			P3P4P5P6P9P10P16P21P22P25P26P27P30	GAGAGAGAGAGAGAGATGAGAGAGAGAGAGAGACAGAGAGAGAGAGAGAGGAGAGAGAGAGAGAGAGCGSGGTGTGTGTGTGTGTGTAGAGAGAGAGAGAGAGTTCTCTCTCTCTCTCTCCAGAGAGAGAGAGAGAGYAAGAGAGAGAGAGAGAGYCGAGAGAGAGAGAGAGAYCGAGAGAGAGAGAGAGAYTGAGAGAGAGAGAGAGAYGGAGAGAGAGAGAGAGAA	52.254.654.654.650.852.254.652.755.055.052.755.054.6

选用P6、P22、P27等3条能同时扩增出亲本特有带的引物，对初筛的53个菌株进行ISSR～PCR反应，根据两个亲本特有扩增带的有无，从分子水平上对53个初筛菌株进行融合子鉴定。引物P6对53个初筛菌株扩增结果显示，20个菌株同时具有亲本SHN4和B1-01的特异带(图3A，图3B)。

ISSR～PCR分析与酯酶同工酶酶谱分析相结合，鉴定出26个再生菌株是真正的融合子。(4)融合子虫草素含量测定

对生长良好的原生质体融合再生菌株进行虫草素含量分析。样品处理及高效液相色谱条件参考文献(鞠建明等，HPLC测定冬仙胶囊中虫草素的含量[J].中成药，2005，27(2)Vol.27，No.2：215～216.)进行。采用Varian高效液相色谱仪，依利特高效液相色谱柱SinoChromODS～BP；虫草素标样购于sigma公司。

虫草素含量测定结果显示，融合子中有部分菌株虫草素含量低于和近似于两个亲本菌株，部分融合子虫草素含量高于亲本菌株B1-01，其中BYB-08是所有融合子和亲本菌株中虫草素含量最高的菌株(见图4B)。

实施例2：本发明的菌株应用于虫草素的生产举例

(1)菌种制备：采用固体培养基制备菌种(菌株为本发明选育的蛹虫草菌BYB-08，保藏号为CCTCC NO：M207091)。该培养基的组分及配比为(按照重量体积计)：马铃薯浸出粉(购自商品)20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.5g，VB₁ 10mg，琼脂粉20g，补充自来水至1000ml，调pH至6.5～7.5。按照常规方法在121℃高压蒸汽灭菌45分钟～1小时，备用。

在每个灭过菌的培养皿中倒入灭菌的上述培养基20ml，待凝固冷却后接入大小为1cm²左右的保藏号为CCTCC NO：M207091的蛹虫草菌株BYB-08菌丝块；将培养皿放入培养箱中于20℃～28℃(优选温度为22～25℃)避光培养15d，再用散射光条件下培养5d，待菌丝体由白转变成金黄色，用无菌水洗下分生孢子后，配制成均匀的分生孢子悬液作为发酵培养的菌种，调节孢子悬液中分生孢子数达到每毫升3.2×10⁹个，将上述孢子悬液置0～5℃冰箱中保藏备用。

(2)液体发酵罐中培养基制备与液体深层发酵培养

将上述制备好的蛹虫草分生孢子悬液接入5L发酵罐(培养基的实际装量按3L发酵罐的容量计)，接种量按分生孢子悬液占液体培养基体积的1～2％的量接种到液体培养基中。

在发酵罐中的液体培养基配方为(按照重量体积计)：葡萄糖2％，豆粕8％，马铃薯浸出粉2％，腺苷0.6％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.1％，补充自来水至100％，调pH至6.5～7.0，备用。

为了提高本发明中虫草素的产量，申请人研制了一种液体深层发酵和表层发酵相结合的方法生产虫草素。具体步骤是：在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为120ml/min～170ml/min，搅拌速度控制为150rpm～200rpm，温度控制为23℃～27℃，培养3～4d。待发酵液中还原糖浓度为0.05～0.09g/l时，停止深层搅拌发酵，将发酵液转移至容器口盖有灭菌纱布的广口容器中，控制发酵温度为23℃～27℃，静止表层发酵16d～20d后停止发酵，得到含虫草素的发酵原液.

(3)虫草素发酵原液的初步分离

用商购的大型离心机将上述步骤得到的发酵原液用3000rpm离心机在25℃下离心30分钟，取上清液。将该上清液采用SHZ-D(III)循环水式真空泵(郑州市亚荣仪器有限公司生产，按照产品说明书操作)，进行抽真空减压蒸发，浓缩至发酵原液原体积的1/10左右时，再加入3倍体积的95％乙醇沉淀出其中的多糖等物质，并将除去沉淀的发酵原液置4℃冰箱中静置过夜；然后将冰箱贮藏的发酵液在4℃条件下，采用5000rpm离心10min后，取上清，再采用SHZ-D(III)循环水式真空泵(郑州市亚荣仪器有限公司生产，按照产品说明书操作)，进行减压蒸发，蒸溜出乙醇；最后将该发酵液浓缩至发酵原液体积的1/5左右，得到最终浓缩液。用Sevage法(参见文献：李卫旗等，啤酒酵母中β-(1-3)葡聚糖的提取及其性能分析[J]，浙江大学学报，1999，26(2)：75～79)除去浓缩液中的蛋白质，所得溶液为初步提纯的虫草素溶液，作为进一步制作虫草素精制品的原料。

(4)发酵液中虫草素浓度的测定

取上述步骤制备的最终浓缩液0.2ml，稀释至1ml，常温下于12000rpm离心5min后，用高效液相色谱进样针取上清20μl作为进样的样品。

高效液相(HPLC)色谱条件的选择：

利用乙腈∶水体积比7∶93作为流动相，流速为1ml/min，使发酵液中虫草素与其它组分达到基线分离；虫草素的保留时间少于20min，在进样后10min左右出峰，做3个重复检测，平均峰面积为36076456，根据虫草素标准曲线所得值乘以稀释倍数，即可以得到蛹虫草发酵液中虫草素浓度为3028μg/ml。虫草素标准品曲线见附图5所示。虫草素标准品高效液相色谱图见附图8所示。不同发酵阶段的发酵液中腺苷和虫草素含量的对照图见附图9所示。终止发酵时发酵液高效液相色谱图见附图10所示。

(5)发酵培养条件优化：

表2显示了本发明的蛹虫草液体发酵过程中总糖、还原糖、氨态氮和虫草素含量的变化。由表2可以看出，蛹虫草液体发酵过程中总糖和还原糖在发酵进行到第12d时几乎消耗殆尽，氨基氮的含量先上升后下降，虫草素的含量在发酵的第8天开始激增，至发酵结束时发酵液中虫草素的含量达到3028μg/ml。

表2  蛹虫草发酵过程中发酵液主要物质的变化趋势测定

发酵时间(d)	总糖(％)	还原糖(％)	氨态氮(mg/ml)	虫草素(μg/ml)
					4812	1.731.40.4	1.330.80.33	385420490	29241275

1620

0.190.08

0.170.03

385350

19553028

在本发明的实施例中，申请人比较了菌种3种不同制作方式对发酵液中虫草素得率的影响。试验采用的菌种为本发明所得的蛹虫草菌株BYB-08，按以下方案设计：(1)培养皿固体菌种培养基接种，避光培养20d后制成分生孢子悬液；(2)培养皿固体菌种培养基接种，避光培养15d后，再加光照培养5d后制成分生孢子悬液；(3)液体发酵培养基(其配方同上述发酵罐液体培养基)接种分生孢子并振荡培养4d后作为菌种。将上述3种方式得到的菌种接种到发酵罐的液体培养基中，在22℃下避光培养7～12d。试验结果见表3所示。

表3  菌种不同制备方法对发酵液中虫草素含量的影响(单位：μg/ml)

菌种制作方法	(1)	(2)	(3)
				培养时间  7d12d	13.514.2	23.624.5	3.23.5

说明：表3使用的菌种为本发明获得的蛹虫草BYB-08菌株。

表4显示了不同接种量对蛹虫草发酵的影响。采用表3所制备的菌种进行接种，接种量分别按菌种占培养基体积的1％，2％，3％，4％，5％进行接种。试验结果见表3。

表4  菌种不同接种量对蛹虫草发酵的影响

接种量(％)	菌饼干重(g/瓶)	虫草素含量(μg/ml)
			1％2％3％4％5％	1.5361.5901.5701.5221.522	606647618577589

从表3、表4、图6、图7和图11试验数据的比较可以看出，本发明所得的最佳工艺和菌种制作工艺为培养皿菌种固体培养基接种，避光培养15d后再光照培养5d，制成分生孢子悬液作为发酵罐液体培养基用菌种；深层振荡发酵4d，再表层静止发酵16d，接种量为培养基体积的1～2％(分生孢子悬液浓度为3.2×10⁹个/mL)，发酵初始pH为6.5～7.0。同其它对照相比，本发明的生产工艺所得蛹虫草发酵液中虫草素含量最高。

本发明中不同培养基的对比试验结果见表5。

表5  本发明液体发酵培养基中不同配方对虫草素含量的影响

因素	葡萄糖	豆粕	土豆浸出粉	腺苷	虫草素含量(μg/ml)
									1	2	3	均值
					试验1	2％	2％	0					0.2％	603	526	628	585

试验2试验3试验4试验5试验6试验7试验8试验9均值1均值2均值3极差

2％2％5％5％5％8％8％8％170512161187518

5％8％2％5％8％2％5％8％112810541927873

2％4％2％4％04％02％102812071874846

0.4％0.6％0.6％0.2％0.4％0.4％0.6％0.2％83416431632809

15443037989869172517098071056

158428821008897161417878471007

137231671223842177716727211074

150030281073870170517237921046

由表5可知，本发明中液体培养基配方中以试验2、3、4、6、7培养效果较好，其中试验3效果最好，发酵液中的虫草素含量最高达3167μg/mL，平均含量为3028μg/mL。

研究结果表明，本发明采用深层发酵培养和静置表层发酵培养工艺相结合，所获得的发酵液中虫草素含量比文献公开报道和专利文献公开的方法所获得的虫草素产量有明显提高。

Claims (3)

1、一种生产虫草素的方法，其特征在于，采用液体深层发酵和表层发酵相结合的方法进行发酵，其步骤如下：

(1)将保藏号为CCTCC NO：M207091的蛹虫草菌株BYB-08，接种于固体培养基的平皿内，于20～28℃避光培养15d，再用散射光培养5d，用无菌水洗下分生孢子制成分生孢子悬液，备用；

(2)将步骤(1)得到的分生孢子悬液接入发酵罐的液体发酵培养基中，接种量按孢子悬液与液体培养基体积比为1～2％的量接入；

(3)按照所述的液体深层发酵和表层发酵相结合的方法培养步骤(2)的培养物：在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为120～170ml/min，搅拌速度为150rpm～200rpm，温度为23～27℃，培养3～4d后，待发酵液中还原糖浓度为0.05～0.09g/L时停止深层搅拌发酵，将发酵液转移至容器口盖有灭菌纱布的广口容器中，控制发酵温度为23～27℃，静止表层发酵16～20d后停止发酵，得到含虫草素的发酵原液；

(4)将步骤(3)得到的虫草素发酵原液以3000rpm，25℃离心30分钟，取上清液，将该上清液经减压浓缩至发酵原液体积的1/10左右，加入3倍体积的95％乙醇，去除其中的沉淀物，将剩余的发酵原液贮藏在2℃条件下，采用5000rpm离心10min后取上清，再经减压蒸出乙醇，将其浓缩至发酵原液体积的1/5左右，去除其中的蛋白，得到初步提纯的虫草素溶液，

其中：

步骤(1)所述的固体培养基组分为：按重量体积计，马铃薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.5g，V_B1 10mg，琼脂粉20g，补充自来水至1000ml，调pH至6.5～7.5；

步骤(2)在发酵罐中的液体培养基按照重量体积计为：葡萄糖2％，豆粕8％，马铃薯浸出粉2％，腺苷0.6％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.1％，补充自来水至100％，调pH至6.5～7.0，备用。

2、一个选育的蛹虫草菌株(Cordyceps militaris)BYB-08，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC NO：M207091。

3、权利要求2所述的蛹虫草菌株BYB-08在生产虫草素及其制品中的应用。

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