CN104054513A - 北冬虫夏草菌种培养方法 - Google Patents

Abstract

一种可以代替冬虫夏草入药、能代替天然冬虫夏草药源的北冬虫夏草菌种培养方法。技术方案是包括下列步骤：（1）母种制备；（2）母种转原种和栽培种；（3）悬浮液菌种或/液体菌种的制备；（4）北冬虫夏草菌种的人工栽培。

Description

北冬虫夏草菌种培养方法

技术领域

本发明属于北冬虫夏草菌种培养方法领域，尤其是一种北冬虫夏草菌种培养方法。

背景技术

冬虫夏草是我国特有的一类珍贵药材，具有极高的医疗保健价值加经济价值，在国内外享有盛誉，素有“东方传奇式珍宝”之美称，是我国传统的出口创汇商品，所以，冬虫夏草是我国传统医药宝库中的一朵奇葩。

唯有冬虫夏草的医疗保健价值及经济价值最高，所以在国内外真菌界、医药界、食品界、生物界等多年来致力于研究开发的重点。冬虫夏草具有抗疲劳、耐缺氧、抗衰老、抗肿瘤以及提高人体免疫功能等多种医疗保健作用。对人体可起到滋肺补肾、止血化痰、平喘、扩张气管、镇静抗各类细菌、降血压等作用。冬虫夏草中含有虫草素、冲草酸多种人体必需氨基酸，有益微量元素的维生素、虫草多糖、超氧化物歧化酶(SOD)等多种营养物质和抗癌抗衰老的活性物质，主要成份之一虫草素是一种具有抗生作用和抑制细胞分裂作用的物质，能抑制癌细胞的增生。国内外同位素检测技术对冬虫夏草研究证明冬虫夏草中虫草素和冲草酸不仅具有补肾壮阳、益精定喘的作用，而且能明显地对抗细胞衰老。

冬虫夏草生长在我国西部与西南部的高寒地区，生长环境特殊，资源有限，随着多年来国内外的深入研究，进一步认识到冬虫夏草对人体的医疗和滋补研究，进一步认识到冬虫夏草对人体的医疗和滋补所具有的重要价值，需求不断增加，由于天然冬虫夏草资源本就不多，加上虫草资源数量锐减，产量不断下降，供求矛盾日益加剧，造成市场供求脱节，价格昂贵，针对这种情况，投入对冬虫夏草的人工引种驯化，栽培遗传及应用等方面的研究工作之中，作为一种有发展潜力的新技术新工艺，开辟药源生物发酵技术确实具有重大价值和发展前途。

由于冬虫夏草生长环境的特殊性，人工培养作为冬虫夏草近缘种的北冬虫夏草受到了关注。然而，在现有的北冬虫夏草人工培养中，由于北冬虫夏草菌种极其容易退化和衰老、不易保藏，在栽培实践中导致许多种植户使用同一优良菌种，甚至同样制备和使用液体菌种，却不出草或很少出草。

在现有的北冬虫夏草人工培养，往往仅仅关注单一步骤的培养基配方和培养条件，未总体考虑到各个步骤的培养基配方和培养条件，有时导致在某一步骤的培养效果虽然好，但是却可能影响到后续步骤的培养效果，从而导致总体培养效果较差。

例如，CN1724641A公开了一种北冬虫夏草液体菌种营养基的制备方法及其应用，它主要通过选取不同的原料，包括胡萝卜、葡萄糖等物料进行充分混合，再加入一定量的连霉素等，进行发酵，制备得北冬虫夏草液体菌种营养基。然后是在培育北冬虫夏草过程中进行温度、时间的不同控制，可以达到较好的培育效果。本发明的优点在于，营养基的制备方法简单，操作方便；培养基在北冬虫夏草的培育过程中可以取得较好的效果，缩短时间，温度控制要求低，遮光要求低等优点。本发明的实施，可以有利于北冬虫夏草的大力推广与培育。然而，在该专利文献中，北冬虫夏草总体培养效果欠佳，如产量不高。

CN101463325A公开了一种北冬虫夏草工厂化栽培方法，经菌种制备、配料装瓶、灭菌、接种、培养、出草采收步骤工厂化栽培北冬虫夏草，采用了常见的人工代料作为培养材料，降低了生产成本，而且本发明获得的北虫草质量稳定性好，生物转化率高等优点。在该专利文献，成草率较低。

非专利文献“不同氮源对北冬虫夏草生长影响的研究”，杨宣华，佛山科学技术学院学报(自然科学版)，第26卷第3期，2008年5月，以硝酸钾，蛋白胨、黄豆粉、硫酸铵、尿素5种不同氮源对北冬虫夏草的菌球数量、干重，菌丝生长状况及子实体的鲜重和干重进行研究，认为液体培养的菌球最多的是蛋白胨，其次是黄豆粉，最差是硝酸钾，固体斜面培养基从菌丝长势来看最好是蛋白胨，最差的是硝酸钾，北冬虫夏草最佳的氮源是黄豆粉。然而，在专利文献中所述优选氮源对不同菌种的适应性较差。

本发明人的在先专利申请CN1935979A公开了一种北冬虫夏草菌种培养方法。然而，母种稳定性较差，易退化和衰老。

因此，目前亟需一种稳定且有效的北冬虫夏草培养方法。

发明内容

本发明人经过深入研究，在先前研究的基础上，经过大量筛选和实验，从整体认真研究了每个培养步骤的培养基配方和培养条件，通过将每一步骤的培养基配方和培养条件加以总体和协同考虑，提供如下可以代替冬虫夏草入药、能代替天然冬虫夏草药源的北冬虫夏草菌种培养方法。

本发明的技术方案是：北冬虫夏草菌种培养方法，包括下列步骤：

(1)母种制备；(2)母种转原种和栽培种；(3)悬浮液菌种或/液体菌种的制备；(4)北冬虫夏草菌种的人工栽培。

所述的母种制备包括：(1)制作培养基；(2)试管母种制备；(3)试管母种的扩大培养；(4)出草试验；(5)组织分离制作母种。

所述(1)母种制备制备优选包括：将斜面菌种活化后分割成豌豆大小，每2～3块接种到一瓶液体培养基中，于25℃、100 r/min振荡培养7天得等级为1的种，将培养好的等级为1的种以8% ( V/V)接种量接种到相同的液体培养基中，在所述等级为1的种相同条件下培养20天，分别将各菌株胞外液经0. 40 μm膜过滤后进行虫草素含量测定，每组试验重复3次，筛选得到所需母种。

所述(2)试管母种制备优选包括采用冬虫夏草的组织直接切取虫草菌核内部的一小块菌索，0.2％升汞溶液和0.1％ KNO₃溶液分别表面消毒3 min，无菌水冲洗3～5次，无菌条件下切去外层、避开肠道，切取内部黑色菌索0.4 cm左右，将菌索分别接种到8个基本培养基中，在三角瓶中进行1～8倍的扩大培养，然后于生化培养箱中20℃静置培养120 h。

在上述培养基中优选加入占培养基总重量的0.001%重量的吲哚基丙酸，并维持培养基的pH为约6.7，可以使子实体生长良好并且使分化的子实体原基较多。

所述的母种转原种和栽培种包括：(1)培养基的配制、(2)母种转管扩大。

所述的悬浮液菌种制备包括：(1)培养基配制、(2)灭菌、(3)接种培养。

所述的液体菌种制作包括(1)液体菌种培养基配方、(2)接种培养。

所述的北冬虫夏草菌种人工栽培包括：(1)按培养基配方制作培养基，培养基配方选自以下5种中的任一种或多种：

①炒大米93％，葡萄糖2％，蛋白胨2％，柠檬酸0.29％，硫酸镁0.2％，蚕蛹粉2.5％，维生素B10.01％；

②高粱米85％，蚕蛹粉10％，蔗糖1.99％，蛋白胨2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.1％，酵母粉0.8％，另加维生素B10.01％；

③小米95％，葡萄糖3.49％，酵母膏1.2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.2％，另加维生素B10.01％；

④高粱米45％，玉米渣40％，小米10％，蔗糖2％，蛋白胨2％，酵母粉0.8％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.1％；

⑤大米50％，麦麸25％，玉米粉9.99％，葡萄糖(或蔗糖)2％，木屑10％，蚕蛹粉2％，尿素0.1％，硫酸镁0.9％，另加维生素B10.01％；

(2)拌料装瓶；(3)灭菌；(4)接种；(5)培养室培养；(6)后期管理；(7)采收。

所述的母种制备中，制作培养基配方为两种之一：

(1)葡萄糖20克、琼脂20克、去皮土豆200克(煮汁)、水1000毫克(PDA培养基)；(2)燕麦片30克、琼脂20克、水1000毫升；

试管母种扩大培养基配方为下列三种之一：

(1)蛋白胨10克，葡萄糖10克，含脂蚕蛹10克，全脂奶粉10克，磷酸二氢钾15克，琼脂20克，水1000毫升；

(2)葡萄糖10克，蛋白胨10克，酵母膏1克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，生长素5毫升，水1000毫升；

(3)去皮土豆200克(煮汁)，葡萄糖20克(或蔗糖40克)，磷酸二氢钾1.5克，琼脂20克，维生素B110克，增长灵0.5克，水1000毫升。

母种转原种和栽培种的培养基为下列之一：

(1)蔗糖10克，蛋白胨10克，琼脂15克，硫酸镁0.5克，维生素B15片1000毫升；

(2)葡萄糖20克，琼脂20克，土豆200克(煮汁)，维生素B13片，蛋白胨5克，磷酸二氢钾(试剂)0.5克。

悬浮液菌种的培养基为下列之一：

(1)磷酸二氢钾3克，食盐3克，维生素B15片，葡糖糖15克，硫酸镁0.5克，味精0.2克，黄豆粉15克，水1000毫升；

(2)玉米粉12克，酵母粉3克，磷酸二氢钾1克，葡萄糖22克，黄豆粉10克，维生素B1180-200毫，硫酸镁0.5克，水1000毫升；

(3)葡糖糖35克，蛋白胨25克，磷酸二氢钾1克，食盐2.5克，维生素B13片。

液体菌种制备的培养基为下列之一：

(1)蛋白胨12克、酵母粉25克、玉米粉10克、黄豆粉10克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁0.3克、味精0.1克、葡萄糖20克、食盐0.3克、维生素B1100毫克、水1000毫升；

(2)葡萄糖10克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1克、氯化钙1克、氨基酸复合粉5克、去皮土豆250克(煮汁)、蝉蛹20克、水1000毫升；

(3)磷酸二氢钾0.05克、维生素B11150毫克、蛋白胨15克、葡萄糖25克、酵母粉10克、硫酸镁0.05克、食盐8克、水1000毫升。

本发明的效果是：通过本发明的北冬虫夏草菌种培养方法，能够增加冬虫夏草的产量，从根本上降低冬虫夏草的价格，为广大患者减轻疾病的痛苦发挥作用，为我国传统医药宝库中又增加另一朵奇葩。

应指出的是，本发明的培养基体系是本发明人经过大量创造性劳动所筛选出的，这样的培养基体系在现有技术中没有记载，也不是北冬虫夏草人工栽培的常规技术手段，需要付出过度劳动才能够加以确定。通过本发明的培养基体系，生物学效率可达60%，远远高于现有的约45%生物学效率。利用本发明培养基体系获得最大虫草产量为36.65g/L，比现有所知的虫草产量高出约50%。

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。

具体实施方式

北冬虫夏草菌种培养方法，包括下列步骤：

一、母种制备

母种制备采用孢子分离法，属于有性繁殖法。它是在无菌条件下利用菌类子实体自行弹射孢子的原理，使孢子散落在人工培养基上，通过培养，得到原始菌系体，然后再移接入斜面试管进行培养。具体包括下列步骤：

(一)制作培养基

培养基可以选择下列两种配方进行制作：

1、葡萄糖20克、琼脂20克、去皮土豆200克(煮汁)、水1000毫克(PDA培养基)

2、燕麦片30克、琼脂20克、水1000毫升

配制方法：燕麦片加水，在沸腾水浴中加热1小时用两层纱布滤后加水补足到配制量，加琼脂深化后装入培养器灭菌即成。

(二)试管母种制备

1、一直径25厘米左右的搪瓷盆，上衬4层纱布，在纱布上放一中号培养器(器内装有培养基)，并在器内放一不锈钢三角架，供插虫草子座用，在培养器上方加盖一个玻璃钟罩，连同瓷盘一起用纱布包好，在147千帕压力下灭菌1小时，冷却后备用。

2、选取新鲜、优质、成熟、尚未散发孢子的正常虫草子座用清水冲洗干净、晾干。

3、将上述灭过菌的整套装置去掉纱布，连同虫草子实体0.1％升汞液(或75％酒精)无菌水等一起放入接种箱内严格消毒，消毒之后，在无菌条件下，用0.1％升汞液(或75％酒精)对虫草子实体表面消毒，并用无菌水清洗表面残留药液，然后拆开钟罩，将虫草子实体插放于三角架上，再盖好钟罩。用纱布将钟罩底部周围塞好，并往纱布上倒0.1％升汞水，最后将整套孢子采集装置从接种箱取出，放入恒温箱中(25摄氏度左右)，使孢子下落，待培养基上有虫草菌落出现时，在无菌条件下挑取单个或多个菌落移接至试管斜面培养基上培养(15摄氏度-20摄氏度恒温条件下避光培养)培养成功后，即可移接、扩制。

(三)、试管母种的扩大培养

经用分离方法制成试管母种后，还需进一步转管移植，扩大培养。母种种植扩繁除了能大大增加菌种数量外，还能有效避免菌种老化或生长不良，防止或消除杂菌感染。

试管母种扩大培养基配方：

1、蛋白胨10克，葡萄糖10克，含脂蚕蛹10克，全脂奶粉10克，磷酸二氢钾15克，琼脂20克，水1000毫升。

2、葡萄糖10克，蛋白胨10克，酵母膏1克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，生长素5毫升，水1000毫升。

3、去皮土豆200克(煮汁)，葡萄糖20克(或蔗糖40克)，磷酸二氢钾1.5克，琼脂20克，维生素B110克，增长灵0.5克，水1000毫升。

有性虫草菌丝生长较慢，在20摄氏度的恒温下，一般需要经3-4个月的培养才能长满斜面，当见到试管斜面培养基有1-2厘米大的菌落，菌凸起且表面曲折不平，颜色为桔黄色即说明试管用母已经培养完成。

(四)、出草试验

虫草有性分离的菌种必须在种植前做出草试验，虫草新分离的菌种不一定都能出草，因此必须经过严格的出草试验，菌丝的有性生殖性状稳定以后方可投入生产，对于出草试验中表现位出草较早、产量较高的菌种要及时进行扩繁和保藏。

(注：分离培养的母种，不能直接用于生产，必须经过移植驯化，使其适应栽培条件，并扩大数量，方可使用。)

(五)、组织分离制作母种

选用优良、纯净、健壮、适龄的天然虫草作无性菌组织分离，是实现高产、优质的关键。北冬虫夏草无性培育代数分为母种、原种和栽培种3级，母种是组织分离培育成的菌丝体，原种和栽培种是在试管母种的基础上扩大培育而成菌种，母种通常不宜直接栽培，而主要用于转管扩大和制作原种，以及用作菌种保存，原种则可以用于栽培生产，也可以继续扩大繁殖成栽培种主要用于栽培生产。

组织分离法为无性繁殖，孢子分离法属有性繁殖，孢子分离法技术性强，操作复杂，难度较大，不适合一般人采用，而组织分离法简单，成功率高。下面介绍母种分离方法。

1、无菌操作的概念，无菌操作技术是成功与失败的关键，必须作好正确的思想准备，不能忽视。整个操作在接种箱进行或在无菌室内进行操作。菌种通过所暴露的空间，必须是无菌区，菌种与容器外的空间通道口(管口、瓶口)必须用酒精灯火焰灭菌封闭。各种工具和菌种接触之前，都必须用酒精灯火焰灭菌、冷却后再进行接种，棉塞塞入试管口部分，拔出后不得与未灭菌物接触，以防感染。

2、制种工具：

(1)天平1台，称量为500克的普通天平。主要是称取种营养料数量。

(2)试管：一般选用18毫米×180毫米或20毫米×200毫米规格试管

(3)量杯：主要用于计量水的体积，规格用500毫升或1000毫升。

(4)塑料小漏斗：用于将培养基装入试管

(5)接种铲、接种刀、接种针及长柄镊子：用于移接菌种。

(6)单面刀片：用于切取虫草组织分离母种。

(7)酒精灯：用于接种时一切工具进行火焰灭菌用。

3、灭菌药液

(1)福尔马林：含甲醛37％-40％用于消毒熏蒸，每立方米空间需要2-5毫升，或用高锰酸钾(PP粉)，以每立方米用5克，加10毫升福尔马林溶液混合熏蒸。

(2)升汞溶液0.1％，升汞液用于虫草组织分离和表面消毒升汞溶液配制方法有两种：

①、先配成浓的原液，用前再稀释到所需浓度。原液成分如下：升汞20克、盐酸(浓)100毫升、配制消毒液时，可取原液5毫升，加蒸馏水或洁净水1000毫升稀释。

②直接配制：升汞液1克、盐酸(浓)25毫升、水1000毫升，先将升汞液溶于盐酸中，然后再加水稀释。

(3)无菌水：经高温灭菌的洁净水(用蒸馏水更好)，用于清洗虫草体表面。

4、培养基配制

(1)葡萄糖20克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升

(2)蛋白胨10克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，生长素5毫升，葡萄糖10克，酵母膏1克，水1000毫升。

(3)蔗糖30克，磷酸二氢钾1.2克，硫酸镁0.3克，天门冬酰胺1克，硝酸钠0.5克，氯化钾0.5克，琼脂20克，水1000毫升。

配置方法：配制常用马铃薯、葡萄糖、琼脂CPDA、培养基，将新鲜土豆洗净去皮去牙眼后称取200克，切成小块或条薄片均可。加水1000毫升煮沸20分钟，至土豆软而不烂时，用事先浸湿拧干的4-6层纱布过滤去渣，取其汁液于锅中。尔后加入葡萄糖20克，再加琼脂20克，硫酸镁0.5克，加水1000毫升，继续加热至琼脂溶化煮沸后即成培养溶液，可趁热迅速分装入试管。

5、高压灭菌

将分装好的试管培养基放入手提式高压锅进行灭菌，等烧至49千帕(0.5千克/厘米2)压力时，打开排气阀排出冷气，使指针回零，然后继续加热到117.68-147.1千帕(1.2-1.5千克/厘米)压力时，保持30-50分钟后停火，待指针回到零后，打开锅盖，取出试管，并趁热把试管摆成斜面。

6、出发菌株的选择

出发菌株有两种：一种是天然虫草子实体，另一种是人工栽培的子实体，选择生长周期短，易发育子座，产量高，药用及营养价值大，生长正常，无病虫害，没有散发孢子的健壮子座作为母种分离出发菌株。

先将选好后的新鲜活性的出发菌株洗净晾干，连同试管培养基及灭过菌的工具，刀片，无菌水镊子，一同放入接种箱，然后对接种箱消毒。

方法是按接种体积计算：每立方米空间用福尔马林溶液3毫升，加热熏蒸30分钟，或按每立方米空间用福尔马林10毫升加入高锰酸钾5克熏蒸40-60分钟(先将高锰酸钾倒入瓷碗内，再将福尔马林倒入，迅速关闭箱门。再用紫外线灯照射20-30分钟，然后按无菌操作，用0.1％升汞溶液(或75％酒精)对菌种表面消毒，方法是用脱脂棉浸蘸0.1升汞液迅速涂擦虫草组织表面，一般需擦3-5次，每次不超过1分钟，最后用无菌水清洗1-3次表面残留药液。经表面消毒后，用单刀切去外表层，切取其内部组织一小块(最好从子实体有龟背状花纹的顶端切取组织块)可获得优质高产的菌株，迅速移接在试管培养基中央，并迅速塞上棉塞，切取的组织块大小要适宜，一般1毫米见方，过大易杂菌感染，过小则易将组织杀死，全部接种完毕后，将试管移出接种箱，在20摄氏度-28摄氏度的恒温箱中培养，一般3-4个月即可得到母种。

二、母种转原种和栽培种

原种和栽培种来源于母种的扩大，原种是天然虫草菌株，通过人工培训后，提出优质菌落转入固体培养基，经过各个阶段不同的温度、湿度，营养物得到一级母种。

母种只能作菌种使用，不得直接栽培，所以必须作原种转管培养，一般原种也不易直接栽培，因为原种来源极少，代价高，需多次转管培养成栽培种。

(一)、培养基的配制

1、蔗糖10克，蛋白胨10克，琼脂15克，硫酸镁0.5克，维生素B15片1000毫升。

2、葡萄糖20克，琼脂20克，土豆200克(煮汁)，维生素B13片，蛋白胨5克，磷酸二氢钾(试剂)0.5克。

配制方法：现将各种营养料称取等量，合起调匀，再将1000毫升水加热使琼脂融化，然后将营养料倒入，煮沸时间为5-10分钟，尔后调节值为PH5-6，趁热分装试管，经过高压灭菌后摆成斜面备用。

(二)母种转管扩大

接种箱及一切用具。事先要进行严格消毒，接种人员在接种前必须用肥皂或2％的来苏儿溶液洗手以防杂菌带入。

转管操作

将母种试种口在酒精灯火焰上灼烧，同时拔出棉塞，然后将所有工具也在酒精灯灼烧，等冷却后进行母种切取转管，转管时工具勿碰到管壁，在火焰旁迅速转入试管中央，注意不要把培养基划破，也不能使菌种粘到试管壁上，抽出接种工具，将棉塞旋紧。

一支母种试管一次可扩接25支-35支试管，接种完毕将接好的试管贴上标签，注明菌名年月日，接种人，7-10支为一捆用牛皮纸扎紧试管上部，结束后放入培养箱中培养，为了避免温度突变，影响菌丝生长发育，最好在恒温箱中培养，一般在20摄氏度-28摄氏度下，保温培养10天左右，即成二级母种(可以作培养栽培种，也可以直接种植)。

用上法移接扩制的北冬虫夏草二级母种，即可以作纯菌种保存，也可以直接用来生产培种，还可以直接种植。

一般来说1支原菌种扩繁次数不宜太多，一般不得超过3次，否则易引起菌种退化。

三、悬浮液菌种的制备

悬浮液属液体菌种的范畴，但是悬浮在很大程度上只能是母种和原种的稀释，而液体菌种才是虫草的复壮繁殖，在相同的用量上悬浮液效果不如液体菌种，悬浮液菌种制作比较简单，投资较少，栽培经验不足者可以先用悬浮制作技术，只是栽培时菌种用量大些以提高感染成功率。

(一)、培养基配制

1、磷酸二氢钾3克，食盐3克，维生素B15片，葡糖糖15克，硫酸镁0.5克，味精0.2克，黄豆粉15克，水1000毫升。

2、玉米粉12克，酵母粉3克，磷酸二氢钾1克，葡萄糖22克，黄豆粉10克，维生素B1180-200毫，硫酸镁0.5克，水1000毫升。

3、葡糖糖35克，蛋白胨25克，磷酸二氢钾1克，食盐2.5克，维生素B13片。

配制方法：按上述等量称取放入锅内煮沸10-15分钟，然后倒入量杯中沉淀15-20分钟后，把上层液装入500毫升盐水瓶中，每瓶装量为200-250毫升。

(二)灭菌

用手提式高压灭菌锅，将悬浮液瓶装锅后拧紧螺旋，升温火力应该逐渐加大，气压达49千帕(0.5千克/厘米2)时打开排气阀排出冷气。待压力表回零时，再关上排气阀重新升温，当气温升到147(1.5千克/厘米2)时保持40-60分钟断火冷却待压力表回零时，打开排气阀，排出残留蒸汽掀开锅盖，取出灭菌液冷却后待用。

(三)接种培养

全过程都在无菌条件下进行，有关操作办法请参阅固体菌种，每只二级试管菌可接4-6瓶悬浮液。

将接好的悬浮液放在黑暗处，在20-28下培养5-7天，见瓶内悬浮液表面有白色菌丝时摇晃瓶体，使瓶内菌丝与液体均匀，悬浮液大多都是在自然温度下，培养，不是在恒温箱种，大多数出现白色菌丝摇晃不开，这是正常现象，在摇晃时表面结块的虫草菌的分生孢子就像花粉一样肉眼看不到却已进入悬浮液，在此种现象出现后再经4-5天后即可栽培使用。

说明：悬浮液，优点是生产菌种时间短，易学，工序简便，成功率高，产量高，发菌旺。

缺点是：悬浮液菌种制作好后，一是菌种用量大，二是不易长久保存。

四、液体菌种制作

目前，国内生产菌种大多数都采用20世纪70年代延续下来的固体菌种，其费用高，劳动强度大，周期长，产量不稳定，现在我们采用单级培养法又叫液体制种速成法，逐步实现多级培养方法，来实现高产稳产周期短，无感染的高效菌种。

单级培养是投资最小的液体菌种小型生产设备，全套设备也只不过百元左右，安装简便，器材易购，此套装装置生产周期短，8-10天即可培养出第一批虫草液体菌种，生产量较大，根据需要1次可生产1000-2000毫升液体菌种，并可连续生产，栽培方便，只要把液体菌种喷到培养基表面即可发菌快，是固体发菌时间一半，产量高，是固体菌产量的2倍，并从根本上解决了感染时间，成功率高，用特制的过滤器完全杜绝了杂菌，酵母菌的感染，成功率高达95％以上，用传统方法种植虫草需要6-8个月的时间，采用液体菌种，只需50-60天，极大的缩短了虫草生产周期。

(一)、液体菌种培养基配方

1、蛋白胨12克、酵母粉25克、玉米粉10克、黄豆粉10克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁0.3克、味精0.1克、葡萄糖20克、食盐0.3克、维生素B1100毫克、水1000毫升。

2、葡萄糖10克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1克、氯化钙1克、氨基酸复合粉5克、去皮土豆250克(煮汁)、蝉蛹20克、水1000毫升。

3、磷酸二氢钾0.05克、维生素B11150毫克、蛋白胨15克、葡萄糖25克、酵母粉10克、硫酸镁0.05克、食盐8克、水1000毫升。装瓶灭菌

选用上述配方，按所需要量(此处以1000毫升培养料为例)称好各种原料，放入锅内，加水1300毫升加热煮沸5-10分钟，冷却，沉淀1小时，取上层清夜装入广口瓶内，装量为瓶的7/10，加入3-6滴食用油为消泡剂，防止通气时培养液产生气泡沫，将瓶口用代替棉塞塞好，放在锅内，进行高压灭菌，高压147千帕下灭菌40-60分钟，灭菌结束自然冷却到30℃以下，准备接种。

(二)、接种培养

按无捆操作要求，在接种箱内接入二级种和栽培种即可，具体操作要领与母种制作相同。

接种后放在20℃-25℃的条件下静止培养2天，观察液基表面无异色，清晰即可通气，先启动小通气量，吹氧3天，再启动大气量吹氧3-4天，这样通氧搅拌较好，培养过程中，每天至少检查一次，观察液基是否出现混浊，如出现混浊说明被感染，应废掉，如果液基内清晰有小菌丝片出现为正常，待菌丝片直径达0.3-1毫米货菌丝球充满液基，说明液体菌种制作完成。

注：液体菌种，可以有效地降低成本，发菌速度快，高产稳产发菌均匀，缺点是：液体菌种制作好后必须及时使用，暂时不用，在常温下(30℃以下)一般可放置2-3天，最长时间不得超过7天，时间太长容易老化和变质。

五、北冬虫夏草人工栽培

(一)、按培养基配方制作培养基

1、炒大米93％，葡萄糖2％，蛋白胨2％，柠檬酸0.3％，硫酸镁0.2％，蚕蛹粉2.5％，另加维生素B10.01％。

2、高粱米85％，蚕蛹粉10％，蔗糖2％，蛋白胨2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.1％，酵母粉0.8％，另加维生素B10.01％。

3、小米95％，葡萄糖3.5％，酵母膏1.2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.2％，另加维生素B10.01％。

4、高粱米45％，玉米渣40％，小米10％，蔗糖2％，蛋白胨2％，酵母粉0.8％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.1％。

5、大米50％，麦麸25％，玉米粉10％，葡萄糖(或蔗糖)2％，木屑(阔叶树木为宜)10％，蚕蛹粉(可用中药店僵蚕代替)2％，尿素0.1％，硫酸镁0.9％，另加维生素B10.01％。

(二)、拌料装瓶

上述培养基任选一种，称取等量拌料均匀，含水量必须保持在60％-65％，PH值5-7、分别装入500毫升罐头瓶中，每瓶可装干料50克左右，营养料水分另计，尔后可用聚乙稀或聚丙稀薄膜封口。

(三)、灭菌

灭菌有两种方法：一种是高压灭菌；一种是常压灭菌。这里只谈常压灭菌，常压灭菌有利于大行生产，容量大，灭菌时间必须保持在8-10小时即可，开始低温在50℃下进行3-4小时(如升温快，温度过高会引起瓶子暴破)，尔后进行高温100℃大火烧至4-6小时，灭菌完后进行出锅冷却，冷却后准备接种，接种温度不得超过20℃。

(四)、接种

在无菌的条件下进行操作，首先具备一个煤球火炉把火烧旺，用消过毒的注射器在火焰上方抽取液体菌种，以每瓶5-10毫升均匀地注射入灭过菌的培养瓶种，接种完毕，将培养瓶转入培养室内培养。

(五)、培养室培养

培养瓶进室前，必须先提前进行消毒，消毒之后，即可把接过种的瓶子放在床架上，每个瓶稍留一点空间，以利于通风散热，同时室内必须保持适宜温度，一般情况下15-25天菌丝可以长满培养基，并形成子实体原基，45天-60天即可成熟，虫草培养管理可分为两个阶段。

1、温度：北冬草菌丝在6℃-30℃均可生长，6℃以下停止生长，30℃以上生长停滞，甚是死亡，适宜温度为15℃-25℃，菌丝发育初期阶段，室温为15℃-20℃，后期为23℃-25℃，超过25℃不易形成子座。

2光线：菌丝阶段，管线黑暗菌丝发育较快，但光强则不易生出子座，而且生长缓慢，过早进入生殖生长阶段，影响产量和质量，必须等菌丝长满瓶面扎到瓶底才能见光。

3、湿度：虫草在瓶内密封生长，空气湿度影响不大，但长时间干燥，也会使瓶内水分慢慢蒸发，影响后期菌丝生长和子实体形成，为此，要适当在室内地面喷水加湿，前期湿度保持在65％左右，过湿易生杂菌，不易形成子座。

4、氧气：北虫草菌丝阶段呼吸量较小，室内无需通风，无需特殊条件管理，在15-25天菌丝即可长满培养基，北虫草的生长也即将由营养生长进入生殖生长阶段，此阶段放瓶的位置不能乱动，因为一动温度变化影响生长。

5、长势：菌丝长满瓶后，并出现鼓包突起，开始见光转色出草转色期，每天早上6-8点钟通风见光，待菌丝全部由白色转为黄色后，每天可以适当增加散射光，转色初期，温度以21℃左右为好，转色完成后，温度保持在23℃左右，湿度保持在85％以上，转色期每天光照不得少于10小时。见黄即止，光不能连续照，转色期需2-8天，转色后即开始在料面上形成小米状原基(即菌蕾)。

(六)、后期管理

1、当大部分料面形成原基时，温度可保持在23℃左右，湿度为85-90％，湿度太大易诱发培养基产生过多气生菌丝对子实体生长不利，湿度太小容易使培养基过早失去水份而影响产量，为保持适宜湿度，可喷雾水于地面，每天3-4天。

2、子实体生长阶段管理

(1)温度：形成虫草子实体的最佳温度为20℃-25℃，因此，本阶段尽能控温，以利于子实体形成与生长，控温在25℃以下，超过28℃不能长处子座。

(2)光线：当菌丝长满后即可增加自然光照，菌丝见光后由白色逐渐变为桔黄色或桔黄色，菌丝分泌色素后培养基表面即会出现米粒状桔黄色菌蕾，菌蕾伸长后即为子实体，转身后不能连续光照，连续光照不能生成子实体。

(3)空气湿度：子实体生长阶段要把室内空气湿度加大到85％-90％，以减少瓶内水分散发，虫草子实体形成要靠水份吸收营养，使细胞膨大，从原基形成之后直到成熟虫草的细胞总数并没有增加，其整个子实体的增大是每个细胞吸收水份及营养而增大的结果，为此，必须在营养料中加足水份，才能使虫草高产。

(4)氧气：虫草即使在密封的瓶中仍能正常生长。也就是说，它对氧气的需求量较小，为此，在整个生长过程中，尽量减少瓶内水份散发，无需去掉封口薄膜，当瓶中子实体长到2厘米高左右时，用粗针在封口薄膜上扎几个孔即可。

按上述条件再经15天左右，虫草子座即可成熟，当高达8厘米左右，子实体表面有黄色粉末物出现即可采收。

(七)、采收

当虫草子座长到5-8厘米长，即成熟，去掉封口薄膜，蒋子实体拔出，晾干或烘干均可，如需保存，水份低于3％以防止发霉变质，干后用薄膜袋密封。

Claims (10)

1.北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是包括下列步骤：(1)母种制备；(2)母种转原种和栽培种；(3)悬浮液菌种或/液体菌种的制备；和(4)北冬虫夏草菌种的人工栽培。

2.根据权利要求1所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是所述的母种制备包括：(1)制作培养基；(2)试管母种制备；(3)试管母种的扩大培养；(4)出草试验；和(5)组织分离制作母种。

3.根据权利要求1或2所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其中所述(1)母种制备制备包括：将斜面菌种活化后分割成豌豆大小，每2～3块接种到一瓶液体培养基中，于25℃、100 r/min振荡培养7天得等级为1的种，将培养好的等级为1的种以8% ( V/V)接种量接种到相同的液体培养基中，在所述等级为1的种相同条件下培养20天，分别将各菌株胞外液经0. 40 μm膜过滤后进行虫草素含量测定，每组试验重复3次，筛选得到所需母种。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其中所述(2)试管母种制备包括采用冬虫夏草的组织直接切取虫草菌核内部的一小块菌索，0.2％升汞溶液和0.1％ KNO₃溶液分别表面消毒3 min，无菌水冲洗3～5次，无菌条件下切去外层、避开肠道，切取内部黑色菌索0.4 cm左右，将菌索分别接种到8个基本培养基中，在三角瓶中进行1～8倍的扩大培养，然后于生化培养箱中20℃静置培养120 h；以及其中，在培养基中加入占培养基总重量的0.001%重量的吲哚基丙酸，并维持培养基的pH为约6.7。

5.根据权利要求1或2所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是：

所述的母种转原种和栽培种包括：(1)培养基的配制；和(2)母种转管扩大；

所述的悬浮液菌种制备包括：(1)培养基配制、(2)灭菌、和(3)接种培养；

所述的液体菌种制作包括：(1)液体菌种培养基配方、和(2)接种培养。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是所述的北冬虫夏草菌种人工栽培包括：(1)按培养基配方制作培养基，培养基配方选自以下5种中的任一种或多种：①炒大米93％，葡萄糖2％，蛋白胨2％，柠檬酸0.29％，硫酸镁0.2％，蚕蛹粉2.5％，维生素B10.01％；②高粱米85％，蚕蛹粉10％，蔗糖1.99％，蛋白胨2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.1％，酵母粉0.8％，另加维生素B10.01％；③小米95％，葡萄糖3.49％，酵母膏1.2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.2％，另加维生素B10.01％；④高粱米45％，玉米渣40％，小米10％，蔗糖2％，蛋白胨2％，酵母粉0.8％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.1％；⑤大米50％，麦麸25％，玉米粉9.99％，葡萄糖(或蔗糖)2％、木屑10％，蚕蛹粉2％，尿素0.1％，硫酸镁0.9％，另加维生素B10.01％；(2)拌料装瓶；(3)灭菌；(4)接种；(5)培养室培养；(6)后期管理；(7)采收。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是在所述的母种制备中，制作培养基配方为两种之一：(1)葡萄糖20克、琼脂20克、去皮土豆200克(煮汁)、水1000毫克(PDA培养基)；(2)燕麦片30克、琼脂20克、水1000毫升；试管母种扩大培养基配方为下列三种之一：(1)蛋白胨10克，葡萄糖10克，含脂蚕蛹10克，全脂奶粉10克，磷酸二氢钾15克，琼脂20克，水1000毫升；(2)葡萄糖10克，蛋白胨10克，酵母膏1克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，生长素5毫升，水1000毫升；(3)去皮土豆200克(煮汁)，葡萄糖20克(或蔗糖40克)，磷酸二氢钾1.5克，琼脂20克，维生素B110克，增长灵0.5克，水1000毫升。

8.根据权利要求6-7中任一项所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是母种转原种和栽培种的培养基为下列之一：(1)蔗糖10克，蛋白胨10克，琼脂15克，硫酸镁0.5克，维生素B15片1000毫升；(2)葡萄糖20克，琼脂20克，土豆200克(煮汁)，维生素B13片，蛋白胨5克，磷酸二氢钾(试剂)0.5克。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是悬浮液菌种的培养基为下列之一：(1)磷酸二氢钾3克，食盐3克，维生素B15片，葡糖糖15克，硫酸镁0.5克，味精0.2克，黄豆粉15克，水1000毫升；(2)玉米粉12克，酵母粉3克，磷酸二氢钾1克，葡萄糖22克，黄豆粉10克，维生素B1180-200毫，硫酸镁0.5克，水1000毫升；(3)葡糖糖35克，蛋白胨25克，磷酸二氢钾1克，食盐2.5克，维生素B13片。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是液体菌种制备的培养基为下列之一：(1)蛋白胨12克、酵母粉25克、玉米粉10克、黄豆粉10克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁0.3克、味精0.1克、葡萄糖20克、食盐0.3克、维生素B1100毫克、水1000毫升；(2)葡萄糖10克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1克、氯化钙1克、氨基酸复合粉5克、去皮土豆250克(煮汁)、蝉蛹20克、水1000毫升；(3)磷酸二氢钾0.05克、维生素B11150毫克、蛋白胨15克、葡萄糖25克、酵母粉10克、硫酸镁0.05克、食盐8克、水1000毫升。