CN113832039B - 一株具有抗真菌活性的工业大麻内生真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株具有抗真菌活性的工业大麻内生真菌及其应用，涉及微生物领域，尤其涉及一株工业大麻内生真菌及其应用。是要解决现有人工合成类抗真菌药物污染环境，且容易产生副产品的问题。该内生真菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)HMY01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年8月26日，保藏编号为CCTCC NO：M20211092。尖孢镰刀菌HMY01能够抑制真菌活性，能够发酵产金丝桃苷。本发明的工业大麻内生真菌用于抑制真菌和发酵产金丝桃苷。

Description

一株具有抗真菌活性的工业大麻内生真菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株工业大麻内生真菌及其应用。
背景技术
近年来，真菌导致的感染性疾病发生率逐年上升，随着抗真菌药物的使用，新的致病真菌及临床耐药也不断涌现，且抗真菌药物研发进展缓慢，临床上可选择的抗真菌药物非常有限，常用的抗真菌药物多为人工合成的唑类抗真菌药物及微生物发酵法生产的多烯类、棘白霉素类药物。其中，人工合成类抗真菌药物为非环境友好型，且在生产过程中容易产生副产品，而微生物发酵法生产的抗真菌类药物为天然产品，且这类产品开发空间较大。因此，开发新型高效、低毒的抗真菌药物具有重要意义。
发明内容
本发明是要解决现有人工合成类抗真菌药物污染环境，且容易产生副产品的问题，提供一株具有抗真菌活性的工业大麻内生真菌及其应用。
本发明提供一株工业大麻内生真菌，为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)HMY01，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年8月26日，保藏编号为CCTCC NO：M20211092。
本发明尖孢镰刀菌HMY01在PDA平板培养基上菌落初白色，渐变为淡紫色，菌丝密集，絮状，基质紫色。
本发明尖孢镰刀菌HMY01为兼性厌氧菌，能够在PDA培养基上生长，最适生长温度为28℃，最适pH值自然。
本发明尖孢镰刀菌HMY01通过ITS序列比对分析，与尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)MW532981的ITS序列的相似性达到了99％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化特征和分子鉴定结果确定，本发明的工业大麻内生真菌HMY01属于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
本发明还提供尖孢镰刀菌HMY01在抑制真菌活性中的应用。
进一步的，所述真菌为白假丝酵母。
进一步的，尖孢镰刀菌HMY01对白假丝酵母的抑菌圈直径可达31.00±0.5mm。
所述尖孢镰刀菌HMY01还能够抑制单增李斯特菌。
进一步的，尖孢镰刀菌HMY01对单增李斯特菌的抑菌圈直径可达9.50±0.5。
本发明还提供尖孢镰刀菌HMY01在发酵产金丝桃苷中的应用。
本发明的有益效果：
本发明工业大麻内生真菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)HMY01，尖孢镰刀菌HMY01对单增李斯特菌和白假丝酵母均有一定的抑菌活性作用，其中对白假丝酵母抑菌效果最强，抑菌圈直径可达31.00±0.5mm。后续可以进行抗真菌活性物质的提取分离。同时本发明尖孢镰刀菌HMY01的发酵液中含有金丝桃苷。
本发明尖孢镰刀菌HMY01可作为筛选新型抗真菌药物的目的菌株进行开发利用，同时也可以作为发酵菌株，采用微生物发酵的方法生产金丝桃苷。
附图说明
图1为尖孢镰刀菌HMY01的菌落形态图；
图2为尖孢镰刀菌HMY01的菌丝形态图；
图3为尖孢镰刀菌HMY01PCR扩增得到的rDNA-ITS序列的电泳图；
图4为尖孢镰刀菌HMY01的系统发育树；
图5为尖孢镰刀菌HMY01发酵液的HPLC图谱。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：本实施例工业大麻内生真菌，为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)HMY01，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年8月26日，保藏编号为CCTCC NO：M20211092。
本实施例尖孢镰刀菌HMY01的获取方法为：
(1)材料预处理：于黑龙江省农业科学院绥化分院科技创新农场内，选取健康工业大麻(龙大麻5号)叶，冲洗干净后放置阴凉处晾干，无菌刀切成5cm小段，备用。
(2)表面消毒：用75％酒精中浸泡30s，然后置于6％NaClO中漂洗5min，接着用75％酒精浸泡30s，之后无菌水冲洗3次。确保实验操作不引入外源菌，消毒剂应适量不破坏内生菌群，尽可能多地分离出内生菌。
(3)内生菌分离：将消毒后的实验材料两端各切除1cm后，用无菌手术刀切割成0.5cm的小块，置于PDA培养基中，于28℃恒温培养箱中培养5-7d；
(4)阴性对照：取最后一次无菌水冲洗液涂布培养平板，或取适量此冲洗液倒入PDA培养基内作对照；另外在相同条件下，将消毒之后的实验材料于培养平板上滚动培养一周，作为对照。
实施例2：尖孢镰刀菌HMY01的理化特征和分子鉴定
参阅《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》，观察菌株HMY01于PDA平板培养基(28℃，7d)上菌落形状、颜色、浓密程度，基内菌丝形态及是否产色素等；同时，取HMY01 PDA平板(培养时间：2d)，将无菌盖玻片倾斜扦入该平板中，继续培养5d后，取出，镊取盖玻片，置于显微镜下观察，初步确定菌株的分类地位。
将HMY01菌种划线接种于PDA平板上培养5d，从菌落上挑取适量的菌丝，转接到50mLPDA培养基中，28℃，120r/min摇床培养4d。待菌丝长到适量时，抽滤发酵液得菌丝体，25％乙醇漂洗2次，灭菌的去离子水冲洗2次，离心去上清液，冷冻干燥，低温保存备用。
(1)取低温保存备用的菌丝体10mg置于研钵中，加液氮研磨成粉末，加1.5mL离心管中。加入200μL Buffer Digestion和2μL巯基乙醇，再加入20μL Proteinase K溶液，震荡混匀，56℃水浴1h至细胞完全裂解。
(2)加入100μL Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃放置5min。
(3)室温10,000rpm离心5min，将上清转移到1.5mL离心管中。
(4)加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀。
(5)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀。
(6)将吸附柱放入吸附管中，用移液器将溶液及半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再室温10,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
(7)将吸附柱放回收集管，加入500μL PW solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
(8)将吸附柱放回收集管，加入500μL Wash solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
(9)将吸附柱重新放回收集管，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的Washsolution。
(10)取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μL TE Buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司生产)，提取纯培养后的内生真菌HMY01菌悬液DNA(-20℃下保存)；PCR扩增，PCR反应体系见表1，反应程序见表2。通用引物ITS1和ITS4(上海生工生物工程股份有限公司合成)序列如下：
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
表1PCR反应体系
反应成分 体积
10×PCR Buffer 2.5μL
dNTP(each 10mM) 0.5μL
Taq Plus DNA Polymerase(5U/μl) 0.5μL
50mM MgSO4 2μL
引物F(10μM) 1μL
引物R(10μM) 1μL
Template(DNA) 1μL
ddH2O 16.5μL
Total 25μL
表2PCR循环条件
工业大麻内生真菌HMY01的分离结果：
从健康的工业大麻叶中分离出内生真菌HMY01，并且阴性对照中对照平板和对照液培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，从而证明所分到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。
菌种鉴定结果：
对工业大麻内生真菌HMY01菌落形态及菌丝进行形态学观察，菌落初白色，渐变为淡紫色，菌丝密集，絮状，基质紫色，结果如图1和图2所示。
提取工业大麻内生真菌HMY01 PCR扩增后，在500bp附近得到一扩增片段，结果如图3，图3中泳道1为内生真菌HMY01，泳道2为Mark。
测序结果见表3所示。
表3菌株HMY01的ITS序列
将测序结果利用BLAST分析并与GenBank中的序列进行比对，然后用MEGA7软件构建内生真菌HMY01的系统发育树，工业大麻内生真菌HMY01系统发育树的构建结果见图4。
内生真菌HMY01 DNA PCR扩增后获得1条500bp的特异性条带，将测序结果在GenBank中进行Blast同源性比对，然后用MEGA7软件构建系统发育树，内生真菌HMY01序列与尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)MW532981的相似性达到了99％。可以初步判断内生真菌HMY01属于尖孢镰刀菌。
参照《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》，结合生理生化特征和测序结果，鉴定内生真菌HMY01为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，命名为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)HMY01。
实施例3：抑菌活性实验
一、采用牛津杯法，以11株菌为供试菌，分别以100μg/mL链霉素和制霉素溶液作为阳性对照，甲醇为阴性对照，对内生真菌HMY01发酵液的抑菌活性进行研究。
11种供试菌株：金黄色葡萄球菌(StapHlococcus aureus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、粪肠球菌(Enterococcus facalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baummanii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、白假丝酵母(Candida albicans)，均购于黑龙江省微生物研究所，菌种现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室。
二、抑菌试验用培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂粉16g，水1000mL；加热至所有药品溶化后，定容至1000mL，调节pH7.0-7.2，121℃高压灭菌30min。
马铃薯培养基(PDA)：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉16g，水1000mL；马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤，再加入糖及琼脂，加热溶化后，定容至1000mL，pH自然，121℃高压灭菌30min。
三、发酵液的制备：
用接种环挑取活化的工业大麻内生真菌HMY01的菌丝，接种于含有50mL PDB培养基的三角瓶中，于28℃，120r/min摇床培养3d，制成1×107CFU/mL种子培养液。将种子培养液(1×107CFU/mL)以20％的装液量接种于装有300mL PDB培养基的锥形瓶中，于28℃120r/min摇床培养14d，抽滤，滤液加3倍体积的95％乙醇醇沉，滤去沉淀后，50℃减压浓缩至近干，用1mL甲醇溶解，作为供试品溶液备用。
四、含试验菌株平板的制作：
将活化后的10株受试细菌接于含有NA培养基的试管平面上，于37℃恒温培养24h；1株真菌接于含有PDA固体培养基的试管平面上，于28℃恒温培养3d。取培养好的试管斜面加入无菌水5mL，振荡至所有菌体混悬于无菌水中，滴一滴放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数，然后稀释到菌体浓度为1×107CFU/mL，得到菌悬液；再按每100mL培养基中加入1mL菌悬液的比例向50℃培养基中加入菌悬液，混匀后，迅速的分装到灭菌后的空平板(放入牛津杯)中，冷却，成含菌平板，备用。
五、抑菌实验：
取内生真菌HMY01发酵液、空白对照品液、阳性对照液各150μL加入到上述平板的孔径中，将含有受试细菌的平板水平放置于37℃恒温箱中培养，24h后测量抑菌圈直径；将含有受试真菌的平板水平放置于28℃恒温箱中培养，3d后测量抑菌圈直径。
抑菌活性实验结果：
以10株致病细菌和1株致病真菌为指标，对供试品溶液进行抑菌活性测定，其结果如表4。
表4工业大麻内生真菌HMY01发酵液抑菌活性结果
注：指示菌：A：大肠杆菌；B：枯草芽孢杆菌；C：金黄色葡萄球菌；D：短小芽孢杆菌；E：铜绿假单孢菌；F：单增李斯特菌；G：肺炎克雷伯菌H：鲍曼不动杆菌；I：屎肠球菌；J：粪肠球菌；K：白假丝酵母。
从表4可以看出，工业大麻内生真菌HMY01对单增李斯特菌和白假丝酵母均有一定的抑菌活性作用，其中对白假丝酵母抑菌效果最强，抑菌圈直径可达31.00±0.5mm。后续可以进行抗真菌活性物质的提取分离，并有望采用内生真菌HMY01发酵法生产抗真菌药物。
实施例4：工业大麻内生真菌HMY01的次生代谢产物分析
一、对照品溶液的制备：
称取金丝桃苷对照品用甲醇稀释溶解，制成质量浓度为0.5mg/mL对照品溶液，备用。
二、供试品溶液的制备：
挑取已活化的工业大麻内生真菌HMY01的菌丝，接种于50mL PDB培养基中，于28℃，120r/min摇床培养3d，制成1×107CFU/mL种子培养液。将种子培养液(1×107CFU/mL)以2％(v/v)的装液量接种于装有300mL PDB培养基的锥形瓶中，于28℃120r/min摇床培养14d，抽滤，50℃减压浓缩至近干，用1mL甲醇溶解，作为供试品溶液备用。
三、空白对照品溶液的制备：
取PDB培养液同“供试品溶液制备”操作后，作为空白对照品液。
色谱条件：
色谱柱：Venusil XBP-C18柱(柱4.6mm×250mm，5μm，USA)；
流动相：乙腈-水(40:60)；
流速：1mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：254nm；
进样量：10μL。
四、工业大麻内生真菌HMY01次生代谢产物分析结果
工业大麻内生真菌HMY01发酵液次生代谢产物HPLC分析结果见图5，图5中A表示PDB空白样品，B表示金丝桃苷标准品，C表示内生真菌HMY01发酵液样品。
从图5可以看出，在工业大麻内生真菌HMY01发酵液中含有金丝桃苷，阴性对照无干扰，说明工业大麻内生真菌HMY01为金丝桃苷产生菌。
上述研究说明工业大麻内生真菌HMY01可作为筛选新型抗真菌药物的目的菌株进行开发利用，同时也可以作为发酵菌株，本发明为采用微生物发酵的方法生产金丝桃苷奠定了基础。

Claims (4)

1.一株具有抗真菌活性的工业大麻内生真菌，其特征在于该内生真菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) HMY01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年8月26日，保藏编号为CCTCC NO：M20211092。
2.如权利要求1所述的工业大麻内生真菌在制备抑制真菌活性的发酵液中的应用；所述真菌为白假丝酵母。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述发酵液对白假丝酵母的抑菌圈直径可达31.00±0.5mm。
4.如权利要求1所述的工业大麻内生真菌在发酵产金丝桃苷中的应用。
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