CN117204433B - 化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的应用及制备方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体公开了化合物1‑甲基‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸的应用及制备方法，本发明首次发现所述化合物1‑甲基‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸具有高效的植物免疫诱抗活性，不仅能够提高作物抗干旱胁迫、提高作物对植物病毒的抗性、促进植物生长、促进作物产量增加、促进番茄对根结线虫的抗性，还可促进植物对营养元素的吸收，与营养元素共用提高营养元素的利用率，具有极大的应用潜力；本发明首次从多脂鳞伞菌（Pholiota adiposa）YX1发酵后菌丝体的乙醇提取物中获得化合物1‑甲基‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑羧酸，所述方法相对于化学合成法，具有简便、高效、绿色、安全、成本低等优点，并且具有高效的植物免疫诱抗活性，具有极大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的应用及制备方法。
背景技术
植物在生长过程中很容易遇到各种病原微生物、害虫、杂草等生物胁迫和干旱、盐碱、贫瘠等非生物胁迫，导致农作物的减产甚至绝收。因此，为了保证目标作物的正常生长并提高产量，在其生长过程中施用农药是必不可少的。传统的化学农药基本都是以病原菌为靶标，使用能快速全面杀死靶标的化合物作为农药的主要成分，虽然快速有效，但是大量盲目使用不仅会使病虫害产生抗药性，而且对人畜的毒性大，对生态环境产生严重影响。随着人们对食品安全和环境问题的重视，世界各国对传统农药使用的管控力度逐渐加大，亟需开发绿色、高效、安全的新型农药迫在眉睫。
植物免疫诱抗剂也叫植物疫苗，与动物疫苗类似，可以通过诱导植物免疫系统启动来提高植物的抗逆能力，增加作物产量，是一种新型生物农药。植物免疫诱抗剂相比于传统农药具有多种优点：使用浓度低、作用范围广、效果显著、环境友好、无毒无残留，且不会使病虫害产生抗药性，因此成为研究新型农药的一个重要方向。目前植物免疫诱抗剂的研发和使用还处于早期阶段，已有的免疫诱抗剂产品存在效果差、用量大、成本高等问题，严重限制了其推广和应用。
现有技术中1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸大都通过化学合成，合成过程复杂，且目前对齐的研究主要集中于抗肿瘤、抑制单酰胺氧化酶和杀寄生虫活性等方面，对于其在植物免疫方面的研究很少。
多脂鳞伞菌属球盖菇科、鳞伞属真菌，其富含蛋白质、矿物质及纤维素，味道十分鲜美，晒干后呈金黄色，具有浓郁的菇香，风味独特、独具一格；多脂鳞伞多糖可预防葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌和结核杆菌感染。专利CN113637594B《一种多脂鳞伞菌YX1、培养方法及其应用》公开了从泰山野生森林中采集，经分离纯化培养得到多脂鳞伞菌（Pholiotaadiposa）YX1菌株，保藏号为CGMCCNO.21077；并公开了所述菌株作为保健产品、调味品、饲料添加物及作物底肥的应用，但是该专利没有对所述菌株进行深入研究。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于，提供化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的应用及制备方法，所述化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸从多脂鳞伞菌YX1中分离纯化得到，所述多脂鳞伞菌（Pholiotaadiposa）YX1已于2020年12月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC NO.21077。
为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面在于，提供化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸作为植物免疫诱抗剂的应用。
具体地，所述化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸作为植物免疫诱抗剂的使用浓度为5ng/mL以上。
具体地，所述化合物在提高作物抗干旱胁迫中的应用。
具体地，所述化合物在干旱胁迫下促进种子萌发、促进植物生长、促进作物产量增加的应用。
具体地，所述化合物在抗干旱胁迫时的使用浓度为5~20ng/ml。
具体地，所述化合物在抗植物病毒中的应用。
具体地，所述植物病毒包括烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、水稻矮缩病毒、甘薯羽状斑驳病毒、马铃薯卷叶病毒、虾白斑病病毒等。
进一步地，所述化合物在抗植物病毒时的使用浓度为10~40ng/ml。
具体地，所述化合物在促进作物生长、提高作物产量中的应用。
具体地，所述化合物在促进作物生长、提高作物产量时的使用浓度为5~20ng/ml。
具体地，所述化合物在促进番茄对南方根结线虫的抗性中的应用。
具体地，所述化合物在促进番茄对南方根结线虫的抗性时的使用浓度为5~20ng/ml。
具体地，所述化合物在促进植物对营养元素的吸收中的应用。
具体地，所述化合物在促进植物对营养元素吸收时的使用浓度为10ng/ml。
优选地，所述营养元素包括但不限于氮、磷或钾。
一种组合物，包括化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸。
本发明的另一方面在于，提供从多脂鳞伞菌YX1中提取化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的方法，其具体制备过程如下：
（1）将所述多脂鳞伞菌YX1依次经活化、扩大培养、发酵培养得发酵液；
（2）将发酵液离心分离，得发酵菌丝体；
（3）洗涤步骤（2）得到的菌丝体，然后烘干、称重、粉碎，粉碎后的菌体与乙醇混合，超声处理、过滤，收集滤液为提取液；
（4）将提取液冻干后，溶于水配制成溶液，使用大孔树脂吸附，并用乙醇洗脱树脂吸附物；
（5）使用80%乙腈分离吸附物，收集上清液；
（6）将上清液经HPLC分离得化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸。
优选地，步骤（1）中多脂鳞伞菌YX1的活化步骤为：将多脂鳞伞菌YX1接种于倒有加富PDA培养基的平板上，于24℃恒温培养箱中培养6天；扩大培养具体为：从加富PDA培养基上挖取菌块于100mL的加富PDB培养基中，于振荡培养箱中24℃、160 r/min培养5天。
优选地，所述加富PDA培养基包括：马铃薯150~250g，葡萄糖15~20g，酵母膏10~20克/升、硫酸镁1~3克/升、磷酸二氢钾1~3g，VC0.3~0.5mg、琼脂15~20g，水1000 ml；pH调整到5.5~6.5附近，灭菌。
优选地，步骤（1）中发酵培养具体为：将3L的加富PDB液体培养基灌装于5L发酵罐中，121℃、30min灭菌，冷却后将100mL扩大培养的菌液接种到发酵罐中，发酵温度24℃，发酵过程中使用1M盐酸和28%氨水维持pH稳定在6.8~7.2左右，溶氧量为30%，培养5天得到发酵液。
优选地，所述加富PDB液体培养基包括：马铃薯150~200g/L、葡萄糖15~25g/L、硫酸镁0.5~1.5g/L、蛋白胨8~15g/L、酵母浸粉5~15g/L，其余加纯水，pH5.5~6.5；该培养基内营养物质极其丰富，使得菌丝生长旺盛，更容易形成菌丝球。
优选地，步骤（3）中，粉碎后菌丝体与乙醇的质量体积比为1g:1mL，所述乙醇的体积分数为80%。
优选地，步骤（4）中，所述乙醇的体积分数为20%。
优选地，步骤（5）中乙腈的体积分数为80%。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次从多脂鳞伞菌YX1中提取出化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸，所述提取过程具有简便、高效、绿色、安全、成本低等优点，且利用本申请所述方法分离出的化合物纯度高；
本发明首次发现所述化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸具有高效的植物免疫诱抗活性，不仅能够提高作物抗干旱胁迫、提高作物对植物病毒的抗性、促进植物生长、促进作物产量增加、促进番茄对根结线虫的抗性，还可促进植物对营养元素的吸收，与营养元素共用提高营养元素的利用率，具有极大的应用潜力。
【附图说明】
图1为样品D分离得到终产物E的HPLC图；
图2为制备得的终产物E的质谱图；
图3为制备得的终产物E的核磁共振氢谱图；
图4为制备得的终产物E的核磁共振碳谱图。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的限制，应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
以下实施例用到的各培养基的成分如下：
加富PDA培养基：马铃薯150~250g，葡萄糖15~20g，酵母膏10~20克/升、硫酸镁1~3克/升、磷酸二氢钾1~3g，VC0.3~0.5mg、琼脂15~20g，水1000ml；pH调整到5.5~6.5附近，121℃灭菌30min。
加富PDB液体培养基：马铃薯150~200g/L、葡萄糖15~25g/L、硫酸镁0.5~1.5g/L、蛋白胨8~15g/L、酵母浸粉5~15g/L，其余加纯水，pH5.5~6.5，121℃灭菌30min。
实施例1多脂鳞伞菌YX1发酵液的制备
（1）多脂鳞伞菌YX1一级活化：将多脂鳞伞菌YX1菌种接种于倒有加富PDA培养基的平板上，于24℃恒温培养箱中培养6天，其中加富PDA培养基使用量为20mL；
（2）多脂鳞伞菌YX1的扩大培养：从加富PDA培养基上取菌块接种于100mL的加富PDB培养基中，于振荡培养箱中24℃、160r/min培养5天；
（3）多脂鳞伞菌YX1的发酵培养：将3L的加富PDB液体培养基灌装于5L发酵罐中，121℃、30min灭菌，冷却后将100mL扩大培养的菌液接种到发酵罐中，发酵温度24℃，发酵过程中使用1M盐酸和28%氨水维持pH稳定在6.8~7.2左右，调整搅拌速度使溶氧量维持在30%，培养5天得到发酵液。
实施例2 化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的分离
（1）将实施例1中制得的发酵液使用连续流离心机离心，工作温度为4℃，转速为8000rpm，离心时长30min，收集离心沉淀即为菌丝体；
（2）将（1）中菌丝体使用100mL的Buffer A缓冲液重悬菌丝体，重悬液中无明显菌块时使用离心机离心分离，工作温度为4℃，转速为8000rpm，离心时长30min，收集离心沉淀为洗涤后的菌丝体，重复洗涤三次；
（3）将洗涤后的菌丝体收集于烧杯中，放置在50℃烘箱中烘干并称重；
（4）将（3）中菌丝体经高速粉碎机粉碎，轴转速为3000r/min，粉碎细度为200目，将粉碎后的菌体粉末用60目筛网过滤，过滤后的菌体粉末与同质量体积比1g：1mL的80%乙醇混合，使用玻璃棒搅拌均匀，超声波震荡1h，超声功率为75%，超声频率为工作4s静止8s，破碎后的菌液使用0.22 μmPVDF滤膜真空抽滤，收集滤液，即为提取液，将提取液冻干为冻干粉；
（5）XAD16大孔吸附树脂的预处理：使用等体积的500mL 1M的HCl溶液浸泡树脂12h，使用G3砂芯漏斗将树脂与酸分离，并用三蒸水将树脂洗至中性；再使用等体积的500mL2%的NaOH对树脂进行相同的处理，洗至中性后待用；
（6）取（4）中粉剂50 g溶解于5 L三蒸水中，配成10mg/ml的溶液，向其中加入500g预处理后的XAD16大孔吸附树脂，然后置于恒温振荡器中，30℃、100rpm过夜孵育12h；使用G3砂芯漏斗将树脂与溶液分离，将树脂放置于层析柱中，用2.5L三蒸水以1mL/min恒速冲洗树脂后，再用2.5L的20%乙醇以1mL/min流速洗脱树脂，收集洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩后得到干样A，称重定量；
（7）取（6）中分离的干样A溶于80%乙腈溶液中，配成10mg/mL的溶液，室温下振荡孵育3h，8000rpm离心分离上清与沉淀，将上清液冻干得到干样B，称重定量，后续重新溶解于80%甲醇进行液相分析；
（8）将（7）中的样品B通过岛津的高效液相色谱仪进行分离，色谱柱为SephadexLH-20凝胶柱（Φ16×1000mm，甲醇中粒径为103μm），使用甲醇-水体系进行洗脱，流速为1.5ml/min，紫外检测波长为210nm，梯度变化为：0~10min 80%甲醇，10~150min 80%甲醇→100%甲醇，150~430min 100%甲醇；将0.9g样品溶解在4ml 80%甲醇中进样检测，收集84~102min洗脱产物，冻干后得到样品C，后续重新溶解于三蒸水进行液相分析；
（9）将（8）中的样品C再次通过岛津的高效液相色谱仪进行分离，色谱柱为Sephadex LH-20凝胶柱（Φ16×1000mm，甲醇中粒径为103μm），使用甲醇-水体系进行洗脱，流速为1ml/min，紫外检测波长为210nm，梯度变化为：0~200min 纯水→100%甲醇，200~600min 100%甲醇；将120mg样品溶解在2ml 纯水中进样检测，收集215~245min洗脱产物，冻干后得到样品D，后续重新溶解于95%乙腈水中进行液相分析；
（10）将（9）中的样品D通过岛津的高效液相色谱仪进行分离，色谱柱为VenusilHILIC柱（4.6×250mm，5μm），使用乙腈-水体系进行洗脱，流速为1ml/min，紫外检测波长为280nm，梯度变化为：0~30min 95%乙腈→60%乙腈；将500μg样品溶解在300μl 95%乙腈水中进样检测，收集17.5~19.0min洗脱产物，冻干后得到终产物E，待后续置换氘代试剂进行质谱与核磁分析。
实施例3 化合物的结构鉴定
（1）将实施例2中的终产物E溶解于甲醇，配置成10μg/mL的溶液，使用德国布鲁克公司的四极杆飞行时间高分辨质谱仪（分辨率为40000）分析终产物E，电离源为ESI源，得如图2所示的质谱图，通过图2可知m/z 231.1133为[M+H]+准分子离子峰，通过分析确定其分子式为C13H14N2O2，该化合物的不饱和度为8；
（2）将实施例2中的终产物E溶解于500 μl的CD3OD，使用安捷伦的核磁共振波谱仪（磁体强度为14.09 T，54mm室温腔，磁场漂移为10Hz/h）分析终产物E，磁场强度为600 MHz，通过核磁氢谱图（图3）及核磁碳谱图（图4）对终产物E进行结构分析：1H-NMR (600 MHz,CD3OD) δH（ppm）：δ 7.48 (d, J = 7.7 Hz, 1H,H-9), 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 1H,H-12),7.13 (t, J = 7.6 Hz, 1H,H-11), 7.04 (t, J = 7.5 Hz, 1H,H-10), 4.70 (q, J =7.1 Hz, 1H,H-6), 3.96 (dd, J = 12.2, 5.0 Hz, 1H,H-2), 3.44 (dd, J = 16.3, 5.0Hz, 1H,H-3b), 3.02 (t, 1H,H-3a), 1.74 (d, J = 6.7 Hz, 3H,H-7)。确定该化合物为1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸（C13H14N2O2）。13C-NMR（600MHz，CD3OD）δC（ppm）：δ172.2（C-1），137.1（C-5），129.9（C-13），126.0（C-8），121.9（C-11），119.1（C-10），117.7（C-9），110.8（C-12），105.4（C-4），58.3（C-2），49.7（C-6），22.9（C-3），15.7（C-7）；
（3）最后确定化合物E为1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸，其结构式为：
。
实施例4 化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸提高作物抗干旱胁迫
1、促进小麦种子在干旱胁迫下的萌发特性
（1）PEG6000干旱胁迫浓度筛选
设置PEG6000七个浓度梯度，分别为0、50、100、150、200、250、300g/L，分别选取大小均匀一致饱满的小麦种子（济麦22），消毒回干后浸种20h。在培养皿中垫2层无菌滤纸，每皿添加5 ml不同浓度PEG6000溶液，每天更换滤纸并重新添加5ml溶液；每处理重复3次，每重复40粒浸种后种子。培养温度条件为23℃(16/8h)，避光培养。自种子发芽当日起，每天定时统计种子发芽总数及每日新萌发种子的数量，培养至第7d，测定各项指标，最终确定PEG6000溶液的试验浓度为20%。
（2）不同处理对干旱胁迫下种子萌发的影响
分别设CK0、CK1、咔啉羧酸-5（5ng/mL）咔啉羧酸-10（10ng/mL）和咔啉羧酸-20（20ng/mL），其中CK0和CK1用清水浸种处理，咔啉羧酸组用化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸（下称咔啉羧酸）浸种处理。20h后，分别用清水和20% PEG6000溶液处理种子，方法同上，每皿40粒种子，重复三次；每天定时统计发芽种子总数及每日新萌发种子的数量，7d后，每皿取10颗幼苗测定根长、芽长，并按照下式分别计算各指标：
发芽率=7d内萌发的种子数/种子总数
发芽势=3d内萌发的种子数/种子总数
发芽指数=∑逐日萌发数/相应的发芽天数
幼苗活性指数=发芽指数×7d时芽长
萌发抗旱指数=处理的萌发指数/对照萌发指数；
活力抗旱指数=处理的活力指数/对照的活力指数；
（3）数据统计与分析
不同处理组小麦种子萌发情况如表1所示；
表1 干旱胁迫下不同处理小麦种子萌发指标
由表1可知，咔啉羧酸浸种能缓解PEG6000模拟的干旱胁迫对小麦种子萌发及生长的影响，使用5~20ng/mL的咔啉羧酸浸种后小麦抗干旱胁迫能力均有所提高，其中咔啉羧酸使用浓度为10ng/mL时效果最好。
2、促进水稻种子在干旱胁迫下的萌发特性
（1）PEG6000干旱胁迫浓度筛选
设置PEG6000七个浓度梯度，分别为0、50、100、150、200、250、300g/L，分别选取大小均匀一致饱满的水稻种子（广两优籼稻），消毒回干后浸种20h。在培养皿中垫2层无菌滤纸，每皿添加5ml不同浓度PEG6000溶液，每天更换滤纸并重新添加5ml溶液；每处理重复3次，每重复40粒浸种后种子，培养温度条件为23℃(16/8h)，避光培养；自种子发芽当日起，每天定时统计种子发芽总数及每日新萌发种子的数量，培养至第7 d，测定各项指标，最终确定PEG6000溶液的试验浓度为15%。
（2）试验设计
分别设CK0、CK1、咔啉羧酸-5（5ng/mL）咔啉羧酸-10（10ng/mL）和咔啉羧酸-20（20ng/mL），其中CK0组为正常处理对照，CK1为干旱处理对照，均用清水浸种，咔啉羧酸组用各对应浓度的咔啉羧酸浸种。之后分别用清水与15% PEG6000溶液处理水稻种子，放在24℃恒温气候室中暗处培养，每天记录发芽数；每培养皿40粒种子，每处理设3个重复，7d后取样，测量根长、芽长等指标。
其中：发芽率=7d内萌发的种子数/种子总数
发芽势=3d内萌发的种子数/种子总数
发芽指数=∑逐日萌发数/相应的发芽天数
活性指数=发芽指数×7d时芽长。
（3）结果统计与数据分析
不同处理组水稻种子萌发情况如表2所示：
表2 不同处理组水稻种子萌发情况
由表2可知，干旱胁迫下水稻种子萌发及生长受到明显抑制，CK1各项指标均显著降低，与CK1相比，咔啉羧酸处理组水稻的各项指标均有了显著提高；当咔啉羧酸使用浓度为10ng/mL时，效果最佳。
3、促进生菜在干旱胁迫条件下生长
（1）试验设计
土壤过筛，高温灭菌，土壤与基质按照3:1混合均匀备用；
将营养基质与珍珠岩充分混匀，加水湿润后装入育苗盘，表面铺平，点入生菜种子，播种深度0.5cm；于温度23℃，湿度50%-60%，光照6000-7000lux培养室内培养，长至两叶一心期，选择长势均匀一致的幼苗进行移栽；每盆移栽1棵生菜，7天后进行试验处理；
分别设正常水分处理（CK0）、干旱处理（CK1）、干旱+5ng/mL 咔啉羧酸（咔啉羧酸-5）、干旱+10ng/mL 咔啉羧酸（咔啉羧酸-10）、干旱+15ng/mL咔啉羧酸（咔啉羧酸-15）、干旱+20ng/mL咔啉羧酸（咔啉羧酸-20），每处理重复6盆，每盆浇灌50mL处理液，7天后浇灌第二次处理液。期间根据土壤水分速测仪测定的土壤含水率定期补充水分（其中，正常水分处理土壤含水量18-20%（饱墒），干旱处理含水量12-15%（黄墒））；培养期间定期观察记录，40天后收获测定生菜各项生长指标。
（2）数据统计与结果分析
不同处理组，生菜生长情况如表3所示；
表3 不同处理组对干旱胁迫下生菜生长指标的影响
由表3可知，干旱胁迫下，不同浓度咔啉羧酸处理组的生菜生长情况与CK1相比均有不同程度的提升，可见，浇灌咔啉羧酸可以缓解干旱胁迫对生菜的伤害，提高生菜叶片含水量，促进生菜地上部生长及产量增加；其中，咔啉羧酸使用浓度为10ng/mL和15ng/mL时效果最明显。
实施例5 化合物与肥料配施对干旱胁迫下生菜生长的影响
（1）试验设计
土壤过筛，高温灭菌，土壤与基质按照3:1混合均匀备用。生菜点种育苗，长至两叶一心后挑选长势一致的幼苗进行移栽，花盆规格为长*宽*高=10*10*7cm3；每盆移栽1棵生菜，每4盆放入一个托盘为一个处理，缓苗3天后进行试验处理。
分别设CK组、S组、咔啉羧酸组和S+咔啉羧酸组，其中CK组为空白对照；S组：硫酸铵（0.6g）冲施处理；咔啉羧酸组：咔啉羧酸（10ng/mL）；S+咔啉羧酸组：硫酸铵（0.6g）+咔啉羧酸（10ng/mL）（将硫酸铵溶解后与咔啉羧酸混合一起浇灌），每处理重复4次；施用体积为50mL/盆，CK组浇灌等量清水。
盆栽置于人工气候室内培养，温度23℃，光照强度6000lux，正常浇水一周后停止浇水，模拟自然干旱，期间每天观察生菜生长情况，定期拍照记录，测定指标。
（2）数据统计与结果分析
培养30天后，测量统计生菜根长、叶长、叶宽；收获后测量叶片饱和鲜重、叶片鲜重、干重，按下式计算生菜相对含水量；
生菜形态指标及鲜重、含水量如表4所示；
表4不同处理组对干旱胁迫下生菜形态指标的影响
由表4可知，干旱条件下，硫酸铵复配咔啉羧酸冲施与单独施用硫酸铵、咔啉羧酸相比，生菜各项指标均有不同程度的提高，硫酸铵与咔啉羧酸配合使用具有显著增效作用，说明咔啉羧酸能够有效提高植物对营养元素的吸收，提高营养元素的利用率。
实施例6 化合物提高烟草抗烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒效果
（1）烟草育苗：将三生烟在穴盘内育苗，烟苗长到3～4片叶时移栽至大花盆中放至人工气候室中继续培养；
（2）施药及接种方法：
分别设CK组、咔啉羧酸-10（10ng/mL）、咔啉羧酸-20（20ng/mL）、咔啉羧酸-30（30ng/mL）和咔啉羧酸-40（40ng/mL）；
在烟草长至6片真叶时喷施不同浓度的咔啉羧酸，CK喷施清水，每盆约用10ml的溶液量进行喷湿；每处理设三次重复，每个重复十株烟草，分别于喷后2 h用摩擦接种的方法接种烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯Y病毒（PVY），接种后第5天开始调查病情，每2d调查一次，记录发病情况，分级标准按中华人民共和国行业标准《烟草病虫害分级及调查方法》（GB/T 23222－2008）进行，最后将调查结果进行统计分析，计算病情指数和诱抗效果：
病情指数＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高病级数)×100；
诱抗效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％。
（3）病情分级方法：
以全株为单位分级调查，
0级：全株无病；
1级：心叶脉明或轻微花叶，病株无明显矮化；
3级：三分之一叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的四分之三以上；
5级：三分之一至二分之一叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高的三分之二至四分之三；
7级：二分之一至三分之二叶片花叶，或变形或主脉坏死，或病株矮化为正常株高的二分之一至三分之二；
9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的二分之一以上。
（4）结果调查与分析
接种TMV 、CMV、PVY21天后，烟草植株的病情指数及诱抗效果如表5~7所示：
表5接种TMV后21天烟草病情指数和诱抗效果
表6 接种CMV后21天烟草病情指数和诱抗效果
表7接种PVY后21天烟草病情指数和诱抗效果
由表5~7可知，无论是接种TMV病毒、CMV病毒还是PVY病毒的烟草植株，喷施咔啉羧酸后，病情指数均有明显降低，且与CK组相比差异极显著，说明喷施咔啉羧酸可提升烟草植株对TMV、CMV、PVY病毒的抗性，其中咔啉羧酸使用浓度为30ng/mL时，效果最显著。
实施例7化合物提高烟草马铃薯X病毒（PVX）的效果
（1）在人工气候室内按常规的育苗方法进行本生烟烟草育苗，待烟草长至3~4叶期进行移栽。
（2）接种及施药方法：
分别设CK组、咔啉羧酸-10（10ng/mL）、咔啉羧酸-20（20ng/mL）、咔啉羧酸-30（30ng/mL）和咔啉羧酸-40（40ng/mL）；
在小花盆内待烟草长至4-8叶后，选取长势一致的烟草分别用不同浓度的咔啉羧酸处理，用量为10 mL/盆，喷施于烟草叶片上，每个处理喷施五棵烟草，用清水喷施作为对照，每种处理重复3次，注意每个叶片均匀喷施，处理两小时后用摩擦接种的方法接种烟草系统叶下方的三片真叶，取50μL病毒溶液用600目石英砂于每片真叶正面轻柔摩擦接种，接种的病毒为含有GFP标签标记的马铃薯X病毒（PVX），接种后放至人工气候室内培养5 d；
（3）病毒含量计算：接种5 d后，将烟草放于长波紫外灯下观察不同药剂处理组的荧光情况，并将发病的系统叶片取下，用锡纸做好标记迅速放入液氮中速冻，待全部处理取完样后放入-80 ℃冰箱长期保存待用，采用酶联免疫吸附测定带毒系统叶的病毒含量，根据酶联检测数据进行诱抗效果计算，诱抗效果＝(对照OD450－处理OD450)/对照OD450×100%。
（4）结果分析
接种PVX病毒5天后，烟草植株的病毒表达量和诱抗效果如表8所示：
表8 接种PVX病毒5d后烟草病毒表达量和诱抗效果
由表8可知，接种PVX病毒的烟草植株，喷施咔啉羧酸后，病毒含量均有明显降低，且与CK组相比差异极显著，说明喷施咔啉羧酸可提升烟草植株对PVX病毒的抗性，其中咔啉羧酸使用浓度为30ng/mL时，效果最显著。
此外，按照上述方法依次验证了所述化合物对水稻矮缩病毒、甘薯羽状斑驳病毒、马铃薯卷叶病毒、虾白斑病病毒等病毒的抗性，试验结果显示，所述化合物对上述病毒均有一定抗性，在此不再展开描述。
实施例8 化合物的促生、增产效果
（1）试验设计
种子消毒：将适量的拟南芥种子用无菌水浸泡1min，先用5%的次氯酸钠消毒5min，充分震荡，用清水清洗3次，再用75%的乙醇消毒1min，用无菌水清洗3-5次，避光，放入4 ℃冰箱中春化2d。
蛭石处理：蛭石灭菌，充分混匀，蛭石装入花盆，表面平整，放入白色托盘中，每托盘放置十盆，托盘底部缓慢加入营养液至花盆内蛭石表面湿润（约2-3 h）。每个花盆中点16粒拟南芥种子，置于温度23℃，湿度50%-60%，光照6000-7000lux培养室内培养，覆膜生长至莲座叶4片揭膜，间苗，每盆保留5棵大小一致的拟南芥；间苗后每周每托盘浇500mL 5mM的N营养液（KNO3培养基），成分如表9所示；培养20d后每周随500mLN营养液灌施不同浓度的咔啉羧酸（2ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL），以清水为对照，期间每天观察植株生长状况。
表9KNO3培养基成分表（5mM）
表9中微量元素的成分如下表所示；
表10 微量元素（500×）成分表
其中，FeNa2EDTA溶液配置方法：
1）称取Na2EDTA 3.73g，加超纯水于烧杯中；
2）加热，使烧杯中Na2EDTA完全溶解；
3）称取2.78g FeSO4·7H2O至烧杯中，继续加热溶解10~15分钟至溶液变为浅茶色；
4）取出烧杯，冷却至室温，定容至500mL，4℃保存。
（2）结果统计与数据分析
在莲座叶期，抽薹期，开花期，果荚期，拍照并统计莲座直径，抽薹数量，抽薹高度和果荚个数，每个处理随机选取5株统计总产量，结果如表11所示；
表11 咔啉羧酸处理对拟南芥生长及产量的影响
由表11可知，不同浓度咔啉羧酸处理与对照相比，拟南芥的叶盘直径、抽薹高度和果荚质量均有不同程度提升，说明咔啉羧酸可促进植物生长，提高作物产量，其中咔啉羧酸使用浓度为5ng/mL时，其效果最显著。
实施例 9化合物促进番茄对南方根结线虫的抗性
（1）试验设计
基质灭菌，加水充分混匀，装入育苗盘，表面铺平，点入番茄种子，每穴孔点种1颗，播种深度0.5cm；放于温度23℃，湿度50%-60%，光照6000-7000lux，16/8 h人工气候室内培养，期间定期浇水，待长至两叶一心期选择长势均匀一致的幼苗移栽至小花盆中。移栽的试验土壤取自山东省泰安市岱岳区大汶口镇东大吴村（117°8'21" E, 35°59'7" N）常年发生根结线虫病的日光温室，田间取土样过筛（2.5mm），除去大颗粒物，过筛后土壤与基质混合均匀（比例约2:1），装盆，移入番茄植株。移栽后缓苗3天进行试验处理，试验设清水CK和咔啉羧酸-5（5ng/mL）咔啉羧酸-10（10ng/mL）、咔啉羧酸-20（20ng/mL）4个处理，每盆灌施200mL处理液，试验每7天处理一次（灌施），每个处理设5盆重复。
（2）结果统计与数据处理
将番茄根部取出，流动水冲洗干净，吸水纸吸干根系表面的水分，天平测定地下部分根重，并将番茄根系置于解剖镜下进行观察计录根结数，具有明显分界记为一个根结，具体结果如表12所示；
表12番茄根重与根结数
由表12可知，咔啉羧酸处理组番茄在灌施条件下的根重明显高于CK，且差异显著；单株根结数及每克根结数与CK相比明显减少，可见，灌施咔啉羧酸可以提高番茄根重并降低番茄根结数量，其中咔啉羧酸使用浓度为10ng/mL时，效果最显著。
（3）病情指数及防治效果测定：根据根结发生情况进行防治效果统计；其中根结分级标准：0级，无根结；1级，0-10%根结；2级，11-20%根结；3级，21-30%根结；4级，31-40%根结；5级，41-50%根结；6级，51-60%根结；7级，61-70%根结；8级，71-80%根结；9级，81-90%根结；10级，91-100%根结；
病情指数=Ʃ（病株数×对应根结级数）/（总株数×最高根结级数）× 100
防治效果（%）= [（对照组的病情指数-处理组的病情指数）/ 对照组的病情指数]× 100
表13番茄植株的病情指数及防治效果
由表13可知，咔啉羧酸10ng/mL灌施处理时，根结线虫病的病情指数为28.00，对线虫的防治效果可达61.11%，说明咔啉羧酸可以有效提高番茄对根结线虫的抵抗能力。
综上所述，所述化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸具有抗旱、抗病毒、促进植物对营养元素的吸收、促生、增产、抗根结线虫病等作用，可将其开发成植物免疫诱抗剂。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (7)
1.化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸作为植物免疫诱抗剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物的使用浓度为5ng/mL以上。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物在提高作物抗干旱胁迫中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物在抗植物病毒中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物在促进作物生长或促进作物增产中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物在促进番茄对根结线虫的抗性中的应用。
7.从多脂鳞伞菌YX1中提取化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将所述多脂鳞伞菌YX1依次经活化、扩大培养、发酵培养得发酵液；
(2)将发酵液离心分离，得发酵菌丝体；
(3)洗涤步骤(2)得到的菌丝体，然后烘干、称重、粉碎，粉碎后的菌体与乙醇混合，超声处理、过滤，收集滤液为提取液；
(4)将提取液冻干后，溶于水配制成溶液，使用预处理后的XAD16大孔树脂吸附，并用20％乙醇洗脱树脂吸附物；
所述XAD16大孔吸附树脂的预处理：使用等体积的500mL 1M的HCl溶液浸泡树脂12h，使用G3砂芯漏斗将树脂与酸分离，并用三蒸水将树脂洗至中性；再使用等体积的500mL 2％的NaOH对树脂进行相同的处理，洗至中性后待用；
(5)使用80％乙腈分离吸附物，收集上清液；
(6)将上清液经HPLC分离得化合物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸；
将上清液通过岛津的高效液相色谱仪进行分离，色谱柱为Sephadex LH-20凝胶柱Φ16×1000mm，甲醇中粒径为103μm，使用甲醇-水体系进行洗脱，流速为1.5ml/min，紫外检测波长为210nm，梯度变化为：0～10min 80％甲醇，10～150min 80％甲醇→100％甲醇，150～430min 100％甲醇；将样品溶解在80％甲醇中进样检测，收集84～102min洗脱产物，冻干后得到样品C，后续重新溶解于三蒸水进行液相分析；
将样品C再次通过岛津的高效液相色谱仪进行分离，色谱柱为Sephadex LH-20凝胶柱Φ16×1000mm，甲醇中粒径为103μm，使用甲醇-水体系进行洗脱，流速为1ml/min，紫外检测波长为210nm，梯度变化为：0～200min纯水→100％甲醇，200～600min 100％甲醇；将120mg样品溶解在2ml纯水中进样检测，收集215～245min洗脱产物，冻干后得到样品D，后续重新溶解于95％乙腈水中进行液相分析；
将样品D通过岛津的高效液相色谱仪进行分离，色谱柱为Venusil HILIC柱4.6×250mm，5μm，使用乙腈-水体系进行洗脱，流速为1ml/min，紫外检测波长为280nm，梯度变化为：0～30min 95％乙腈→60％乙腈；将样品溶解在95％乙腈水中进样检测，收集17.5～19.0min洗脱产物，冻干后得到终产物1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸。
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| GR01 | Patent grant | ||
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