CN109988736B

CN109988736B - 一株松树内生细菌fbs135及其应用

Info

Publication number: CN109988736B
Application number: CN201910419969.5A
Authority: CN
Inventors: 樊奔; 陆一鸣; 宋忠文
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-05-20
Filing date: 2019-05-20
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2039-05-20
Also published as: CN109988736A

Abstract

本发明涉及一种松树内生细菌FBS135，其为Pantoea eucalypti属，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019198，保藏日期为2019年4月9日。所述松树内生细菌FBS135的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的松树内生细菌FBS135，其对松树生长有促进作用，试验数据表明，利用该菌制备的松树生长促进剂对松树幼苗的根茎叶等各项生长指标起到明显的促进作用，并且可以增加松苗的系统抗逆性，减少病原菌的侵染和在逆境下发病死亡的几率。

Description

一株松树内生细菌FBS135及其应用

技术领域

本发明涉及一种松树内生细菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

松树对贫瘠、干旱的土壤具有很强的耐受性，其往往被当作“开荒先锋”进行培育，因此可以广泛分布于世界各地。作为松科植物的一员，马尾松是中国人造林的主要种类。不仅如此，马尾松也同样具有巨大的经济价值。例如，由于其生长期较短，马尾松每年可以为造纸和木工行业提供大量木材原料；从马尾松中提取出的松香是也一种十分重要的化学原料；使用马尾松为原材料加工生产出的芳香添加剂也往往应用于化学，制药和其他各项工业生产领域中；此外，松树具有四季常青的特点，在我国园林景观领域也受到广泛的应用。

但是松树生长缓慢，同时生长过程中，还会遭受多种病害侵袭，比较为人熟知的有树苗立枯病、油松烂皮病、松针锈病和松落叶病等。其中主要是枝干病害和叶部病害，叶部病害具有危害重、分布广以及种类多等特点，其可能引发落果、落叶等危害，对松树的果实产量和木材质量带来严重影响。枝干病害虽然没有叶部病害种类多，但是危害性却较大，幼树或者幼苗如果遭遇枝干病害，可能导致其全株枯死，带来严重的经济损失。另外，由于松树在种植时常常都选择在土壤贫瘠的地区进行开荒，在这种恶劣的条件下，松树对营养的吸收会收到明显的抑制，松树生长受到各种逆境胁迫，常常会造成其病害情况增加，成活率降低等问题。

因此，设法促进松树生长，提高松树耐受逆境能力以及松树造林过程中的成活率迫在眉睫。但是长久以来，对促进松树生长的手段主要集中在加强培育措施等方面，研究较为局限，鲜见使用其他技术手段实现松树促生抗病效果的报道。

在过去的数十年中，植物内生菌方面的研究受到越来越多的关注。内生菌被定义为能够定殖在植物细胞间隙或细胞内部的所有微生物，并且对具有复杂共生关系的寄主植物有增益作用。霍尔曼等人后来提出了一个更实际的定义：从经受严格表面消毒的植物组织中分离出的微生物，如果它们对植物寄主没有任何致病性，就可以被认为是内生菌。

迄今为止，关于内生菌的研究主要集中在农作物上，而木本植物中内生菌的研究则很少。木本植物是世界森林的核心成员，探索内生菌对森林植物的影响和其与植物的相互作用机制，对于揭示地球上生态循环的内在规律和保护自然环境都非常重要，同时，挖掘内生菌的功能和实用特性，对于提高植树造林成效，提高人工林生产力，加强生态环境保护来说，亦有巨大的潜力和价值。

发明内容

本发明的目的在于解决背景技术中的不足，提供一种松树内生细菌。

技术方案

一种松树内生细菌，其命名为Pantoea eucalypti FBS135，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019198，保藏日期为2019年4月9日。

进一步，所述松树内生细菌FBS135的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的松树内生细菌FBS135是从马尾松的顶芽和松针中分离得到的，先对顶芽和松针进行严格的表面消毒，之后用无菌去离子水冲洗经过表面灭菌的组织5次，将处理过的组织放入无菌培养皿中，用高压灭菌过的刀片将其切成约2mm厚的薄切片。再将其附着在LB培养基上，并将切片轻轻刺入琼脂中，将平板放置在30℃下孵育1～5天，分离纯化出现在切片周围和下面的细菌菌落，经过形态学和分子生物学鉴定，并对其全基因组进行了测序和分析，该菌属于Pantoea eucalypti属，命名为Pantoea eucalypti FBS135。

上述松树内生细菌FBS135用于促进松树幼苗生长的应用。

一种松树生长促进剂，由上述松树内生细菌FBS135制备而成。制备方法为：将上述松树内生细菌FBS135接种到LB培养基中，30℃下培养至OD₆₀₀为1，即为松树生长促进剂。

进一步，所述LB培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。

促进剂原液可通过延长培养时间的方式，使其OD值达到较高浓度，在低温(4℃)下存放，使用时需将浓度OD₆₀₀稀释到1，即得松树生长促进剂。使用方法为林间喷洒，可使用农用直升机或大行喷洒水车进行喷洒灌溉，喷洒时间需选择在前后3天无降雨的天气条件。

本发明的有益效果：本发明提供了一种松树内生细菌FBS135，其对松树生长有促进作用，试验数据表明，该菌对松树幼苗的根茎叶等各项生长指标起到明显的促进作用，并且可以增加松苗的系统抗逆性，减少病原菌的侵染和在逆境下发病死亡的几率。

附图说明

图1为基于FBS135的16S rDNA序列构建的系统发生树；

图2为FBS135对马尾松松针长度、株高、茎直径的影响；

图3为FBS135对马尾松茎鲜重、茎干重、根鲜重、根干重的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

材料说明：LB培养基(1L)：10g Tryptone、5g Yeast extract、5g NaCl、15g Agar，按比例混合121℃灭菌备用；Ashby无氮培养基(1L)：10g Mannitol、0.2g KH₂PO₄、0.2gMgSO₄·7H₂O、0.2g NaCl、0.1g CaSO₄·2H₂O、5g CaCO₃、15g Agar，调节pH至7.0后按比例混合灭菌备用；#8无氮培养基：蔗糖20g、硫酸亚铁0.015g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾3.4g、氯化钠0.01g、钼酸钠0.005g、磷酸氢二钾12.06g、蒸馏水1000mL。

实施例1

松树内生细菌FBS135的分离鉴定：

顶芽和松针均取自南京林业大学校园内生长的马尾松，先对顶芽和松针进行严格的表面消毒(首先，用无菌水洗涤组织3分钟，然后，将组织在75％的乙醇溶液中浸泡1分钟，再将其转移到5％次氯酸钠溶液中浸泡5分钟，所有步骤均在不断摇动的状态下进行)，之后用无菌去离子水冲洗经过表面灭菌的组织5次，为了确保样品表面完全灭菌，将最后的冲洗水施加到LB琼脂上并在30℃下孵育过夜以检查是否有任何微生物的生长。将处理过的组织放入无菌培养皿中，用高压灭菌过的刀片将其切成2mm厚的薄切片，再将其附着在LB培养基上，并将切片轻轻刺入琼脂中，将平板放置在30℃下培养。

培养36小时后，在松芽的横截面以及一些针片周围出现细菌菌落。所有菌落均呈黄色，外观十分相似，这表明它们可能属于一个相同的物种。本发明人对黄色菌落进行了进一步的纯化工作，经过形态学和分子生物学鉴定，并对其全基因组进行了测序(通过Trizol法制备基因组DNA，并使用Illumina Hiseq和PacBio RS II测序仪在生物技术公司进行全基因组测序，测序完成后使用SOAP denovo(v2.04)组装测序数据，最后使用NCBI原核基因组注释管道PGAP(v4.2)完成基因组注释)，该松树内生细菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，利用16S rDNA序列构建系统发生树(见图1，使用最大似然法重复2000次建树，Bootstrap值使用百分比表示，系统发生树使用Erwinia toletana CECT 5263(T)作为外群)，结果显示与该松树内生细菌最接近的是P.eucalypti，命名为FBS135，FBS135的16SrDNA序列与P.eucalypti的序列的相似性为99.33％，FBS135的生理生化特征基本上与P.eucalypti LMG 24197的标准菌株描述一致。因此，FBS135是P.eucalypti的分离株。

FBS135是短棒状(0.6×1.5-3.0μm)的革兰氏阴性细菌，具有运动性且不产生孢子。菌落呈圆形凸起状，整体和边缘都呈现光滑形态。并且本发明人发现FBS135产生的黄色色素明显不溶于水。FBS135可以在无氮Ashby培养基和#8培养基的琼脂上生长，表明FBS135是一种固氮细菌。

实施例2

抗生素耐药性试验：

使用实验室常用的抗生素检测其对FBS135的抑制作用：氯霉素(Cm)为5μg/mL，氨苄青霉素(Amp)为100μg/mL，红霉素(Em)为5μg/mL，卡那霉素(Km)为5μg/mL，壮观霉素(Spe)为100μg/mL。将FBS135在LB培养基中培养至对数生长期，然后均匀涂布在含有上述一种抗生素的LB固体培养基上，在30℃温育过夜后，观察并记录FBS135的生长情况。

抗生素测试表明，FBS135对红霉素的抗性为5μg/mL，但对氯霉素(5μg/ml)，氨苄青霉素(100μg/ml)，卡那霉素(5μg/mL)和壮观霉素(100μg/ml)敏感。

实施例3

FBS135对马尾松幼苗的生长效应试验：

实验方法：从南京林业大学校园内北大山取土样，充份混合均匀后分别放置在直径为15cm大小的花盆中。选择30个具有相似大小和相似生长状态的一年生马尾松幼苗，剪开营养袋之后种植在上述花盆中，每颗松苗均使用于独立的花盆。将种植的幼苗随机分成3组，每组10株。使用LB培养基将FBS135在30℃下摇培至OD₆₀₀为1，制备松树生长促进剂，对于第一组(灌溉组)的10株幼苗，将30ml松树生长促进剂缓慢灌溉到围绕幼苗中心半径为3cm的土壤中；对于第二组(喷雾组)的10个幼苗，将20ml松树生长促进剂以适宜的喷洒速度轻轻地喷洒在针和茎上，以使松树生长促进剂可以快速聚集；第三组作为对照组，不作任何处理。将三组马尾松幼苗均置于温室中培养，定期观察并浇水。七个月后，取样以测定各项生长指数，包括最长的松针长度，茎鲜重，茎干重，根干重，根鲜重，株高和茎直径等，实验结果见图2和图3。

实验结果：图2为FBS135对马尾松松针长度、株高、茎直径的影响；图3为FBS135对马尾松茎鲜重、茎干重、根鲜重、根干重的影响。可以看出，灌溉组和喷雾组的数据与对照组的数据相比有统计学意义的提升(p<0.05)，这表明灌溉组和喷雾组与对照组有显著的差异性，由图2和图3可见，只有茎高这一指标在灌溉组和喷雾组和对照组之间没有显著性差异，根据整体的统计数据，可得出结论：FBS135对马尾松的生长具有显著的促进作用。然而，在喷雾处理和灌溉处理之间没有显着差异，这表明FBS135可以在根部和土壤上方发挥作用。

实施例4

FBS135对马尾松幼苗的抗逆效应试验：

试验方法：从育苗园购买一年生的松树幼苗，从中选择135个具有相似大小和相似生长状态的松树幼苗并种植在与实施例3中相同的花盆中。将实施例3中制得的松树生长促进剂均匀喷洒在75株幼苗的松针和茎上，而剩余的60株幼苗作为对照组，以与实施例3类似的方式进行种植，但在种植过程不去除营养袋，使幼苗承受营养缺乏的逆境条件。培养6个月之后，统计处理组和对照组的马尾松的存活率。结果见表1：

表1.松树幼苗的存活率。

备注：括号中的数字是理论频率。使用2×2卡方检验。

可以看出，对照组的死亡率为50％，而喷雾组的死亡率为32％，也显著低于对照组(p＝0.0039,2×2卡方检验)。表明，喷洒P.eucalypti FBS135可以提高松树幼苗对胁迫的耐受性，这可能是通过FBS135诱导了植物系统的耐受性(IST)，从而提高其存活率。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一株松树内生细菌FBS135及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1449

<212> DNA

<213> 松树内生细菌FBS135(Pantoea eucalypti FBS135)

<400> 1

catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcggac ggtagcacag 60

agagcttgct cttgggtgac gagtggcgga cgggtgagta atgtctgggg atctgcccga 120

tagaggggga taaccactgg aaacggtggc taataccgca taacgtcgca agaccaaaga 180

gggggacctt cgggcctctc actatcggat gaacccagat gggattagct agtaggcggg 240

gtaatggccc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca gccacactgg 300

aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc 360

gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt 420

cagcggggag gaaggcgatg tggttaataa ccgcatcgat tgacgttacc cgcagaagaa 480

gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga 540

attactgggc gtaaagcgca cgcaggcggt ctgttaagtc agatgtgaaa tccccgggct 600

taacctggga actgcatttg aaactggcag gcttgagtct tgtagagggg ggtagaattc 660

caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc 720

tggacaaaga ctgacgctca ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg 780

gtagtccacg ccgtaaacga tgtcgacttg gaggttgttc ccttgaggag tggcttccgg 840

agctaacgcg ttaagtcgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa 900

ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac 960

cttacctact cttgacatcc agagaacttt gcagagatgc attggtgcct tcgggaactg 1020

tgagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg 1080

caacgagcgc aacccttatc ctttgttgcc agcgcgtgat ggcgggaact caaaggagac 1140

tgccggtgat aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc ccttacgagt 1200

agggctacac acgtgctaca atggcgcata caaagagaag cgacctcgcg agagcaagcg 1260

gacctcacaa agtgcgtcgt agtccggatc ggagtctgca actcgactcc gtgaagtcgg 1320

aatcgctagt aatcgtggat cagaatgcca cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1380

ccgcccgtca caccatggga gtgggttgca aaagaagtag gtagcttaac cttcgggagg 1440

gcgcttacc 1449

Claims

1.一种松树内生细菌桉树泛菌（Pantoea eucalypti）FBS135，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019198，保藏日期为2019年4月9日。

2.权利要求1所述松树内生细菌桉树泛菌FBS135用于促进松树幼苗生长的应用。

3.一种松树生长促进剂，其特征在于，由权利要求1所述松树内生细菌桉树泛菌FBS135制备而成。

4.如权利要求3所述松树生长促进剂，其特征在于，制备方法为：将权利要求1所述松树内生细菌桉树泛菌FBS135接种到LB培养基中，30℃下培养至OD₆₀₀为1，即为松树生长促进剂。

5.如权利要求4所述松树生长促进剂，其特征在于，所述LB培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。