CN111944698A - 一种麦角甾醇过氧化物的生物发酵制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种麦角甾醇过氧化物的生物发酵制备方法，涉及生物工程技术领域。以甘油、酵母粉和蛋白胨为主要原料，通过蝉拟青霉菌体液态摇瓶培养、液体种子罐扩大培养获得含有蝉拟青霉菌丝体。利用该蝉拟青霉菌丝体通过乙醇提取、大孔树脂Amberlite XE‑243分离、C‑18柱纯化获取麦角甾醇过氧化物。经试验研究，蝉拟青霉液体发酵及其从该菌发酵液中分离纯化麦角甾醇过氧化物，该麦角甾醇过氧化物可以作为治疗肾脏肿瘤的药物，为肾癌患者提供理想的药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特指通过感染蝉形成蝉花的蝉拟青霉菌种的液体发酵技术制备麦角甾醇过氧化物的方法。
背景技术
肾细胞癌起源于肾上皮细胞。它占肾脏癌症的90％以上，占所有致命，恶性肿瘤的3％。多达30％的肾细胞癌患者出现局部复发或远处转移，目前的五年生存率不理想。尽管使用一线靶向酪氨酸激酶抑制剂(例如索拉非尼或舒尼替尼)进行肾细胞癌治疗取得了显著进展，但在肾细胞癌治疗中仍需要具有优异效果和安全性的新食品或药物。天然食品和动植物是药物开发的非常宝贵的资源，活性产品的利用是一种抗击癌症的有希望的策略。传统中草药是治疗各种流行病包括癌症的常用药物。迄今为止，在中国传统中医学理论的指导下，许多有效的抗癌配方已经从这些草药中衍生。中药蝉花(Cordycep cicadae)是一种可食用的虫生真菌，由蝉拟青霉感染的蝉若虫形成，并被广泛用于预防和治疗各种疾病。在中国，它已被用于医药和食用超过1000年，经常被推荐用于治疗肺部疾病。最近，越来越多地发现了蝉花及蝉拟青霉菌丝体的抗肿瘤作用，例如妇科癌细胞中的抗增殖和促凋亡特性。麦角甾醇过氧化物是蝉拟青霉的主要活性成分之一(分子式：C28H44O·C6H12O7)。麦角甾醇过氧化物可以从蝉花子实体中术分离出来。麦角甾醇过氧化物具有激活免疫反应和发挥抗癌/病毒效果。最近，越来越多的证据已经发现麦角甾醇过氧化物对肾脏肿瘤、结肠直肠癌，肝细胞癌，前列腺癌，骨髓瘤和白血病的具有抗肿瘤活性。目前麦角甾醇过氧化物可通过色谱方法从毛癣菌，萤火虫，蝉虫草，灵芝等中分离出来。本发明是发明者通过反复实验研究发现，蝉拟青霉通过液体发酵产生菌丝体，从菌丝体中可以分离获得麦角甾醇过氧化物。该麦角甾醇过氧化物同样具备抑制人肾细胞癌的增殖，侵袭/迁移抑制，促肾癌细胞凋亡。
发明内容
针对目前麦角甾醇过氧化物主要来源于植物或药用真菌子实体，受到资源限制的问题、麦角甾醇过养化物由于受到地质环境、气候等影响导致含量不稳定等问题，本发明的目的在于：提供一种通过蝉拟青霉液体发酵获得蝉拟青霉菌丝体，蝉拟青霉菌丝体通过乙醇提取、大孔树脂Amberlite XE-243吸附分离，C-18柱纯化获得具有抑制肾细胞癌的麦角甾醇过氧化物方法。
技术方案
本发明经过深入的研究，摸索出一种以甘油、酵母粉和蛋白胨为主要原料，通过蝉拟青霉菌体液态摇瓶培养、液体种子罐扩大培养获得含有蝉拟青霉菌丝体。利用该蝉拟青霉菌丝体通过乙醇提取、大孔树脂Amberlite XE-243分离、C-18柱纯化获取麦角甾醇过氧化物。具体方案如下：
一种麦角甾醇过氧化物的生物发酵制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1、根据配合比和制造量选择适当量的甘油、酵母粉、蛋白胨、硫酸锌、硫酸镁、磷酸二氢钾；所使用的的1L培养基中主要成分包括甘油10-50克、酵母粉1-7克、蛋白胨1-7克、硫酸锌0.01-0.05克、硫酸镁0.1-0.3克、磷酸二氢钾0.1-0.5；
步骤2、将上述甘油、酵母粉、蛋白胨、硫酸锌、硫酸镁、磷酸二氢钾溶解于适量的水中，装入发酵罐121℃灭菌30分钟；
步骤3、以蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)保藏的试管菌种为对象，将蝉拟青霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，25-35℃下培养3-7天，放置在2-10℃环境下保藏，制得蝉拟青霉斜面菌种；
步骤4、将步骤3制得的蝉拟青霉斜面菌种切成3×3mm大小，挑取4-6块接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，在100-200rpm、25-35℃摇床里培养3-7天，制得液体摇瓶菌种；其中，每1L液体摇瓶培养基组成为：葡萄糖10-50g、玉米粉15-45g、小麦粉5-25g、酵母浸膏5-25g；
步骤5、将步骤4制得的液体摇瓶菌种按5-20％(体积比)接种量接种到种子罐培养基，在25-35℃，通气量0.6-1.5/1/min(v/v/min，即通气体积/发酵罐中发酵液体积/min)，转速60～200rpm培养3-5天，制得种子罐菌种液体；其中，每1L种子罐培养基含有：葡萄糖10-50g、玉米粉15-45g、小麦粉5-25g、酵母浸膏5-25g；
步骤6、采用液体发酵培养技术，将种子罐菌种按5-20％(体积比)接种量无菌地转移到发酵培养基中，在25-35℃，通气量0.6-1.5/1/min(v/v/min，即通气体积/发酵罐中发酵液体积/min)，发酵罐搅拌转速60-150转/min下培养24-96h，制得含有麦角甾醇过氧化物的蝉拟青霉发酵液；
步骤7、将步骤6中的发酵液4000转/分离心10分钟获得蝉拟青霉菌丝体。
所述蝉拟青霉菌丝体中麦角甾醇过氧化物的分离纯化的方法，按照下述步骤进行：
(a)步骤6制得的含有麦角甾醇过氧化物的蝉拟青霉菌丝体，加入10倍体积的无水乙醇，85℃回流提取4小时，过滤；滤渣用无水乙醇重复提取一次，滤液合并；
(b)合并的滤液真空浓缩至十分之一体积，用2倍浓缩液体积的大孔树脂Amberlite XE-243静态吸附4小时；过滤，用无离子水漂洗树脂3次。
(c)树脂装入层析柱，分别用20倍柱体积的20％、40％、60％、80％和100％乙醇溶液解析，收集含有麦角甾醇过氧化物的解析液浓缩至膏状
(d)麦角甾醇过氧化物膏状浓缩液用5倍体积乙醇溶解，用高径比为50的C18层析柱，用30倍柱体积的60％、70％、80％、90％和100％的乙醇溶液进一步分离纯化，收集含有麦角甾醇过氧化物的解析液，浓缩至小体积，置于-20℃结晶沉淀。
(e)过滤，获得上述结晶沉淀物，沉淀物用去离子水洗涤5次，烘干得到麦角甾醇过氧化物。
一种麦角甾醇过氧化物的拮抗肾癌的片剂制备方法，按照下述步骤进行：
(a)将麦角甾醇过氧化物的粉状物86份，混合均匀，加入75份玉米淀粉、45份麦芽糊精、0.5份羟丙甲基纤维素混合均匀；
(b)称取4.5份羟丙甲基纤维素，然后加入90％乙醇制成10％的羟丙甲基纤维素溶液，备用；
(c)将(a)中混合粉末加入(b)中粘合剂，14目筛网制粒；
(d)烘箱温度调至55℃，干燥3h；
(e)干燥颗粒于14目筛网进行整粒，后外加2份硬脂酸镁和2份二氧化硅，进行总混；
(f)颗粒进行压片，调整片重为0.6g/片，进行薄膜包衣，铝塑包装，即得具有治疗肾脏肿瘤的片剂。
有益效果：本发明利用蝉拟青霉菌种通过液体发酵生产麦角甾醇过氧化物；本发明的麦角甾醇过氧化物是一种纯天然药物，与现有化学合成的治疗肾脏肿瘤的药物相比，无任何毒副作用；麦角甾醇过氧化物作为治疗肾脏肿瘤的药物，为肾癌患者提供理想的药物。
附图说明：
图1：标准品(A)、菌丝体提取物(B)和空白(C)HPLC-MS/MS分析的MRM图；
图2：标准品、菌丝体提取物和空白HPLC-MS/MS分析的MRM图；
图3：分离麦角甾醇过氧化物样品红外光谱图；
图4：分离麦角甾醇过氧化物样品质谱图；
图5：麦角甾醇过氧化物梯度浓度对肾癌细胞生长抑制曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1麦角甾醇过氧化物的制备
a.以蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae，从北京北纳创联生物技术研究所购买，编号：BNCC114807)保藏的试管菌种为对象，将蝉拟青霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，25℃下培养7天，放置在10℃环境下保藏，制得蝉拟青霉斜面菌种；
b.将步骤a制得的蝉拟青霉斜面菌种切成3×3mm大小，挑取4块接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，在100rpm、25℃下培养7天，制得液体摇瓶菌种；其中，每1L液体摇瓶培养基组成为：葡萄糖10g、玉米粉45g、小麦粉25g、酵母浸膏5g；
c.将步骤b制得的蝉拟青霉液体摇瓶菌种按5％(摇瓶菌种液体体积/种子罐培养基液体体积)接种量接种到种子罐培养基，在25℃，通气量1.5/1/min(v/v/min，即通气体积/种子罐中培养基液体体积/min)，转速130rpm培养4天，制得种子罐液体菌种；其中，每1L种子罐培养基含有：葡萄糖10g、玉米粉45g、小麦粉25g、酵母浸膏5；
d.液体发酵培养：将种子罐菌种按20％(种子罐菌种液体体积与发酵培养基的液体体积比)接种量无菌地转移到发酵培养基中，在35℃，通气量1.5/1/min(v/v/min，即通气体积/发酵罐中发酵液体积/min)，发酵罐搅拌转速60转/min下培养96h，制得含有麦角甾醇过氧化物的蝉拟青霉发酵液；所使用的1L培养基主要成分包括甘油50克、酵母粉7克、蛋白胨1克、硫酸锌0.01克、硫酸镁0.1克、磷酸二氢钾0.1克。
实施例2麦角甾醇过氧化物的制备
a.以蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae江南大学馈赠，编号bio-33088)保藏的试管菌种为对象，将蝉拟青霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，25℃下培养3天，放置在2℃环境下保藏，制得蝉拟青霉斜面菌种；
b.将步骤a制得的蝉拟青霉斜面菌种切成3×3mm大小，挑取5块接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，在150rpm、31℃下培养6天，制得液体摇瓶菌种；其中，每1L液体摇瓶培养基组成为：葡萄糖31g、玉米粉32g、小麦粉16g、酵母浸膏18g；
c.将步骤b制得的蝉拟青霉液体摇瓶菌种按20％(摇瓶菌种液体体积/种子罐培养基液体体积)接种量接种到种子罐培养基，在31℃，通气量1.2/1/min(v/v/min，即通气体积/种子罐中培养基液体体积/min)，转速200rpm培养3天，制得种子罐液体菌种；其中，每1L种子罐培养基含有：葡萄糖32g、玉米粉28g、小麦粉17g、酵母浸膏14g；
d.液体发酵培养：将种子罐菌种按14％接种量(种子罐菌种液体体积与发酵培养基的液体体积比)无菌地转移到发酵培养基中，在25℃，通气量0.6/1/min(v/v/min，即通气体积/发酵罐中发酵液体积/min)，发酵罐搅拌转速150转/min下培养24h，制得含有麦角甾醇过氧化物的蝉拟青霉发酵液；所使用的1L培养基主要成分包括甘油10克、酵母粉1克、蛋白胨7克、硫酸锌0.05克、硫酸镁0.3克、磷酸二氢钾0.5克。
实施例3麦角甾醇过氧化物的制备
a.以蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae，从北京北纳创联生物技术研究所购买，编号：BNCC114807)保藏的试管菌种为对象，将蝉拟青霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，30℃下培养5天，放置在5℃环境下保藏，制得蝉拟青霉斜面菌种；
b.将步骤a制得的蝉拟青霉斜面菌种切成3×3mm大小，挑取6块接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，在200rpm、35℃下培养3天，制得液体摇瓶菌种；其中，每1L液体摇瓶培养基组成为：葡萄糖50g、玉米粉15g、小麦粉5、酵母浸膏25g；
c.将步骤b制得的蝉拟青霉液体摇瓶菌种按13％(摇瓶菌种液体体积/种子罐培养基液体体积)接种量接种到种子罐培养基，在35℃，通气量0.6/1/min(v/v/min，即通气体积/种子罐中培养基液体体积/min)，转速60rpm培养5天，制得种子罐液体菌种；其中，每1L种子罐培养基含有：葡萄糖50g、玉米粉15g、小麦粉5g、酵母浸膏25g；
d.液体发酵培养：将种子罐菌种按12％接种量(种子罐菌种液体体积与发酵培养基的液体体积比)无菌地转移到发酵培养基中，在30℃，通气量1.1/1/min(v/v/min，即通气体积/发酵罐中发酵液体积/min)，发酵罐搅拌转速110转/min下培养60h，制得含有麦角甾醇过氧化物的蝉拟青霉发酵液；所使用的1L培养基主要成分包括甘油31克、酵母粉4克、蛋白胨5克、硫酸锌0.03克、硫酸镁0.2克、磷酸二氢钾0.3克。
实施例4麦角甾醇过氧化物的提取
(a)将蝉拟青霉发酵液4000转/分离心10分钟获得蝉拟青霉菌丝体，加入10倍体积的无水乙醇，85℃回流提取4小时，过滤；滤渣用无水乙醇重复提取一次，滤液合并；
(b)合并的滤液真空浓缩至十分之一体积，用2倍浓缩液体积的大孔树脂Amberlite XE-243静态吸附4小时；过滤，用无离子水漂洗树脂3次。
(c)树脂装入层析柱，分别用20倍柱体积的20％、40％、60％、80％和100％乙醇溶液解析，收集含有麦角甾醇过氧化物的解析液浓缩至膏状
(d)麦角甾醇过氧化物膏状浓缩液用5倍体积乙醇溶解，用高径比为50的C18层析柱，用30倍柱体积的60％、70％、80％、90％和100％的乙醇溶液进一步分离纯化，收集含有麦角甾醇过氧化物的解析液，浓缩至小体积，置于-20℃结晶沉淀。
(e)过滤，获得上述结晶沉淀物，沉淀物用去离子水洗涤5次，烘干得到麦角甾醇过氧化物。
实施例5高效液相色谱-质谱(HPLC-MS/MS)联用测定蝉拟青霉发酵液中麦角甾醇过氧化物含量
a.HPLC条件采用梯度洗脱。流动相A：甲醇(含0.1％甲酸)，流动相B：水(含0.1％甲酸)；色谱柱：Acquity uplc beh C18柱(
1.7μm,2.1×100mm)；流速：0.2mL/min；柱温：40℃进样量：5μL。梯度洗脱条件如下：10％流动相A保持为3min，在0.5min增加到90％，持续6min后，在0.5min增加到95％流动相A，保持1min，然后在0.1min下降到10％流动相A，并保持对2.5min，总周期时间为13.5min，标准品和样品的HPLC(附图1)。点喷雾离子源(ESI)正离子扫描质谱条件：进样量：5μL；毛细管电压4.2kV,提取电压2V,离子源温度150℃,脱溶剂气温度450℃,锥孔气流速50L/Hr,脱溶剂气流速800L/Hr。多反应监控(MRM)参数，扫描时间(min)0.0～13.5min，母离子429.6Da，子离子393.6Da，锥孔电压25V，碰撞电压18V。标准品和样品的MRM图见附图2。
b.标准曲线制作：精密称取麦角甾醇过氧化物10mg，置200mL容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，配制成50μg/mL的麦角甾醇过氧化物原液，分别临用时配制成0.2μg/mL,0.5μg/mL,1.0μg/mL,2.0μg/mL,3.0μg/mL,4.0μg/mL和5.0μg/mL标准溶液。
c.发酵液中麦角甾醇过氧化物的提取：100mL发酵液滤布过滤，菌丝体(滤渣)用20倍去离子水分3次洗涤后，60烘干至恒重，研磨。精密称取60℃干燥研磨后的样品0.1g，置5mL离心管中，加入3mL甲醇和钢珠3颗，以组织细胞研磨仪，60hz，研磨时间1min，研磨5次。取出超声提取30min，13000rpm离心2min，取上清作为供试品溶液。
d.利用HPLC-MS/MS测得实施例1、实施例2和实施例3发酵液中麦角甾醇过氧化物的含量见表1。
表1：实施例发酵液中麦角甾醇过氧化物含量
| 样品 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 麦角甾醇过氧化物含量(μg/L) | 1000 | 101 | 2000 |
实施例6分离产物麦角甾醇过氧化物光谱鉴定
a.红外吸收光谱：用Nicolet iS10傅立叶变换红外光谱仪测量的分离产物的红外光谱见附图3。
b.氢质子核磁(1H-NMR)和碳核磁(13C-NMR)共振光谱：采用Bruker DRX 500MHz核磁共振波谱仪，以四甲基硅烷(TMS)为内参照物，记录分离产物在CDCl3中1H-NMR和13C-NMR(表2)。
c.质谱分析：在低分辨质谱Agilent 1290UPLC/6540Q-TOF飞行时间质谱仪上记录了分离产物的低分辨质谱图(附图4)。质谱给出了如下信息：分子离子峰m/z 429[M+H]+；加和物分子离子峰m/z 451[M+Na]+,m/z 467[M+K]+，m/z 880[2M+Na]+,m/z 896[2M+K]+；碎片离子峰m/z411[M–H2O]+,m/z 395[M–H2O2]+，m/z 377[M–H2O–H2O2]+.
表2：制备的麦角甾醇过氧化物和文献中麦角甾醇过氧化物碳、质子分配和化学位移的比较
实施例7麦角甾醇过氧化物片剂的制备方法
一种麦角甾醇过氧化物的拮抗肾癌的片剂的制备方法：
(a)将麦角甾醇过氧化物86份，加入75份玉米淀粉、45份麦芽糊精、0.5份羟丙甲基纤维素混合均匀；
(b)称取4.5份羟丙甲基纤维素，然后加入90％乙醇制成10％的羟丙甲基纤维素溶液，备用；
(c)将(a)中混合粉末加入(b)中粘合剂，14目筛网制粒；
(d)烘箱温度调至55℃，干燥3h；
(e)干燥颗粒于14目筛网进行整粒，后外加2份硬脂酸镁和2份二氧化硅，进行总混；
(f)颗粒进行压片，调整片重为0.6g/片，进行薄膜包衣，铝塑包装，即得显著治疗肾脏肿瘤的片剂。
实施例8麦角甾醇过氧化物体外抑制肾脏肿瘤
(a)肾癌细胞系培养：采用90％RPMI-1640(GIBCO，货号31800022)培养，培养基添加：NaHCO3 1.5g/L，葡萄糖2.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L，10％优质胎牛血清。培养条件：5％二氧化碳培养箱，饱和湿度，37℃。
(b)麦角甾醇过氧化物体外抑制肾癌细胞生长IC50测定：将768-0细胞消化获得细胞悬液，铺于96孔板中，每孔5000个细胞。细胞接种6小时候，加入麦角甾醇过氧化物溶液(以DMSO为溶剂)，最终麦角甾醇过氧化物工作浓度依次为：0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、100μM、150μM，每个浓度三个复孔，药物作用48小时后，采用CCK8法测定光吸收度，反应细胞活力，并利用浓度梯度抑制曲线计算IC50。
(c)试验结果显示采用CCK8法，基于细胞活力绘麦角甾醇过氧化物抑制梯度浓度抑制曲线。如附图5所示，麦角甾醇过氧化物以剂量依赖性方式发挥肾癌细胞生长抑制作用，其IC50约为30μM。
Claims (2)
1.一种麦角甾醇过氧化物的生物发酵制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
步骤1、根据配合比和制造量选择适当量的甘油、酵母粉、蛋白胨、硫酸锌、硫酸镁、磷酸二氢钾；所使用的的1L培养基中主要成分包括甘油10-50克、酵母粉1-7克、蛋白胨1-7克、硫酸锌0.01-0.05克、硫酸镁0.1-0.3克、磷酸二氢钾0.1-0.5；
步骤2、将上述甘油、酵母粉、蛋白胨、硫酸锌、硫酸镁、磷酸二氢钾溶解于适量的水中，装入发酵罐121℃灭菌30分钟；
步骤3、以蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)保藏的试管菌种为对象，将蝉拟青霉菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中，25-35℃下培养3-7天，放置在2-10℃环境下保藏，制得蝉拟青霉斜面菌种；
步骤4、将步骤3制得的蝉拟青霉斜面菌种切成3×3mm大小，挑取4-6块接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，在100-200rpm、25-35℃摇床里培养3-7天，制得液体摇瓶菌种；其中，每1L液体摇瓶培养基组成为：葡萄糖10-50g、玉米粉15-45g、小麦粉5-25g、酵母浸膏5-25g；
步骤5、将步骤4制得的液体摇瓶菌种按5-20％(体积比)接种量接种到种子罐培养基，在25-35℃，通气量0.6-1.5/1/min(v/v/min，即通气体积/发酵罐中发酵液体积/min)，转速60～200rpm培养3-5天，制得种子罐菌种液体；其中，每1L种子罐培养基含有：葡萄糖10-50g、玉米粉15-45g、小麦粉5-25g、酵母浸膏5-25g；
步骤6、采用液体发酵培养技术，将种子罐菌种按5-20％(体积比)接种量无菌地转移到发酵培养基中，在25-35℃，通气量0.6-1.5/1/min(v/v/min，即通气体积/发酵罐中发酵液体积/min)，发酵罐搅拌转速60-150转/min下培养24-96h，制得含有麦角甾醇过氧化物的蝉拟青霉发酵液；
步骤7、将步骤6中的发酵液4000转/分离心10分钟获得蝉拟青霉菌丝体；
步骤8、蝉拟青霉菌丝体中麦角甾醇过氧化物的分离纯化的方法，按照下述步骤进行：
(a)步骤6制得的含有麦角甾醇过氧化物的蝉拟青霉菌丝体，加入10倍体积的无水乙醇，85℃回流提取4小时，过滤；滤渣用无水乙醇重复提取一次，滤液合并；
(b)合并的滤液真空浓缩至十分之一体积，用2倍浓缩液体积的大孔树脂AmberliteXE-243静态吸附4小时；过滤，用无离子水漂洗树脂3次；
(c)树脂装入层析柱，分别用20倍柱体积的20％、40％、60％、80％和100％乙醇溶液解析，收集含有麦角甾醇过氧化物的解析液浓缩至膏状
(d)麦角甾醇过氧化物膏状浓缩液用5倍体积乙醇溶解，用高径比为50的C18层析柱，用30倍柱体积的60％、70％、80％、90％和100％的乙醇溶液进一步分离纯化，收集含有麦角甾醇过氧化物的解析液，浓缩至小体积，置于-20℃结晶沉淀；
(e)过滤，获得上述结晶沉淀物，沉淀物用去离子水洗涤5次，烘干得到麦角甾醇过氧化物。
2.一种麦角甾醇过氧化物的拮抗肾癌的片剂制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
(a)将麦角甾醇过氧化物的粉状物86份，混合均匀，加入75份玉米淀粉、45份麦芽糊精、0.5份羟丙甲基纤维素混合均匀；
(b)称取4.5份羟丙甲基纤维素，然后加入90％乙醇制成10％的羟丙甲基纤维素溶液，备用；
(c)将(a)中混合粉末加入(b)中粘合剂，14目筛网制粒；
(d)烘箱温度调至55℃，干燥3h；
(e)干燥颗粒于14目筛网进行整粒，后外加2份硬脂酸镁和2份二氧化硅，进行总混；
(f)颗粒进行压片，调整片重为0.6g/片，进行薄膜包衣，铝塑包装，即得具有治疗肾脏肿瘤的片剂。
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| CN108342325A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-07-31 | 中山大学 | 一种蝉虫草来源的蒽醌类化合物及其制备方法和应用 |
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|---|
| LINFU HE 等: "Anticancer Action and Mechanism of Ergosterol Peroxide from Paecilomyces cicadae Fermentation Broth", 《INT. J. MOL. SCI.》 * |
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