CN104367586A - 金丝桃苷在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用 - Google Patents

金丝桃苷在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了金丝桃苷在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用，金丝桃苷通过抑制群体感应信号分子，从而降低了细菌的生物膜形成和毒力因子的致病性，以及细菌群集运动能力降低，最终降低细菌耐药性，减轻细菌的致病能力，且毒性低，使用安全。

Description

金丝桃苷在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用
技术领域
本发明属于化学领域，特别涉及金丝桃苷在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用。 
背景技术
抗生素的使用使人类许多严重的细菌感染性疾病得到有效控制，但抗生素的广泛使用也导致了耐药菌株的增加，降低了现有抗生素的抗菌效率。因此，开发新的抗生素和建立新的治疗模式是及其必要的。目前认为，最有前景的治疗策略应是不致死病原菌细胞而仅削弱病原菌的致病毒性，该策略不威胁病原菌自身的生存而不会引起耐药性问题。近来的研究发现，病原菌的致病性是由一种密度依赖的群体感应系统(QS)调控，群体感应系统通过介导致病基因的表达以实现其致病性。此外，群体感应系统还调控病原菌生物膜的形成，从而提高其耐药性，据美国NIH的统计，约80％人类细菌感染性疾病是由生物膜的形成引起的。细菌群体感应系统的调控机制为开发新的抗生素提供了新的靶点，寻找高效的群体感应系统抑制剂将有望实现对病原菌致病性和生物膜的控制。 
近些年来，我国科研工作者从中药、天然药物中分离、筛选获得了一些群体感应抑制分子化合物，比如黄芩苷、绿原酸、穿心莲内酯等。金丝桃苷是天然黄酮类化合物，广泛存在于金银花、连翘、菟丝子、吴茱萸等传统中草药中。研究表明金丝桃苷具有抗炎、解痉、利尿、止咳、降压、降低胆固醇、蛋白同化、局部和中枢镇疼以及对心、脑血管的保护作用等多种生理活性，是一种重要的天然产物。但有关金丝桃苷在细菌群体感应的作用尚未见报道。 
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供金丝桃苷在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用。 
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案： 
本发明从细菌群体感应信号分子、生物膜形成、毒力因子和群集运动几个方面考察了金丝桃苷的抑制细菌群体感应系统生物活性，结果显示金丝桃苷可以抑制QS系统AHLs信号分子的产生，抑制细菌生物膜的形成，降低毒力因子弹性蛋白酶、蛋白水解酶、绿脓菌素和鼠李糖脂的活性或浓度，降低细菌群集运动能力，因此，金丝桃苷可用于制备抑制细菌群体感应系统的药物。 
本发明中金丝桃苷的结构式为： 
本发明中，金丝桃苷为有效成分可以直接使用，为了方便给药，可以加入药学上可接受的常规辅料，通过常规制药方法制成片剂、胶囊剂、注射剂、散剂、颗粒剂。 
本发明的有益效果在于：本发明公开了金丝桃苷在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用，金丝桃苷通过抑制群体感应信号分子，从而降低了细菌的生物膜形成和毒力因子的致病性，以及细菌群集运动能力降低，降低细菌耐药性，减轻细菌的致病能力。此外，金丝桃苷来源广泛，其药物及其制剂具有较高的安全剂量，使得该药物及其制剂具有广泛的明确市场应用前景。 
附图说明
图1为建模3天SEM观察结果(A：对照组；B：实验组)。 
图2为建模7天SEM观察结果(A：对照组；B：实验组)。 
图3为建模银染法观察载体表面BF结果(A：对照组；B：实验组)。 
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对金丝桃苷的药理作用及其效果进行详细的阐述。 
一、金丝桃苷对铜绿假单胞菌PAO1的最小抑菌浓度检测 
取浓度为200000μg/mL的金丝桃苷进行倍比稀释，然后加入96孔圆底培养板中，使板中的铜绿假单胞菌PAO1浓度为OD600＝0.05。将96孔板置于37℃条件下培养24小时，然后每孔取菌液，接种于LB固体培养基，继续在37℃条件下培养24小时，观察无细菌生长的最小浓度即是药物的最小抑菌浓度。结果显示，金丝桃苷对铜绿假单胞菌PAO1的最小抑菌浓度为2000μg/mL。 
二、金丝桃苷对铜绿假单胞菌PAO1群体感应系统信号分子(AHLs)的抑制作用 
1、铜绿假单胞菌信号分子提取 
将-70℃保存的铜绿假单胞菌PAO1在LB固体培养基上划线培养进行复苏，然后挑取单个新鲜菌落转种于5ml LB液体培养基中，并于110rpm、37℃恒温培养12h；将培养后的菌液用LB培养基按体积比为1：50进行稀释，并将稀释后的菌液分为2组，其中一组为PAO1空白组：1mL稀释菌液+49mL LB；另一组为金丝桃苷组：1mL稀释菌液+41.5mL LB+7.5mL金丝桃苷(原液：5mg/mL，终浓度为750μg/mL)，再继续于110rpm、37℃恒温条件下培养12h，然后将菌液于10000g条件下离心5min，去菌体，上清用0.22μM一次性滤器过滤。将过滤后的上清用等体积的酸化的乙酸乙酯(质量分数为0.5％的甲酸酸化)萃取两次，每次大于3h，最后加入少许无水硫酸镁干燥(大于2h)。将干燥后的萃取液用0.45μM、13mm的一次性有机滤器过滤，然后于真空旋转蒸发仪，37℃挥干乙酸乙酯，再向旋转瓶中加入1.5mL甲醇将沉淀重悬，收集与1.5mL EP管中，用有机滤器再次滤过后，-20℃保存待测。 
2、HPLC-MS测定铜绿假单胞菌信号分子 
取2μL样品直接注入XDB-C18(4.6×50mm，1.8μm)色谱柱(Agilent公司)以200μL/min的速率进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如表1所示，洗脱液直接流进质谱仪。样本洗脱完后，进行一次空白洗脱后，再进行下一个样本。 
表1、液相色谱梯度洗脱条件 
时间(min) 甲醇(％) 10mmol/L醋酸铵(含体积百分数为0.1％甲酸)
0～4 5 95
4～8 90 10
8～19 90 10
19～21 5 95
21～30 5 95
将上述洗脱液直接流进质谱仪，其质谱条件如下：毛细管电压：3.10KV；离子源温度：300℃；去溶剂温度：300℃；脱溶剂气：500L/hr；锥孔气：100L/hr，结果如表2所示。多重反应检测(MRM)试验以相同的HPLC条件及相同的MS参数，前驱离子扫描鉴定了这些离子是由相应的AHLs转变成酰基部分[M+H-101]+及内酯部分m/z 102。 
表2、AHLs分子离子及对应的碎片离子 
由表2可知，PAO1产生的AHLs信号分子主要是3-oxo-C12-HSL和C4-HSL。 
3、AHLs定量检测 
对照品配制：精密称取C4-HSL 10.36mg至10mL容量瓶用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成1.036mg/mL的储备液。精密称取3-oxo-C12-HSL 9.02mg至10mL容量瓶用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成0.902mg/mL的储备液，4℃保存备用。 
制作标准曲线：将储备液用色谱级甲醇进行稀释，其C4-HSL和3-oxo-C12-HSL稀释液浓度如下，C4-HSL：51.8ng/mL、103.6ng/mL、518.0ng/mL、1.036μg/mL、5.18μg/mL、51.8ug/mL；3-oxo-C12-HSL：45.1ng/mL、90.2ng/mL、451.0ng/mL、0.902μg/mL、4.50μg/mL、45.0ug/mL。在同样的HPLC及MS参数下利用MRM分析标准曲线，利用(Analyst1.2；Perkin-Elmer)定量软件包分析整合峰面积。根据分析物的峰面积与对应的分析物的量绘制曲线，对每一个样本同样条件进行测定，重复三次，按照曲线换算为浓度。结果采用SPSS16.0方法，组间比较采用单因素方差分析P<0.05有统计学意义，结果如表3所示。 
表3、铜绿假单胞菌AHLs信号分子测定(ng/ml，) 
与空白对照组比较：*p<0.05。 
定量检测可以看，胞外AHLs信号分子中，C4-HSL含量高于3-oxo-C12-HSL；金丝桃苷组的C4-HSL，3-oxo-C12-HSL含量都明显少于空白对照组(P<0.05)。结果表明金丝桃苷可以抑制QS系统AHLs信号分子的产生。 
三、金丝桃苷对铜绿假单胞菌PAO1体外生物膜形成的抑制作用 
1、建立铜绿假单胞菌(P.a)的生物膜(BF)模型 
取出-80℃保存的铜绿假单胞菌PAO1菌种，复苏后，接种于40mL LB培养液中，于37℃、250rpm过夜培养。次日清晨在4℃、10000rpm条件下离心10分钟，沉淀物用无菌生理盐水洗涤2次，然后用无菌生理盐水调菌悬液浓度为0.5麦氏单位(细菌数约为5×107-8CFU/mL)，再用生理盐水按体积比为1：200稀释，每试管(100×150mm)加入5mL稀释液，每管置入无菌BF载体1片，在37℃培养24小时后用体积分数为50％的LB换液，作为对照组，并于3天进行SEM观察BF，7天进行银染法和SEM观察BF。同时，在放入BF载体时加入金丝桃苷至金丝桃苷的终浓度为500μg/mL，作为实验组，同样与3天进行SEM观察BF，7天进行银染法和SEM观察BF。 
银染法的具体步骤如下：用生理盐水充分漂洗去除浮游菌，再用质量分数为2.5％的戊二醛溶液固定1小时，然后用蒸馏水清洗1分钟，接着用饱和氯化钙溶液结合15分钟，继续用蒸馏水清洗1分钟；然后在质量分数为5％的AgNO3溶液反应15分钟；反应后用质量分数为1％的对苯二酚溶液显色2分钟；再用蒸馏水漂洗1分钟；漂洗后用质量分数为5％的NaS2O3溶液固定2分钟；蒸馏水漂洗1分钟后于400×倍光学显微镜下观察。 
SEM观察的标本处理方法：用灭菌生理盐水冲洗去掉浮游菌，然后用质量分数为2.5％的戊二醛固定；固定后用pH7.4的PBS、4℃漂洗3次；先依次用体积分数为50％、70％的酒精，于4℃脱水1次，每次15分钟；再依次用体积分数为80％、90％酒精各脱水一次，每次15分钟，然后用100％的酒精脱水3次，每次均为10分钟；最后在真空条件下镀金粉，SEM下观察。 
图1为建模3天SEM观察结果。结果显示，空白对照组载体表面可见均匀、密布堆积的稀薄BF，局部成立体结构。加入金丝桃苷的实验组仅偶见聚集的细菌，期间有少量稀薄的黏液样物质，细菌轮廓仍可清晰显示。 
图2为建模7天SEM观察结果。结果显示，空白对照组载体表面可见大规模呈立体结构的BF，而实验组仅见稀少的薄层BF。 
图3为建模7天银染法观察载体表面BF。结果显示，空白对照组可见大量体积较大的棉絮样黑染物质，周边散在黑色颗粒样物质，高倍镜下观察为聚集的细菌。实验组载体可见少量规模较小的淡染颗粒样物质，高倍镜下为局部聚集堆积的细菌，菌体被黏液样物质包绕，但较空白对照组规模较小，染色较淡。 
载体表面BF半定量，具体方法如下：上述相同的方法建模，于建模第3天和第7天分别取出各组载体，用10mL质量分数为0.9％的NaCl冲洗载体表面浮游菌，然后将载体在室温(18-25℃)下干燥后，取1mL质量分数为1％的结晶紫染色20分钟，再用质量分数为0.9％的NaCl洗脱未结合的结晶紫，室温干燥，然后再用2mL体积分数为95％的乙醇脱色3分钟。洗脱液用紫外分光光度计540nm处测量吸光值。每组重复2个标本，均独立重复3次，结果采用SPSS16.0软件分析，BF半定量采用单因素方差分析，P<0.05有统计学意义。统计结果如表4和表5所示。 
表4、建模3天载体表面BF半定量
与空白对照组比较：**p<0.01. 
由表4可知，实验组载体表面BF形成量和空白对照组比较，经统计学分析，差异有显著性意义(P<0.01)。 
表5、建模7天载体表面BF半定量
与空白对照组比较：**p<0.01. 
由表5可知，实验组载体表面的BF生物量少于空白对照组(P<0.01)。 
四、金丝桃苷对铜绿假单胞菌PAO1毒力因子的抑制作用 
1、金丝桃苷对弹性蛋白酶活性的抑制作用 
将-70℃保存的铜绿假单胞菌PAO1接种至M-H琼脂中，37℃孵箱中孵育18h，可见绿色菌落的生长。挑取新鲜生长的菌落接种于2mL PTSB液体培养基中，用分光光度计调节OD540nm为0.5后，转入装有18mL PTSB培养基(药物最终浓度金丝桃苷组为1/4MIC)中，在37℃、250次/分线性速度振荡条件下恒温振荡培养。16小时后，将培养物于4℃、10000g离心15分钟，吸取上清液，用孔径为0.45μm的一次性滤器过滤除菌，之后储存于-70℃备用。 
酶-底物反应：向15mL振荡培养管中加入1mL弹性蛋白酶-刚果红(ECR)反应缓冲液(ECR：20mg，0.1M Tris-HCI/1mMCaCl2，pH7.2)，之后加入lmL过滤的细菌培养物上清液，在37℃，250次/分线性速度振荡条件下恒温振荡反应18小时后，然后加入0.1mL浓度为0.12M的EDTA终止反应，将反应物置于冰上，最后于4℃、5000rpm条件下离心去除不可溶的ECR。 
活性测定：将反应物在OD495nm下测定吸光度值，并未加ECR的反应物为背景吸光度值(主要为铜绿假单胞菌色素产生的吸光度)，酶-底物反应的吸光度值减去背景吸光度值，即为最终的吸光度值。每次测定3份同样的待测样品，重复试验3次，结果如表6所示。 
表6、铜绿假单胞菌弹性蛋白酶活性(OD495,) 
与空白对照组比较：**p<0.01. 
由表6可知，金丝桃苷组和空白对照组比较，P<0.01，差异有统计学意义，表明金丝桃苷组弹性蛋白酶活性低于空白对照组。 
2.金丝桃苷对蛋白水解酶活性的抑制作用 
测定上述铜绿假单胞菌的生物膜模型第3天和第7天菌液的OD600nm后，在12000rpm条件下离心5min，取上清液，用0.22μm孔径滤膜过滤上清液除菌，取150μL无菌上清液溶液加入250μL含2％(wt)的偶氮酪蛋白的Tris-HCl溶液(pH 7.8)，然后在4℃下反应4小时，再加入1.2mL含10％(wt)的三氯乙酸中止反应，最后将溶液在10000rpm离心10分钟，取上清，并加入1.4mL浓度为1M的NaOH，测量波长为440nm的吸光度。蛋白水解酶活性以OD440nm与菌液光密度OD600nm的比值表示，上述实验相同条件重复实验三次，结果如表7所示。 
表7铜绿假单胞菌蛋白水解酶活性测定(OD440,) 
与空白对照组比较：**p<0.01. 
由表7可知，实验组早期(3天)BF形成时期的菌液及BF成熟时期(7天)的菌液蛋白水解酶低于对照组，且P<0.01，差异有统计学意义，表明金丝桃苷能够降低组蛋白水解酶的活性。 
3.金丝桃苷对绿脓菌素的抑制作用 
按上述方法建立铜绿假单胞菌的生物膜模型，并取各组1天、3天、5天和7天菌液2mL测定其OD600值，然后加入3mL氯仿萃取，然后在萃取到1mL的0.2mol/L的HCl，得到一个粉红色至深红色液体，测定其在520nm处吸光度，即为菌液绿脓菌素的相对浓度，相同条件重复实验三次，结果如表8所示。 
表8、铜绿假单胞菌绿脓菌素测定(OD520,) 
与空白对照组比较：**p<0.01. 
由表8可知，在BF形成的各个时期，实验组菌液绿脓菌素相对较低，与空白对照组比较，P<0.01，差异有统计学意义，表明金丝桃苷能抑制绿脓菌素的浓度。 
4.金丝桃苷对鼠李糖脂的抑制作用 
将鼠李糖标准品配制1mg/mL母液，然后分别稀释至0、50、100、200及300μg/mL浓度， 各取100μL，每个浓度取3个复孔，加入900μL的含0.19％苔黑酚的浓硫酸，80℃水浴30min后，室温冷却15min，测定OD421。根据相吸光度及浓度，用软件建立标准曲线。由统计软件得相应直线关系式为Y＝0.012X+0.375(s＝0.134，r＝0.997)。 
将铜绿假单胞菌PAO1在PPGAS培养基上复苏，并用PPGAS培养基调节菌液OD600＝0.05，然后将菌液分为两组，分别为：PAO1空白组、金丝桃苷组(终浓度为1/4MIC)，各组体积为20mL，置于100mL三角烧瓶，于30℃、200rpm条件下培养，分别于48h和72h取菌液10ml，在6000g、离心10min，去菌体，将上清用浓盐酸调pH＝2，取1mL用等量乙酸乙酯萃取两次，收集有机层至新管，室温过夜挥发至干，加入0.5mL的无菌双蒸水重新溶解后，4℃保存待测。取100μL，测定OD421吸光度，根据标准曲线算出鼠李糖含量，再按1μg鼠李糖＝2.5μg鼠李糖脂进行换算，结果采用SPSS16.0，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05有统计学意义，结果如表9所示。 
表9铜绿假单胞菌的鼠李糖脂测定(ug/ml,) 
与空白对照组比较：**p<0.01. 
由表9可知，在金丝桃苷处理后48h和72h，鼠李糖脂含量显著低于PAO1空白组，且P<0.01，差别有统计学意义，表明金丝桃苷能够抑制鼠李糖脂。 
五、金丝桃苷对铜绿假单胞菌群集运动的抑制作用 
不含金丝桃苷群集运动培养基(BM1-swarming medium)成分如下：62mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)；0.5％(wt/vol)酪蛋白氨基酸；2mM MgSO4；10μM FeSO4；0.4％(wt/vol)葡萄糖。 
含金丝桃苷(1/4MIC)群集运动培养基(BM2-swarming medium)成分如下：62mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)；0.5％(wt/vol)酪蛋白氨基酸；2mM MgSO4；10μM FeSO4；0.4％(wt/vol)葡萄糖，加金丝桃苷使最终浓度为1/4MIC。 
群集运动琼脂培养基是上述培养基中加质量分数为0.5％的琼脂。 
培养条件：将铜绿假单胞菌PAO1分别在BM1-swarming medium和BM1-swarming medium中，在37℃、225rpm条件下震荡培养至OD600为0.1时终止培养。然后用灭菌过的牙签挑取各培养基的细菌接种在群集运动琼脂培养基上，37℃生长24h。比较两组间的群集运动直径大小，实验重复3次，结果见表10。 
表10金丝桃苷对PAO1的群集运动能力的影响
与空白对照组比较：**p<0.05. 
由表10可知，金丝桃苷组较空白组的群集运动直径小，具有显著的统计学意义。表明金丝桃苷能够抑制PAO1的群集运动能力。 
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 

Claims (7)

1.金丝桃苷在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：金丝桃苷在制备抑制细菌群体感应信号分子的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：金丝桃苷在制备降低细菌生物膜形成的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：金丝桃苷在制备降低细菌毒力因子致病性的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细菌毒力因子为弹性蛋白酶、蛋白水解酶、绿脓菌素和鼠李糖脂。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：金丝桃苷在制备降低细菌群集运动能力的药物中的应用。
7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于：所述细菌为铜绿假单胞菌。
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