CN108866040A - 一种克隆未知基因的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种克隆未知基因的方法及其应用，包括如下步骤：S1：蛋白质序列测定及数据分析；S2：将上述蛋白电泳所得的蛋白条带取样，将取样的蛋白条放入检测设备中进行二级质谱分析；S3：预测蛋白质序列数据汇总整理。本发明确保了产品性能的稳定，提高了效率，稳定性高，降低了生产和应用的成本，促进了益生菌的大面积推广使用，通过获知控制拮抗菌拮抗活性成分的基因，并通过分子生物学手段对该基因进行克隆，获得工程菌株，进而通过发酵工程技术批量生产该菌株，对该基因进行高通量表达，最终为生产提供稳定、高产、高效的微生物制剂。

Description

一种克隆未知基因的方法及其应用
技术领域
本发明涉及克隆未知基因技术领域，具体为一种克隆未知基因的方法及其应用。
背景技术
基因工程的上游工程主要是目的基因的制取和无性繁殖。具体地说是从生物体的组织、器官或细胞制取目的基因或者人工合成目的基因，将目的基因与载体的DNA拼接，使重组体分子导入受体细胞，筛选和进行无性繁殖。这个过程可以称为基因克隆。基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制。基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。
目前生产上已有不少益生菌在示范推广中，但显现出的突出问题一是产品性能不稳定，二是有效成分比例偏低，三是生产和应用成本较高，严重限制了益生菌的大面积推广使用。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种克隆未知基因的方法及其应用，解决了上述背景技术中所提出的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种克隆未知基因的方法，包括如下步骤：
S1：蛋白质序列测定及数据分析；
S2：将上述蛋白电泳所得的蛋白条带取样，将取样的蛋白条放入检测设备中进行二级质谱分析；
S3：预测蛋白质序列数据汇总整理：
①根据测序反馈回来的蛋白质信息，进行分析，首先将不同数据库中的蛋白质分别整理，每个数据库中每个样品的，每种蛋白质名称、分子量大小等电点、肽段数和序列号等各种原始数据分类归纳到一起。
②将所有数据库的数据放在一起整理，将相同蛋白质的整理在一起，比较相同蛋白质的菌株来源和分子量以及肽段数等的区别。
③将相同的蛋白质归为一组，整理蛋白质与菌株。
S4：预测蛋白的分组及氨基酸序列数据库的建立：
根据上述整理出来的预测蛋白质的数据，通过每种蛋白不同菌株来源的序列号进入相应的数据库中进行氨基酸序列的搜索查询，并下载每种蛋白质的氨基酸信息，保存在单独的文本文档并命名以建立个人蛋白质数据库。
S5：引物设计：
1)用Vector NTI Advance 11软件对氨基酸序列进行比对，将同源性较高的归为一组。
2)根据每组蛋白N端和C端的同源性，各取7个氨基酸序列，查对遗传密码子表，将氨基酸序列转化为对应的核酸序列，以基因头尾固定的方式手动设计引物，同时考虑氨基酸的兼并性、酶切位点及其保护碱基。
3)引物合成。
S6：目的基因扩增及测序：以研究菌株总DNA为模板，以下列反应程序和体系扩增目的基因(目的基因被命名为an04)，进而T-克隆。
PCR反应程序：
PCR体系：
S7：目的基因扩增
(1)酶连PCR产物按Takara T4DNA Ligase使用说明书操作，将目的基因与T-载体连接。
(2)转化常规化学转化法转化E.coli Top10。
(3)测序。
S8：目的基因克隆：将目的基因与表达载体pET15b连接，用常规化学转化法转入表达宿主E.coli BL21(DE3)plysS。
S9：目的基因的诱导及抑菌活性检测：三区划线E.coli BL21(DE3) plysS/pET15b-目的基因，挑取单菌落接种到5mL LB液体培养基中，通过37 ℃摇床培养，室内放置10h，放置10h后按照1:100的比例转接到1000mL LB培养基中进行扩大培养至A600到0.8～1.0，随后加入0.16mM IPTG(0.8 M IPTG 200μL/L)，并在25℃下诱导10h。
抑菌活性检测：以哈维氏弧菌为指示菌，检测克隆基因表达产物的拮抗性能，采用打孔法，具体操作如下：用移液枪吸取1μL过夜培养的哈维氏弧菌发酵液，加入99μL无菌水，稀释为1％，均匀涂布到LB平板上，用无菌黄色枪头大头在培养基上打孔，孔中添加50μL拮抗菌，至拮抗菌完全渗入培养基后28℃培养，9h后观察抑菌活性。
S10：克隆基因诱导表达产物分子量分析，常规蛋白电泳技术，检测方法 7诱导表达产物的分子量。
S11：得出结论：
1、抗菌肽电泳：可抑制哈维氏弧菌生长的拮抗菌 BACILLUS PUMILUS E14-3，其发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE离子交换分离，具有拮抗作用的成分经蛋白电泳。分子量在25kD以下，和前期研究中质谱分析结果21kD一致。
2、蛋白质测序及数据分析，将条带取样，条带标注为1，2，3，进行二级质谱分析，预测蛋白质组成及氨基酸序列，根据预测蛋白序列结果，留取蛋白质可信度在85％以上的蛋白质并归类，35个菌株8种不同类型的蛋白质，将来自不同菌株、分子量在21kD左右的蛋白Phosphoheptose isomerase，在相应数据库中下载对应蛋白质的氨基酸序列信息，由此获得Phosphoheptose isomerase N端和C端氨基酸序列分别为MYHDLIR和EKEMVKA。
3、引物设计通过预测蛋白质Phosphoheptose isomerase的首尾氨基酸序列，设计引物，命名为SW-06F&SW-06R，其序列如下：SW-06F GCTCTAGAATGTAYCATGAYCTNATHCGN SW-06R CGGGATC CRGCYTTRACCATYTCYTTYTC4、目的基因扩增以哈维氏弧菌拮抗菌株 BACILLUSPUMILUS E14-3总DNA为模板，按方法4进行PCR扩增并与及T-载体连接：
GCTCTAGAATGTATCATGATCTCATACGTAGTGAACTGAACGAAGCGGCCGATACCCTGGCGAAATTTATCAATGACGATGCCAATATCGACGCCATTCAACGCGCGGCAGTGCTGCTGGCCGACTCCTTCAAAGCCGGCGGGAAAGTCATTTCCTGCGGTAACGGTGGCTCCCACTGTGACGCCATGCATTTTGCCGAAGAGCTGACCGGCCGCTACCGTGAAAACCGCCCAGGCTATCCGGCGATTGCCATTTCCGACGTTAGCCACCTGTCTTGCGTCAGCAACGACTTCGGCTACGAGTATGTGTTTTCGCGCTATGTGGAAGCGGTAGGCCGCGAAGGCGACGTACTGCTGGGCATTTCCACCTCAGGCAACTCCGGCAACATCATTAAAGCTATCGAAGCGGCGCGTGCCAAAGGGATGAAAGTGATCACCCTGACCGGCAAAGACGGCGGCAAAATGGCCGGTTCCGCAGACGTGGAAATCCGCGTACCGCACTTCGGTTACGCCGATCGCATCCAGGAAATTCATATCAAAGCGATCCACATCTTGATTCAGCTGATCGAGAAAGAGATGGTCAAAGCCGGATCCCGA5、目的基因克隆根据T-测序结果，两端添加酶切位点NdeI/BamHI，连入pET15b，转化E.coli Top10，得E.coli Top10/pET15b-an04，目的基因序列如下：
CATATGTATCATGATCTCATACGTAGTGAACTGAACGAAGCGGCCGATACCCTGGCGAAATTTATCAATGACGATGCCAATATCGACGCCATTCAACGCGCGGCAGTGCTGCTGGCCGACTCCTTCAAAGCCGGCGGGAAAGTCATTTCCTGCGGTAACGGTGGCTCCCACTGTGACGCCATGCATTTTGCCGAAGAGCTGACCGGCCGCTACCGTGAAAACCGCCCAGGCTATCCGGCGATTGCCATTTCCGACGTTAGCCACCTGTCTTGCGTCAGCAACGACTTCGGCTACGAGTATGTGTTTTCGCGCTATGTGGAAGCGGTAGGCCGCGAAGGCGACGTACTGCTGGGCATTTCCACCTCAGGCAACTCCGGCAACATCATTAAAGCTATCGAAGCGGCGCGTGCCAAAGGGATGAAAGTGATCACCCTGACCGGCAAAGACGGCGGCAAAATGGCCGGTTCCGCAGACGTGGAAATCCGCGTACCGCACTTCGGTTACGCCGATCGCATCCAGGAAATTCATATCAAAGCGATCCACATCTTGATTCAGCTGATCGAGAAAGAGATGGTCAAAGCCTAAGGATCC6、目的基因转化表达宿主从E.coli Top10/pET15b-an04中提取质粒pET15b-an04，化学法转化表达宿主E.coli BL21(DE3)plysS，得E.coli BL21(DE3)plysS/pET15b-an04，该菌株命名为An04。目的基因的诱导表达及抑菌活性检测诱导：将An04三区划线，C过夜培养，随机挑取5个单菌落，诱导表达目的基因，表达产物用于抑菌活性检测，抑菌活性检测。成功克隆到了拮抗哈维氏弧菌生长的基因。克隆基因诱导表达产物分子量分析，将上述经诱导表达的基因产物，进行SDS-PAGE电泳检测，结果该基因被成功诱导表达，且诱导表达产物分子量在20.1kD处，与 Bacillus pumilus E14-3拮抗菌株活性成分分子量为21kD一致。
优选的，所述摇床培养采用的是摆动幅度一致的摇床。
优选的，所述S9：目的基因的诱导及抑菌活性检测中，室内放置10h，室内为无尘、无细菌室。
(三)有益效果
本发明提供了一种克隆未知基因的方法。具备以下有益效果：拮抗菌是通常所说的益生菌之一，益生菌用于动物饲料添加剂不仅能提高饲养动物的抗病能力，同时还能提高产量，而且病原微生物不易产生耐药性，使用效果良好，结果表明，益生菌添加到养殖鱼类的饲料中或直接投入养殖池，不仅可以提高鱼体的免疫抗病力[2-4]，而且可以产生抗菌物质抑制病原微生物生长等[5，6]，免抗生素在鱼体中的累积，提高水产品质量，在饲料中添加抗菌蛋白，无论是在日生长速度、相对增重率、饲料系数、成活率等均有显著提高，同时益生菌还能通过调节养殖水体的微生态平衡，改善养殖环境，净化水质，提高养殖对象免疫力与抗病能力，抑制病原微生物，进而减少养殖病害的发生，并且不会出现耐药性及残留或污染等副作用，因此，在水产动物的疾病防治中，益生菌的应用作为抗生素的替代品逐渐成为水产养殖动物病害防治的一种生物控制模式，该发明，确保了产品性能的稳定，提高了效率，稳定性高，降低了生产和应用的成本，促进了益生菌的大面积推广使用，通过获知控制拮抗菌拮抗活性成分的基因，并通过分子生物学手段对该基因进行克隆，获得工程菌株，进而通过发酵工程技术批量生产该菌株，对该基因进行高通量表达，最终为生产提供稳定、高产、高效的微生物制剂。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种克隆未知基因的方法，包括如下步骤：
S1：蛋白质序列测定及数据分析；
S2：将上述蛋白电泳所得的蛋白条带取样，将取样的蛋白条放入检测设备中进行二级质谱分析；
S3：预测蛋白质序列数据汇总整理：
①根据测序反馈回来的蛋白质信息，进行分析，首先将不同数据库中的蛋白质分别整理，每个数据库中每个样品的，每种蛋白质名称、分子量大小等电点、肽段数和序列号等各种原始数据分类归纳到一起。
②将所有数据库的数据放在一起整理，将相同蛋白质的整理在一起，比较相同蛋白质的菌株来源和分子量以及肽段数等的区别。
③将相同的蛋白质归为一组，整理蛋白质与菌株。
S4：预测蛋白的分组及氨基酸序列数据库的建立：
根据上述整理出来的预测蛋白质的数据，通过每种蛋白不同菌株来源的序列号进入相应的数据库中进行氨基酸序列的搜索查询，并下载每种蛋白质的氨基酸信息，保存在单独的文本文档并命名以建立个人蛋白质数据库。
S5：引物设计：
1)用Vector NTI Advance 11软件对氨基酸序列进行比对，将同源性较高的归为一组。
2)根据每组蛋白N端和C端的同源性，各取7个氨基酸序列，查对遗传密码子表，将氨基酸序列转化为对应的核酸序列，以基因头尾固定的方式手动设计引物，同时考虑氨基酸的兼并性、酶切位点及其保护碱基。
3)引物合成。
S6：目的基因扩增及测序：以研究菌株总DNA为模板，以下列反应程序和体系扩增目的基因(目的基因被命名为an04)，进而T-克隆。
PCR反应程序：
PCR体系：
S7：目的基因扩增
(1)酶连PCR产物按Takara T4DNA Ligase使用说明书操作，将目的基因与T-载体连接。
(2)转化常规化学转化法转化E.coli Top10。
(3)测序。
S8：目的基因克隆：将目的基因与表达载体pET15b连接，用常规化学转化法转入表达宿主E.coli BL21(DE3)plysS。
S9：目的基因的诱导及抑菌活性检测：三区划线E.coli BL21(DE3) plysS/pET15b-目的基因，挑取单菌落接种到5mL LB液体培养基中，通过37 ℃摇床培养，室内放置10h，放置10h后按照1:100的比例转接到1000mL LB培养基中进行扩大培养至A600到0.8～1.0，随后加入0.16mM IPTG(0.8 M IPTG 200μL/L)，并在25℃下诱导10h。
抑菌活性检测：以哈维氏弧菌为指示菌，检测克隆基因表达产物的拮抗性能，采用打孔法，具体操作如下：用移液枪吸取1μL过夜培养的哈维氏弧菌发酵液，加入99μL无菌水，稀释为1％，均匀涂布到LB平板上，用无菌黄色枪头大头在培养基上打孔，孔中添加50μL拮抗菌，至拮抗菌完全渗入培养基后28℃培养，9h后观察抑菌活性。
S10：克隆基因诱导表达产物分子量分析，常规蛋白电泳技术，检测方法 7诱导表达产物的分子量。
S11：得出结论：
1、抗菌肽电泳：可抑制哈维氏弧菌生长的拮抗菌 BACILLUS PUMILUS E14-3，其发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE离子交换分离，具有拮抗作用的成分经蛋白电泳。分子量在25kD以下，和前期研究中质谱分析结果21kD一致。
2、蛋白质测序及数据分析，将条带取样，条带标注为1，2，3，进行二级质谱分析，预测蛋白质组成及氨基酸序列，根据预测蛋白序列结果，留取蛋白质可信度在85％以上的蛋白质并归类，35个菌株8种不同类型的蛋白质，将来自不同菌株、分子量在21kD左右的蛋白Phosphoheptose isomerase，在相应数据库中下载对应蛋白质的氨基酸序列信息，由此获得Phosphoheptose isomerase N端和C端氨基酸序列分别为MYHDLIR和EKEMVKA。
3、引物设计通过预测蛋白质Phosphoheptose isomerase的首尾氨基酸序列，设计引物，命名为SW-06F&SW-06R，其序列如下：SW-06F GCTCTAGAATGTAYCATGAYCTNATHCGN SW-06R CGGGATC CRGCYTTRACCATYTCYTTYTC4、目的基因扩增以哈维氏弧菌拮抗菌株 BACILLUSPUMILUS E14-3总DNA为模板，按方法4进行PCR扩增并与及T-载体连接：
GCTCTAGAATGTATCATGATCTCATACGTAGTGAACTGAACGAAGCGGCCGATACCCTGGCGAAATTTATCAATGACGATGCCAATATCGACGCCATTCAACGCGCGGCAGTGCTGCTGGCCGACTCCTTCAAAGCCGGCGGGAAAGTCATTTCCTGCGGTAACGGTGGCTCCCACTGTGACGCCATGCATTTTGCCGAAGAGCTGACCGGCCGCTACCGTGAAAACCGCCCAGGCTATCCGGCGATTGCCATTTCCGACGTTAGCCACCTGTCTTGCGTCAGCAACGACTTCGGCTACGAGTATGTGTTTTCGCGCTATGTGGAAGCGGTAGGCCGCGAAGGCGACGTACTGCTGGGCATTTCCACCTCAGGCAACTCCGGCAACATCATTAAAGCTATCGAAGCGGCGCGTGCCAAAGGGATGAAAGTGATCACCCTGACCGGCAAAGACGGCGGCAAAATGGCCGGTTCCGCAGACGTGGAAATCCGCGTACCGCACTTCGGTTACGCCGATCGCATCCAGGAAATTCATATCAAAGCGATCCACATCTTGATTCAGCTGATCGAGAAAGAGATGGTCAAAGCCGGATCCCGA5、目的基因克隆根据T-测序结果，两端添加酶切位点NdeI/BamHI，连入pET15b，转化E.coli Top10，得E.coli Top10/pET15b-an04，目的基因序列如下：
CATATGTATCATGATCTCATACGTAGTGAACTGAACGAAGCGGCCGATACCCTGGCGAAATTTATCAATGACGATGCCAATATCGACGCCATTCAACGCGCGGCAGTGCTGCTGGCCGACTCCTTCAAAGCCGGCGGGAAAGTCATTTCCTGCGGTAACGGTGGCTCCCACTGTGACGCCATGCATTTTGCCGAAGAGCTGACCGGCCGCTACCGTGAAAACCGCCCAGGCTATCCGGCGATTGCCATTTCCGACGTTAGCCACCTGTCTTGCGTCAGCAACGACTTCGGCTACGAGTATGTGTTTTCGCGCTATGTGGAAGCGGTAGGCCGCGAAGGCGACGTACTGCTGGGCATTTCCACCTCAGGCAACTCCGGCAACATCATTAAAGCTATCGAAGCGGCGCGTGCCAAAGGGATGAAAGTGATCACCCTGACCGGCAAAGACGGCGGCAAAATGGCCGGTTCCGCAGACGTGGAAATCCGCGTACCGCACTTCGGTTACGCCGATCGCATCCAGGAAATTCATATCAAAGCGATCCACATCTTGATTCAGCTGATCGAGAAAGAGATGGTCAAAGCCTAAGGATCC6、目的基因转化表达宿主从 E.coli Top10/pET15b-an04中提取质粒pET15b-an04，化学法转化表达宿主E.coli BL21(DE3)plysS，得E.coli BL21(DE3)plysS/pET15b-an04，该菌株命名为An04。目的基因的诱导表达及抑菌活性检测诱导：将An04三区划线，C过夜培养，随机挑取5个单菌落，诱导表达目的基因，表达产物用于抑菌活性检测，抑菌活性检测。成功克隆到了拮抗哈维氏弧菌生长的基因。克隆基因诱导表达产物分子量分析，将上述经诱导表达的基因产物，进行SDS-PAGE电泳检测，结果该基因被成功诱导表达，且诱导表达产物分子量在20.1kD处，与 Bacillus pumilus E14-3拮抗菌株活性成分分子量为21kD一致。
具体而言，所述摇床培养采用的是摆动幅度一致的摇床。
具体而言，所述S9：目的基因的诱导及抑菌活性检测中，室内放置10h，室内为无尘、无细菌室。
综上可得，该克隆未知基因的方法及其应用，拮抗菌是通常所说的益生菌之一，近年来开发用于水产病害防治，益生菌用于动物饲料添加剂不仅能提高饲养动物的抗病能力，同时还能提高产量，而且病原微生物不易产生耐药性，使用效果良好，结果表明，益生菌添加到养殖鱼类的饲料中或直接投入养殖池，不仅可以提高鱼体的免疫抗病力[2-4]，而且可以产生抗菌物质抑制病原微生物生长等[5，6]，免抗生素在鱼体中的累积，提高水产品质量，在饲料中添加抗菌蛋白，无论是在日生长速度、相对增重率、饲料系数、成活率等均有显著提高，同时益生菌还能通过调节养殖水体的微生态平衡，改善养殖环境，净化水质，提高养殖对象免疫力与抗病能力，抑制病原微生物，进而减少养殖病害的发生，并且不会出现耐药性及残留或污染等副作用，因此，在水产动物的疾病防治中，益生菌的应用作为抗生素的替代品逐渐成为水产养殖动物病害防治的一种生物控制模式，该发明确保了产品性能的稳定，提高了效率，稳定性高，降低了生产和应用的成本，促进了益生菌的大面积推广使用，通过获知控制拮抗菌拮抗活性成分的基因，并通过分子生物学手段对该基因进行克隆，获得工程菌株，进而通过发酵工程技术批量生产该菌株，对该基因进行高通量表达，最终为生产提供稳定、高产、高效的微生物制剂。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种克隆未知基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：蛋白质序列测定及数据分析；
S2：将上述蛋白电泳所得的蛋白条带取样，将取样的蛋白条放入检测设备中进行二级质谱分析；
S3：预测蛋白质序列数据汇总整理：
①根据测序反馈回来的蛋白质信息，进行分析，首先将不同数据库中的蛋白质分别整理，每个数据库中每个样品的，每种蛋白质名称、分子量大小等电点、肽段数和序列号等各种原始数据分类归纳到一起。
②将所有数据库的数据放在一起整理，将相同蛋白质的整理在一起，比较相同蛋白质的菌株来源和分子量以及肽段数等的区别。
③将相同的蛋白质归为一组，整理蛋白质与菌株。
S4：预测蛋白的分组及氨基酸序列数据库的建立：
根据上述整理出来的预测蛋白质的数据，通过每种蛋白不同菌株来源的序列号进入相应的数据库中进行氨基酸序列的搜索查询，并下载每种蛋白质的氨基酸信息，保存在单独的文本文档并命名以建立个人蛋白质数据库。
S5：引物设计：
1)用Vector NTI Advance 11软件对氨基酸序列进行比对，将同源性较高的归为一组。
2)根据每组蛋白N端和C端的同源性，各取7个氨基酸序列，查对遗传密码子表，将氨基酸序列转化为对应的核酸序列，以基因头尾固定的方式手动设计引物，同时考虑氨基酸的兼并性、酶切位点及其保护碱基。
3)引物合成。
S6：目的基因扩增及测序：以研究菌株总DNA为模板，以下列反应程序和体系扩增目的基因(目的基因被命名为an04)，进而T-克隆。
PCR反应程序：
PCR体系：
S7：目的基因扩增
(1)酶连PCR产物按Takara T4 DNA Ligase使用说明书操作，将目的基因与T-载体连接。
(2)转化常规化学转化法转化E.coli Top10。
(3)测序。
S8：目的基因克隆：将目的基因与表达载体pET15b连接，用常规化学转化法转入表达宿主E.coli BL21(DE3)plysS。
S9：目的基因的诱导及抑菌活性检测：三区划线E.coli BL21(DE3)plysS/pET15b-目的基因，挑取单菌落接种到5mL LB液体培养基中，通过37℃摇床培养，室内放置10h，放置10h后按照1:100的比例转接到1000mL LB培养基中进行扩大培养至A600到0.8～1.0，随后加入0.16mM IPTG(0.8M IPTG 200μL/L)，并在25℃下诱导10h。
抑菌活性检测：以哈维氏弧菌为指示菌，检测克隆基因表达产物的拮抗性能，采用打孔法，具体操作如下：用移液枪吸取1μL过夜培养的哈维氏弧菌发酵液，加入99μL无菌水，稀释为1％，均匀涂布到LB平板上，用无菌黄色枪头大头在培养基上打孔，孔中添加50μL拮抗菌，至拮抗菌完全渗入培养基后28℃培养，9h后观察抑菌活性。
S10：克隆基因诱导表达产物分子量分析，常规蛋白电泳技术，检测方法7诱导表达产物的分子量。
S11：得出结论：
1、抗菌肽电泳：可抑制哈维氏弧菌生长的拮抗菌
BACILLUS PUMILUS E14-3，其发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE离子交换分离，具有拮抗作用的成分经蛋白电泳。分子量在25kD以下，和前期研究中质谱分析结果21kD一致。
2、蛋白质测序及数据分析，将条带取样，条带标注为1，2，3，进行二级质谱分析，预测蛋白质组成及氨基酸序列，根据预测蛋白序列结果，留取蛋白质可信度在85％以上的蛋白质并归类，35个菌株8种不同类型的蛋白质，将来自不同菌株、分子量在21kD左右的蛋白
Phosphoheptose isomerase，在相应数据库中下载对应蛋白质的氨基酸序列信息，由此获得Phosphoheptose isomerase N端和C端氨基酸序列分别为MYHDLIR和EKEMVKA。
3、引物设计通过预测蛋白质Phosphoheptose isomerase的首尾氨基酸序列，设计引物，命名为SW-06F &SW-06R，其序列如下：SW-06F GCTCTAGAATGTAYCATGAYCTNATHCGN SW-06R CGGGATCCRGCYTTRACCATYTCYTTYTC4、目的基因扩增以哈维氏弧菌拮抗菌株BACILLUSPUMILUS E14-3总DNA为模板，按方法4进行PCR扩增并与及T-载体连接：
GCTCTAGAATGTATCATGATCTCATACGTAGTGAACTGAACGAAGCGGCCGATACCCTGGCGAAATTTATCAATGACGATGCCAATATCGACGCCATTCAACGCGCGGCAGTGCTGCTGGCCGACTCCTTCAAAGCCGGCGGGAAAGTCATTTCCTGCGGTAACGGTGGCTCCCACTGTGACGCCATGCATTTTGCCGAAGAGCTGACCGGCCGCTACCGTGAAAACCGCCCAGGCTATCCGGCGATTGCCATTTCCGACGTTAGCCACCTGTCTTGCGTCAGCAACGACTTCGGCTACGAGTATGTGTTTTCGCGCTATGTGGAAGCGGTAGGCCGCGAAGGCGACGTACTGCTGGGCATTTCCACCTCAGGCAACTCCGGCAACATCATTAAAGCTATCGAAGCGGCGCGTGCCAAAGGGATGAAAGTGATCACCCTGACCGGCAAAGACGGCGGCAAAATGGCCGGTTCCGCAGACGTGGAAATCCGCGTACCGCACTTCGGTTACGCCGATCGCATCCAGGAAATTCATATCAAAGCGATCCACATCTTGATTCAGCTGATCGAGAAAGAGATGGTCAAAGCCGGATCCCGA5、目的基因克隆根据T-测序结果，两端添加酶切位点Nde I/BamHI，连入pET15b，转化E.coli Top10，得E.coliTop10/pET15b-an04，目的基因序列如下：
CATATGTATCATGATCTCATACGTAGTGAACTGAACGAAGCGGCCGATACCCTGGCGAAATTTATCAATGACGATGCCAATATCGACGCCATTCAACGCGCGGCAGTGCTGCTGGCCGACTCCTTCAAAGCCGGCGGGAAAGTCATTTCCTGCGGTAACGGTGGCTCCCACTGTGACGCCATGCATTTTGCCGAAGAGCTGACCGGCCGCTACCGTGAAAACCGCCCAGGCTATCCGGCGATTGCCATTTCCGACGTTAGCCACCTGTCTTGCGTCAGCAACGACTTCGGCTACGAGTATGTGTTTTCGCGCTATGTGGAAGCGGTAGGCCGCGAAGGCGACGTACTGCTGGGCATTTCCACCTCAGGCAACTCCGGCAACATCATTAAAGCTATCGAAGCGGCGCGTGCCAAAGGGATGAAAGTGATCACCCTGACCGGCAAAGACGGCGGCAAAATGGCCGGTTCCGCAGACGTGGAAATCCGCGTACCGCACTTCGGTTACGCCGATCGCATCCAGGAAATTCATATCAAAGCGATCCACATCTTGATTCAGCTGATCGAGAAAGAGATGGTCAAAGCCTAAGGATCC6、目的基因转化表达宿主从E.coli Top10/pET15b-an04中提取质粒pET15b-an04，化学法转化表达宿主E.coliBL21(DE3)plysS，得E.coli BL21(DE3)plysS/pET15b-an04，该菌株命名为An04。目的基因的诱导表达及抑菌活性检测诱导：将An04三区划线，C过夜培养，随机挑取5个单菌落，诱导表达目的基因，表达产物用于抑菌活性检测，抑菌活性检测。成功克隆到了拮抗哈维氏弧菌生长的基因。克隆基因诱导表达产物分子量分析，将上述经诱导表达的基因产物，进行SDS-PAGE电泳检测，结果该基因被成功诱导表达，且诱导表达产物分子量在20.1kD处，与Bacillus pumilus E14-3拮抗菌株活性成分分子量为21kD一致。
2.根据权利要求1所述的一种克隆未知基因的方法及，其特征在于：所述摇床培养采用的是摆动幅度一致的摇床。
3.根据权利要求1所述的一种克隆未知基因的方法及，其特征在于：所述S9：目的基因的诱导及抑菌活性检测中，室内放置10h，室内为无尘、无细菌室。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1840663A (zh) * 2006-01-12 2006-10-04 河北师范大学 小麦耐盐基因
CN103725735A (zh) * 2013-12-30 2014-04-16 淮海工学院 一种从短小芽孢杆菌e14中分离抗菌蛋白质的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1840663A (zh) * 2006-01-12 2006-10-04 河北师范大学 小麦耐盐基因
CN103725735A (zh) * 2013-12-30 2014-04-16 淮海工学院 一种从短小芽孢杆菌e14中分离抗菌蛋白质的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN ET AL.: "The ability of marine Bacillus spp. isolated from fish gastrointestinal tract and culture pond sediment to inhibit growth of aquatic pathogenic bacteria", 《IRANIAN JOURNAL OF FISHERIES SCIENCES》 *
刘笋等: "3 株水产动物病原弧菌主要分泌性蛋白的鉴定及其分泌性序列的分析", 《水产学报》 *
刘缙等: "银杏果仁抗菌蛋白的分离纯化及其基因克隆和原核表达初步研究", 《农业生物技术学报》 *
安贤惠等: "哈维氏弧菌拮抗菌E14活性物质的初步研究", 《道客巴巴》 *
梁文裕等: "干燥和复吸水条件下发菜过氧化物氧还蛋白差异表达与基因克隆", 《应用与环境生物学报》 *
马国兴等: "单环剌蠘血红蛋白纯化、基因克隆与生物信息学分析", 《全国笫九届海洋生物技术与创新药物学术会议摘要集》 *

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