CN112586562A - 中药酸奶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药酸奶及其制备方法。本发明制备中药酸奶的方法是包括使中药材提取物预先发酵，接着添加牛奶进行发酵制得酸奶。其中的中药材是铁皮石斛或者刺梨。具体地，该方法先将中药材用水煎煮提取得到提取物，备用；对所得提取物进行高压灭菌，接着以摇瓶发酵方式，接种酿酒酵母进行连续发酵，然后对发酵液进行高压灭菌，接着以静止发酵方式接种复合菌种进行发酵，得到发酵液；向牛奶中添加蔗糖和发酵液进行调配，混合均匀，巴氏杀菌，冷却至常温；向上述混合液料中接种复合菌种混合均匀，放入恒温培养箱42℃，进行发酵，然后置4℃冰箱中冷藏保存24h，得到酸奶。本发明所得酸奶具有优良的效果。
Description
技术领域
本发明涉及中药发酵和奶制品技术领域，具体涉及一种铁皮石斛酸奶或刺梨中药酸奶及其制备方法。
背景技术
功能性酸奶是酸奶的一种，除具备传统酸奶的营养和保健功能，还具有一种或多种改善人体某种生理机能的作用，通常是在普通酸奶的基础上添加某些具有特殊效用的物质。根据加工方式和原料的不同，功能性酸奶可以拥有不同的保健功能和新鲜口味，如添加半乳糖、D-甘露醇、鼠李糖、半乳糖荃酸等具有“3重健抑功效”的健抑轻舒酸奶，添加麦芽糊精、低聚木糖等膳食纤维的减脂酸奶等，因此与普通酸奶相比，功能性酸奶口味更加多样、营养也更为丰富。近年来，随着人民生活水平和健康意识的普遍提高，致越来越多的消费已开始重视“健康酸奶”这一话题，对功能性酸奶的期待日趋热烈。
近年来，市场上不断出现将药食同源中药与酸奶结合的多种畅销的功能性酸奶，如折耳根酸奶、红枣酸奶等。实质上，通过一种或几种益生菌发酵中药，主要是利用微生态学、仿生学的方法，在体外模拟人体肠道环境和功效成分在体内的消化分解过程，对提取的功效成分进行生物学转化，提高肠道的吸收效率及功效。
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是一种益胃生津，滋阴清热的药食同源中药，为兰科石斛属多年生附生型草本植物，素有“救命仙草”之称，含有石斛多糖、生物碱、氨基酸、黄酮类化合物及钙、镁、磷等矿物质和B族维生素等各种微量元素，营养价值极高，并具有抗氧化、抗衰老、降血糖和提高人体免疫力等功效。
刺梨，Rosa roxburghii Tratt.f.normalis Rehd.Et Wils.，又名：送春归、茨梨等，为蔷薇科植物刺梨的果实，酸涩，归脾、肾，胃经，具有健胃、消食、止泻等功效，常用于治疗食积饱胀。刺梨富含维C、维E、维B1、维B2等多种维生素和钙、铁、锌、硒等微量元素，还含有对抗白血病的天门冬氨酸，可谓是一种防病养生的“营养珍果”。每百克刺梨中维生素C含量为2585毫克，被誉为维C之王。目前已有相关采用刺梨为原料的产品，但市场上未见刺梨酸奶制品。另外，目前，市场上鲜有以铁皮石斛为原料的功能性酸奶，且以往铁皮石斛主要以原粉进行发酵，而以铁皮石斛提取液先制备成铁皮石斛发酵液者较少，对于其有效成分的研究则更少，不利于铁皮石斛酸奶的规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用铁皮石斛作为原料制备的酸奶，即铁皮石斛酸奶。本发明的目的还在于提供一种使用刺梨作为原料制备的酸奶，即刺梨酸奶。已经出人意料的发现，通过本发明方法制备的酸奶呈现如本发明所述优异技术效果，本发明因此发现而得以完成。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明的目的是提供一种中药酸奶及其制备方法。所述方法包括使铁皮石斛提取物预先发酵，接着添加牛奶进行发酵制得酸奶。
上述的一种铁皮石斛中药酸奶及其制备方法，所述的铁皮石斛可为干条。
上述的一种铁皮石斛中药酸奶及其制备方法，主要是通过以铁皮石斛为原料，经蒸馏水回流提取所获得的铁皮石斛提取物。
上述的一种铁皮石斛中药酸奶及其制备方法，主要是以优选的益生菌，利用微生态、仿生学的方法，在体外模拟人体的肠道环境和中药成分在人体内的消化分解过程，对铁皮石斛提取物进行第一次发酵，获得发酵液；
上述的一种铁皮石斛中药酸奶及其制备方法，主要是将铁皮石斛提取物的一次发酵液与奶一起发酵，获得铁皮石斛酸奶。
本发明的另一目的是提供一种刺梨中药酸奶及其制备方法。所述方法包括使刺梨提取物预先发酵，接着添加牛奶进行发酵制得酸奶。
上述的一种刺梨中药酸奶及其制备方法，所述的刺梨可为野生刺梨、刺梨干等。
上述的一种刺梨中药酸奶及其制备方法，主要是通过鲜果榨汁获得原汁或用刺梨干作为原料获得提取物。
上述的一种刺梨中药酸奶及其制备方法，主要是以优选的益生菌，利用微生态、仿生学的方法，在体外模拟人体的肠道环境和中药成分在人体内的消化分解过程，对刺梨原汁或提取物进行第一次发酵，获得发酵液；
上述的一种刺梨中药酸奶及其制备方法，主要是通过第一次发酵降低刺梨中的单宁等涩味物质含量，提高营养成分的释放效率，减少刺梨可能引起的肠胃不适。
上述的一种刺梨中药酸奶及其制备方法，主要是将刺梨原汁或提取物的一次发酵液与奶一起发酵，获得刺梨酸奶。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备中药酸奶的方法，其包括如下步骤：
(1)制备提取物：将中药材(例如铁皮石斛干条或刺梨干)用水煎煮提取得到提取物，备用；
[例如，铁皮石斛干条分2次水煎煮提取，第一次提取料液比1:10，提取时间4h；第二次提取料液比1:8，提取时间3h，合并两次提取液，浓缩成0.5g生药/mL浓度的提取物，备用]
或者[例如，刺梨干打粉，过20目筛，分2次水煎煮提取，第一次提取料液比1:8，提取时间2h；第二次提取料液比1:6，提取时间1h，合并两次提取液，浓缩成1g生药/mL浓度的提取物，备用]
(2)提取物的发酵：对步骤(1)所得提取物进行高压灭菌，接着以摇瓶发酵方式，接种酿酒酵母进行连续发酵，然后对发酵液进行高压灭菌，接着以静止发酵方式接种复合菌种进行发酵，得到发酵液；
[例如，所述高压灭菌是指121℃灭菌30min；例如，酿酒酵母发酵时接种量5×103CFU/mL；例如，摇瓶发酵方式是在温度35℃、转速120rpm发酵条件下，连续摇动发酵10h；例如，复合菌种包含保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌；例如，复合菌种是以菌数计各菌比例为4/8/3/3/2的混合菌粉；例如，混合菌粉的接种量2×102CFU/mL；例如，静止发酵方式是在恒温培养箱43℃的发酵条件下连续静止发酵24h]
(3)调配：向牛奶中添加蔗糖和发酵液进行调配，混合均匀，巴氏杀菌法加热至90℃，持续5min，冷却至常温；
[例如，调配时铁皮石斛发酵液添加量为2.5％；例如，调配时蔗糖添加量为70mg/ml；例如，调配时还添加甘油磷酸钙；例如，调配时还添加0.12％的甘油磷酸钙；例如，调配时还添加门冬氨酸；例如，调配时还添加0.6％的门冬氨酸；例如，调配时还添加0.12％的甘油磷酸钙和0.6％的门冬氨酸]
或者[例如，调配时刺梨发酵液添加量为5％；例如，调配时蔗糖添加量为70mg/ml；例如，调配时还添加甘油磷酸钙；例如，调配时还添加0.12％的甘油磷酸钙；例如，调配时还添加门冬氨酸；例如，调配时还添加0.5％％的门冬氨酸；例如，调配时还添加0.12％的甘油磷酸钙和0.5％％的门冬氨酸]
(4)酸奶发酵：向上述混合液料中接种复合菌种混合均匀，放入恒温培养箱42℃，进行发酵，然后置4℃冰箱中冷藏保存24h，得到酸奶(例如铁皮石斛酸奶或刺梨酸奶)。
[例如，复合菌种是由嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌组成的复合菌种；例如，该复合菌种是混合菌粉，其以菌数计各菌比例为3/8/2/3/2/2/2/1；例如，复合菌种添加量为1mg/ml；例如，42℃发酵时长为10h]
在本发明中，涉及％时，如未另外说明是指某物质占其总物料的百分数，若该物质和总物料均为固体则为重量/重量百分数，若该物质和总物料均为液体则为体积/体积百分数，若该物质为固体且总物料为液体则为重量/体积百分数。本发明出人意料的发现，在酸奶发酵时额外添加甘油磷酸钙和门冬氨酸可以显著延长酸奶中乳酸菌的效期。
本发明的有益效果：本发明采用两步发酵法，不仅可以最大限度保留有效营养成分和特有芳香，而且可以保证酸奶良好的口感和外观特征。
本发明的优点在于：本发明以铁皮石斛干条的提取物为原料，原材料在全国范围内种植面积大，来源广，具有更大的市场优势和广阔的市场前景。此外，采用此项工艺制备的铁皮石斛复合酸奶，产品风味及口感稳定性好，适于企业大规模生产。铁皮石斛中药发酵后口感明显得到改善，各种功效性成分含量基本保持不变。本发明的优点还在于：本发明不仅可以刺梨原汁为原料，而且可以刺梨干作为原材料，全年也可生产，不受果期影响，具有更大的市场优势和广阔的市场前景。此外，采用此项工艺制备的刺梨复合酸奶，不同批次产品的风味及口感稳定性好，更适合企业大规模生产。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本申请进行进一步的描述，然而，本申请的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本申请的精神和范围的前提下，可以对本申请进行各种变化和修饰。本申请对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本申请目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本申请仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本申请，而不是限制本申请。
实施例1、铁皮石斛提取物的制备
将铁皮石斛干条，用水煎煮提取，第一次提取料液比1:10，提取时间4h；第二次提取料液比1:8，提取时间3h，合并两次提取液，浓缩成0.5g生药/mL浓度的提取物备用。
实施例2、铁皮石斛提取物的发酵
2.1发酵菌种：(1)混合菌种：保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaricus、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus、嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、干酪乳杆菌Lactobacillus casei(混合菌粉，其以菌数计各菌比例为4/8/3/3/2)。(2)单一菌种：酿酒酵母Saccharomyce cerevisiae。
2.2发酵方法：提取物发酵实验采用“三分法(分菌——真菌与细菌、单菌与复合菌；分段——二步发酵；分条件——震荡发酵和静止发酵)”进行。按过程可以分为酵母菌发酵阶段和5菌复合发酵阶段。发酵过程：在进行发酵前，于无菌条件下分别对高压灭菌后的中药提取物进行取样(发酵前样品)，留待各项指标检测。酵母菌发酵为第一发酵阶段，采用摇瓶发酵方式。接种量5×103CFU/mL、温度35℃、转速120rpm发酵条件下，连续摇动发酵10h。第一发酵阶段结束后，于无菌条件下分别对发酵液进行取样，留待各项指标检测。取样完成后，将发酵产物置于121℃，30min条件下灭菌，冷却后，接复合菌种(接种量2×102CFU/mL)进行二次发酵。此阶段采用静止发酵方式。复合5菌接种完成后，摇匀，在恒温培养箱43℃的发酵条件下，连续静止发酵24h。两阶段共发酵34h。第二发酵阶段结束后，于无菌条件下分别对发酵液进行取样，并对各项指标进行检测。
2.3指标检测：包括pH测定、发酵菌数量测定、浊度测定、口感评价。
(1)测pH值：按规定取样或制备样本，置小烧杯中，用供试液淋洗电极数次，将电极浸入供试液中，轻摇供试液平衡稳定后，进行读数。进行平行试验2次，以算数平均值作为测定结果。
(2)酵母计数方法：①样品的稀释：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的适宜容器内(预置适当数量的无菌玻璃珠)，充分振摇1min～2min，制成1:10的样品匀液。②取1mL1：10样品匀液注入含有9mL无菌稀释液的试管中，在旋涡混合器上混匀，此液为1：100的样品匀液。③制备10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1mL无菌吸管。在进行10倍递增稀释的同时，选择10-5和10-6稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL无菌稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。④及时将20mL～25mL冷却至46℃的沙氏培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。置水平台面待培养基完全凝固。⑤培养。琼脂凝固后，正置平板，置28℃±1℃培养箱中培养，观察并记录培养至第5d的结果。⑥计数。用肉眼观察，选取菌落数在10CFU～150CFU的平板。记录稀释倍数和相应酵母菌落数。
(3)细菌总数计数方法：①样品的稀释：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀,制成1∶10的样品匀液；用1mL微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液；按b操作，制备10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1mL吸头；在进行10倍递增稀释的同时，选择10-5和10-6稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL无菌稀释液加入2个无菌平皿作空白对照；及时将20mL～25mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。②培养。琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。③计数。可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
(4)浊度测定：①零浊度水制备：将蒸馏水通过0.2μm滤膜过滤，收集于用滤过水荡洗两次的烧瓶中。②标准浊度液制备：硫酸肼溶液：称取1.000g硫酸肼((NH2)2SO4·H2SO4)溶于水中，定容至100ml；六次甲基四胺溶液：称取10.00g六次甲基四胺((CH2)6N4)溶于水中，定容至100ml；浊度标准溶液：吸取5.00ml硫酸肼溶液与5.00ml六次甲基四胺溶液于100ml容量瓶中，混匀。于25℃±3℃下静置反应24h。冷却后用水稀释至标线，混匀。③浊度测定。标准曲线的绘制：吸取浊度标准溶液0、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00和12.50ml，置于50ml比色管中，加无浊度水至标线。摇匀后即得浊度为0、4、10、20、40、80、100的标准系列。在680nm波长下，用3cm比色皿，测定吸光度，绘制校准曲线。④水样的测定。吸取50.0ml摇匀水样(无气泡，如浊度超过100度可酌情少取，用无浊度水稀释至50.0ml)，于50ml比色管中，按绘制校准曲线步骤测定吸光度，由校准曲线上查得水样浊度。⑤结果计算。计算式为：
浊度(度)＝A(B+C)/C
式中：
A——稀释后水样的浊度(度)；
B——稀释水体积(m1)；
C——原水样体积(ml)。
(5)感官评价：参照《GB/T10220-2012》(国家标准-感官分析方法学总论)采用描述性检验方法中自由选择剖面对样本进行评价。评价小组的每一位人员对样品的多种特性进行评价并尽力表征和区分，产生各自独特的描述性词汇表。根据每个评价员的词汇构建常规描述评估单完成对样品的评价。
(6)铁皮石斛粗多糖含量测定
参照SN/T4260-2015食品安全国家标准中出口植物源食品中粗多糖的测定方法，苯酚-硫酸法对铁皮石斛酸奶中粗多糖含量进行测定。
(7)生物碱含量测定
参照GH/T1107-2015食品安全国家标准中蜂蜜中5种双稠吡咯啶类生物碱的测定方法，高效液相色谱-质谱/质谱法对铁皮石斛酸奶中生物碱含量进行测定。
2.4发酵结果：
(1)发酵前后铁皮石斛粗多糖含量测定结果
| 添加类别 | 发酵前粗多糖含量(质量/体积) | 发酵后粗多糖含量(质量/体积) |
| 铁皮石斛 | 27.319％ | 25.244％ |
(2)发酵前后生物碱含量检查结果
| 添加类别 | 发酵前生物碱含量(质量/体积) | 发酵后生物碱含量(质量/体积) |
| 铁皮石斛 | 0.125％ | 0.101％ |
(3)发酵前后pH测定结果
发酵前pH值为5，第一阶段结束时pH值为4，第二阶段结束时pH值为4。
(4)发酵后酵母计数CFU结果
第一阶段发酵酵母计数CFU结果为4.5×106CFU/mL。
(5)发酵后细菌计数CFU结果
第二阶段发酵细菌计数CFU结果为7.1×104CFU/mL。
(6)发酵后浊度测定结果
第二阶段发酵结束时浊度为465。
(7)感官评价
发酵前的感官评价为气淡淡清香，味甜，余味甜，滞留时间长。第一阶段发酵的感官评价为可闻及淡淡米酒香味。气香，味微酸。余味微酸，滞留时间短。第二阶段发酵的感官评价为可闻及淡淡米酒香味。气香，味微甜，余味略有微酸，滞留时间短。
2.5通过分段发酵，发酵产物中的粗多糖和生物碱含量变化，显著改善了发酵产物的口感和含菌量变化。
实施例3、铁皮石斛酸奶的发酵
3.1实验方法
3.1.1铁皮石斛酸奶的工艺制备流程如下：
蔗糖+铁皮石斛发酵液+牛奶→调配→均质→杀菌→冷却→接种→发酵→冷藏→检验→铁皮石斛酸奶。
3.1.2铁皮石斛酸奶制备的工艺操作要点
(1)铁皮石斛发酵液制备：由“实施例2”提供。
(2)调配、均质、杀菌、冷却：以牛奶为基液添加规定量的蔗糖和发酵液，调配并均质后，巴氏杀菌法加热至90℃，持续5min，冷却至常温。
(3)接种、发酵：无菌条件下，选用由嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌组成的复合菌种(混合菌粉，其以菌数计各菌比例为3/8/2/3/2/2/2/1)，接入调配后乳液中，混合均匀，放入恒温培养箱42℃，进行发酵。
(4)冷藏：发酵后放入冰箱中，4℃冷藏保存24h，即得酸奶。
(5)器具准备：在实验进行前，对所要用的实验器具在121℃、持续20min条件下高温灭菌。
3.1.3铁皮石斛酸奶的感官评价方法
感官评价标准参照GB19302《食品安全国标-发酵乳》、GB 12310国标-感官分析方法，并综合相关文献资料关于酸奶的评价标准进行设定，以色泽、风味、口感、组织状态各25分为评价指标，酸奶相关形态特征为评分标准，制定总分为100分的评定标准表(见表1)。参评人员选用年龄在18～45岁的10位(男女各5人)组成，并对其进行相关专业评分培训，由其对各批次铁皮石斛酸奶进行感官品尝打分。
表1铁皮石斛酸奶的感官评定标准表
3.1.4实验设计
3.1.4.1铁皮石斛酸奶制备工艺的单因素试验
按照“1.2.1”铁皮石斛酸奶制备流程，选取铁皮石斛发酵液添加量、复合菌种添加量、蔗糖添加量、发酵时长4个单因素，在发酵温度42℃条件下，进行单因素试验，通过以感官评分为主要指标，分析确定铁皮石斛酸奶制备工艺最佳单因素条件。
(1)铁皮石斛发酵液添加量对酸奶感官品质的影响
在100ml鲜牛奶基础上，分别按0.5％、1.0％、1.5％、2.0％的铁皮石斛发酵液添加量、0.8mg/ml复合菌种添加量，70mg/ml蔗糖添加量，在42℃发酵温度，10h的发酵时长条件下进行发酵，冷藏后进行感官评价分析。
(2)复合菌种添加量对酸奶感官品质的影响
在42℃发酵10h条件下，以100ml鲜牛奶为基准，分别按0.6、0.8、1.0、1.2mg/ml复合菌种的添加量进行接种，加入1.0％的铁皮石斛发酵液，70mg/ml的蔗糖，制备铁皮石斛酸奶做对比试验，冷藏后进行感官评价分析。
(3)蔗糖添加量对酸奶感官品质的影响
在42℃发酵10h条件下，以100ml鲜牛奶为基准，添加1.0％的铁皮石斛发酵液，0.8mg/ml的复合菌种，分别添加50、60、70、80、90mg/ml的蔗糖做对比试验，冷藏后进行感官评价分析。
(4)发酵时长对酸奶感官品质的影响
在100ml鲜牛奶基础上，加入1.0％的铁皮石斛发酵液，70mg/ml的蔗糖，0.8mg/ml的复合菌种，发酵温度为42℃，分别设定发酵时长为6、8、10、12h做对比试验，冷藏后进行感官评价分析。
3.1.4.2铁皮石斛酸奶制备工艺优化的正交试验
(1)因素及水平的选定
根据单因素实验分析结果与正交试验设计原理，以感官评分为评价指标，选取铁皮石斛发酵液添加量(A)、复合菌种添加量(B)、蔗糖添加量(C)、发酵时长(D)4个因素作自变量，并添加误差项(E)，以感官评价综合评分(Y)为响应值，进行五因素四水平的正交实验设计，完成对铁皮石斛酸奶制备艺优化的进一步分析。
(2)正交试验的设计及方差分析
根据正交实验的直观分析和方差分析结果，确定铁皮石斛酸奶的最优制备工艺。
(3)再验证实验
以正交试验得到的各因素最佳水平组合，结合实际实验操作，确定铁皮石斛酸奶最佳制备工艺后，制备铁皮石斛酸奶最佳制备工艺酸奶样本，并进行感官评分验证。
3.2实验结果
3.2.1铁皮石斛酸奶制备工艺的单因素试验结果
(1)铁皮石斛发酵液添加量对酸奶感官品质的影响结果
如表2所示，铁皮石斛发酵液添加量在0.5％-2.0％区间内，随着铁皮石斛发酵液添加量增加酸奶感官得分逐渐增加，原因是铁皮石斛发酵液加入过少则无铁皮石斛风味或明显不足，影响口感；当铁皮石斛发酵液添加量超过1.0％时，酸奶感官得分由增高又逐渐降低，原因是铁皮石斛发酵液添加量过大则易导致酸奶析出乳清且药味较重，影响酸奶的组织形态、色泽及口味；在添加量为1.0％时感官评分最高，说明单因素1.0％铁皮石斛发酵液添加量的酸奶感官品质最佳。因此，选定0.5％、1.0％、1.5％及2.0％为优化范围做下一步研究较为适宜。
表2铁皮石斛发酵液添加量对酸奶感官品质的影响
注：为中药发酵液添加量的单因素考察。
(2)复合菌种添加量对酸奶感官品质的影响结果
如表3所示，复合菌种添加量在0.6mg/ml-1.0mg/ml区间内，随着复合菌种添加量的增加酸奶感官得分逐渐增加，原因是由于复合菌种添加量较小则酸奶的凝乳能力不够，不利于发酵，会直接影响酸奶组织形态、口感及色泽，导致评分较低。当复合菌种添加量超过0.8mg/ml时，酸奶感官得分由增高又逐渐降低，原因是由于复合菌种添加量较大则会引起发酵速度过快，导致酸奶乳清析出，口感偏酸而影响和掩盖中药风味。在添加量为0.8mg/ml时感官评分最高，说明单因素复合菌种添加量为0.8mg/ml的酸奶感官品质最佳。综合考虑，选定0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml为优化范围做下一步研究较为适宜。
表3复合菌种添加量对酸奶感官品质的影响
| 添加量(mg/ml) | 感官评价 | 评分 |
| 0.6 | 色泽差，乳清析出，口感差，风味不佳 | 85.3 |
| 0.8 | 色泽差，少量乳清析出，口感一般，风味欠佳 | 86.3 |
| 1.0 | 酸奶品质较好，口感良好，铁皮石斛风味佳 | 89.7 |
| 1.2 | 酸奶品质质较好，口感良好，风味色泽一般 | 83.7 |
(3)蔗糖添加量对酸奶感官品质的影响结果
如表4所示，蔗糖添加量对酸奶感官品质的影响较大。蔗糖添加量在50mg/ml-70mg/ml区间内，随着蔗糖添加量的增加酸奶感官得分逐渐增加，原因是由于蔗糖添加量较少则酸奶的凝乳效果较差并且口味偏酸，影响口感，导致评分较低。当蔗糖添加量超过70mg/ml时，酸奶感官得分由增高又逐渐降低，原因是由于蔗糖添加量较多则会影响水分活度，不利于发酵菌发酵，且口味酸甜不协调。在添加量为70mg/ml时感官评分最高，说明单因素复合菌种添加量为70mg/ml的酸奶感官品质最佳。综合考虑，选取50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml为优化范围做下一步研究较为适宜。
表4蔗糖添加量对酸奶感官品质的影响
| 添加量(mg/ml) | 感官评价 | 评分 |
| 50 | 色泽良好，凝乳稍欠佳，口味偏酸 | 75.5 |
| 60 | 色泽良好，酸奶品质较好，口味酸甜适中 | 78.3 |
| 70 | 色泽良好，酸奶品质较好，口味酸甜适中 | 85.5 |
| 80 | 色泽良好，酸奶品质较好，口味偏甜 | 79.8 |
| 90 | 色泽良好，酸奶品质一般，口味过甜 | 73.1 |
(4)发酵时长对酸奶感官品质的影响结果
如表5所示，发酵时长在6h-10h区间内，随着发酵时长的延长酸奶感官得分逐渐增高，原因是由于发酵时间较短则会引起凝乳能力不足乳清析出，且乳酸菌的增殖效果欠佳，影响酸奶的组织形态、口感、风味，导致感官评分较低；当发酵时长超过10h时，酸奶感官得分由增高又逐渐降低，原因是由于发酵时间过长则会引起凝乳过度，乳清析出，且酸奶酸度增加，口味偏酸，影响感官评分。在发酵时长为10h时感官评分最高，说明单因素发酵时长10h的酸奶感官品质最佳。综合考虑，选取发酵时长6h、8h、10h、12h为优化范围做下一步研究较为适宜。
表5发酵时长对酸奶感官品质的影响
| 发酵时长(h) | 感官评价 | 评分 |
| 6 | 表面无光泽，乳清析出，口味偏甜 | 76.6 |
| 8 | 色泽较差，少量乳清析出，口味稍甜 | 80.9 |
| 10 | 色泽良好，酸奶品质较好，口感适宜 | 84.2 |
| 12 | 色泽较差，少量乳清析出，口味偏酸 | 78.5 |
3.2.2铁皮石斛酸奶制备工艺优化的正交试验结果
3.2.2.1正交试验因素与水平选定结果(见表6)
表6正交试验因素水平表
3.2.2.2正交试验设计及结果(见表7)
表7正交试验设计及结果表
注：因素A为铁皮石斛发酵液添加量、因素B为复合菌种添加量、因素C为蔗糖添加量、因素D为发酵时长、因素E为空白误差项；k1、k2、k3、k4为各因素各水平总感官评分的均值；极差R值为该因素k1、k2、k3、k4中最大值减最小值。
由表7可见，因素A、B、C、D中k2、k3、k3、k3值最大，表明最优组合应为A2B3C3D3，即铁皮石斛发酵液添加量为1.0％、复合菌种添加量为1mg/ml、蔗糖添加量为70mg/ml、发酵时长为10h为铁皮石斛酸奶最优制备条件。同时极值为A＞C＞D＞B，表明对铁皮石斛酸奶感官评分主次顺序为铁皮石斛发酵液添加量＞蔗糖添加量＞发酵时长＞复合菌种添加量。
3.2.2.3正交试验方差分析结果(见表8)
表8正效试验方差分析结果
| 方差来源 | 偏差平方和 | 自由度 | F值 | 显著性 |
| A | 661.19 | 3 | 141.04 | ** |
| B | 17.19 | 3 | 3.67 | |
| C | 208.69 | 3 | 44.52 | ** |
| D | 198.69 | 3 | 42.38 | ** |
| E(误差) | 4.69 | 3 |
注：因素A为铁皮石斛发酵液添加量、因素B为复合菌种添加量、因素C为蔗糖添加量、因素D为发酵时长；E为实验中设定的误差项，以A、B、C、D均方值比E均方值得到F值；F0.05(3,3)＝9.280、F0.01(3,3)＝29.500；*为有显著性影响(0.01≤P＜0.05)，**为有极显著性影响(P＜0.01)。
由表8可见，铁皮石斛发酵液添加量、复合菌种添加量、蔗糖添加量、发酵时长的F值分别为141.04、3.67、44.52、42.38，结合查询F值表，其分别为P＜0.01、0.05＞P＞0.01、P＜0.01、P＜0.01，表明铁皮石斛发酵液添加量对酸奶感官评分具有极显著性影响，蔗糖及发酵时长对酸奶感官评分具有显著性影响，复合菌种加入量则无显著性影响。结合F值大小，表明对酸奶感官评分影响大小分别为铁皮石斛发酵液添加量＞蔗糖添加量＞发酵时长＞复合菌种添加量，与直观分析结果一致。
3.2.2.4再验证实验
结合正交试验优化的因素水平结果，选定铁皮石斛发酵液添加量为2.5％、复合菌种添加量为1mg/ml、蔗糖添加量为70mg/ml、发酵时长为10h以及发酵温度为42℃为最佳组合，制备铁皮石斛酸奶，得到感官评分结果为90.4分，表明该制备工艺为最佳制备工艺。
实施例4、铁皮石斛酸奶的品质及稳定性研究
4.1实验方法
4.1.1铁皮石斛酸奶的制备
按上述实施例3铁皮石斛酸奶制备工艺优化后的最佳组合参数进行制备，所得铁皮石斛酸奶4℃冰箱冷藏保存，备用。
4.1.2铁皮石斛酸奶中标志性成分含量测定
(1)铁皮石斛粗多糖含量测定
参照SN/T4260-2015食品安全国家标准中出口植物源食品中粗多糖的测定方法，苯酚-硫酸法对铁皮石斛酸奶中粗多糖含量进行测定。复合菌种添加前后铁皮石斛粗多糖含量测定结果：
| 添加类别 | 添加前粗多糖含量(质量/体积) | 添加后粗多糖含量(质量/体积) |
| 铁皮石斛 | 0.614％ | 0.586％ |
(2)生物碱含量测定
参照GH/T1107-2015食品安全国家标准中蜂蜜中5种双稠吡咯啶类生物碱的测定方法，高效液相色谱-质谱/质谱法对铁皮石斛酸奶中生物碱含量进行测定。复合菌种添加前后生物碱含量检查结果：
4.1.3铁皮石斛酸奶的品质研究
铁皮石斛酸奶的品质研究主要包括酸奶感官指标、理化指标、微生物指标、活菌数测定、pH值和酸度的测定等，按照《食品安全国家标准》GB 19302-2010规定对相关指标进行测定分析，完成铁皮石斛酸奶的品质研究。酸奶品质相关指标测定方法及标准如下表9。
表9铁皮石斛酸奶的品质相关指标测定方法及标准表
| 测定指标 | 参照国标方法 | 标准 | 单位 |
| 脂肪含量 | GB5413.3-2010 | ≥3.1 | g/100g |
| 非脂乳固体 | GB5413.39-2010 | ≥8.1 | g/100g |
| 蛋白质 | GB/T5009.5-2010 | ≥2.9 | g/100g |
| 大肠菌群 | GB4789.3-2010 | ≤5 | CFU/g |
| 金黄色葡萄球菌 | GB4789.10-2010 | ≤0 | CFU/g |
| 沙门氏菌 | GB4789.4-2010 | ≤0 | CFU/g |
| 酵母菌 | GB4789.15-2010 | ≤100 | CFU/g |
| 霉菌 | GB4789.15-2010 | ≤30 | CFU/g |
| 乳酸菌 | GB4789.35-2010 | ≥1×10<sup>6</sup> | CFU/g |
| 酸度 | GB5413.34-2010 | ≥70 | °T |
4.1.4铁皮石斛酸奶的稳定性研究
研究铁皮石斛酸奶在4℃冷藏保存下，24天内酸奶酸度、pH值、乳酸菌活菌数、标志性成分含量和感官品质的变化，依据表9中对应的国家标准规定的方法前三项进行测定，并检测酸奶生物碱和粗多糖含量，根据感官评价方法进行评定，综合以上测定的数据进行分析，完成铁皮石斛酸奶的稳定性研究。
4.2实验结果
4.2.1铁皮石斛酸奶中标志性成分含量测定
依上述实验条件于空白对照组中均未检测出铁皮石斛总黄酮及挥发油，同时测得铁皮石斛酸奶中粗多糖含量为5.86‰、生物碱含量为0.023‰。
4.2.2铁皮石斛酸奶的品质研究结果
依上述实验条件测得铁皮石斛酸奶品质研究各项指标结果如下表10。
表10铁皮石斛酸奶品质研究结果
4.2.3铁皮石斛酸奶的稳定性研究
依上述实验条件测得铁皮石斛酸奶稳定性研究结果见下表11。
表11铁皮石斛酸奶稳定性研究结果
由表11可见，铁皮石斛酸奶在4℃冰箱冷藏保存24天内，其酸度、pH值、乳酸菌数量、总黄酮含量、挥发油含量及感官评分均有不同程度的变化，研究分析相应的数据情况，随着时间推移，铁皮石斛酸奶的酸度上升但仍符合要求、乳酸菌数量逐渐下降，在18天时乳酸菌数量下降至低于国家标准要求，总黄酮及挥发油含量基本保持稳定，结合感官评分综合分析，铁皮石斛酸奶在15天内各方面品质均比较稳定。
实施例5、铁皮石斛酸奶的品质及稳定性研究
参考实施例3的最佳组合参数的制备工艺制备酸奶，不同的仅是在调配工序中(a)还额外添加甘油磷酸钙0.12％和0.6％门冬氨酸、(b)还额外添加甘油磷酸钙0.12％、或(c)还额外添加0.6％门冬氨酸，分别得到可称为实施例5a、实施例5b、实施例5c的三种酸奶；接着参照实施例4的方法对酸奶品质和稳定性进行考察。结果，
实施例5a、实施例5b、实施例5c三种酸奶中的铁皮石斛粗多糖含量的变化与实施例4之4.1.1的酸奶(可称为实施例4酸奶)结果基本一致，复合菌种添加前粗多糖含量均在0.60～0.63％范围内、添加后粗多糖含量均在0.57～0.60％范围内，例如实施例5a酸奶在复合菌种添加前后粗多糖含量分别为0.613％和0.616％；
实施例5a、实施例5b、实施例5c三种酸奶中的生物碱含量的变化与实施例4之4.1.1的酸奶结果基本一致，复合菌种添加前后生物碱含量均在0.0022～0.0026％范围内，例如实施例5a酸奶在复合菌种添加前后生物碱含量分别为0.0024％和0.0023％；
实施例5a、实施例5b、实施例5c三种酸奶中的品质研究结果与实施例4之4.1.1的酸奶之表10结果基本一致，例如实施例5a酸奶的脂肪含量为4.53、蛋白质为4.36、乳酸菌为9.78×109、酸度为88.34；
24天稳定性试验中，实施例5a、实施例5b、实施例5c三种酸奶的酸度、pH值、生物碱、粗多糖、感官评分与表11结果基本一致，例如实施例5a酸奶0～24天的粗多糖均在0.58～0.60％范围内；
24天稳定性试验中，不同实施例所得酸奶中的乳酸菌呈现不同的变化趋势，具体如下：
根据上述结果可知，实施例5a在24天时乳酸菌含量才降到1×106CFU/g以下，可以在21天内保持乳酸菌含量大于标准规定范围。由于酸奶是快速消费品，因此增加6天的保质期是具有相当大的意义的，为产品的供应链和销售链提供了显著更有益的贮运条件。
实施例11、刺梨干提取物的制备
将刺梨干打粉，过20目筛，用水煎煮提取，第一次提取料液比1:8，提取时间2h；第二次提取料液比1:6，提取时间1h，合并两次提取液，浓缩成1g生药/ml浓度的提取物备用。
实施例12、刺梨干提取物的发酵
2.1发酵菌种：(1)混合菌种：保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaricus、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus、嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、干酪乳杆菌Lactobacillus casei(混合菌粉，其以菌数计各菌比例为4/8/3/3/2)。(2)单一菌种：酿酒酵母Saccharomyce cerevisiae。
2.2发酵方法：提取物发酵实验采用“三分法(分菌——真菌与细菌、单菌与复合菌；分段——二步发酵；分条件——震荡发酵和静止发酵)”进行。按过程可以分为酵母菌发酵阶段和5菌复合发酵阶段。发酵过程：在进行发酵前，于无菌条件下分别对高压灭菌后的中药提取物进行取样(发酵前样品)，留待各项指标检测。酵母菌发酵为第一发酵阶段，采用摇瓶发酵方式。接种量5×103CFU/mL、温度35℃、转速120rpm发酵条件下，连续摇动发酵10h。第一发酵阶段结束后，于无菌条件下分别对发酵液进行取样，留待各项指标检测。取样完成后，将发酵产物置于121℃，30min条件下灭菌，冷却后，接复合菌种(接种量2×102CFU/mL)进行二次发酵。此阶段采用静止发酵方式。复合5菌接种完成后，摇匀，在恒温培养箱43℃的发酵条件下，连续静止发酵24h。两阶段共发酵34h。第二发酵阶段结束后，于无菌条件下分别对发酵液进行取样，并对各项指标进行检测。
2.3指标检测：包括pH测定、发酵菌数量测定、细菌总数测定、浊度测定、口感评价。
(1)测pH值：按规定取样或制备样本，置小烧杯中，用供试液淋洗电极数次，将电极浸入供试液中，轻摇供试液平衡稳定后，进行读数。进行平行试验2次，以算数平均值作为测定结果。
(2)酵母计数方法：①样品的稀释：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的适宜容器内(预置适当数量的无菌玻璃珠)，充分振摇1min～2min，制成1:10的样品匀液。②取1mL1：10样品匀液注入含有9mL无菌稀释液的试管中，在旋涡混合器上混匀，此液为1：100的样品匀液。③制备10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1mL无菌吸管。在进行10倍递增稀释的同时，选择10-5和10-6稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL无菌稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。④及时将20mL～25mL冷却至46℃的沙氏培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。置水平台面待培养基完全凝固。⑤培养。琼脂凝固后，正置平板，置28℃±1℃培养箱中培养，观察并记录培养至第5d的结果。⑥计数。用肉眼观察，选取菌落数在10CFU～150CFU的平板。记录稀释倍数和相应酵母菌落数。
(3)细菌总数计数方法：①样品的稀释：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀,制成1∶10的样品匀液；用1mL微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液；按b操作，制备10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1mL吸头；在进行10倍递增稀释的同时，选择10-5和10-6稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL无菌稀释液加入2个无菌平皿作空白对照；及时将20mL～25mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。②培养。琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。③计数。可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
(4)浊度测定：①零浊度水制备：将蒸馏水通过0.2μm滤膜过滤，收集于用滤过水荡洗两次的烧瓶中。②标准浊度液制备：硫酸肼溶液：称取1.000g硫酸肼((NH2)2SO4·H2SO4)溶于水中，定容至100ml；六次甲基四胺溶液：称取10.00g六次甲基四胺((CH2)6N4)溶于水中，定容至100ml；浊度标准溶液：吸取5.00ml硫酸肼溶液与5.00ml六次甲基四胺溶液于100ml容量瓶中，混匀。于25℃±3℃下静置反应24h。冷却后用水稀释至标线，混匀。③浊度测定。标准曲线的绘制：吸取浊度标准溶液0、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00和12.50ml，置于50ml比色管中，加无浊度水至标线。摇匀后即得浊度为0、4、10、20、40、80、100的标准系列。在680nm波长下，用3cm比色皿，测定吸光度，绘制校准曲线。④水样的测定。吸取50.0ml摇匀水样(无气泡，如浊度超过100度可酌情少取，用无浊度水稀释至50.0ml)，于50ml比色管中，按绘制校准曲线步骤测定吸光度，由校准曲线上查得水样浊度。⑤结果计算。计算式为：
浊度(度)＝A(B+C)/C
式中：
A——稀释后水样的浊度(度)；
B——稀释水体积(m1)；
C——原水样体积(ml)。
(5)感官评价：参照《GB/T10220-2012》(国家标准-感官分析方法学总论)采用描述性检验方法中自由选择剖面对样本进行评价。评价小组的每一位人员对样品的多种特性进行评价并尽力表征和区分，产生各自独特的描述性词汇表。根据每个评价员的词汇构建常规描述评估单完成对样品的评价。
(6)单宁含量测定
参照NY/T1600-2008水果、蔬菜及其制品中单宁含量的测定分光光度法对刺梨酸奶中单宁含量进行测定。
(7)维生素C含量测定
参照GB5413.18-2010食品安全国家标准中婴幼儿食品和乳品中维生素C的测定方法对刺梨酸奶中Vc含量进行测定。
2.4发酵结果：
(1)刺梨提取物发酵前后单宁含量测定结果为：
(2)刺梨提取物发酵前后Vc含量测定结果为：
| 添加类别 | 发酵前Vc含量(质量/体积) | 发酵后Vc含量(质量/体积) |
| 刺梨 | 0.045％ | 0.041％ |
通过“三分”发酵，发酵产物中的单宁含量显著下降了，显著改善了发酵产物的口感，有效成分Vc的含量基本保留。
(3)发酵前后pH测定结果
发酵前pH值为3，第一阶段结束时pH值为3，第二阶段结束时pH值为3。
(4)发酵后酵母计数CFU结果
第一阶段发酵酵母计数CFU结果为2.8×106CFU/mL。
(5)发酵后细菌计数CFU结果
第二阶段发酵细菌计数CFU结果为7.0×104CFU/mL。
(6)发酵后浊度测定结果
第二阶段发酵结束时浊度为1030。
(7)感官评价
发酵前的感官评价为气酸涩，味酸甜微涩，余味微涩，滞留时间长。第一阶段发酵的感官评价为气香，味酸涩，余味略香，微涩。滞留时间长。第二阶段发酵的感官评价为气香，味酸，余味微涩，持续时间长。
实施例13、刺梨酸奶的发酵
3.1实验方法
3.1.1刺梨酸奶的工艺制备流程如下
蔗糖+刺梨发酵液+牛奶→调配→均质→杀菌→冷却→接种→发酵→冷藏→检验→刺梨酸奶。
3.1.2刺梨酸奶制备的工艺操作要点
(1)刺梨发酵液制备：由“实施例2”提供。
(2)调配、均质、杀菌、冷却：以牛奶为基液添加规定量的蔗糖和发酵液，调配并均质后，巴氏杀菌法加热至90℃，持续5min，冷却至常温。
(3)接种、发酵：无菌条件下，选用由嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌组成的复合菌种(混合菌粉，其以菌数计各菌比例为3/8/2/3/2/2/2/1)，接入调配后乳液中，混合均匀，放入恒温培养箱42℃，进行发酵。
(4)冷藏：发酵后放入冰箱中，4℃冷藏保存24h，即得酸奶。
(5)器具准备：在实验进行前，对所要用的实验器具在121℃、持续20min条件下高温灭菌。
3.1.3刺梨酸奶的感官评价方法
感官评价标准参照GB19302《食品安全国标-发酵乳》、GB 12310国标-感官分析方法，并综合相关文献资料关于酸奶的评价标准进行设定，以色泽、风味、口感、组织状态各25分为评价指标，酸奶相关形态特征为评分标准，制定总分为100分的评定标准表(见表1)。参评人员选用年龄在18～45岁的10位(男女各5人)组成，并对其进行相关专业评分培训，由其对各批次刺梨酸奶进行感官品尝打分。
表1刺梨酸奶的感官评定标准表
3.1.4实验设计
3.1.4.1刺梨酸奶制备工艺的单因素试验
按照“1.2.1”刺梨酸奶制备流程，选取刺梨发酵液添加量、复合菌种添加量、蔗糖添加量、发酵时长4个单因素，在发酵温度42℃条件下，进行单因素试验，通过以感官评分为主要指标，分析确定刺梨酸奶制备工艺最佳单因素条件。
(1)刺梨发酵液添加量对酸奶感官品质的影响
在100ml鲜牛奶基础上，分别按2.5％、5.0％、7.5％、10.0％的刺梨发酵液添加量、1.0mg/ml复合菌种添加量，70mg/ml蔗糖添加量，在42℃发酵温度，10h的发酵时长条件下进行发酵，冷藏后进行感官评价分析。
(2)复合菌种添加量对酸奶感官品质的影响
在42℃发酵10h条件下，以100ml鲜牛奶为基准，分别按0.8、1.0、1.2、1.4mg/ml复合菌种的添加量进行接种，加入5.0％的刺梨发酵液，70mg/ml的蔗糖，制备刺梨酸奶做对比试验，冷藏后进行感官评价分析。
(3)蔗糖添加量对酸奶感官品质的影响
在42℃发酵10h条件下，以100ml鲜牛奶为基准，添加5.0％的刺梨发酵液，1.0mg/ml的复合菌种，分别添加50、60、70、80、90mg/ml的蔗糖做对比试验，冷藏后进行感官评价分析。
(4)发酵时长对酸奶感官品质的影响
在100ml鲜牛奶基础上，加入5.0％的刺梨发酵液，70mg/ml的蔗糖，1.0mg/ml的复合菌种，发酵温度为42℃，分别设定发酵时长为6、8、10、12h做对比试验，冷藏后进行感官评价分析。
3.1.4.2刺梨酸奶制备工艺优化的正交试验
(1)因素及水平的选定
根据单因素实验分析结果与正交试验设计原理，以感官评分为评价指标，选取刺梨发酵液添加量(A)、复合菌种添加量(B)、蔗糖添加量(C)、发酵时长(D)4个因素作自变量，并添加误差项(E)，以感官评价综合评分(Y)为响应值，进行五因素四水平的正交实验设计，完成对刺梨酸奶制备艺优化的进一步分析。
(2)正交试验的设计及方差分析
根据正交实验的直观分析和方差分析结果，确定刺梨酸奶的最优制备工艺。
(3)再验证实验
以正交试验得到的各因素最佳水平组合，结合实际实验操作，确定刺梨酸奶最佳制备工艺后，制备刺梨酸奶最佳制备工艺酸奶样本，并进行感官评分验证。
3.2实验结果
3.2.1刺梨酸奶制备工艺的单因素试验结果
(1)刺梨发酵液添加量对酸奶感官品质的影响结果
如表2所示，刺梨发酵液添加量在2.5％-10.0％区间内，随着刺梨发酵液添加量增加酸奶感官得分逐渐增加，原因是刺梨发酵液加入过少则无刺梨风味或明显不足，影响口感；当刺梨发酵液添加量超过5.0％时，酸奶感官得分由增高又逐渐降低，原因是刺梨发酵液添加量过大则易导致酸奶析出乳清且药味较重，影响酸奶的组织形态、色泽及口味；在添加量为5.0％时感官评分最高，说明单因素5.0％刺梨发酵液添加量的酸奶感官品质最佳。因此，选定2.5％、5.0％、7.5％及10.0％为优化范围做下一步研究较为适宜。
表2刺梨发酵液添加量对酸奶感官品质的影响
注：为中药发酵液添加量的单因素考察。
(2)复合菌种添加量对酸奶感官品质的影响结果
如表3所示，复合菌种添加量在0.8mg/ml-1.0mg/ml区间内，随着复合菌种添加量的增加酸奶感官得分逐渐增加，原因是由于复合菌种添加量较小则酸奶的凝乳能力不够，不利于发酵，会直接影响酸奶组织形态、口感及色泽，导致评分较低。当复合菌种添加量超过1.0mg/ml时，酸奶感官得分由增高又逐渐降低，原因是由于复合菌种添加量较大则会引起发酵速度过快，导致酸奶乳清析出，口感偏酸而影响和掩盖中药风味。在添加量为1.0mg/ml时感官评分最高，说明单因素复合菌种添加量为1.0mg/ml的酸奶感官品质最佳。综合考虑，选定0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml为优化范围做下一步研究较为适宜。
表3复合菌种添加量对酸奶感官品质的影响
| 添加量(mg/ml) | 感官评价 | 评分 |
| 0.8 | 色泽差，乳清析出，口感差，风味不佳 | 77.9 |
| 1.0 | 色泽差，少量乳清析出，口感一般，风味欠佳 | 79.6 |
| 1.2 | 酸奶品质较好，口感良好，刺梨风味佳 | 78.1 |
| 1.4 | 酸奶品质质较好，口感良好，风味色泽一般 | 75.1 |
(3)蔗糖添加量对酸奶感官品质的影响结果
如表4所示，蔗糖添加量对酸奶感官品质的影响较大。蔗糖添加量在50mg/ml-70mg/ml区间内，随着蔗糖添加量的增加酸奶感官得分逐渐增加，原因是由于蔗糖添加量较少则酸奶的凝乳效果较差并且口味偏酸，影响口感，导致评分较低。当蔗糖添加量超过70mg/ml时，酸奶感官得分由增高又逐渐降低，原因是由于蔗糖添加量较多则会影响水分活度，不利于发酵菌发酵，且口味酸甜不协调。在添加量为70mg/ml时感官评分最高，说明单因素复合菌种添加量为70mg/ml的酸奶感官品质最佳。综合考虑，选取50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml为优化范围做下一步研究较为适宜。
表4蔗糖添加量对酸奶感官品质的影响
(4)发酵时长对酸奶感官品质的影响结果
如表5所示，发酵时长在6h-10h区间内，随着发酵时长的延长酸奶感官得分逐渐增高，原因是由于发酵时间较短则会引起凝乳能力不足乳清析出，且乳酸菌的增殖效果欠佳，影响酸奶的组织形态、口感、风味，导致感官评分较低；当发酵时长超过10h时，酸奶感官得分由增高又逐渐降低，原因是由于发酵时间过长则会引起凝乳过度，乳清析出，且酸奶酸度增加，口味偏酸，影响感官评分。在发酵时长为10h时感官评分最高，说明单因素发酵时长10h的酸奶感官品质最佳。综合考虑，选取发酵时长6h、8h、10h、12h为优化范围做下一步研究较为适宜。
表5发酵时长对酸奶感官品质的影响
| 发酵时长(h) | 感官评价 | 评分 |
| 6 | 表面无光泽，乳清析出，口味偏甜 | 67.8 |
| 8 | 色泽较差，少量乳清析出，口味稍甜 | 69.1 |
| 10 | 色泽良好，酸奶品质较好，口感适宜 | 78.6 |
| 12 | 色泽较差，少量乳清析出，口味偏酸 | 67.9 |
3.2.2刺梨酸奶制备工艺优化的正交试验结果
3.2.2.1正交试验因素与水平选定结果(见表6)
表6正交试验因素水平表
3.2.2.2正交试验设计及结果(见表7)
表7正交试验设计及结果表
注：因素A为刺梨发酵液添加量、因素B为复合菌种添加量、因素C为蔗糖添加量、因素D为发酵时长、因素E为空白误差项；k1、k2、k3、k4为各因素各水平总感官评分的均值；极差R值为该因素k1、k2、k3、k4中最大值减最小值。
由表7可见，因素A、B、C、D中k2、k3、k3、k3值最大，表明最优组合应为A2B2C3D3，即刺梨发酵液添加量为5.0％、复合菌种添加量为1mg/ml、蔗糖添加量为70mg/ml、发酵时长为10h为刺梨酸奶最优制备条件。同时极值为A＞C＞D＞B，表明对刺梨酸奶感官评分主次顺序为刺梨发酵液添加量＞蔗糖添加量＞发酵时长＞复合菌种添加量。
3.2.2.3正交试验方差分析结果(见表8)
表8正效试验方差分析结果
| 方差来源 | 偏差平方和 | 自由度 | F值 | 显著性 |
| A | 655.25 | 3 | 44.42 | ** |
| B | 79.25 | 3 | 5.37 | |
| C | 285.25 | 3 | 19.34 | * |
| D | 261.25 | 3 | 17.71 | * |
| E(误差) | 14.75 | 3 |
注：因素A为刺梨发酵液添加量、因素B为复合菌种添加量、因素C为蔗糖添加量、因素D为发酵时长；E为实验中设定的误差项，以A、B、C、D均方值比E均方值得到F值；F0.05(3,3)＝9.280、F0.01(3,3)＝29.500；*为有显著性影响(0.01≤P＜0.05)，**为有极显著性影响(P＜0.01)。
由表8可见，刺梨发酵液添加量、复合菌种添加量、蔗糖添加量、发酵时长的F值分别为44.42、5.37、19.34、17.71，结合查询F值表，其分别为P＜0.01、P＞0.05、0.01＜P＜0.05、0.01＜P＜0.05，表明刺梨发酵液添加量对酸奶感官评分具有极显著性影响，蔗糖及发酵时长对酸奶感官评分具有显著性影响，复合菌种加入量则无显著性影响。结合F值大小，表明对酸奶感官评分影响大小分别为刺梨发酵液添加量＞蔗糖添加量＞发酵时长＞复合菌种添加量，与直观分析结果一致。
3.2.2.4再验证实验
结合正交试验优化的因素水平结果，选定刺梨发酵液添加量为5.0％、复合菌种添加量为1mg/ml、蔗糖添加量为70mg/ml、发酵时长为10h以及发酵温度为42℃为最佳组合，制备刺梨酸奶，得到感官评分结果为80.5分，表明该制备工艺为最佳制备工艺。
实施例14、刺梨酸奶的品质及稳定性研究
4.1实验方法
4.1.1刺梨酸奶的制备
按上述实施例3刺梨酸奶制备工艺优化后的最佳组合参数进行制备，所得刺梨酸奶4℃冰箱冷藏保存，备用。
4.1.2刺梨酸奶中标志性成分含量测定
(1)单宁含量测定
参照NY/T1600-2008水果、蔬菜及其制品中单宁含量的测定分光光度法对刺梨酸奶中单宁含量进行测定。复合菌种添加前后单宁含量测定结果：
| 添加类别 | 添加前单宁含量(质量/体积) | 添加后单宁含量(质量/体积) |
| 刺梨发酵液 | 0.00074％ | 0.00073％ |
(2)维生素C含量测定
参照GB5413.18-2010食品安全国家标准中婴幼儿食品和乳品中维生素C的测定方法对刺梨酸奶中Vc含量进行测定。复合菌种添加前后Vc含量测定结果：
| 添加类别 | 添加前Vc含量(质量/体积) | 添加后Vc含量(质量/体积) |
| 刺梨发酵液 | 0.0021％ | 0.0019％ |
4.1.3刺梨酸奶的品质研究
刺梨酸奶的品质研究主要包括酸奶感官指标、理化指标、微生物指标、活菌数测定、pH值和酸度的测定等，按照《食品安全国家标准》GB 19302-2010规定对相关指标进行测定分析，完成刺梨酸奶的品质研究。酸奶品质相关指标测定方法及标准如下表9。
表9刺梨酸奶的品质相关指标测定方法及标准表
4.1.4刺梨酸奶的稳定性研究
研究刺梨酸奶在4℃冷藏保存下，24天内酸奶酸度、pH值、乳酸菌活菌数、标志性成分含量和感官品质的变化，依据表9中对应的国家标准规定的方法前三项进行测定，并检测酸奶单宁和维生素C含量，根据感官评价方法进行评定，综合以上测定的数据进行分析，完成刺梨酸奶的稳定性研究。
4.2实验结果
4.2.1刺梨酸奶中标志性成分含量测定
依上述实验条件于空白对照组中均未检测出刺梨单宁及维生素C，同时测得刺梨酸奶中单宁含量为0.0073‰、维生素C含量为0.019‰。
4.2.2刺梨酸奶的品质研究结果
依上述实验条件测得刺梨酸奶品质研究各项指标结果如下表10。
表10刺梨酸奶品质研究结果
| 测定指标 | 标准 | 单位 | 测定值 |
| 脂肪含量 | ≥3.1 | g/100g | 4.29 |
| 非脂乳固体 | ≥8.1 | g/100g | 12.57 |
| 蛋白质 | ≥2.9 | g/100g | 4.35 |
| 大肠菌群 | ≤3 | CFU/g | 未检出 |
| 金黄色葡萄球菌 | ≤0 | CFU/g | 未检出 |
| 沙门氏菌 | ≤0 | CFU/g | 未检出 |
| 酵母菌 | ≤100 | CFU/g | 未检出 |
| 霉菌 | ≤30 | CFU/g | 未检出 |
| 乳酸菌 | ≥1×10<sup>6</sup> | CFU/g | 9.86×10<sup>9</sup> |
| 酸度 | ≥70 | °T | 88.97 |
| pH值 | - | - | 4.72 |
| 感官评分 | - | - | 80.2 |
4.2.3刺梨酸奶的稳定性研究
依上述实验条件测得刺梨酸奶稳定性研究结果见下表11。
表11刺梨酸奶稳定性研究结果
由表11可见，刺梨酸奶在4℃冰箱冷藏保存24天内，其酸度、pH值、乳酸菌数量、单宁含量、维生素C含量及感官评分均有不同程度的变化，研究分析相应的数据情况，随着时间推移，刺梨酸奶的酸度上升但仍符合要求、乳酸菌数量逐渐下降，在18天时乳酸菌数量下降至低于国家标准要求，单宁及维生素C含量基本保持稳定，结合感官评分综合分析，刺梨酸奶在15天内各方面品质均比较稳定。
实施例15、刺梨酸奶的品质及稳定性研究
参考实施例3的最佳组合参数的制备工艺制备酸奶，不同的仅是在调配工序中(a)还额外添加甘油磷酸钙0.12％和0.5％门冬氨酸、(b)还额外添加甘油磷酸钙0.12％、或(c)还额外添加0.5％门冬氨酸，分别得到可称为实施例5a、实施例5b、实施例5c的三种酸奶；接着参照实施例4的方法对酸奶品质和稳定性进行考察。结果，
实施例5a、实施例5b、实施例5c三种酸奶中的刺梨单宁含量的变化与实施例4之4.1.1的酸奶(可称为实施例4酸奶)结果基本一致，复合菌种添加前单宁含量均在0.00073～0.00076％范围内、添加后单宁含量均在0.00072～0.00076％范围内，例如实施例5a酸奶在复合菌种添加前后单宁含量分别为0.00075％和0.00074％；
实施例5a、实施例5b、实施例5c三种酸奶中的维生素C含量的变化与实施例4之4.1.1的酸奶结果基本一致，复合菌种添加前后维生素C含量均在0.0019～0.0023％范围内，例如实施例5a酸奶在复合菌种添加前后维生素C含量分别为0.0020％和0.0021％；
实施例5a、实施例5b、实施例5c三种酸奶中的品质研究结果与实施例4之4.1.1的酸奶之表10结果基本一致，例如实施例5a酸奶的脂肪含量为4.38、蛋白质为4.31、乳酸菌为9.63×109、酸度为88.63；
24天稳定性试验中，实施例5a、实施例5b、实施例5c三种酸奶的酸度、pH值、维生素C、单宁、感官评分与表11结果基本一致，例如实施例5a酸奶0～24天的单宁均在0.00070～0.00075％范围内；
24天稳定性试验中，不同实施例所得酸奶中的乳酸菌呈现不同的变化趋势，具体如下：
根据上述结果可知，实施例5a在24天后乳酸菌含量才降到1×106CFU/g以下，可以在24天内保持乳酸菌含量大于标准规定范围。由于酸奶是快速消费品，因此增加6天以上的保质期是具有相当大的意义的，为产品的供应链和销售链提供了显著更有益的贮运条件。
以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。
Claims (23)
1.制备中药酸奶的方法，其包括如下步骤：
(1)制备提取物：将中药材用水煎煮提取得到提取物，备用；
(2)提取物的发酵：对步骤(1)所得提取物进行高压灭菌，接着以摇瓶发酵方式，接种酿酒酵母进行连续发酵，然后对发酵液进行高压灭菌，接着以静止发酵方式接种复合菌种进行发酵，得到发酵液；
(3)调配：向牛奶中添加蔗糖和发酵液进行调配，混合均匀，巴氏杀菌法加热至90℃，持续5min，冷却至常温；
(4)酸奶发酵：向上述混合液料中接种复合菌种混合均匀，放入恒温培养箱42℃，进行发酵，然后置4℃冰箱中冷藏保存24h，得到酸奶。
2.根据权利要求1的方法，其中所述中药材是铁皮石斛或者刺梨。
3.根据权利要求2的方法，其中所述中药材是铁皮石斛干条或者刺梨干。
4.根据权利要求2的方法，步骤(1)中，分2次水煎煮提取，第一次提取料液比1:10，提取时间4h；第二次提取料液比1:8，提取时间3h，合并两次提取液，浓缩成0.5g生药/mL浓度的提取物，备用。
5.根据权利要求2的方法，步骤(2)中，所述高压灭菌是指121℃灭菌30min。
6.根据权利要求2的方法，步骤(2)中，酿酒酵母发酵时接种量5×103CFU/mL。
7.根据权利要求2的方法，步骤(2)中，摇瓶发酵方式是在温度35℃、转速120rpm发酵条件下，连续摇动发酵10h。
8.根据权利要求2的方法，步骤(2)中，复合菌种包含保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌。
9.根据权利要求2的方法，步骤(2)中，复合菌种是以菌数计各菌比例为4/8/3/3/2的混合菌粉。
10.根据权利要求2的方法，步骤(2)中，混合菌粉的接种量2×102CFU/mL。
11.根据权利要求2的方法，步骤(2)中，静止发酵方式是在恒温培养箱43℃的发酵条件下连续静止发酵24h。
12.根据权利要求2的方法，步骤(3)中，调配时铁皮石斛发酵液添加量为2.5％。
13.根据权利要求2的方法，步骤(3)中，调配时刺梨发酵液添加量为5％。
14.根据权利要求2的方法，步骤(3)中，调配时蔗糖添加量为70mg/ml。
15.根据权利要求2的方法，步骤(3)中，调配时还添加甘油磷酸钙。
16.根据权利要求2的方法，步骤(3)中，调配时还添加0.12％的甘油磷酸钙。
17.根据权利要求2的方法，步骤(3)中，调配时还添加门冬氨酸。
18.根据权利要求2的方法，步骤(3)中，调配时还添加0.5％或0.6％的门冬氨酸。
19.根据权利要求2的方法，步骤(3)中，调配时还添加0.12％的甘油磷酸钙和0.5％或0.6％的门冬氨酸。
20.根据权利要求2的方法，步骤(4)中，复合菌种是由嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌组成的复合菌种。
21.根据权利要求2的方法，步骤(4)中，复合菌种是混合菌粉，其以菌数计各菌比例为3/8/2/3/2/2/2/1。
22.根据权利要求2的方法，步骤(4)中，复合菌种添加量为1mg/ml。
23.根据权利要求2的方法，步骤(4)中，42℃发酵时长为10h。
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