CN103518528B - 可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法。一种可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，包含以下步骤：(A)将牛樟菌接种至漂浮培养基的步骤；(B)进行初期避光培养的步骤，促使牛樟菌增生聚集成漂浮于液面的牛樟菌菌块；(C)在避光且密闭的休眠温度环境下进行休眠的步骤；(D)在避光的供氧环境下诱使牛樟菌菌块的重新生长的步骤；及(E)重复循环该步骤(C)与该步骤(D)预定次数。通过上述漂浮培养方法设计，可使牛樟菌快速长出层叠状类子实体形态的牛樟菌菌块，且牛樟菌菌块的三萜类含量高于一般固态培养方式，并适用于人工大量培养。

Description

可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法

技术领域

本发明涉及一种真菌培养方法，特别涉及一种牛樟菌培养方法。

背景技术

由于牛樟芝所含有的三萜类成分已被证实对于人体免疫力的提升与许多癌症的治疗都具有疗效，因此，有许多生技厂商开始投注大量研究资源开发牛樟芝相关医药品或保健品。

但是因为野生牛樟芝子实体取得不易，且价格昂贵，再加上野生牛樟芝子实体的三萜类不易萃取释出，其萃取成本高。为取得大量牛樟芝三萜类成分，业者逐渐朝向实验室培养方面进行研究，希望通过实验室人工培养的方式，来大量培养生产牛樟菌，以萃取其三萜类成分。

目前的主要培养方式大多是采用固态培养方式，目的在于大量培养出牛樟菌菌丝体，然后再由这些菌丝体萃取出所需的三萜类成分，但是在进行固态培养时发现，牛樟菌菌丝在分散生长布满固态培养基表面后，其生长速度就会开始减慢。且经研究发现，由牛樟菌菌丝体萃取出的三萜类成分含量，远不及牛樟芝子实体萃取出的三萜类含量，因此，如何提高人工培养的牛樟菌三萜类含量，是目前牛樟菌相关产业正积极研究的方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可提高人工培养的牛樟菌的三萜类含量的牛樟菌培养法。

本发明可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，依序包含以下步骤：(A)将含有牛樟菌活性菌丝的培养载体接种至漂浮培养基的步骤，所述漂浮培养基包括含有牛樟木萃取液的营养液，及沉浸于该营养液中的固态营养基质团块，该培养载体局部浸泡在营养液中，且部分牛樟菌活性菌丝外露于营养液液面上方，而部分牛樟菌活性菌丝局部浸泡在营养液中；(B)在供氧且适合牛樟菌生长的培养环境温度条件下进行初期避光培养的步骤，促使外露于营养液液面上方的牛樟菌活性菌丝增生，而于该培养载体上聚集成局部外露于营养液液面上方的牛樟菌菌块，且使该牛樟菌菌块的部分活性菌丝增生附着于该固态营养基质团块撷取养分；(C)在避光环境下进行休眠的步骤，密封培养环境而停止供氧，并将培养环境温度调降至休眠温度，诱使牛樟菌进入休眠期，并维持休眠期预定期间；(D)在避光环境下诱使牛樟菌重新生长的步骤，对该培养环境重新供氧，且将培养环境温度调升至适合牛樟菌生长的温度，诱使该牛樟菌菌块位于液面上的孢子萌发生长成活性菌丝，并维持此生长期预定时间；及(E)重复循环该步骤(C)与该步骤(D)预定次数。

本发明所述可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，该步骤(A)的营养液液面会高出该固态营养基质团块顶缘，该培养载体局部沉浸在营养液中，而叠靠于该固态营养基质团块顶缘。

本发明所述可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，该步骤(A)的漂浮培养基的营养液液面高出该固态营养基质团块顶缘的距离范围介于0.5-2cm之间。

本发明所述可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，该步骤(A)中局部浸泡于营养液中的培养载体间隔位于该固态营养基质团块旁侧。

本发明所述可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，该步骤(A)的漂浮培养基装在培养容器中，该步骤(B)与该步骤(D)还会分别在牛樟菌的培养期期间，调控该培养容器所在的培养环境的湿度，使培养容器中的营养液保持局部浸泡该牛樟菌菌块。

本发明所述可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，该步骤(B)与该步骤(D)的培养环境温度较佳范围介于15-25℃之间。

本发明所述可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，该步骤(C)的休眠温度范围介于4-10℃之间。

本发明所述可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，该步骤(C)的休眠期时间为24小时以上。

本发明所述可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，该步骤(C)休眠期的较佳时间长度为72小时。

本发明所述可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，所述漂浮培养基由提供碳源与氮源的五谷杂粮，及枸杞、土肉桂、提供胡萝卜素与维生素的蔬菜汁、牛樟木萃取液与二次蒸馏水混合并经高温灭菌处理制成。

本发明的有益效果在于：通过让牛樟菌菌块局部外露于营养液液面上，而局部菌丝附着于固态营养基质团块，以及交替休眠与生长的漂浮培养方法设计，可诱使牛樟菌在短期间内长出层叠状类子实体产物的菌块，且所培养出的牛樟菌菌块的三萜类含量会明显高于一般固态培养方式，并适用于人工大量培养。

附图说明

图1是本发明可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法的较佳实施例的步骤流程图；

图2是该较佳实施例的步骤示意图；

图3是该较佳实施例培养所得牛樟菌(BCRC35396)菌块的萃出物与三年生野生牛樟芝子实体萃出物的HPLC图谱比较；

图4是一般固态培养的牛樟菌(B CRC 35396)菌块的萃出物与三年生野生牛樟芝子实体萃出物的HPLC图谱比较：

图5是该较佳实施例培养所得牛樟菌(BCRC37848)菌块的萃出物与三年生野生牛樟芝子实体萃出物的HPLC图谱比较；

图6是一般固态培养的牛樟菌(BCRC 37848)菌块的萃出物与三年生野生牛樟芝子实体萃出物的HPLC图谱比较。

图7是本发明采用的漂浮培养基装于培养容器中的影像；

图8是将含有牛樟菌的培养载体切片接种至该漂浮培养基后的影像；

图9是本发明培养产生的牛樟菌菌块的影像。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明：

本发明可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法的较佳实施例，是利用牛樟菌的生长具有厌水性的特性，特别将牛樟菌接种漂浮于培养液上，用于限制牛樟菌的生长方向，并通过模仿野生牛樟芝生长方式进行牛樟菌的培养，以得到类似牛樟芝子实体的层叠状类子实体产物，且该层叠状类子实体产物可萃取出大量的三萜类成分。

如图1、2所示，本发明漂浮式牛樟菌培养法包含以下步骤：

(一)将牛樟菌活性菌丝接种至漂浮培养基400的步骤。

在本文中，术语“牛樟菌(Antrodia camphorata)”意欲涵盖那些为熟习此项技术人士可易于获得的牛樟菌菌株(例如，可购自于国内或国外寄存机构者)，或者利用本技艺中所惯用的微生物分离方法而从天然来源中所分离纯化出的新颖牛樟菌菌株。

在本实施例中，所采用的牛樟菌菌株是购自台湾食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)，寄存编号分别为BCRC35396及BCRC37848，菌株是预先进行平板培养，而培养在培养载体300上，然后再将已培养出牛樟菌活性菌丝的培养载体300进行切片，再将含有牛樟菌活性菌丝的培养载体切片301接种至漂浮培养基400。但是实施时，该培养载体300也可不需进行切片，而直接将整个含有牛樟菌活性菌丝的培养载体300接种至漂浮培养基400。

在本实施例中，所采用的培养载体300为琼脂(agar)成分的固态培养基，其制备方式如下：将葡萄糖20g、食品级酵母萃取物4g、V8蔬菜汁30ml与琼脂(agar)20g混合后，加入二次蒸馏水调整至1000ml，经高温灭菌釜(autoclave)在1.1atm、121℃下进行灭菌25分钟，待其降温后，平均倒入多个培养皿中冷却凝固后，就获得尚未接种牛樟菌的培养载体300。然后，将培养载体300移置37℃环境存放备用。实施时，由于牛樟菌平板培养可采用的培养载体300种类众多，且只是一种中间载体，也非本发明的创作重点，因此培养载体300组分设计不以上述揭露的组分为限，实施时，也可直接以含有活性菌丝的牛樟芝子实体块作为培养载体，同样可进行本发明漂浮培养。

该牛樟菌活性菌丝的预先平板培养方法如下：用接种针钩取上述菌株的菌种保存管的少许菌丝，并分别穿刺接种于前述培养皿的培养载体300的中心部位。然后，将接种后的培养载体300移入17℃培养箱中避光培养，直到培养所得的活性菌丝菌落500分布该培养载体300表面八分满。

由于活性菌丝菌落500边缘501的一小圈带白色部分为高度生长区，且从该活性菌丝菌落500边缘501往外延伸预定距离内，通常都已含有肉眼看不清的前驱菌丝生长其中，也会有外泌酶分泌其中。因此，在从该培养载体300切取接种用的含有牛樟菌活性菌丝的培养载体切片301时，需取用包含这些含有前驱菌丝的部位，如此可使取得的含有牛樟菌活性菌丝的培养载体切片301移植接种于漂浮培养基400后，牛樟菌的生长不会出现明显停滞现象。

在本实施例中，当要切取培养载体切片301时，是从该培养载体300表面的活性菌丝菌落500边缘501径向往外延伸0.2cm处进行环切后，再自该活性菌丝菌落500中心部位往外辐射分切成多片培养载体切片301，也就是说，每一等分培养载体切片301都含有牛樟菌的前驱菌丝。

配合参阅图7，所述漂浮培养基400是装在培养容器6中，包含有固态营养基质团块401，及包围在该固态营养基质团块401周围的营养液402，且该营养液402液面高出该固态营养基质团块401顶缘预定距离，也就是说，该营养基质团块401沉浸于该营养液402中，此设计关系着牛樟菌接种后是否可顺利进行本发明的漂浮培养生长，容后一并说明。

该漂浮培养基400含有牛樟菌生长所需的养分，在本实施例中，该漂浮培养基400包含用于提供碳源、氮源与矿物质的五谷杂粮与蔬菜汁，及用于提供适合牛樟菌生长与构成三萜类物质的中间代谢物与萜类脂质的土肉桂粉、干枸杞和牛樟木萃取液。

其中，五谷杂粮包含谷类与豆类。谷类选自小米、高梁、燕麦、大麦、荞麦、糙米、薏仁或所述的组合。所述豆类选自黄豆、大豆、绿豆、红豆、黑豆、花豆或所述的组合。蔬菜汁采用市售V8蔬菜汁，用于提供促进牛樟菌生长的维生素与用于构成三萜类的胡萝卜素，其中，胡萝卜素为四萜类，被代谢后会有较多制造三萜类起始合成结构原料。由于可提供维生素与胡萝卜素的蔬菜汁来源相当多，因此实施时，蔬菜汁的选用不以市售V8蔬菜汁为限。

该牛樟木萃取液是将二次蒸馏水与牛樟木混合后，经高温灭菌釜在1.1atm、121℃下进行灭菌1小时，接着快速泄压而使得高温灭菌釜中的水气大量蒸发，而残余的液体就是牛樟木萃取液。在本实施例中，使用的牛樟木包括木块与未杀青枝叶，并将500g牛樟木加入10L二次蒸馏水后，依据上述方式来进行萃取，而得到体积范围为9-9.5L的牛樟木萃取液。

漂浮培养基400的制备方式是将上述成分与预定量的二次蒸馏水加入该培养容器6后，经高温灭菌釜在1.1atm、121℃下进行高温杀菌处理1小时所制成。在高温杀菌处理过程中，五谷杂粮、干枸杞、土肉桂粉等物质会凝集成团，而构成前述固态营养基质团块401，其余液体则构成浸泡该固态营养基质团块401周围的营养液402。

在制备上述漂浮培养基400时，所添加的二次蒸馏水含量会随采用的培养容器6大小与预定接种的培养载体300或培养载体切片301大小而有所不同，目的在于使构成的固态营养基质团块401完全浸泡在营养液402中，以及使接种后的培养载体300或培养载体切片301局部外露于营养液402液面上方。

在本实施例中，使用的培养容器6为500ml的螺旋盖美乃滋瓶，漂浮培养基400成分含量为：五谷杂粮的谷类与豆类分别为70g与2g、干枸杞5g、土肉桂粉1g、蔬菜汁10ml、牛樟木萃取液10ml，及二次蒸馏水100ml，也就是总重101g的固形物混合120ml的液体，其中，五谷杂粮类的谷类包含燕麦15g、荞麦15g、糙米25g与薏仁15g，而豆类为黄豆。但是实施时，上述成分含量只为较佳示范例，实施时应当不以此为限。且实施时，上述漂浮培养基400的营养液402与固态营养基质团块401也可分别制作后，再一起置入适当尺寸的培养容器6中，不以一起制作为必要。

配合参阅图8，将含有牛樟菌活性菌丝的培养载体切片301接种至漂浮培养基400时，将该培养载体切片301含有前驱菌丝的一端朝上地置入培养容器6中，使该培养载体切片301局部浸泡于营养液402，往下靠抵于该固态营养基质团块401顶缘，并使培养载体切片301含有前驱菌丝的部位外露于营养液402液面上。然后，将培养容器6的瓶盖61旋紧后再倒悬开1/4圈，以维持透气，就完成牛樟菌的漂浮培养的接种。

在进行牛樟菌的漂浮培养的接种时，当培养容器6中营养液402液面高出固态营养基质团块401顶缘太多时，会致使置入培养容器6内的培养载体切片301的大部分部位沉浸在营养液402中，也就是使大部分活性菌丝都浸泡在营养液402中，例如超过80%以上的活性菌丝浸泡在营养液402中时，会造成牛樟菌接种后就出现生长缓慢或立刻进入休眠状态的现象，而无法继续执行本发明的漂浮培养。当培养容器6中的营养液402太少，营养液402液面高出该固态营养基质团块401顶缘的高度太低或低于固态营养基质团块401顶缘，会致使培养载体切片301置入培养容器6后，绝大部分活性菌丝会外露于液面上，例如超过80%以上的活性菌丝外露于液面上时，则在后续培养过程中，牛樟菌的生长就会与一般固态培养基培养相似，在生长布满该固态营养基质团块401表面后，就会休眠而出现生长停滞现象。

因此，该培养容器6中的营养液402液面高出该固态营养基质团块401顶缘的距离，要根据采用的培养载体切片301的体积大小进行调整，例如根据培养载体切片301的厚度进行调整。就本实施例而言，由于该培养载体300为一般实验室经常使用，且装于培养皿中的琼脂培养基，其厚度范围介于0.5-1.5cm之间，所以营养液402液面高出固态营养基质团块401顶缘的较佳距离范围介于0.5-2.5cm之间。

但是实施时，若是以牛樟芝子实体块作为培养载体植入培养容器6内的漂浮培养基400时，营养液402液面高出固态营养基质团块401顶缘的较佳距离范围则不以0.5-2.5cm为限，需根据该牛樟芝子实体块大小与形状，调整营养液402液面高度，以使预定比例的牛樟菌活性菌丝外露于液面上。其中，该培养载体300或培养载体切片301上的活性菌丝外露于营养液402液面上的比例范围为20-80%，较佳范围为40-60%，最佳为50%。

接着，(二)在适合生长的环境条件下进行初期培养的步骤，此阶段主要是要利用牛樟菌的厌水特性，迫使牛樟菌往上生长。

将牛樟菌接种于漂浮培养基400后，在供氧且适合牛樟菌生长的培养环境温度条件下进行初期培养，先诱使牛樟菌在该培养载体切片301上大量增生活性菌丝，前述活性菌丝包括营养菌丝与气生菌丝等，并使前述菌丝聚集构成菌块。本实施例是在17℃环境中进行避光培养，初期培养的期程为15天，但是实施时，所述培养环境温度的最佳范围可介于15~25℃之间，牛樟菌生长状况会因为采用的培养载体300、营养基质团块401与营养液402成分差异而不同，所以初期培养期程可根据实际培养情况而调整，较佳的初期培养期程介于10~30天之间。

另外，在初期培养过程中，会同时调控整个培养环境的湿度，在高湿度环境下进行漂浮培养，以控制培养容器6中的液体蒸散速度与生成速度，使该营养液402维持在高出该固态营养基质团块401预定距离的状态。在本实施例中，该培养容器6是体积为500ml的美乃滋瓶，而培养环境温度设定在17℃，所以培养环境湿度调整在70％，但是实施时，因所使用的培养容器6尺寸与形状的不同，也就是培养容器6中的营养液402液面的表面积差异，以及培养环境温度的差异，该培养环境湿度可做适度调整。

在此初期培养过程的前期，牛樟菌的营养菌丝会在该培养载体切片301上大量增生，且部分营养菌丝会往下延伸入营养液402中，而附着于该固态营养基质团块401，并分解该营养液402与该固态营养基质团块401以摄取所需养分，但是营养菌丝并未与固态营养基质团块401紧密结合，两者仍会相对移动；此外，牛樟菌的气生菌丝也会大量叠生于前述营养菌丝上，且会随着营养菌丝的增生外扩而逐渐覆盖整个培养载体切片301表面，并制造细胞间质填充于菌丝间，进而使所有菌丝逐渐连结聚集成团，而构成块状的牛樟菌菌块302，并呈鲜艳橘红色，且部分具备生殖能力的气生菌丝会开始产生孢子。

此外，这些大量增生的气生菌丝会产生大量水蒸气，通过控制培养环境湿度的方式，除了可降低水蒸气的散除外，还可使培养容器6中的水蒸气再冷凝变成水，而沿培养容器6的瓶壁流下。在此期间，培养载体切片301会因为牛樟菌的分解与长期浸泡在营养液402中而逐渐缩小，所以该牛樟菌菌块302会逐渐变成局部沉浸于营养液401中，并靠抵于该固态营养基质团块401顶缘的近似漂浮生长状况。

在初期培养的末期，该牛樟菌菌块302体积会大量增加，且牛樟菌菌块302会因表面积增加量赶不上体积增加量，而无法摄取足够氧气以供呼吸代谢，造成中间代谢物快速累积，再加上，该固态营养基质团块401顶部会被优先分解而局部降低高度，致使靠抵的牛樟菌菌块302也对应下沉，因为牛樟菌的生长具有厌水性，所以此下沉现象会致使分布于牛樟菌菌块302周缘的部分菌丝浸入营养液402中，所以牛樟菌菌块302会在初期培养的末期开始出现代谢迟缓与生长迟滞的休眠征兆，气生菌丝会自鲜艳橘红色逐渐褪色变白，且牛樟菌菌块302微量皱缩。

接着，(三)在避光环境下进行休眠的步骤。在完成牛樟菌的初期培养后，将培养环境温度调降至休眠温度范围，并锁紧培养容器6的瓶盖61而停止供氧，使培养容器6中的牛樟菌完全进入休眠状态，并维持此休眠期预定时间，使菌丝代谢停止并停止生长。

在本实施例中，该休眠温度为5℃，休眠期为72小时，但是实施时，适合牛樟菌的较佳休眠温度范围介于4~10℃之间，而休眠期长短可视需要调整，大于24小时，就可使菌丝的生长代谢完全停止，所以实施时，休眠期不以72小时为限。

然后，(四)在避光环境下诱使牛樟菌重新生长的步骤。在完成休眠期后，将培养容器6瓶盖61旋开1/4圈而重新开始供氧，并将培养环境温度重新调高至适合牛樟菌生长的温度，而诱使牛樟菌重新进入生长期，使得牛樟菌菌块302外露于液面的表面部位的孢子开始大量萌发生长成菌丝，并维持此生长期预定期间。

在此期间，会有大量鲜艳橘红色的营养菌丝与气生菌丝增生，并重新层叠生长布满于牛樟菌菌块302原本外露于液面的部位表面，部分新生的营养菌丝会往外延伸入营养液402中，以及往下延伸至该固态营养基质团块401摄取养分，部分新生的营养菌丝则会往下延伸侵入其下层牛樟菌菌块302中，以摄取先前累积的中间代谢物，借此使牛樟菌菌块302出现层叠状生长状态，且牛樟菌菌块302体积也会再次逐渐外扩增大与增高。

在此重新生长期期间，水气会再次大量蒸发，所以也会同时调控培养环境湿度，同样在高湿度环境下进行重新生长，以控制培养容器6中的液体蒸发量与生成量，使该培养容器6中的营养液402维持在高出该固态营养基质团块401预定距离的状态。本实施例设定的湿度为70%，但是实施时，同样可根据培养容器6大小、培养环境温度…等因素，适度调整培养环境湿度。

与前述初期培养状况相同，在此重新生长期的末期，牛樟菌菌块302会因为其表面积增加量小于其体积增加量，造成氧气的摄取量不足以供其生长代谢之用，且也会因为该固态营养基质团块401的高度降低，而再次局部下沉入该营养液402中，致使该牛樟菌菌块302新生分布于其周缘的部分菌丝浸泡于营养液402中，而开始出现生长迟滞且开始变白的现象，牛樟菌会再次逐渐出现休眠征兆。

在本实施例中，根据培养容器6的尺寸大小，较佳的生长期范围介于10~20天之间，最佳生长期为15天，但是实施时，生长期长短可视牛樟菌生长情况以及采用的培养容器6大小而调整。基本上，本发明主要是要诱使牛樟菌仿效野生牛樟芝的层叠生长方式进行生长，且因牛樟菌菌块302的后层生长量会受限于其前一层外露于液面的表面积量，若生长期过短，牛樟菌菌块302表面积增加量太少，会不利于后层的生长，也就是说，牛樟菌菌块302的后层面积会越来越小，而影响产率；若生长期太长，则不易进行批量化管控，以及统一进行休眠与生长的调控。

配合参阅图9，(五)重复循环上述休眠步骤与重新生长步骤预定次数的步骤。通过调控培养环境温度，诱使牛樟菌反复进行休眠与重新生长的方式，可使培养的牛樟菌菌块302的生长形态如野生牛樟芝子实体的层叠状生长的情况，而产生层叠状的类子实体产物。

在本实施例中，依据目前使用的漂浮培养基400总量，以及使用的培养容器6容量大小，该休眠步骤与重新生长步骤重复进行共计十五个循环，为期九个月。但是实施时，休眠步骤与重新生长步骤的循环次数可依据漂浮培养基400的使用量与消耗情况，并配合牛樟菌菌块302生长情况做适度调整，尽量培养至该固态营养基质团块401被消耗殆尽，以减少资源的浪费，同时可提高收成效益。

由于牛樟菌具有厌水生长特性，本发明上述漂浮式牛樟菌培养法就是利用此厌水特性，将牛樟菌漂浮接种在漂浮培养基400的培养液402中进行培养，迫使牛樟菌只能往液面上方大量增生并聚集成菌块状，而无法再如一般固态培养的分散生长。然后，通过交替诱使牛樟菌休眠与重新生长，每次的休眠与重新生长都会使牛樟菌菌块302在原本的块状结构上再产生一层新的菌层结构，且牛樟菌菌块302上新生的菌层除了会通过营养菌丝自营养液402与固态基质团块401摄取养分外，还会往下自其下方菌层结构中摄取先前累积的中间代谢物，并进一步分解代谢产生三萜类成分。因此，通过循环诱使牛樟菌菌块302上的牛樟菌交替休眠与重新生长，就可产生富含三萜类成分且类似野生牛樟芝子实体的层叠状类子实体产物。

另外，必须说明的是，为避免培养容器6中的营养液402蒸散量过大，以致于发生营养液402液面过低，而致使牛樟菌出现类似固态培养生长的情况，所以在上述培养过程中，若培养容器6中的营养液402液面过低时，会适时添加二次蒸馏水以调整液面高度，但是实施时，此并非为必要步骤。

完成前述培养步骤后，取出培养所得牛樟菌菌块302以进行三萜类成分含量的分析。为进一步比较一般固态培养所得的牛樟菌的三萜类含量差异，本发明另外就上述牛樟菌菌株以固态培养基进行固态培养，并自中药店购得三年生野生牛樟芝子实体以作为三萜类成分含量比较对象。

【固态培养方式如下说明】：

所使用的固态培养基组成与上述漂浮培养基400大致相同，唯一的差别在于添加的二次蒸馏水的水量，固态培养基在高温杀菌处理前的总液量为80ml，经高温灭菌处理后，五谷杂粮与枸杞会呈湿润颗粒状。然后，将含有牛樟菌活性菌丝的培养载体接种至置于培养容器中的固态培养基上，并在供氧且避光的15℃环境与20℃环境中各十五天交替循环，为期九个月，以进行固态培养。在此生长期间，牛樟菌菌丝会生长在固态培养基颗粒上。

【三萜类成分分析比较】

本申请三萜类成分是委托嘉南药理科技大学食品科技系-有机与保健食品检验实验室代为分析。

本申请漂浮培养方法所得牛樟菌(BCRC35396、BCRC 37848)菌块：取出漂浮培养所得的125g牛樟菌菌块302，并将其移入-70℃环境冻存隔夜，然后进行真空冷冻干燥处理，冻干后的菌块重11.8g，并研磨成粉末，研磨大小为120目，以HPLC进行三萜类成分分析。HPLC分析条件如下：

三萜类萃取：取适量粉末加入95%乙醇，在室温下搅拌萃取六小时以上，然后滤除不溶物，再以0.45μm过滤器过滤备用。

HPLC分析：采用C 18管柱(OD S)，UV侦测器波长245nm，流动相A为0.1%磷酸溶液，流动相B为acetonitrile(乙腈)，以表1所示梯度流洗进行HPLC三萜类图谱分析。

表1

min	流动相A	流动相B	ml/min
				0	95	5	1
10	95	5	1
				70	50	50	1
90	0	100	1
				100	0	100	1

固态培养的牛樟菌：同样采用-70℃真空冷冻干燥处理，将牛樟菌连同残余的固态培养基直接进行-70℃真空冷冻干燥处理，并研磨成粉末，研磨大小为120目，以HPLC进行三萜类成分分析，分析条件同上。

三年生野生牛樟芝子实体：采用-70℃真空冷冻干燥处理，将野生牛樟芝子实体直接进行-70℃真空冷冻干燥处理，并研磨成粉末，研磨大小为120目，以HPLC进行三萜类成分分析，分析条件同上。

【三萜类成分含量分析结果】

如图3、4所示，并参阅表2，显示漂浮培养所得的BCRC35396菌株的牛樟菌菌块的萃取物成分接近野生牛樟芝子实体萃取物成分，且每克样品三萜类萃取量明显高于野生牛樟芝子实体与固态培养的牛樟菌菌块，高达野生牛樟芝子实体的4.6倍，而为一般固态培养方式的8倍。证实本发明所培养的牛樟菌菌块可萃取出较高的三萜类成分。

表2:漂浮培养与固态培养的牛樟菌(BCRC35396)的三萜类含量

同样的，如图5、6与表3所示，漂浮培养所得的BCRC37848菌株的牛樟菌菌块的每克样品的三萜类含量，同样明显高于野生牛樟芝子实体与固态培养牛樟菌菌块。

表3:漂浮培养与固态培养的牛樟菌(BCRC37848)菌块的三萜类含量

必须特别说明的是，在本实施例中，在初期培养步骤与重新生长步骤中，都是在牛樟菌出现休眠征兆后，才再通过降温与停止供氧的方式，促使所有牛樟菌完全进入休眠期。但是实施时，只通过调降温度与停止供氧的方式，就可促使牛樟菌进入休眠期，所以不以培养至牛樟菌出现休眠征兆才进入休眠期为限。

另外，在上述实施例中，由于漂浮培养基400是直接装在培养容器6中进行高温高压杀菌作业，然后就直接用于进行牛樟菌的漂浮培养，所以制成的固态营养基质团块401形状会大致与该培养容器6内部空间相符，也就是说，其周缘会大致靠抵于该培养容器6内壁，所以将培养载体300或培养载体切片301置入该培养容器6时，只能将培养载体300或培养载体切片301置于该固态营养基质团块401上方的营养液402中。但是实施时，该漂浮培养基400制作完成后，也可另外移至径宽大于该固态营养基质团块401外径的其它培养容器6中，使该培养容器6位于该固态营养基质团块401旁侧的内部空间足以容置培养载体300或培养载体切片301，此时，该营养液402液面高度会因为培养容器6内径变大而降低，甚至是低于该固态营养基质团块401顶缘。

接着，将含有牛樟菌活性菌丝的培养载体300或培养载体切片301置入该培养容器6内，并浸泡在该固态营养基质团块401旁侧空间的营养液402中，同样是使培养载体300或培养载体切片301上具有前驱菌丝的部分外露于液面上方，而部分活性菌丝位于液面下。再通过施行上述漂浮培养步骤，同样可诱使牛樟菌的营养菌丝与气生菌丝增生聚集成局部沉浸在营养液中的牛樟菌菌块302，在此漂浮培养期间，该固态营养基质团块401会逐渐被分解缩小，而牛樟菌菌块302会逐渐增大，也可获得类似野生牛樟芝层叠状生长的类子实体产物。

综上所述，通过让牛樟菌菌块302局部沉浸在营养液402中而只局部外露于液面上方的漂浮培养方式，可迫使牛樟菌只能往液面上方进行增生，并通过重复循环地诱使牛樟菌进行休眠与重新生长的漂浮培养方法设计，就可诱使人工培养的牛樟菌仿效野生牛樟芝层叠生长型态进行生长，而在短期间内长出类似层叠状子实体的牛樟菌菌块302，且本发明漂浮培养方式所培养出的牛樟菌菌块302萃取所得的三萜类含量会明显高于野生牛樟芝与一般固态培养方式所得的牛樟菌，并适用于大量人工培养。因此，确实可达到本发明的目的。

Claims (8)

1.一种可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，其特征在于：依序包含以下步骤：(A)将含有牛樟菌活性菌丝的培养载体接种至漂浮培养基的步骤，所述漂浮培养基是由提供碳源与氮源的五谷杂粮，及枸杞、土肉桂、提供胡萝卜素与维生素的蔬菜汁、牛樟木萃取液与二次蒸馏水混合并经高温灭菌处理制成，所述牛樟木萃取液是将牛樟木与二次蒸馏水混合并经高温灭菌所制成，该漂浮培养基包括含有牛樟木萃取液的营养液，及沉浸于所述营养液中的固态营养基质团块，所述培养载体局部浸泡在营养液中，且部分牛樟菌活性菌丝外露于营养液液面上方，而部分牛樟菌活性菌丝局部浸泡在营养液中；(B)在供氧且适合牛樟菌生长的培养环境温度条件下进行初期避光培养的步骤，促使外露于营养液液面上方的牛樟菌活性菌丝增生，而在该培养载体上聚集成局部外露于营养液液面上方的牛樟菌菌块，且使所述牛樟菌菌块的部分活性菌丝增生附着于所述固态营养基质团块撷取养分；(C)在避光环境下进行休眠的步骤，密封培养环境而停止供氧，并将培养环境温度调降至休眠温度，诱使牛樟菌进入休眠期，并维持休眠期预定期间，所述休眠温度范围介于4-10℃之间；(D)在避光环境下诱使牛樟菌重新生长的步骤，对所述培养环境重新供氧，且将培养环境温度调升至适合牛樟菌生长的温度，诱使所述牛樟菌菌块位于液面上的孢子萌发生长成活性菌丝，并维持此生长期预定时间；及(E)重复循环所述步骤(C)与所述步骤(D)预定次数。

2.根据权利要求1所述的可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，其特征在于，所述步骤(A)的营养液液面会高出所述固态营养基质团块顶缘，所述培养载体局部沉浸在营养液中，而叠靠于所述固态营养基质团块顶缘。

3.根据权利要求2所述的可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，其特征在于，所述步骤(A)的漂浮培养基的营养液液面高出所述固态营养基质团块顶缘的距离范围介于0.5-2cm之间。

4.根据权利要求1所述的可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，其特征在于，所述步骤(A)中局部浸泡于营养液中的培养载体间隔位于所述固态营养基质团块旁侧。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，其特征在于，所述步骤(B)与所述步骤(D)还会分别在牛樟菌的培养期期间，调控所述培养环境的湿度，使营养液保持局部浸泡所述牛樟菌菌块。

6.根据权利要求1所述的可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，其特征在于，所述步骤(B)与所述步骤(D)的培养环境温度较佳范围介于15-25℃之间。

7.根据权利要求1所述的可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，其特征在于，所述步骤(C)的休眠期时间为24小时以上。

8.根据权利要求7所述的可提高三萜类含量的漂浮式牛樟菌培养法，其特征在于，所述步骤(C)休眠期的较佳时间长度为72小时。