CN104212856A

CN104212856A - 一种樟芝菌中腺苷的提取方法

Info

Publication number: CN104212856A
Application number: CN201410471596.3A
Authority: CN
Inventors: 刘巴宁; 郑安乔
Original assignee: ZHONGSHAN ANQIAO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHONGSHAN ANQIAO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-09-17
Filing date: 2014-09-17
Publication date: 2014-12-17

Abstract

本发明涉及一种樟芝菌中腺苷的提取方法。所述的提取方法包括以下步骤：先将樟芝菌接种于PDA培养基中进行菌种活化，再将活化后的樟芝菌接种于液体种子培养基中，摇床培养得到摇床培养后的樟芝菌摇床培养，再取2%-5%的摇床培养后的樟芝菌接种于发酵罐中培养，得到深层发酵后的樟芝菌发酵液，最后制备樟芝菌菌丝体干粉，并将其溶于加有有机溶剂的水中在40-50℃的恒温水浴锅里浸提40-60min，离心取沉淀用水洗涤，取洗涤液即为腺苷的提取液。本发明中先对样品进行预处理，在有机溶剂提取时，将提取温度控制在40-50℃，提取时间控制在40-60min,大大缩短了提取时间，同时也使腺苷提取率明显增加，还能维护腺苷结构的稳定性。

Description

一种樟芝菌中腺苷的提取方法

技术领域

本发明涉及一种真菌有效成份的提取，具体涉及一种樟芝菌中腺苷的提取方法。

背景技术

樟芝Antrodia camphorata 又称牛樟芝或牛樟菇，是台湾特有珍贵真菌。研究发现樟芝成分复杂，含有很多生理活性物质具有多种生理活性，如抗氧化、保肝、抗癌、解毒、消炎等，对食物中毒等危急病症具有神奇的疗效。腺苷也是牛樟芝重要成分中的一种，其是一种内源性嘌呤核苷酸，具有广泛的生理活性，如可以减少心肌漏出酶，维持细胞膜完整，降低冠状动脉阻力和肺动脉压，并能促进造血等功能。另外，腺苷在炎症中由大量ATP降解而成，局部浓度可达1200nmoL/L，腺苷浓度在此水平时具抗炎作用。目前ATP已广泛用于心功能不全及血管动脉硬化等疾病的治疗。目前，国内外对腺苷的提取方法主要包括超声提取、冷凝回流提取及水浴提取，提取介质主要包括水、甲醇、乙醇等，提取时采用的提取介质不同、提取方法不同时，腺苷提取率也不同，但上述方法存在操作繁琐或提取率低等缺点。为此，本发明对水浴浸提的方法进行了进一步改进，提供一种操作简单，腺苷提取率高的提取方法。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种对樟芝菌中腺苷进行有效提取的方法。

本发明的技术方案如下：

一种樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将樟芝菌接种于PDA培养基中，培养活化得到活化后的樟芝菌；

（2）摇床培养：将步骤（1）中得到的活化后的樟芝菌接种于液体种子培养基中，摇床培养得到摇床培养后的樟芝菌；

（3）发酵培养：取2%-5%的步骤（2）中得到的摇床培养后的樟芝菌接种于发酵罐中培养，得到深层发酵后的樟芝菌发酵液；

（4）樟芝菌干粉制备：取步骤（3）中得到的深层发酵后的樟芝菌发酵液离心，取沉淀加水洗涤，再次离心，洗涤，将洗涤液在45-55℃条件下真空冷冻干燥，粉碎过筛，制得樟芝菌菌丝体干粉；

（5）腺苷提取及腺苷含量测定：将步骤（4）中制得的樟芝菌菌丝体干粉溶于加有有机溶剂的水中，在40-50℃的恒温水浴锅里浸提40-60min，离心，弃上清液，取沉淀用水洗涤，取洗涤液即为腺苷的提取液。

步骤（1）中所述的PDA培养基由以下重量份的组分组成：牛樟木萃取的营养液5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨 5-10%，酵母粉2-5%，琼脂5%-8%，水余量。

步骤（1）中所述的PDA培养基的制成方法具体为：将5%-10%牛樟木萃取的营养液，10-30%的葡萄糖，5-10%的蛋白胨， 2-5%的酵母粉，5%-8%的琼脂，水余量，加热融化，装试管，灭菌。

所述的灭菌方法具体为：121℃条件下湿热灭菌30-45min。

优选的，步骤（1）中所述的培养温度为25-28℃，培养时间为5-7d。

步骤（2）中所述的液体种子培养基及步骤（3）中所述的发酵罐中的培养基均由以下重量份的组分制成：牛樟木萃取的营养液5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨 5-10%，酵母粉2-5%，水余量。

优选的，步骤（2）中所述的摇床培养的培养温度为25-28℃，培养时间为5-10d，摇床速度为150-180r/min。

优选的，步骤（3）中所述的培养温度为25-28℃，培养时间为3-5d，通气量为1vvm。

优选的，步骤（4）及步骤（5）中所述的离心速度为3000-5000r/min,离心温度为25-28℃；所述的过筛为过60-80目筛。

优选的，步骤（5）中所述的溶剂选自乙醇或甲醇中的一种；所述的溶剂与水的体积比为（3-5）:(11-17)

本发明与现有技术相比，有益效果体现在以下几点：

1.研究显示，真菌中腺苷的提取温度对腺苷的提取率具有显著的影响，提取温度在40-50℃时，腺苷提取率有所增加，而当超过50℃时，腺苷提取率明显下降，因此，本发明中，在对腺苷进行恒温水浴浸提时，将温度控制在40-50℃，更加利于样品中腺苷的有效提取，此外，在温度控制在40-50℃时还有利于维护腺苷结构的稳定性。

2.研究显示，采用有机溶剂进行腺苷提取时，提取时间在2.5h左右时，腺苷提取率最高，本发明中，先对样品进行预处理制得樟芝菌干粉，在采用有机溶剂提取时，将溶剂与水的体积比限定为（3-5）:(11-17)，在保证提取效果的基础上，可明显缩短提取时间。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将樟芝菌接种于PDA培养基中，在25℃条件下培养5d，培养活化得到活化后的樟芝菌；

（2）摇床培养：将步骤（1）中得到的活化后的樟芝菌接种于液体种子培养基中，在25℃，150r/min条件下摇床培养5d，得到摇床培养后的樟芝菌；

（3）发酵培养：取2%的步骤（2）中得到的摇床培养后的樟芝菌接种于发酵罐中在25℃条件下培养3d，通气量为1vvm，得到深层发酵后的樟芝菌发酵液；

（4）樟芝菌干粉制备：取步骤（3）中得到的深层发酵后的樟芝菌发酵液在25℃条件下采用3000r/min离心，取沉淀加水洗涤，以3000r/min再次离心，洗涤，将洗涤液在45℃条件下真空冷冻干燥，粉碎过60目筛，制得樟芝菌菌丝体干粉；

（5）腺苷提取及腺苷含量测定：将步骤（4）中制得的樟芝菌菌丝体干粉溶于加有乙醇的水中，乙醇与水的体积比为3:11，在40℃的恒温水浴锅里浸提40min，在25℃条件下以3000r/min离心，弃上清液，取沉淀用水洗涤，取洗涤液即为腺苷的提取液。

步骤（1）中所述的PDA培养基由以下重量份的组分组成：牛樟木萃取的营养液5%，葡萄糖10%，蛋白胨 5%，酵母粉2%，琼脂5%，水余量。

步骤（1）中所述的PDA培养基的制成方法具体为：将5%牛樟木萃取的营养液，10%的葡萄糖，5%的蛋白胨，2%的酵母粉，5%的琼脂，水余量，加热融化，装试管，在121℃条件下湿热灭菌30min。

步骤（2）中所述的液体种子培养基及步骤（3）中所述的发酵罐中的培养基均由以下重量份的组分制成：牛樟木萃取的营养液5%，葡萄糖10%，蛋白胨 5%，酵母粉2%，水余量。

实施例2

一种樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将樟芝菌接种于PDA培养基中，在28℃条件下培养7d，培养活化得到活化后的樟芝菌；

（2）摇床培养：将步骤（1）中得到的活化后的樟芝菌接种于液体种子培养基中，在28℃，180r/min条件下摇床培养10d，得到摇床培养后的樟芝菌；

（3）发酵培养：取5%的步骤（2）中得到的摇床培养后的樟芝菌接种于发酵罐中在28℃条件下培养5d，通气量为1vvm，得到深层发酵后的樟芝菌发酵液；

（4）樟芝菌干粉制备：取步骤（3）中得到的深层发酵后的樟芝菌发酵液在28℃条件下采用5000r/min离心，取沉淀加水洗涤，以5000r/min再次离心，洗涤，将洗涤液在55℃条件下真空冷冻干燥，粉碎过80目筛，制得樟芝菌菌丝体干粉；

（5）腺苷提取及腺苷含量测定：将步骤（4）中制得的樟芝菌菌丝体干粉溶于加有甲醇的水中，甲醇与水的体积比为5:17，在50℃的恒温水浴锅里浸提60min，在28℃条件下以5000r/min离心，弃上清液，取沉淀用水洗涤，取洗涤液即为腺苷的提取液。

步骤（1）中所述的PDA培养基由以下重量份的组分组成：牛樟木萃取的营养液10%，葡萄糖30%，蛋白胨 10%，酵母粉5%，琼脂8%，水余量。

步骤（1）中所述的PDA培养基的制成方法具体为：将10%牛樟木萃取的营养液，30%的葡萄糖，10%的蛋白胨，5%的酵母粉，8%的琼脂，水余量，加热融化，装试管，在121℃条件下湿热灭菌45min。

步骤（2）中所述的液体种子培养基及步骤（3）中所述的发酵罐中的培养基均由以下重量份的组分制成：牛樟木萃取的营养液10%，葡萄糖30%，蛋白胨10%，酵母粉5%，水余量。

实施例3

一种樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将樟芝菌接种于PDA培养基中，在26℃条件下培养6d，培养活化得到活化后的樟芝菌；

（2）摇床培养：将步骤（1）中得到的活化后的樟芝菌接种于液体种子培养基中，在26℃，160r/min条件下摇床培养8d，得到摇床培养后的樟芝菌；

（3）发酵培养：取3%的步骤（2）中得到的摇床培养后的樟芝菌接种于发酵罐中在26℃条件下培养4d，通气量为1vvm，得到深层发酵后的樟芝菌发酵液；

（4）樟芝菌干粉制备：取步骤（3）中得到的深层发酵后的樟芝菌发酵液在26℃条件下采用4000r/min离心，取沉淀加水洗涤，以4000r/min再次离心，洗涤，将洗涤液在50℃条件下真空冷冻干燥，粉碎过80目筛，制得樟芝菌菌丝体干粉；

（5）腺苷提取及腺苷含量测定：将步骤（4）中制得的樟芝菌菌丝体干粉溶于加有甲醇的水中，甲醇与水的体积比为4:15，在45℃的恒温水浴锅里浸提50min，在26℃条件下以4000r/min离心，弃上清液，取沉淀用水洗涤，取洗涤液即为腺苷的提取液。

步骤（1）中所述的PDA培养基由以下重量份的组分组成：牛樟木萃取的营养液8%，葡萄糖20%，蛋白胨8%，葡萄糖12%，酵母粉3%，琼脂6%，水余量。

步骤（1）中所述的PDA培养基的制成方法具体为：将8%牛樟木萃取的营养液，20%的葡萄糖，8%的蛋白胨，3%的酵母粉，6%的琼脂，水余量，加热融化，装试管，在121℃条件下湿热灭菌40min。

步骤（2）中所述的液体种子培养基及步骤（3）中所述的发酵罐中的培养基均由以下重量份的组分制成：牛樟木萃取的营养液8%，葡萄糖20%，蛋白胨8%，酵母粉3%，水余量。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式，并不应理解为对本发明的限定，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（1）中所述的PDA培养基由以下重量份的组分组成：牛樟木萃取的营养液5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨 5-10%，酵母粉2-5%，琼脂5%-8%，水余量。

3.根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（1）中所述的PDA培养基的制成方法具体为：将5%-10%牛樟木萃取的营养液，10-30%的葡萄糖，5-10%的蛋白胨， 2-5%的酵母粉，5%-8%的琼脂，水余量，加热融化，装试管，灭菌。

4.根据权利要求3所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，所述的灭菌方法具体为：121℃条件下湿热灭菌30-45min。

5.根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（1）中所述的培养温度为25-28℃，培养时间为5-7d。

6.根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（2）中所述的液体种子培养基及步骤（3）中所述的发酵罐中的培养基均由以下重量份的组分制成：牛樟木萃取的营养液5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨 5-10%，酵母粉2-5%，水余量。

7.根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（2）中所述的摇床培养的培养温度为25-28℃，培养时间为5-10d，摇床速度为150-180r/min。

8.根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（3）中所述的培养温度为25-28℃，培养时间为3-5d，通气量为1vvm。

9.根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（4）及步骤（5）中的所述的离心速度为3000-5000r/min,离心温度为25-28℃；所述的过筛为过60-80目筛。

10.根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（5）中所述的溶剂选自乙醇或甲醇中的一种；所述的溶剂与水的体积比为（3-5）:(11-17)。