CN110305918A - 一种牛樟芝发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法 - Google Patents

一种牛樟芝发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法 Download PDF

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金彧菡
刘欢
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Abstract

本发明提供一种牛樟芝深层液体发酵耦合萃取生产4‑乙酰基安卓奎诺尔B(4‑Acetylantroquinonol B)的方法，包括如下步骤：(1)菌种的扩大培养；(2)孢子悬液的制备；(3)牛樟芝液体种子培养；(4)牛樟芝液体发酵培养；(5)产物的提取。本方法使用液‑液提取，与传统固‑液提取法相比，省去了物理方法处理干菌体的各种步骤，实现了生产过程中的节能要求。利用本方法从牛樟芝发酵液中获得了较高产量的活性物质4‑Acetylantroquinonol B。

Description

一种牛樟芝发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的 方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种牛樟芝深层液体发酵耦合萃取生产4-乙酰基安卓奎诺尔B(4-Acetylantroquinonol B)的方法。
背景技术
牛樟芝是中国国台湾地区的特有真菌，其分属于担子菌门，伞菌纲，多孔菌目，拟层孔菌科。牛樟芝子实体仅仅生长在我中国台湾地区海拔数百米甚至几千米的的丛林山地中，并且只寄生在牛樟树的树腔内壁。外形呈板形、钟形、马蹄形或是不规则形状，多年生、无柄，紧贴于木材表面生长。之前的研究中已经对牛樟芝子实体的活性成分及其药理活性进行研究，主要有三萜类化合物，活性多糖，腺苷等多种活性成分。
近年来，从牛樟芝子实体中又分离出4-Acetylantroquinonol B等泛醌类化合物，有保肝，健肝，抗癌等功效。Yu-wei Lin已经证实4-乙酰基安卓奎诺尔B对肝癌细胞HepG2有极强的抑制作用，Yu等人研究表明4-acetylantroquinonol B对胰腺癌(PANC-1、AsPC-1)的生长具有显著的抑制作用，其抑制效果与其含量正相关。4-acetylantroquinonol B同时具有可以降低癌细胞的抗药性，是一种极具潜力的抗癌新药。
由于牛樟芝具有严格的寄主特性，造成牛樟芝的自然产量处于一个极低的水平。因此，牛樟芝子实体的价格十分昂贵，一直处于供不应求的市场状态。所以利用现代生物发酵技术人工培养牛樟芝的菌体成分是解决这一矛盾的途径。Yu-Wei Lin和Been-HuangChiang从液体发酵培养的菌丝体中分离出了4-Acetylantroquinonol B，同时发现在牛樟芝深层液体发酵的培养过程中加入TMBA等物质可以提高4-Acetylantroquinonol B的产量，最终产量为0.8mg/g，仍处于较低水平。对于牛樟芝液态发酵法生产4-Acetylantroquinonol B的报道很少，研究仍处于初级阶段。CN105463038公布了一种在不添加诱导物和前提物的情况下从牛樟芝液体发酵所获得的菌体中获得4-Acetylantroquinonol B的方法，其产量达2.6-5mg/g。但由于发酵提取方法所限，目前从发酵菌体中获取4-Acetylantroquinonol B的产量仍不理想。
发明内容
本发明目的是克服现有技术产量低的不足，提供一种利用牛樟芝菌丝体发酵耦合萃取获得高产量活性物质4-乙酰基安卓奎诺尔B(4-Acetylantroquinonol B)的新方法。
本发明为了实现上述目的而采取如下技术方案：
一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，包括如下步骤：
(1)菌种的扩大培养：通过挖块接种的方式将牛樟芝菌接种至新固体培养基中，进行扩大培养，直至新牛樟芝菌落的形成；
(2)孢子悬液的制备：将无菌水倒入新固体培养基中，用玻璃棒刮下孢子，得到孢子悬液；
(3)牛樟芝液体种子培养：将孢子悬液接种至液体种子培养基中，通过控制培养基组成和培养条件，形成规则小球状菌体即为液体种子；
(4)牛樟芝液体发酵培养：将步骤(3)中的液体种子接入液体发酵培养基中，150-180rpm，25-28℃，发酵培养第8-10d时，加入吐温80；发酵培养第14-17d时，加入油酸；继续发酵至20d；
(5)产物提取：发酵结束后，将发酵液离心，收集上层有机相，用乙醇提取发酵液有机相中的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
进一步地，所述步骤(1)中固体培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，蛋白胨1-5g/L，麦芽浸粉15-30g/L，琼脂20-35g/L；117℃灭菌25min。
进一步地，所述步骤(2)中孢子悬液中孢子数含量为106-107个/mL。
进一步地，所述步骤(3)中液体种子培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨5-15g/L，KH2PO4 0.5-2g/L，MgS04·7H2O 0.5-1.0g/L；117℃灭菌25min。
进一步地，所述步骤(4)中液体发酵培养基组成为:葡萄糖25-45g/L，蛋白胨5-10g/L，K2HPO4 0.5-1.0g/L，MgS04·7H2O 0.1-1.0g/L；117℃灭菌25min。
进一步地，所述步骤(4)中液体种子的接种量为10％-30％v/v。
进一步地，所述步骤(4)中加入吐温80量为1％-3％v/v。
进一步地，所述步骤(4)中加入油酸量为20％-50％v/v。
进一步地，将步骤(5)离心后的下层发酵液抽滤除去液体培养基，再用去离子水清洗菌体2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量即为菌体干重。
进一步地，利用高效液相色谱配合紫外检测器对所述步骤(5)提取得到的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B进行测定。
本发明具有以下优点和有益效果：
与其他培养方法相比，本发明方法在液体发酵过程中利用吐温80使胞内产物4-Acetylantroquinonol B绝大部分转移到发酵液中，活性物质在菌体中几乎无残留，解除了产物抑制，同时利用油酸对发酵液中的4-Acetylantroquinonol B同步萃取到有机相中，实现了初步分离，进一步提高产物得率。本方法使用液-液提取，与传统固-液提取法相比，省去了物理方法处理干菌体的各种步骤，实现了生产过程中的节能要求。利用本方法从牛樟芝发酵液中获得了较高产量的活性物质4-Acetylantroquinonol B，使单位体系内其含量可高达18.3mg/g以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，仍在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。下述实施例中涉及的具体操作方法，如未特别说明，均为本领域常规方法。
本发明实施方式中所述牛樟芝或牛樟芝菌，优选现有技术中一株Antrodiacamphorata(同义名:Taiwanofungus camphorates；Ganoderma camphoratum；Antrodia cinnamomea)YMT 1002菌株，该菌株子实体保藏于台湾生物资源保存及研究中心(简称BCRC)(BCRC Number：35396)，也可以采用现有技术中其他牛樟芝菌株如Antrodiacinnamomea(BCRC Number:35398)，Taiwanofungus camphoratus菌株(CGMCC Number:5.906)，以上菌株均可以通过购买方式获得。
实施例1：
以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体种子培养的操作工艺如下：
1)牛樟芝孢子的制备：
利用挖块接种法，将牛樟芝菌Antrodia camphorata YMT 1002菌株(BCRCNumber：35396)接种至新的固体培养基中，优选的固体培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨2.5g/L，麦芽浸粉20g/L，琼脂25g/L，避光培养20-25天后，新的圆形菌落形成，直径约4-5cm，菌落中心呈橙色，边缘呈白色，保存于4℃备用。
2)牛樟芝孢子悬液的制备：
经扩大培养后的新菌落可用于制备孢子悬液。4℃保存的菌种于室温中放置1-2h后，无菌条件下加入10-15mL无菌水，用玻璃棒轻轻刮下菌落表面的孢子，最终菌悬液呈浑浊的橙色，其中孢子数为106-107个/mL。
3)牛樟芝液体种子的制备：
装液量为100mL/250mL，优选的培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO41.5g/L，MgS04·7H2O 0.1g/L，117℃灭菌25min。加入1-2mL制备好的孢子悬液，置于150rpm，25℃的恒温摇床中培养3-4天，菌体呈规则球状，直径约为1-2mm，即为液体种子，可接种至发酵培养基中。
实施例2：
以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵耦合萃取产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
1)发酵培养：
以实施例1中所得牛樟芝小球为种子液，以15％的接种量接种至液体发酵培养基中，装液量为100mL/250mL，液体发酵培养基组成为:葡萄糖25g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L。置于150rpm，28℃的恒温摇床中培养。于发酵第10d向发酵培养基中加入1％的吐温80，第16d向发酵培养基中加入20％的油酸，继续发酵至20d结束。
2)发酵液中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
发酵结束后，将发酵液离心，收集上层有机相保存，用乙醇提取发酵液有机相中的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
离心后的下层发酵液抽滤除去液体培养基，再用去离子水清洗菌体2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量为菌体干重。取一定量烘干后的菌体，研磨粉碎，过120目筛，常规方法提取胞内的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
利用高效液相色谱配合紫外检测器分别对上述两部分的提取液进行测定，测得发酵液有机相中获得的目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为14.2mg/g干菌体；测得胞内获得目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为0.01mg/g干菌体。
实施例3：
以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵耦合萃取产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
1)发酵培养：
以实施例1中所得牛樟芝小球为种子液，以20％的接种量接种至液体发酵培养基中，装液量为100mL/250mL，液体发酵培养基组成为:葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L。置于180rpm，28℃的恒温摇床中培养。于发酵第12d向发酵培养基中加入2％的吐温80，第17d向发酵培养基中加入30％的油酸，继续发酵至20d结束。
2)发酵液中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
发酵结束后，将发酵液离心，收集上层有机相保存，用乙醇提取发酵液有机相中的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
离心后的下层发酵液抽滤除去液体培养基，再用去离子水清洗菌体2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量为菌体干重。取一定量烘干后的菌体，研磨粉碎，过120目筛，常规方法提取胞内的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
利用高效液相色谱配合紫外检测器分别对上述两部分的提取液进行测定，测得发酵液有机相中获得的目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为18.3mg/g干菌体；测得胞内获得目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为0.003mg/g干菌。
实施例4：
以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵耦合萃取产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
1)发酵培养：
以实施例1中所得牛樟芝小球为种子液，以15％的接种量接种至第一阶段液体发酵培养基中，装液量为100mL/250mL，液体发酵培养基组成为:葡萄糖30g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L。置于150rpm，25℃的恒温摇床中培养。于发酵第10d向发酵培养基中加入3％的吐温80，第16d向发酵培养基中加入40％的油酸，继续发酵至20d结束。
2)发酵液中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
发酵结束后，将发酵液离心，收集上层有机相保存，用乙醇提取发酵液有机相中的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
离心后的下层发酵液抽滤除去液体培养基，再用去离子水清洗菌体2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量为菌体干重。取一定量烘干后的菌体，研磨粉碎，过120目筛，常规方法提取胞内的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
利用高效液相色谱配合紫外检测器分别对上述两部分的提取液进行测定，测得发酵液有机相中获得的目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为17.2mg/g干菌体；测得胞内获得目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为0.005mg/g干菌。
对比例1：
对照实施例2，以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵耦合萃取产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
1)发酵阶段培养：
以实施例1中所得牛樟芝小球为种子液，以15％的接种量接种至液体发酵培养基中，装液量为100mL/250mL，液体发酵培养基组成为:葡萄糖25g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L。置于150rpm，28℃的恒温摇床中培养。于发酵第10d向发酵培养基中加入1％的植物油，第16d向发酵培养基中加入20％的正己烷，继续发酵至20d结束。
2)发酵液中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
发酵结束后，将发酵液离心，收集上层有机相保存，用乙醇提取发酵液有机相中的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
离心后的下层发酵液抽滤除去液体培养基，再用去离子水清洗菌体2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量为菌体干重。取一定量烘干后的菌体，研磨粉碎，过120目筛，常规方法提取胞内的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
利用高效液相色谱配合紫外检测器分别对上述两部分的提取液进行测定，测得发酵液有机相中获得的目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为6.1mg/g干菌体；测得胞内获得目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为4.2mg/g干菌。
对比例2：
对照实施例4，以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵耦合萃取产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
1)发酵培养：
以实施例1中所得牛樟芝小球为种子液，以20％的接种量接种至液体发酵培养基中，装液量为100mL/250mL，液体发酵培养基组成为:葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L。置于180rpm，28℃的恒温摇床中培养20天。
2)菌体中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
发酵结束后，将发酵液离心，收集上层发酵液，用乙醇提取发酵液中的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
离心后的下层发酵液抽滤除去液体培养基，再用去离子水清洗菌体2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量为菌体干重。取一定量烘干后的菌体，研磨粉碎，过120目筛，常规方法提取胞内的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
利用高效液相色谱配合紫外检测器分别对上述两部分的提取液进行测定，测得胞内获得目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为0.8mg/g干菌，发酵液中未检出目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
实施例5：
以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵耦合萃取产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
1)发酵培养：
以实施例1的方法培养牛樟芝菌Antrodia cinnamomea(BCRC Number：35398)制备液体种子，以20％的接种量接种至液体发酵培养基中，装液量为100mL/250mL，液体发酵培养基组成为:葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L。置于180rpm，28℃的恒温摇床中培养。于发酵第12d向发酵培养基中加入2％的吐温80，第17d向发酵培养基中加入30％的油酸，继续发酵至20d结束。
2)发酵液中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
发酵结束后，将发酵液离心，收集上层有机相保存，用乙醇提取发酵液有机相中的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
离心后的下层发酵液抽滤除去液体培养基，再用去离子水清洗菌体2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量为菌体干重。取一定量烘干后的菌体，研磨粉碎，过120目筛，常规方法提取胞内的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
利用高效液相色谱配合紫外检测器分别对上述两部分的提取液进行测定，测得发酵液有机相中获得的目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为15.4mg/g干菌体；测得胞内获得目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为0.002mg/g干菌。
实施例6：
以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵耦合萃取产4-Acetylantroquinonol B的操作工艺如下：
1)发酵培养：
以实施例1的方法培养牛樟芝菌Taiwanofungus camphoratus菌株(CGMCCNumber:5.906)制备液体种子，以20％的接种量接种至液体发酵培养基中，装液量为100mL/250mL，液体发酵培养基组成为:葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L。置于180rpm，28℃的恒温摇床中培养。于发酵第12d向发酵培养基中加入2％的吐温80，第17d向发酵培养基中加入30％的油酸，继续发酵至20d结束。
2)发酵液中4-Acetylantroquinonol B的提取及测定：
发酵结束后，将发酵液离心，收集上层有机相保存，用乙醇提取发酵液有机相中的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
离心后的下层发酵液抽滤除去液体培养基，再用去离子水清洗菌体2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量为菌体干重。取一定量烘干后的菌体，研磨粉碎，过120目筛，常规方法提取胞内的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
利用高效液相色谱配合紫外检测器分别对上述两部分的提取液进行测定，测得发酵液有机相中获得的目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为16.6mg/g干菌体；测得胞内获得目标活性产物4-Acetylantroquinonol B，产量为0.004mg/g干菌。

Claims (10)

1.一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，包括如下步骤：
(1)菌种的扩大培养：通过挖块接种的方式将牛樟芝菌接种至新固体培养基中，进行扩大培养，直至新牛樟芝菌落的形成；
(2)孢子悬液的制备：将无菌水倒入新固体培养基中，用玻璃棒刮下孢子，得到孢子悬液；
(3)牛樟芝液体种子培养：将孢子悬液接种至液体种子培养基中，通过控制培养基组成和培养条件，形成规则小球状菌体即为液体种子；
(4)牛樟芝液体发酵培养：将步骤(3)中的液体种子接入液体发酵培养基中，150-180rpm，25-28℃，发酵培养第8-10d时，加入吐温80；发酵培养第14-17d时，加入油酸；继续发酵至20d；
(5)产物提取：发酵结束后，将发酵液离心，收集上层有机相，用乙醇提取发酵液有机相中的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B。
2.如权利要求1所述的一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤(1)中固体培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，蛋白胨1-5g/L，麦芽浸粉15-30g/L，琼脂20-35g/L。
3.如权利要求1所述的一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤(2)中孢子悬液中孢子数含量为106-107个/mL。
4.如权利要求1所述的一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤(3)中液体种子培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨5-15g/L，KH2PO40.5-2g/L，MgS04·7H2O 0.5-1.0g/L。
5.如权利要求1所述的一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤(4)中液体发酵培养基组成为:葡萄糖25-45g/L，蛋白胨5-10g/L，K2HPO40.5-1.0g/L，MgS04·7H2O 0.1-1.0g/L；117℃灭菌25min。
6.如权利要求1所述的一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤(4)中液体种子的接种量为10％-30％v/v。
7.如权利要求1所述的一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤(4)中加入吐温80量为1％-3％v/v。
8.如权利要求1所述的一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤(4)中加入油酸量为20％-50％v/v。
9.如权利要求1所述的一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述牛樟芝菌为Antrodia camphorate BCRC Number：35396或Antrodiacinnamomea BCRC Number:35398或Taiwanofungus camphorates CGMCC Number:5.906。
10.如权利要求1所述的一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，利用高效液相色谱配合紫外检测对所述步骤(5)提取得到的目标活性物质4-Acetylantroquinonol B进行测定。
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