CN101736031A - 一种脂溶性生物复合发酵促进剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂溶性生物复合发酵促进剂，属生物发酵技术领域。它是由类脂成分、维生素成分、氨基酸成分、4种生长因子和芝麻油组成。该种脂溶性生物复合发酵促进剂可以显著改善细胞膜的通透性，补充微生物维持生长所需的多种营养成分，促进微生物细胞的分裂与增殖，明显地提高发酵液中的活菌含量，提高菌体内酶的含量和活性，抑制并杀死细胞内代谢产生的自由基，保护细胞免受自由基伤害，延缓细胞衰老、自溶，从而延长发酵代谢产物合成时间，达到促进目的代谢产物产率提高的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种脂溶性生物复合发酵促进剂及其应用。
背景技术
现代对发酵的定义是通过微生物(或动植物细胞)的生长培养和化学变化，大量产生和积累专门的代谢产物的反应过程。工业生产上笼统地把一切依靠微生物的生命活动而实现的工业生产均称为“发酵”，微生物代谢产物的水平为多种多样的调节机制所控制，因此微生物终产物的合成量在正常状态下是不会超过自身生长所需要的量。
近百年来，随着科学技术的进步，发酵技术发生了划时代的变革，已经从利用自然界中原有的微生物进行发酵生产的阶段进入到按照人的意愿改造成具有特殊性能的微生物以生产人类所需要的发酵产品的新阶段。
微生物和一切生物体一样，需要从外界不断的吸收营养物质并通过异化作用获得合成细胞物质所需要的能量和代谢中间体，同时把一部分代谢产物排出体外，所以影响微生物生物合成的因素除产生菌直接的合成能力外，另一个重要的因素是细胞膜的通透性问题，细胞膜的通透性从两个方面影响微生物生物合成，一是细胞膜对产物从胞内向外的运输发生障碍，使在胞内已被合成的代谢物难以及时地排泄至胞物而造成自身毒性，二是细胞膜的通透性限制某些用于代谢物生物合成必需的营养成分或其他物质进入胞内，从而限制了代谢物的进一步生物合成，所以通过改善细胞膜的通透性可以提高产物的生物合成量。
微生物生长和繁殖需要大量的外源有机物质，主要包括碳源、氮源、水分、无机盐和微量元素，有些微生物即使在上述物质都存在的情况下，仍然不能生长或生长不好，因为它们还需要一些量不大但必须的特殊的营养物，称为生长因素，包括维生素、氨基酸和嘌呤、嘧啶等物质。
目前使用的单一豆油或单一植物油不能充分满足不同菌种细胞的分裂、增值，直接影响到菌体内的酶的含量和活性，使同一单位消耗的能量降低了菌体内三羧酸循环代谢产物，出现高能耗、高成本、低收益的局面。
发明内容
本发明克服上述不足，根据现代生物代谢调控理论，同时综合、全面考虑微生物生长代谢通常所需要的营养物质，而提供一种脂溶性生物复合发酵促进剂。
本发明的另一个目的是提供该种脂溶性生物复合发酵促进剂在发酵方面的应用。
本发明解决问题的技术方案是：
一种脂溶性生物复合发酵促进剂，它是由如下微粉化原料制成：
每升促进剂中含有类脂成分0.5～300克、维生素成分0.5～2000毫克、氨基酸成分0.1～100克、四种生长因子0.04～100克和余量的芝麻油；
所述的类脂成分为油酸甲酯、亚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、棕榈酸甲酯、花生四烯酸甲酯、二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯、二十二碳五烯酸甲酯、脑磷脂和卵磷脂中的一种或多种；
所述的维生素成分为维生素A、维生素E、维生素D、β胡萝卜素和维生素K中的一种或多种；
所述的氨基酸成分为L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸和L-蛋氨酸中的一种或多种；
所述的四种生长因子为磷酸肌醇、胆碱、尿嘧啶和胸腺苷，各生长因子用量重量比为1∶1∶1∶1。
作为进一步的方案，所述的一种脂溶性生物复合发酵促进剂，所述的类脂成分为油酸甲酯、亚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、棕榈酸甲酯、花生四烯酸甲酯、二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯、二十二碳五烯酸甲酯、脑磷脂和卵磷脂，对应重量比为50∶40∶10∶10∶10∶10∶10∶10∶1∶1；所述的维生素成分为维生素A、维生素E、维生素D、β胡萝卜素和维生素K，对应重量比为1∶2∶1∶1∶2；所述的氨基酸成分为L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸和L-蛋氨酸，对应重量比为1∶5∶5∶5∶5。
作为进一步的方案，一种脂溶性生物复合发酵促进剂，每升促进剂中含有：
类脂成分：油酸甲酯25克，亚油酸甲酯20克，硬脂酸甲酯5克，棕榈酸甲酯5克，花生四烯酸甲酯5克，二十二碳六烯酸甲酯5克，二十碳五烯酸甲酯5克，二十二碳五烯酸甲酯5克，脑磷脂0.5克，卵磷脂0.5克；
维生素成分：维生素A 100毫克、维生素E 200毫克、维生素D 100毫克、β胡萝卜素100毫克和维生素K 200毫克；
氨基酸成分：L-缬氨酸0.1克、L-苯丙氨酸0.5克、L-亮氨酸0.5克、L-脯氨酸0.5克和L-蛋氨酸0.5克；
四种生长因子：磷酸肌醇0.1克、胆碱0.1克、尿嘧啶0.1克和胸腺苷0.1克；
余量：芝麻油。
本发明所述的微粉化原料粒度透400-800目筛。
本发明所述的脂溶性生物复合发酵促进剂，它应用于包括微生物酶制剂发酵、抗生素发酵、氨基酸发酵、有机溶媒和有机酸发酵、核苷酸发酵、微生物生物活性物质发酵、微生物多糖和微生物脂肪发酵、食品发酵和单细胞蛋白发酵等发酵领域。
本发明所述的脂溶性生物复合发酵促进剂，其使用方法是：在发酵基础料中，按照发酵基料体积的2％的比例加入本发明促进剂。
本发明所述的脂溶性生物复合发酵促进剂可以显著改善细胞膜的通透性，补充微生物维持生长所需的多种营养成分，促进微生物细胞的分裂与增殖，明显地提高发酵液中的活菌含量，提高菌体内酶的含量和活性，抑制并杀死细胞内代谢产生的自由基，保护细胞免受自由基伤害，延缓细胞衰老、自溶，从而延长发酵代谢产物合成时间，达到促进目的代谢产物产率提高的目的，并提高生产效率，降低发酵成本，提高经济、生态效益和社会效益。
采用本发明所配制的脂溶性生物复合发酵促进剂和使用方法，在脂肪酶、青霉素、盐霉素、头孢菌素、泰乐菌素、阿奇霉素等品种的摇瓶发酵中进行实验，以未加入本发酵促进剂的原基础培养基作为对照，在同等培养条件下，加入本发酵促进剂的实验组比对照组发酵水平均有提高，其中的优选配方可提高20％，发酵单位成本降低15％以上。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
脂溶性生物复合发酵促进剂的配制
1.按照下列成分和含量称取原料：(1)类脂成分是油酸甲酯0.5g/L；(2)维生素成分是维生素A 0.5mg/L；(3)氨基酸成分是L-缬氨酸0.1g/L；(4)4种生长因子包括磷酸肌醇、胆碱、尿嘧啶和胸腺苷，各生长因子含量都为0.01g/L；将这些原料经微粉机处理后混合均匀，加入芝麻油定容，芝麻油为上述四种成分的余量。
2.按照下列成分和含量称取原料：(1)类脂成分是亚油酸甲酯0.2g/L、棕榈酸甲酯0.1g/L、花生四烯酸甲酯0.1g/L和二十二碳六烯酸甲酯0.1g/L；(2)维生素成分是维生素A 0.1mg/L、维生素E 0.2mg/L和维生素D 0.2mg/L；(3)氨基酸成分是L-缬氨酸0.1g/L、L-苯丙氨酸0.1g/L和L-亮氨酸0.1g/L；(4)4种生长因子包括磷酸肌醇、胆碱、尿嘧啶和胸腺苷，各生长因子含量都为10g/L；将这些原料经微粉机处理后混合均匀，加入芝麻油定容，芝麻油为上述四种成分的余量。
3.按照下列成分和含量称取原料(1)类脂成分：硬脂酸甲酯0.1g/L，二十碳五烯酸甲酯0.1g/L，二十二碳五烯酸甲酯0.1g/L，脑磷脂0.1g/L，卵磷脂0.1g/L；(2)维生素成分：β胡罗卜素0.1mg/L，维生素K0.5mg/L；(3)氨基酸成分：L-脯氨酸0.1g/L，L-蛋氨酸0.1g/L；(4)生长因子：磷酸肌醇25g/L，胆碱25g/L，尿嘧啶25g/L，胸腺苷25g/L；将这些原料经微粉机处理后混合均匀，加入芝麻油定容，芝麻油为上述四种成分的余量。
4.按照下列成分和含量称取原料(1)类脂成分：油酸甲酯5g/L，亚油酸甲酯4g/L，硬脂酸甲酯1g/L，棕榈酸甲酯1g/L，花生四烯酸甲酯1g/L，二十二碳六烯酸甲酯1g/L，二十碳五烯酸甲酯1g/L，二十二碳五烯酸甲酯1g/L，脑磷脂0.1g/L，卵磷脂0.1g/L；(2)维生素成分：维生素A 10mg/L，维生素E 20mg/L，维生素D 10mg/L，β胡罗卜素10mg/L，维生素K 20mg/L；(3)氨基酸成分含量：L-缬氨酸0.1g/L，L-苯丙氨酸0.5g/L，L-亮氨酸0.5g/L，L-脯氨酸0.5g/L，L-蛋氨酸0.5g/L；(4)生长因子：磷酸肌醇0.1g/L，胆碱0.1g/L，尿嘧啶0.1g/L，胸腺苷0.1g/L；将这些原料经微粉机处理后混合均匀，加入芝麻油定容，芝麻油为上述四种成分的余量。
5.按照下列成分和含量称取原料(1)类脂成分：油酸甲酯25g/L，亚油酸甲酯20g/L，硬脂酸甲酯5g/L，棕榈酸甲酯5g/L，花生四烯酸甲酯5g/L，二十二碳六烯酸甲酯5g/L，二十碳五烯酸甲酯5g/L，二十二碳五烯酸甲酯5g/L，脑磷脂0.5g/L，卵磷脂0.5g/L；(2)维生素成分：维生素A 100mg/L，维生素E 200mg/L，维生素D 100mg/L，β胡罗卜素100mg/L，维生素K 200mg/L；(3)氨基酸成分含量：L-缬氨酸、0.1g/L，L-苯丙氨酸0.5g/L，L-亮氨酸0.5g/L，L-脯氨酸0.5g/L，L-蛋氨酸0.5g/L；(4)生长因子：磷酸肌醇0.1g/L，胆碱0.1g/L，尿嘧啶0.1g/L，胸腺苷0.1g/L；将这些原料经微粉机处理后混合均匀，加入芝麻油定容，芝麻油为上述四种成分的余量。
6.按照下列成分和含量称取原料(1)类脂成分：油酸甲酯30g/L，亚油酸甲酯30g/L，硬脂酸甲酯30g/L，棕榈酸甲酯30g/L，花生四烯酸甲酯30g/L，二十二碳六烯酸甲酯30g/L，二十碳五烯酸甲酯30g/L，二十二碳五烯酸甲酯30g/L，脑磷脂30g/L，卵磷脂30g/L；(2)维生素成分：维生素A 100mg/L，维生素E 500mg/L，维生素D 200mg/L，β胡罗卜素200mg/L，维生素K 1000u g/mL；(3)氨基酸成分：L-缬氨酸20g/L，L-苯丙氨酸20g/L，L-亮氨酸20g/L，L-脯氨酸20g/L，L-蛋氨酸20g/L；(4)生长因子：磷酸肌醇0.1g/L，胆碱0.1g/L，尿嘧啶0.1g/L，胸腺苷0.1g/L；将这些原料经微粉机处理后混合均匀，加入芝麻油定容，芝麻油为上述四种成分的余量。
实施例2
将本发明脂溶性生物复合发酵促进剂应用于脂肪酶发酵。
将菌种解脂耶氏酵母JK依次经PDA固体培养基活化1次，PDA液体培养基活化2次，接种入PDA液体培养基，28℃培养12h。
PDA培养基配制：200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖，115℃灭菌30分钟，固体培养基中加入15g琼脂。
发酵培养基成分及配比为(w/v)：黄豆粉6％，豆油4％，脂溶性生物复合发酵促进剂2％(v/v)，(NH4)2SO4 0.2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH 6.5。
对照发酵培养基成分及配比为(w/v)：黄豆粉6％，豆油4％，(NH4)2SO40.2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH 6.5。
种子培养基中另外添加1％(w/v)葡萄糖，不加脂溶性生物复合发酵促进剂，种子液以5％(v/v)接种量接入发酵培养基中，28℃，以200rpm在摇床上培养。每24小时取样测定酶活，直至酶活下降。
脂肪酶酶活测定方法采用橄榄油滴定法：
(1)0.05M NaOH的配置：先用无CO2水配置5M的NaOH储液；再准确稀释50倍后，称取100℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾0.38g，溶于80ml无CO2水中，标定出其准确浓度，再推算出储液浓度；0.05M的NaOH溶液以无CO2水用储液现用现配；
(2)质量分数为2％PVA-1750的配置：称量好药品后，加入到蒸馏水中，并用沸水浴加热使之溶解，然后用三层纱布过滤，并定容，4℃保存；
(3)PVA-橄榄油乳化液底物的配置：将橄榄油与2％PVA1750以1∶3(v/v)比例混合，用超声波乳化，功率300W，超声3s，间歇4s，超声30次，循环2次；
(4)取5ml乳化液底物，4ml 0.1M pH8.0的磷酸钠缓冲液加入到150ml三角瓶中，置于恒温水浴摇床37℃，130rpm下温育5min；
(5)取1ml适当稀释的酶液加入到底物和缓冲液中，37℃下130rpm反应10min后加入15ml无水乙醇终止反应；
(6)滴加4滴酚酞作指示剂，用0.05M NaOH滴定酶解产生的脂肪酸，至反应液变粉红色停止；
空白操作与上述一致，只是将发酵液与无水乙醇混合反应10min后加入到底物和缓冲液中。
酶活定义为在该测定条件下，1min释放1μmol脂肪酸的酶量为一个酶活单位。
Claims (5)
1.一种脂溶性生物复合发酵促进剂，其特征是，它是由如下微粉化原料制成：
每升促进剂中含有类脂成分0.5～300克、维生素成分0.5～2000毫克、氨基酸成分0.1～100克、四种生长因子0.04～100克和余量的芝麻油；
所述的类脂成分为油酸甲酯、亚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、棕榈酸甲酯、花生四烯酸甲酯、二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯、二十二碳五烯酸甲酯、脑磷脂和卵磷脂中的一种或多种；
所述的维生素成分为维生素A、维生素E、维生素D、β胡萝卜素和维生素K中的一种或多种；
所述的氨基酸成分为L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸和L-蛋氨酸中的一种或多种；
所述的四种生长因子为磷酸肌醇、胆碱、尿嘧啶和胸腺苷，各生长因子用量重量比为1∶1∶1∶1。
2.根据权利要求1所述的一种脂溶性生物复合发酵促进剂，其特征是，所述的类脂成分为油酸甲酯、亚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、棕榈酸甲酯、花生四烯酸甲酯、二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯、二十二碳五烯酸甲酯、脑磷脂和卵磷脂，对应重量比为50∶40∶10∶10∶10∶10∶10∶10∶1∶1；
所述的维生素成分为维生素A、维生素E、维生素D、β胡萝卜素和维生素K，对应重量比为1∶2∶1∶1∶2；
所述的氨基酸成分为L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸和L-蛋氨酸，对应重量比为1∶5∶5∶5∶5。
3.根据权利要求2所述的一种脂溶性生物复合发酵促进剂，其特征是，每升促进剂中含有：
类脂成分：油酸甲酯25克，亚油酸甲酯20克，硬脂酸甲酯5克，棕榈酸甲酯5克，花生四烯酸甲酯5克，二十二碳六烯酸甲酯5克，二十碳五烯酸甲酯5克，二十二碳五烯酸甲酯5克，脑磷脂0.5克，卵磷脂0.5克；
维生素成分：维生素A 100毫克、维生素E 200毫克、维生素D 100毫克、β胡萝卜素100毫克和维生素K 200毫克；
氨基酸成分：L-缬氨酸0.1克、L-苯丙氨酸0.5克、L-亮氨酸0.5克、L-脯氨酸0.5克和L-蛋氨酸0.5克；
四种生长因子：磷酸肌醇0.1克、胆碱0.1克、尿嘧啶0.1克和胸腺苷0.1克；
余量：芝麻油。
4.根据权利要求1所述的一种脂溶性生物复合发酵促进剂，其特征是，所述的微粉化原料粒度透400-800目筛。
5.一种按照权利要求1所述的脂溶性生物复合发酵促进剂，其特征是，它应用于微生物酶制剂发酵、抗生素发酵、氨基酸发酵、有机溶媒和有机酸发酵、核苷酸发酵、微生物生物活性物质发酵、微生物多糖和微生物脂肪发酵、食品发酵和单细胞蛋白发酵发酵领域。
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