CN1643156A - 制备共轭亚油酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备共轭亚油酸的方法。具体地，本发明公开了通过有益细菌从谷物制备共轭亚油酸，尤其是其顺式－9，反式－11异构体的方法。本发明还涉及通过该方法制备的产品。

Description

制备共轭亚油酸的方法
发明领域
本发明涉及制备共轭亚油酸的方法。具体地，本发明公开了通过有益细菌从谷物制备共轭亚油酸，特别是其顺式-9，反式-11异构体的方法。
发明背景
CLA是共轭亚油酸的不同异构体的通称，在这些异构体中只有两种异构体(顺式-9，反式-11异构体，即牛酸，和反式-11，顺式-12异构体)被发现具有生物活性。合成的CLA产品可通过商业途径得到，但是这些产品通常包括CLA的所有不同异构体并且只有40％c9，t11异构体。此外，动物产品(如肉和奶)可被用作CLA来源。这些产品的一个益处是它们所含有的CLA大多数是c9，t11异构体，例如，奶CLA含有80％的c9，t11-18∶2异构体。
一些研究表明动物脂肪含有能在试验动物中防止癌症、影响生长因子并可以调节身体脂肪组织的量的脂肪酸。当研究汉堡牛排时，MichaelPariza发现它们包含经分析为共轭亚油酸(CLA)的脂肪酸。在试验动物上进行的研究中发现与对照组相比，在用含有CLA的食物饲养的组中乳腺癌、胃癌和大肠癌的发生率降低(Pariza，M.W.，Loretz，L.J.，Storkson，J.M.和Holland，N.C.1983油炸碎牛肉中诱变的诱变剂和调节剂，CancerRes.(Suppl.)43：2444-2446，和Pariza，M.W，和Hargraves，W.A.1985.一种来自牛肉的诱变调节剂抑制7，12-二甲基苯并蒽对小鼠表皮肿瘤的引发.Carcinogenesis 6：591-593))。CLA还能够抑制人细胞的组织培养物中癌细胞的发育。作用的模式仍然未知，但是已经发现CLA对癌的不同发育阶段、一些生长因子和可能地对肝脏中致癌物质的代谢具有影响。此外，CLA被提示还可以发挥抗氧化剂的功能(Ip，C.，Chin，S.F.，Sci-meca，J.A.，和Pariza，M.W.1991.通过亚油酸的共轭二烯酸衍生物防止乳腺癌.Cancer Res.51：6118-6124)，在这种情况下，该化合物将保护细胞膜免受自由基的不利影响。此外，已经研究了该化合物对胆固醇水平的降低作用，并且已经发现该化合物不像胆固醇降低药物那样降低好HDL的量(Lee，K.N.，Kritchevsky，D.，和Pariza，M.W.1994.共轭亚油酸和兔中动脉粥样硬化症.Atherosclerosis 108：19-25)。CLA可能还帮助体重观察者，因为已发现该化合物分解脂肪组织(Park等，1999.喂饲和除去共轭亚油酸的过程中小鼠身体组成的变化.Lipids 34，243-248)。
已发现非共轭亚油酸具有不利影响，如对乳腺癌的刺激作用。通常还公知非共轭亚油酸的抗微生物作用。
可以通过化学方法或酶学方法通过异构化亚油酸制备CLA。天然CLA从例如多不饱和的脂肪酸形成，是细菌溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)在反刍动物的瘤胃中的细菌作用的结果，CLA从瘤胃中分泌到奶和肉中，它们是已发现的最好的CLA来源。
已经注意到在过去十年中从食物得到的CLA的量已经大量降低。在食物成分分析中计算出在20世纪70年代，平均饮物含有约0.45g CLA/天。由于奶和奶产品的使用下降，现在的平均摄入是0.25g CLA/天。在食物中增加天然CLA的量对于公共健康是非常重要的，因为根据研究，CLA摄入加倍将降低例如癌症的危险。
对于食品，在一些研究中强调了奶作为CLA来源的重要性。例如，根据芬兰人口统计学研究(Knekt等，口头交流)，奶的使用降低了乳腺癌的危险。现在奶脂肪的CLA含量根据饲养质量而周期性地发生相当大程度(2.4-28.1mg/g脂肪)的变化。
已经发现肠道有益微生物形成CLA。具体地，研究了瘤胃细菌溶纤维丁酸弧菌及其异构酶。然而，该细菌对厌氧条件的要求如此之高以致通过该细菌工业规模生产CLA是不可能的，因为安排该菌株所需的严格厌氧条件是困难和不经济的(US 5,856,149，Pariza等)。
已发现Propionibacterium agnes种也形成CLA，但是该病原性菌株也产生还原酶，其将产生的CLA还原成其他脂肪酸(Verhulst等，System.Appl.Microbiol.9(1987)12-15)。
还通常知道一些丙酸细菌能够将亚油酸转变成其共轭的顺式-9，反式-11的形式。此外，公知游离的亚油酸转变成CLA比甘油三酯脂肪酸的转变更有效。然而，游离的亚油酸对已经是相对小浓度的丙酸细菌具有生长抑制作用，这迄今为止阻碍了共轭亚油酸特别是其顺式-9，反式-11形式的大规模生产。
美国专利5,856,149，Pariza和Yang，描述了通过卢氏乳杆菌(Lactobacillus reuterii)菌株，优选L.reuterii PYR8菌株转化非共轭的不饱和(9位和12位的双键)脂肪酸来生产顺式-9，反式-11脂肪酸的方法。该出版物描述了CLA-生产菌株的分离并且陈述仅仅4/45的分离的菌株具有想要的亚油酸异构酶活性，即，这些菌株能够从亚油酸生产CLA。该出版物没有提到游离亚油酸对细菌生长的抑制效果，其也没有提出避免该问题的技术方案。
在通过日常起始培养物生产共轭亚油酸方面，J.Appl.Microbiol.85(1998)，PP.95-102，J.Jiang，L.Bjrck and R.Fonden描述了丙酸细菌将亚油酸转变成CLA的能力。已经注意到成熟干酪含有比其他奶产品更高的CLA量，Jiang等研究了19种不同的起始细菌将加到培养基中的亚油酸转变成CLA的能力。他们研究了7种乳杆菌(lactobacillus)菌株、4种乳球菌(lactococcus)菌株、2种链球菌(streptococcus)菌株和6种丙酸细菌在MRS、奶和乳酸钠培养基上将亚油酸转变成CLA的能力。此外，通过将亚油酸以Tween 80去污剂的水性溶液形式加入MRS肉汤研究了不同亚油酸浓度。所分析的细菌中只有少许丙酸细菌显示出生物转化活性；6种菌株中的3种显示出活性，即费氏丙酸杆菌费氏亚种(Propionibacteriumfreudenreichii ssp.Freudenreichii)PFF和PFF6和费氏丙酸杆菌谢氏亚种(P.freudenreichii ssp.Shermanii)PFS。使用PFF6菌株从750μg/ml的最初亚油酸浓度得到了265μg/ml的CLA的最大产量。产生的CLA含有70到90％生物活性c9，t11异构体。没有发现乳杆菌、乳球菌和链球菌产生CLA。
从而，通过Jiang等描述的技术，最好的丙酸细菌PFF6菌株只能够将35％所加入的亚油酸转变成CLA。研究人员发现丙酸细菌的CLA生产与它们对游离亚油酸的耐受性正相关。因此，该研究证实了亚油酸具有抑制细菌生长的抗微生物作用这一公知事实。该出版物陈述可通过使用表面活性剂，如去污剂，例如Tween 80，或者蛋白质减少此抗微生物的脂肪酸的效果。然而，这些研究还没有进行并且出版物也没有公开过可行的、有用的技术。
WO 99/29886，J.Jiang，L.Bjorck和R.Fonden部分基于在上面提到的文献中描述的研究结果。该申请涉及一些在食品应用中有用的细菌在CLA的体外生产中的用途。除了费氏丙酸杆菌费氏亚种和费氏丙酸杆菌谢氏亚种，提到短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)是适宜的细菌。根据该出版物，可在乳化剂，如Tween 80和卵磷脂的存在下进行发酵。但该出版物的实施例没有描述乳化剂的使用，并且得到的最佳结果与上面提到的文章中的结果相同：使用PFF6菌株从750μg/ml的最初亚油酸浓度得到246.4μg/ml生物活性c9，t11异构体。从而，产率低于33％。
芬兰专利88856描述了制备含有活的微生物并且主要基于燕麦麸的发酵食品的方法。燕麦麸或就此发酵或热处理后发酵，并且乳酸细菌，尤其是嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)被用作微生物。在该出版物中描述的发明目的是在新食品种类中利用燕麦的高纤维含量。作为实例，该出版物给出了酸乳酪型点心。该出版物没有提到亚油酸或从其生产的共轭亚油酸。
因此，仍然清楚地需要生产共轭亚油酸的新方法。当CLA通过微生物方法制备时，基本的是如何最小化或避免与外部亚油酸的毒性和抗微生物作用相关的问题。此外，也非常欢迎在CLA生产中可以利用新的原材料的方法。
发明简述
本发明基于谷物作为亚油酸来源的用途。对于不同谷物种类，燕麦被认为是优选的亚油酸来源。
从而本发明涉及从亚油酸制备共轭亚油酸(CLA)的方法，该方法利用包括亚油酸的谷物作为亚油酸来源。
本发明的方法优选包括两个步骤，其中谷物脂肪被水解以从中释放亚油酸和释放的亚油酸通过微生物被异构化成共轭亚油酸。
本发明还涉及谷物在共轭亚油酸的制备中的用途。
本发明还涉及通过本发明方法制备的产品和它们的就此使用或在功能性物质制备中的用途。
发明详述
通过微生物制备共轭亚油酸的本发明方法的特征是包括亚油酸的谷物脂肪被水解并且水解释放的亚油酸通过微生物被异构化成共轭亚油酸。
从而本发明的基础在于应用谷物作为亚油酸的来源。根据本发明，通过脂肪的水解反应从谷物释放亚油酸。与本发明相关的，已经令人惊奇地发现当谷物材料用作本申请中描述的亚油酸来源时，亚油酸不抑制异构反应。当谷物，特别是燕麦被用作起始材料时，可以保证在异构化的整个过程中微生物都可以得到亚油酸，而亚油酸不妨碍细菌行使功能。
用作来源材料的谷物可以是含有亚油酸并且适于用作可食用产品的起始材料的任何谷物。燕麦、大麦、黑麦、小麦和从它们制备的麦芽可被作为实例提及。适宜的原材料包括未处理的和处理的谷物和从它们制备的级分。
根据本发明，燕麦是最优选的起始材料。燕麦的亚油酸含量是干固体物质的约2到4％，并且大多数亚油酸结合到甘油二酯和甘油三酯。燕麦还含有脂肪酶，其将甘油二酯和甘油三酯降解成游离脂肪酸。考虑本发明的目的，燕麦由于其高的亚油酸含量和天然的脂肪酶活性而是有利的原材料。
谷物，特别是燕麦的天然脂肪酶活性可用于脂肪的水解反应。该反应所需要的酶活性也可以从外部加入。对于燕麦和特别是其他谷物，根据需要向反应中加入脂肪酶可以提高CLA产率。
通过预处理也可以促进燕麦脂肪或其它谷物的脂肪的酶促水解。一种有利的预处理方法是制麦芽(malting)，其可被用于在谷物中产生脂肪酶活性。其他适宜的预处理包括碾碎、碾磨、粉碎和溶于适宜的溶剂，特别是溶于水或其它液体介质。
燕麦的脂解，例如，可以通过碾碎燕麦谷粒并将水加入碾碎的燕麦中启始。脂解中形成的游离亚油酸部分地结合到燕麦的其他组分上，这减少了异构化反应可以得到的亚油酸的量，因此应该加以避免。
可通过选择适宜的反应条件减小或甚至消除该问题。在条件的选择中，最必要的是防止燕麦材料的特征性pH降低，这可通过在亚油酸异构化步骤中使pH保持在足够高的水平来实现。
适宜的pH为例如，6.5到9。优选地，pH被调节到约7.0到9.0的水平，优选到约8.0到约8.5的水平。该pH调节可以防止亚油酸结合到燕麦物质上，这似乎对异构化反应具有有利的影响。重要的是，异构化混合物中pH的降低由燕麦物质本身而不是由发酵导致。因此，异构化反应不需要常规发酵，即酸化，但是其涉及生物转化。异构化反应中形成的多数CLA为顺式-9，反式-11异构体。
根据本发明(从燕麦)释放的亚油酸用于CLA生产。异构化反应可通过例如化学方法、酶学方法或微生物学方法进行。亚油酸转变成CLA优选通过微生物学方法进行。在生物转化中，可以使用能够将亚油酸转变成CLA的任何细菌，如在上面的发明背景描述中提到的细菌。然而，异构化优选通过适于食品中使用的有益细菌，尤其是通过丙酸细菌进行。例如，属于费氏丙酸杆菌，尤其是属于费氏丙酸杆菌费氏亚种和费氏丙酸杆菌谢氏亚种的菌株是适宜的。
异构化以本身已知的方式进行。根据所用菌株的要求选择异构化混合物的组分和条件以便得到最佳CLA产率。
本发明公开后，适宜的反应参数的选择是本领域技术人员技术的一部分。
脂肪水解和异构化步骤可以平行地，即同时地，或者在不同容器或同一容器中顺序地进行。在一个容器中两步骤的同时进行由于方法简单而被认为是有利的备选方案。
在一个尤其优选的实施方案中，有益细菌，优选丙酸细菌被加到碾磨的燕麦中，在这种情况下脂解中释放的亚油酸直接与有益细菌反应，该细菌将亚油酸异构化成共轭亚油酸。通过调整过程条件以适于脂解和异构化反应，可以在混合物中形成大量CLA。水或其它适宜的介质，尤其是液体介质，可用于方便混合。与本发明相关，例如，水已经被用作介质从而燕麦混合物中干固体含量为5％，在这种情况下燕麦干固体的约1％以及燕麦脂肪的约10％形成了CLA。
通过将谷物性质和能够在异构化反应中作为异构化催化剂的细菌的应用相联合，可以避免与CLA生产相关的两个最大的问题：亚油酸的毒性和其在水中的难溶性。优选将CLA生产菌株的能力与这样的材料联合，所述材料含有亚油酸和脂肪酶并且可以无需其他添加物以研磨形式为CLA生产提供亚油酸。谷物中的这种材料是燕麦。当使用没有脂肪酶活性的材料，如小麦时，可以加入外来脂肪酶活性或通过制麦芽形成脂肪酶活性。根据本发明，可以避免使用为“溶解”外部亚油酸所需的去污剂或其他有害添加剂。
根据本发明制备的含有CLA(燕麦)的细菌混合物可以就此使用，其可以被加入并在食品或类似的功能性产品的制备中使用，并且可从中分离出各种含有CLA的级分。CLA形成也可以与食品的制备同时发生。当形成不同产品时，CLA、有益细菌和/或谷物如燕麦的功能性性质可以以想要的方式在产品中应用。
其中将共轭亚油酸从异构化混合物中分离出来的实施方案被认为是优选的实施方案。当要利用共轭亚油酸和细菌细胞的功能性作用时，它们可以一起被回收、浓缩和可能地干燥或冻干。当水被用作介质时，通过降低pH，CLA可以结合到(燕麦)细菌固体上。根据本发明，通过调整反应混合物的pH到约3到9，优选低于7.0的值，最优选约4到6可以使共轭亚油酸结合到固体物上。
在本文件中，术语“食品”以广义使用，包括所有可食用的产品，其可以是固体、凝胶状或液体形式，并且包括即可食用的产品和食用时添加本发明产品作为添加剂或者作为产品的组成性组分的产品。例如，食品可以是奶工业、肉类加工工业、食品加工工业、饮料工业、烘焙工业、糖食工业和饲料工业的产品。典型的产品包括奶和奶产品，如酸乳酪、凝乳、凝乳酪、酸奶、酪乳和其他发酵奶饮料、未成熟的奶酪和成熟的奶酪、点心馅，等等，饮料，如乳清饮料、水果饮料、啤酒和汤。饲料工业的产品组成了另一个重要的组。
优选的应用包括冻干产品，如含有CLA和燕麦的丙酸细菌胶囊剂和粉剂，以及其CLA含量由于利用丙酸细菌的活性而增加的产品。包含CLA和燕麦组分如β-葡聚糖的产品，即表现两种成分的功能性效果的产品，是尤其优选的。本发明的一个重要的额外益处是共轭亚油酸可以在燕麦产品中形成，从而可以增加燕麦的营养价值。
通过下面的实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅仅旨在阐明本发明，而决不限制本发明的范围。
参考实施例1
一种基于发酵燕麦麸的产品的CLA浓度
在芬兰专利88856中描述的发酵产品的油酸、亚油酸和CLA浓度及脂肪酸含量按如下确定。从商业产品Yosa Wild berry和Yosa Plum(Bioferme Oy生产，芬兰)取样，通过直接皂化和二乙醚己烷提取分离脂肪。通过硫酸催化的方法制备脂肪酸的甲基酯。表A显示了以脂肪酸总量的百分数(％)表示的样品中脂肪酸含量，表B显示了油酸、亚油酸和CLA(c9，t-11)的浓度(mg/g样品)。Yosa Plum和Yosa Wild berry产品几乎不含CLA。非常少的CLA残留可能是分析方法所导致的或者它们可能是亚油酸(C18∶3)的异构体，其在气相色谱分析中接近CLA洗脱下来。
表A：Yosa样品的脂肪酸含量，以脂肪酸总量的百分数(％)表示。
            棕榈酸    硬脂酸  油酸          亚油酸    亚麻酸   CLA(c-9，t-11)
Yosa
            C16∶0    C18∶0  Ccis-9-18∶1    C18∶2    C18∶3   C18∶2
Plum        16.07     1.21    32.05         39.63     2.04     0.05
Wild berry  15.58     1.14    30.93         39.45     3.68     0.07
表B：Yosa样品的油酸、亚油酸和CLA浓度(mg/g样品)
                油酸           亚油酸       CLA(c-9，t-11)
Yosa
                (mg/g样品)     (mg/g样品)   (mg/g样品)
Plum            1.77           2.15         0.003
Wild Berry      1.65           2.08         0.004
实施例1
通过丙酸细菌在燕麦/水混合物中生产CLA
为了证明根据本发明的方法的效果，进行了一种试验，其中丙酸细菌被加入到燕麦/水混合物中作为异构化催化剂。通过碾磨未匀好湿的(untempered)燕麦(Lisbeth品种)使之穿过0.5mm的筛子，产生的燕麦粉用于本试验中。从燕麦粉制备5％水混合物(w/v)并将混合物通过UltraTurrax仪器匀浆约2分钟。
在试验中使用两种丙酸细菌，即费氏丙酸杆菌谢氏亚种JS(PJS)和费氏丙酸杆菌费氏亚种131(P131)。
如Rainio，A.，Vahvaselka，M.，Suomalainen，T.ja Laakso，S.，在费氏丙酸杆菌谢氏亚种的共轭亚油酸生产中减少亚油酸抑制，Can.J.Microbiol.47(2001)，735-740中所描述的，为本试验培养PJS细胞。P131菌株培养于MRS液(LabM)中。细胞被离心(6000rpm，20min)分离并在少量蛋白胨盐溶液中淘洗，该蛋白胨盐溶液含有0.1％细菌学蛋白胨(LabM)和0.85％NaCl。将细胞悬液加到燕麦/水混合物(a′100ml)中以得到约1×1010cfu/ml的细胞浓度。用1M NaOH溶液将混合物pH调节到7.0，并在25℃下进行水解和异构化反应。在开始的17小时中，允许燕麦/水混合物水解而不调节pH，结果pH降低到约4.8。此后，通过NaOH溶液使混合物的pH上升到8.0，并约每1.5到2小时再次调节，共约8小时。从而混合物的pH保持约7.5到8.0。此后，继续异构化而不调节pH直到总时间达到约40小时。
相比较，进行了一个试验，其中将相应体积的蛋白胨盐溶液而不是PJS或P131细胞悬液加到燕麦/水混合物中。在开始的17个小时中，混合物的pH降低到约5.4。此后，如上述试验中描述的调节pH。
在该试验中，跟踪了由燕麦的天然脂肪酶活性导致的亚油酸的释放和微生物细胞将该游离亚油酸向CLA的异构化。0.5ml样品取自燕麦/水混合物，并且这些样品在脂肪酸分析前被冷冻干燥。通过气相色谱从样品确定不同脂肪酸的量。如在Suutari M.，Liukkonen，K.和Laakso，S.，酵母中温度适应：脂肪酸的角色，J.Gen.Microbiol.136(1990)，1469-1474中描述的进行脂肪酸的分析。样品中所含的脂肪酸通过将它们的滞留时间和已知脂肪酸标准品的滞留时间相比来确定。使用来自Sigma的制品(其是CLA的顺式和反式-9，11与顺式和反式-10，12异构体的混合物)鉴定共轭亚油酸。在脂肪酸的定量中C17∶0脂肪酸的甲酯(十七酸甲基酯，Sigma)被用作内标。
冷冻干燥的1.5ml样品来自燕麦/水混合物，被用于脂肪酸的脂种类分析。如在Liukkonen，K.H.，Montfoort，A.和Laakso，S.，燕麦加工中水诱导的脂质改变，J.Agric.Food Chem.40(1992)126-130中所描述的进行脂种类分析。
计算每个固体样品随着反应时间所形成的亚油酸和CLA的量。在存在丙酸细菌(PAB)和不存在丙酸细菌时在燕麦/水混合物中进行试验。结果在表1中给出。
表1.每个固体样品随着反应时间所形成的亚油酸和CLA的量
时间(h)   亚油酸(mg/g干固体物)     CLA(mg/g干固体物)
    PJS细胞     P131细胞     无PHB细胞     PJS细胞   P131细胞     无PHB细胞
    0     41.9     36.3     43.4     ＜0.1   ＜0.1     ＜0.1
    17     40.7     -     -     0.6   -     -
    21.5     36.3     -     -     4.8   -     -
    25     33.6     -     -     6.5   -     -
    41     32.3     32.7     42.3     7.6   0.7     ＜0.1
从而CLA形成需要丙酸细菌在燕麦/水混合物中作为异构化催化剂的功能。当使用PJS菌株时，形成大量CLA——7.6mg/g干固体物。该量为燕麦中脂肪的7.3％。
表2显示了当燕麦/水混合物与PJS细胞一起孵育时亚油酸和CLA在不同脂类中的分布。PL＝极性脂质，TG＝甘油三酯，DG＝甘油二酯，FFA＝游离脂肪酸。
表2.试验中亚油酸和CLA在不同脂类中的分布(％)
    时间   化合物     PL     TG     DG     FFA
    0h   亚油酸     12     81     3     4
    17h   亚油酸     9     49     5     37
    41h   亚油酸     12     40     5     43
    41h   CLA     4     8     1     87
结果表明在试验的开始，大多数亚油酸与甘油三酯结合，仅仅4％为游离脂肪酸的形式。然而，17小时的水解后，约40％的亚油酸从甘油三酯释放出来。正形成的CLA大多数(约90％)是游离脂肪酸的形式。至少80％形成的CLA是顺式-9，反式-11异构体。
使用缓冲的乳酸钠琼脂确定活的丙酸细菌细胞的浓度，该缓冲的乳酸钠琼脂含有0.5％胰蛋白胨(LabM)、1％酵母提取物(LabM)、16.8ml/l 50％乳酸钠(Merck)、1％β-甘油磷酸的二钠盐(Merck)和1.5％琼脂(LabM)。平板在30℃下厌氧孵育6天。在试验开始时，PJS浓度为9.0×109cfu/ml，20小时后为7.5×109cfu/ml。根据这些结果，从而在反应中丙酸细菌不在燕麦/水混合物中生长。
无论丙酸细菌是否加到混合物中，燕麦/水混合物的pH都倾向于快速降低。pH降低由燕麦的酸性成分在水中的溶解导致。因此该方法不需要细胞能够发酵燕麦，由此形成的有机酸将降低pH。
实施例2通过丙酸细菌从其他谷物种类生产CLA
使用大麦和黑麦代替燕麦重复实施例1。
费氏丙酸杆菌谢氏亚种JS(PJS)细胞用作丙酸细菌。基于结果，在大麦或黑麦的水混合物中的CLA生产比在燕麦/水混合物中要弱；在41小时的孵育中(其中在17到25小时之间pH被调节到8.0)在大麦中形成0.91mgCLA/g干固体物，在黑麦中为0.83mg。该较差的结果可部分通过这些谷物材料中的亚油酸浓度比燕麦中的低这一事实来解释。此外，公知这些谷物如不发芽就没有脂肪酶活性。然而，基于这些结果，很清楚根据本发明的方法也在其他谷物材料中起作用。可通过向反应混合物中加入外部脂肪酶活性来增强游离亚油酸的形成，这种情况下该方法的产率可比上面给出的值得到显著提高。
实施例3 pH对CLA形成的影响
通过下面的试验分析燕麦/水混合物的pH对CLA形成的影响：
-pH根本不调节；
-pH在0到8小时间调节到8.0(从而试验不包括单独的脂肪水解步骤)；
-pH在17到25小时之间调节到7.0；
-pH在17到25小时间调节到8.0；
-pH在17到25小时间调节到8.5；
-pH在17到25小时间调节到9.0。
在所有上面提到的试验中，如实施例1所描述的将PJS细菌菌株加到燕麦/水混合物中。其他试验的安排也相同。
此外，一个试验在发酵罐中进行，其中燕麦/水混合物的pH在整个异构化步骤(第17-41小时之间)中通过自动化加入NaOH溶液而保持在8.5。在其前面的17小时的脂解步骤中，pH降低到4.7。燕麦/水混合物的体积是1.5升，温度25℃，混合速度100rpm。活PJS细胞的浓度在试验开始是1.1×1010cfu/ml，在试验末是8.4×109cfu/ml。
结果在表3显示。根据这些结果，在脂肪酶释放亚油酸后将燕麦/水混合物的pH调节到8.0到8.5时CLA的形成是有效的。这在pH低于异构化反应的pH时进行得最好。当在整个异构化步骤中通过连续调节保持燕麦/水混合物的pH为8.5时得到最快和最大的CLA形成。
这反映了适于异构化反应的均匀的pH水平对该方法的重要性。
表3燕麦/水混合物的pH对CLA形成的影响
    CLA(mg/g干固体物)
    25h     41h
 pH根本不调节     0.9
 pH在0到8小时间调节到8.0     3.5
 pH在17到25小时之间调节到7.0     3.9
 pH在17到25小时间调节到8.0     6.5     7.6
 pH在17到25小时间调节到8.5     7.9
 pH在17到25小时间调节到9.0     6.0
 pH在17-41h通过自动调节保持在8.5     8.2     9.3
实施例4通过pH降低导致的产生的CLA进入燕麦干固体物的浓度
通过PJS细胞根据实施例1进行燕麦/水混合物中的CLA生产。此后，将燕麦/水混合物的pH通过NaOH溶液调节到8.0或通过HCl溶液调节到4.5。将混合物离心并从上清液和燕麦细菌物质确定CLA浓度。CLA分布如下：在pH 8.0时，85％的CLA在固体中，15％CLA在液体中，在pH 4.5时，100％的CLA在固体中。这些结果提供了一种方法，通过该方法，利用pH降低，CLA可以被浓缩到燕麦和细菌细胞所形成的固体中，从而CLA不随培养基一起除去。

Claims (24)

1.一种通过微生物制备共轭亚油酸的方法，其特征是水解含有亚油酸的谷物脂肪，并通过微生物将水解释放的亚油酸异构化成共轭亚油酸。
2.根据权利要求1的方法，其特征是谷物为燕麦、黑麦、大麦或小麦。
3.根据权利要求2的方法，其特征是谷物是燕麦或燕麦级分。
4.根据权利要求1到3任一项的方法，其特征是脂肪水解由谷物的酶活性导致。
5.根据权利要求1到3任一项的方法，其特征是通过加入外部酶活性进行脂肪水解。
6.根据权利要求1到5任一项的方法，其特征是通过一种或多种有益细菌进行异构化。
7.根据权利要求6的方法，其特征是有益细菌是丙酸细菌。
8.根据权利要求7的方法，其特征是丙酸细菌是属于费氏丙酸杆菌种，优选属于费氏丙酸杆菌费氏亚种或费氏丙酸杆菌谢氏亚种的菌株。
9.根据权利要求8的方法，其特征是丙酸细菌是费氏丙酸杆菌谢氏亚种JS，DSM 7067。
10.根据权利要求1到9任一项的方法，其特征是异构化在约6.5到9.5的pH下进行。
11.根据权利要求10的方法，其特征是异构化在约7.0到9.0的pH，更优选约8.0到8.5的pH下进行。
12.根据权利要求1到11任一项的方法，其特征是水解和异构化步骤顺序进行。
13.根据权利要求1到11任一项的方法，其特征是水解和异构化步骤平行地进行。
14.根据权利要求1到13任一项的方法，其特征是共轭亚油酸的制备与食品的制备相结合发生。
15.根据权利要求1到14任一项的方法，其特征是其中主要形成共轭亚油酸的顺式-9，反式-11异构体。
16.根据权利要求1到15任一项的方法，其特征是通过调节反应混合物的pH到约3到9，优选低于7.0的值，最优选约4到6使共轭亚油酸固定到固体上。
17.根据权利要求1到16任一项的方法，其特征是从反应肉汤分离和可能地干燥共轭亚油酸。
18.根据权利要求1到16任一项的方法，其特征是共轭亚油酸、细菌细胞和用作起始材料的谷物被浓缩和可能地干燥，其中谷物优选为燕麦材料。
19.根据权利要求18的方法，其特征是回收、浓缩和冻干亚油酸、细菌细胞和用作起始材料的谷物，其中谷物优选为燕麦材料。
20.通过权利要求1到19任一项得到的产品。
21.在共轭亚油酸制备中使用的谷物。
22.根据权利要求21的谷物，其特征是该谷物是燕麦。
23.从亚油酸制备共轭亚油酸的方法，其特征是谷物被用作亚油酸的来源。
24.根据权利要求23的方法，其特征是谷物是燕麦。
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