CN103849660A - 一种以固定化脂肪酶为催化剂的耦联法制备共轭亚油酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以固定化脂肪酶为催化剂，耦联法制备共轭亚油酸的方法。该方法为：用有机酸中和甲酯或乙酯共轭化料至pH7.5-9，与少量水形成均一乳化体系，以固定化脂肪酶为催化底物进行水解制备共轭亚油酸，所述共轭化料是含亚油酸80%以上的红花籽油，经碱催化异构化而制备得到。乳化体系的应用大大缩短了反应时间，提高了甲酯/乙酯共轭化料的水解效率，减少了水的用量，利于工业化的应用。本发明，在制备步骤中未引入其它乳化剂，不会带来后续的分离纯化的困难及乳化剂残留对品质产生影响，也不会因为分离纯化而造成产品损失。同时催化过程中用到的固定化脂肪酶能够重复循环利用100次，酶活降低≤5%，大大降低了生产成本。

Description

一种以固定化脂肪酶为催化剂的耦联法制备共轭亚油酸的方法

技术领域

本发明涉及一种共轭亚油酸的制备方法，尤其涉及一种以固定化脂肪酶为催化剂的耦联法制备共轭亚油酸的方法。

背景技术

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acids，简称CLA）是亚油酸（Linoleic acids，简称LA）分子的几种立体和位置异构体的通称，是一系列含有共轭双键的十八碳二烯酸。CLA的双键在碳链上主要有四种位置的排列方式：8，10-、9，11-、10，12-和11，13-，且由于共轭双键两端的碳原子都具有顺式（cis）和反式（trans）两种几何构型，即每种位置异构又具有cis-cis、cis-trans、trans-cis、trans-trans四种几何异构体，所以CLA异构体的种类众多。其中c9，t11-CLA和t10，c12-CLA是含量最多且已经被证实具有生理活性的两种主要异构体。天然的CLA主要存在于瘤胃动物如牛、羊的乳脂及肉制品中，每克乳脂中含量从2-25mg不等，并主要以c9，t11-CLA异构体的形式存在。在天然的植物种子中，并不存在具有生理活性的c9，t11-CLA和t10，c12-CLA这两种异构体。无论是从动物来源还是植物来源中，人们都无法从直接大量获取CLA。

共轭亚油酸（CLA）具有明显的抗癌作用，对胃癌、乳腺癌、肠癌、皮肤癌和前列腺癌有明显的抑制作用。CLA具有抗动脉硬化、降低血脂及调节血压的作用。CLA能有效地发挥“血管清道夫”的作用。可清除血管中的垃圾。有效调节血液粘稠度，达到舒张血管，改善微循环，平稳血压的作用。同时CLA具有抗氧化、抗疲劳作用、免疫调节及减肥增肌等生理活性被越来越多的国内外科研和医疗机构关注。由于CLA无毒，无用量上限，CLA产品的开发将在食品、医药和饲料工业中得到广泛的应用。

商业化的CLA产品混合物含有等量的c9，t11-CLA和t10，c12-CLA，还有微量的t9，t11和t10，t12-CLAs。t9，t11和t10，t12-CLAs具有致癌作用、增加患糖尿病及心脑血管方面疾病的风险，所以控制此异构体的含量是衡量CLA品质的主要指标（An Philippaerts等，2011）。异构体t9，t11和t10，t12-CLAs含量的变化主要与反应温度有关，高温会使得异构体t9，t11和t10，t12-CLAs含量大幅增加（Pierre Juanéda等，2003）。

共轭亚油酸的制备大部分是化学法，其制备过程是通过红花油与甲醇或者乙醇酯交换得到亚油酸甲酯或者乙酯产品（CN200710010361.4），然后通过碱性催化剂催化共轭化后得到甲酯或者乙酯共轭化料，之后进行皂化、酸化、水洗物料得到共轭亚油酸，进一步蒸馏得到最终产品。整个制备工序繁琐，共轭化、酸化、水洗物料时都会引起t9，t11和t10，t12-CLAs的增长，尤其是高温不仅会引起t9，t11和t10，t12-CLAs的增长，还会影响产品的色泽，这些都会直接影响产品品质。

酶催化水解油脂制备自由酸法由于具有反应条件温和，对环境友好等优点，在油脂工业中的应用日益受到人们的青睐。脂肪酶(EC3.1.1.3)是一类特殊的酰基水解酶，多被用来催化一些酯类合成和转化反应。脂肪酶是作为重要的工业酶制剂品种之一，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业，具有其他酶蛋白无法比拟的优点。而在实际应用中游离脂肪酶受环境pH，有机溶剂，高温的影响很容易丧失它的催化活性，而且难以回收再利用，固定化是一种提高酶稳定性的有效方法，同时还有利于酶的循环使用和产物的分离纯化。

酶促反应需要一定的水存在，发明专利CN200710118466.1利用诺维信脂肪酶（Novozym435与Lipozyme RM）进行水解蓖麻油制备蓖麻酸，对比了不同油水的质量比由1:1增加至1:20水解效率由60%增加至96%，反应时间为10-30h。利用有机试剂促进油水混合进而提高酶催化水解效率（Takashi等，2012），选择亲水有机试剂叔醇可以大幅提高反应效率，10天水解效率达到70%左右。但反应时间仍然很长，水解效率不高，无法进行工业化生产。发明专利CN200910098113.9利用固定化脂肪酶—选择性透水膜生物反应器，油膜走膜组件管程，水则以反方向走膜组件的壳程，水透过膜提供酶促反应所需要的水分，同时固定化脂肪酶催化油脂水解。但因为采用了透水膜，成本被迫大幅提高，而且该膜循环利用度低，未见应用实例。发明专利CN200910097896.9由静电纺丝制备纤维素超细纤维膜，利用偶联试剂将脂肪酶固定于纤维膜上，进行油脂水解。这种膜的固定化工艺可能同样会存在成本高，固定化酶循环利用率低的问题。专利US20050170477A1利用脂肪酶水解共轭亚油酸短链酯，反应过程中抽真空除去短链醇，反应48h，水解效率达到98%以上，反应时间比较长。专利CN200810110995.1利用脂肪酶在乳化剂存在下进行水解反应，水解36h以上，水解率达到90%以上，但酶催化油脂水解时间比较长，后续分离比较麻烦。

通过以上专利及文章的对比分析可以看出，化学法制备共轭亚油酸工序繁琐，产品品质较低，而且对环境有不利影响。利用固定化脂肪酶水解油脂的反应效率不高，主要体现在转化率与反应时间上，普遍反应时间比较长，不能满足工业化生产。以上专利中利用的酶催化底物-共轭亚油酸甲酯，基本上是酸化水洗，蒸馏后的产品，此种处理工艺步骤复杂，蒸馏过程中易引起非必需异构体含量的增长，且成本较高。以上专利基本并未阐述固定化脂肪酶循环利用率的问题，这是直接制约大工业生产的关键点，同时也并未阐明制备得到的产品品质问题。

发明内容

本发明提供了一种以固定化脂肪酶为催化剂，催化甲酯或者乙酯共轭化料耦联制备共轭亚油酸的方法，本发明的目的是提供一种结合了化学法和酶法优点而摒弃各自缺点的制备共轭亚油酸的方法，即提供一种制备时间较短，不添加乳化剂，对环境友好，产品有效含量高的制备共轭亚油酸的方法。申请人在使用甲酯/乙酯共轭化料制备共轭亚油酸过程中，出乎意料地发现如果采用未完全酸化中和的甲酯/乙酯共轭化料，其中少量残留的皂会起到乳化剂的作用，从而使得甲酯/乙酯共轭化料能够很好地与水结合，也能很好地与固定化脂肪酶反应。受此启发，经过不断摸索，技术人员总结出了最优的一种以固定化脂肪酶为催化剂，耦联法制备共轭亚油酸的技术方案。

本发明的方法是利用有机酸中和甲酯或者乙酯共轭化料至pH7.5-9，加入少量水，利用料液中残留的少量的皂做为乳化剂制备乳化体系，使用自制的固定化脂肪酶为催化剂制备共轭亚油酸。与已知的化学法制备共轭亚油酸工艺相比，本发明避免了皂化、酸化、水洗、蒸馏等繁琐步骤，不使用乳化剂，降低了不需要的t9，t11和t10，t12-CLAs的含量，提高了产品品质。与已知的酶法制备共轭亚油酸的工艺相比，反应时间大大缩短，工艺更简单、成本更低、得到的共轭亚油酸品品质更高，适合工业化生产。

本发明的目的是采用如下的技术方案来实现的。

一种制备共轭亚油酸的方法，是将共轭化料经酶催化水解反应制备得到共轭亚油酸，包括如下步骤：

（1）将共轭化料用有机酸调节pH至7.5-9，得酸化共轭化料，酸化共轭化料与水按质量比1:0.5-2混合均匀，配制成反应液，预热至40-60℃；

（2）通过恒流泵匀速将预热的反应液泵入填充有固定化脂肪酶的酶反应柱中，酶催化水解反应1.5-4h，收集反应产物；

（3）反应产物经油水分离、脱溶及分子蒸馏得到共轭亚油酸产品；

其中：在步骤（2）所述的酶催化反应过程中反应液通过充入氮气或者抽真空的方式进行不间断地脱除甲醇或乙醇；所述的共轭化料是将含亚油酸80%以上的红花籽油，经碱催化异构化制备得到的甲酯共轭化料或乙酯共轭化料。

本发明的技术方案中，所述的固定化脂肪酶是我公司申请的专利CN103224926A中所述的方法制备得到。本发明中，所述的固定化脂肪酶的含水量优选控制在60-70%。

本发明的技术方案中，所述的共轭化料是采用含亚油酸80%以上的红花籽油为原料，经碱催化异构化制备得到的甲酯共轭化料或乙酯共轭化料。所述由红花油籽油制备甲酯共轭化料或乙酯共轭化料的方法采用本领域常用的碱催化异构化方法，具体为：

①将红花籽油与C_1-2短链醇按照摩尔比为1:3.5，加入红花籽油质量的2-3%的氢氧化钠一起投入到反应釜，氮气置换后在60-90℃条件下搅拌反应3-5h；所述C_1-2短链醇为甲醇或乙醇；

②反应产物酸化至pH为7搅拌，静置，分离出油相产物，得到红花籽油脂肪酸甲酯或者红花籽油脂肪酸乙酯产物；

③将步骤②的产物降膜脱汽后得到的物料与甲酯或乙酯质量的2-3%的甲醇钾投入反应釜中，氮气置换后在110-150℃条件下搅拌反应1-5h，得到最终产物，即甲酯共轭化料或者乙酯共轭化料。

本发明中，用上述方法由红花籽油中制备得到的甲酯共轭化料或乙酯共轭化料是一种混合物，甲酯共轭化料中含有80%的共轭亚油酸甲酯；所述的乙酯共轭化料中含有80%的共轭亚油酸乙酯；其它成分为棕榈酸、硬脂酸、油酸或者亚油酸的甲酯或乙酯。

本发明中，所述的有机酸优选采用柠檬酸，酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸等弱酸。

本发明中，所述的氮气流量优选为0.1-1.0l/min，抽真空的负压优选为0.3-1.0mMpa。

本发明中，所述的步骤（2）的酶催化反应温度为40-60℃。

本发明利用中和后少量的皂为乳化剂将甲酯或乙酯的共轭化料与水乳化在一起，形成均一体系，并且弱有机酸的应用有利于酶活的发挥，使得酶反应时间大大缩短，提高了固定化酶重复利用率达到100次以上，降低了成本，利于工业化大生产。

采用本发明的方法，共轭化料（甲酯共轭化料或乙酯共轭化料）的水解率高达90-99%；制备得到的产品中共轭亚油酸的含量在78-85%，其中反9，反11-共轭亚油酸与反10，反12-共轭亚油酸的含量≤1%，产品品质较好。

本发明的有益效果：

①本发明提供了一种与通常方法构思不同的技术方案，利用有机酸中和甲酯或乙酯共轭化料至pH7.5-9，加入少量水，利用料液中残留的少量的皂做为乳化剂制备乳化体系，自制固定化脂肪酶为催化剂制备共轭亚油酸。与已知的酶法制备共轭亚油酸的工艺相比，反应时间大大缩短，此工艺大大简化了酶催化物料的前期处理过程，节省了成本及水的大量消耗，减低能耗，提高反应效率。由于固定化酶的重复利用率大幅提高使得制备成本大大降低、得到的共轭亚油酸产品品质更高，适合工业化生产。另外，乳化体系的应用，大大缩短了反应时间，提高了共轭亚油酸的转化率，得到的共轭亚油酸的酸值在196mgKOH/g以上，其中大量存在（70-85%）共轭亚油酸的异构体顺9，反11（“c9，t11”）和反10，顺12（“t10，c12”），其它的异构体反9，反11（“t9，t11”）与反10，反12（“t10，t12”）的含量≤1%。

②在酶催化反应过程中，采用填充床的方式，充氮气脱甲醇/乙醇的方法进行打破平衡进行催化反应，提高了反应效率，得到的产物易于分离。

③本发明中，共轭亚油酸甲酯/乙酯共轭化料，经有机酸等弱酸酸化，酸化后呈弱碱性，pH7.5-9，克服了通常认为的共轭亚油酸甲酯/乙酯制备共轭亚油酸时，必须将甲酯/乙酯共轭亚油酸料完全中和的技术偏见。同时采用有机酸进行酸化，克服了通常认为的共轭亚油酸甲酯/乙酯制备共轭亚油酸时，酸化中和后必须经水洗、水解等步骤的技术偏见，而且降低了成本，减少了产品中的酸性杂质含量，提高了产品品质，产生了显著的技术进步。进一步，弱有机酸的应用，有利于酶活的发挥，使得酶反应时间大大缩短，提高了固定化酶重复利用率达到100次以上，降低了成本，利于工业化大生产，产生了显著的技术进步。

④如①所述，本发明采用由有机酸先酸化的共轭化料中加入水混合均匀，利用料液中残留的少量的皂做为乳化剂制备乳化体系，在进一步的酶反应中不加入乳化剂，而现有技术中酶法制备共轭亚油酸时需要必须加入乳化剂，本发明的方法省去了乳化剂的使用，省去了后续的破乳等步骤，从而大大降低了因破乳带来的产品损失，减少了杂质的引入，提高了产品品质，降低了生产时间和产品成本，产生了显著的技术进步。

⑤本发明的制备方法，综合了化学法和酶法制备共轭亚油酸的优点：使用弱酸酸化后残留的少量皂作为乳化剂，使甲酯/乙酯共轭亚油酸料很好地与水结合，从而很好地与固定化脂肪酶反应，发挥了化学法反应时间短的优点；同时，使用了固定化脂肪酶制备共轭亚油酸，发挥了酶法不添加有机溶剂，对环境友好等优点。本发明的方法克服了化学法和酶法制备共轭亚油酸的缺点，在降低不需要的t9，t11和t10，t12-CLAs含量的同时，减少了反应时间，提高了产品品质，克服了通常认为的要么产品中含t9，t11和t10，t12-CLAs，要么长时间反应才能制备共轭亚油酸的技术偏见。

⑥本发明的方法，系统地整合了制备共轭亚油酸甲酯/乙酯和制备共轭亚油酸的工艺，在应用中可以从制备共轭亚油酸甲酯/乙酯的过程中，迅速转换为生产共轭亚油酸，提高了企业生产灵活性，能使企业迅速响应市场需求，具有显著的技术效果和商业成功的潜力。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学试剂公司购买。

在下述实施例中使用的固定化脂肪酶是专利CN103224926A中公开的实施例4中制备的固定化脂肪酶。

酶反应柱的准备：下述实施例中使用的酶反应柱为带加热套的玻璃层析柱，反应柱的规格为:长度20cm，直径1.6cm。反应柱与恒流泵相连接。反应液在反应过程中匀速流经恒流泵然后进入反应柱中。

装柱方法：将固定化脂肪酶以干法装住的方式进行填充，装柱时先利用固定化脂肪酶自然沉降入柱中，然后用转换头将其压实。

下述实施例中使用的甲酯共轭化料由如下方法制备得到：

①将含有亚油酸80%的红花籽油、甲醇和氢氧化钠投入到反应釜，红花籽油与甲醇的摩尔比为1:3.5，氢氧化钠（碱催化剂）的加入量为红花籽油质量的2.5%，氮气置换后在80℃条件下搅拌反应4h；

②反应产物酸化至pH为7左右，搅拌，静置，分离出油相产物，得到红花籽油脂肪酸甲酯；

③将步骤②的产物降膜脱汽后得到的物料与红花籽油质量2.5%的甲醇钾投入反应釜中，氮气置换后在130℃条件下搅拌反应3h，得到最终产物，即甲酯共轭化料，所述甲酯共轭化料中共轭亚油酸含量为80wt%。

产品脂肪酸组成的测定参照AOCs、GB/17376和GB/T17377中所记载的方法。

产品酸值的测定参照GB/T5530中所记载的方法。

CLA甲酯水解率计算公式为：酸值/2%

实施例1

（1）取100g的甲酯共轭化料在50度下加入适量的50%的硫酸/水中和至pH=8后继续酸化1h，得酸化甲酯共轭化料，所述甲酯共轭化料中共轭亚油酸甲酯含量为80wt%；

（2）将5g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在45℃；

（3）将步骤（1）的得到的酸化甲酯共轭化料与水按质量比1:0.5配成反应液，反应液搅拌均匀，得到乳化体系，并预热至40℃，通过恒流泵泵入步骤（2）准备的酶反应柱中，搅拌速度为100rpm/min流速为0.5ml/min，连续反应4h，得到反应产物，在80℃的条件下，继续利用50%的硫酸/水溶液酸化至pH7.0左右，然后离心得到油相，即为最终产物，测定共轭亚油酸的酸值、计算共轭亚油酸甲酯的水解率，结果见表1。

实施例2

（1）向100g的甲酯共轭化料中加入50%的柠檬酸水溶液，中和至pH=8后继续酸化1h，得酸化甲酯共轭化料，所述甲酯共轭化料中共轭亚油酸甲酯含量为80wt%；

（2）将5g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在40℃；

（3）将步骤（1）的得到的酸化甲酯共轭化料与水按质量比1:0.5配成反应液，反应液搅拌均匀，并预热至40℃，通过恒流泵泵入步骤（2）准备的酶反应柱中，搅拌速度为100rpm/min流速为0.5ml/min，连续反应4h，得到反应产物在80℃的条件下，继续利用50%的柠檬酸/水溶液酸化至pH7.0左右，然后离心得到油相，即为最终产物，测定共轭亚油酸的酸值、计算共轭亚油酸甲酯的水解率，结果见表1。

实施例3

按照实施2的步骤（1）的方法得酸化甲酯共轭化料，其中用于酸化的有机酸为50%的枸杞酸水溶液，所述甲酯共轭化料中共轭亚油酸甲酯含量为80wt%。

按照实施例2的方法准备填充固定化脂肪酶的酶反应柱。

将准备好的酸化甲酯共轭化料与水按质量比1:0.5配成反应液，反应液搅拌均匀，并预热至40℃，通过恒流泵泵入酶反应柱中，搅拌速度为100rpm/min流速为0.5ml/min，连续反应4h，得到的反应产物在80℃的条件下，继续利用50%的枸杞酸水溶液酸化至pH7.0左右，然后离心得到油相，即为最终产物，测定共轭亚油酸的酸值和组成、计算共轭亚油酸甲酯的水解率，结果见表1。

实施例4

按照实施2的步骤（1）的方法得酸化甲酯共轭化料，其中在酸化中加入1.5g柠檬酸。

其余步骤同实施例2，得到最终产品共轭亚油酸并测定其酸值和组成、计算共轭亚油酸甲酯的水解率，结果如表1。

实施例5

按照实施2的步骤（1）的方法得酸化甲酯共轭化料，其中在酸化中加入0.5g柠檬酸。

其余步骤同实施例2，得到最终产品共轭亚油酸并测定其酸值和组成、计算共轭亚油酸甲酯的水解率，结果如表1。

实施例6

酸化的甲酯共轭化料的制备同实施例2，其中在制备步骤中柠檬酸的加入量为0.5g。

其余步骤同实施例3，其中酶反应柱温度保持在50℃，得到最终产品共轭亚油酸并测定其酸值和组成、计算共轭亚油酸甲酯的水解率，结果如表1。

实施例7

按照实施例2的步骤（1）的方法得酸化甲酯共轭化料。

其余步骤同实施例3，其中酶反应柱温度保持在55℃，得到最终产品共轭亚油酸并测定其酸值和组成、计算共轭亚油酸甲酯的水解率，结果如表1。

实施例8

按照实施例2的步骤（1）的方法得酸化甲酯共轭化料。

其余步骤同实施例3，其中酶反应柱温度保持在60℃，得到最终产品共轭亚油酸并测定其酸值和组成、计算共轭亚油酸甲酯的水解率，结果如表1。

实施例9

按照实施例2的步骤（1）的方法得酸化甲酯共轭化料。

其余步骤同实施例5，其中酸化甲酯共轭化料与水的质量比为1:1，酶催化反应时间为2.5h，得到最终产品共轭亚油酸并测定其酸值和组成、计算共轭亚油酸甲酯的水解率，结果如表1。

实施例10

按照实施例2的步骤（1）的方法得酸化甲酯共轭化料。

其余步骤同实施例5，其中酸化甲酯共轭化料与水的质量比为1:2，酶催化反应时间为1.5h，得到最终产品共轭亚油酸并测定其酸值和组成、计算共轭亚油酸甲酯的水解率，结果如表1。

表1.

表1中，实施例2-10的结果显示，用本发明的方法制备共轭亚油酸时，CLA甲酯的水解率达到90%以上，实施例7-10的固定化脂肪酶的CLA甲酯水解率高达99%，酶催化反应时间小于4小时，实施例10反应时间只有1.5小时，相对于现有的酶催化反应大幅缩短了反应时间，同时也大幅降低了水的使用量（油:水比质量比未超过1:2），降低了生产成本；制备得到的共轭亚油酸中异构体反9，反11（“t9，t11”）与反10，反12（“t10，t12”）的含量≤0.42%，产品品质较好。

相对于实施例7-10，使用无机酸进行酸化的实施例1的水解率明显低。产品中反9，反11（“t9，t11”）与反10，反12（“t10，t12”）的含量也高，说明本发明方法使用有机弱酸酸化时相对于无机酸酸化得到更好的效果。

实施例11

采用实施例6、7、8的方法将甲酯共轭化料酶催化水解制备共轭亚油酸，反应结束后回收水解产物，反应柱中的固定化脂肪酶，可以直接反复使用于本发明所述共轭亚油酸的制备。表2为固定化脂肪酶循环反复利用次数及其对甲酯水解率的影响。

表2.固定化脂肪酶循环反复利用次数及其对甲酯水解率的影响

表2中，实施例6的固定化脂肪酶反复回收使用100次后，对CLA甲酯的水解率仍在90%，实施例7和实施例8的固定化脂肪酶反复回收使用150次后，其对CLA甲酯的水解率仍保持90%，主要是受温度升高影响，循环次数下降。

Claims (8)

1.一种以固定化脂肪酶为催化剂的耦联法制备共轭亚油酸的方法，是将共轭化料经酶催化水解反应制备得到共轭亚油酸，包括如下步骤：

（1）将共轭化料用有机酸调节pH至7.5-9，得酸化共轭化料，酸化共轭化料与水按质量比1:0.5-2混合均匀，配制成反应液，预热至40-60℃；

（2）通过恒流泵匀速将预热的反应液泵入填充有固定化脂肪酶的酶反应柱中，酶催化水解反应1.5-4h，收集反应产物；

（3）反应产物经油水分离得到共轭亚油酸产品；

其中，在步骤（2）所述的酶催化反应过程中反应液通过充入氮气或者抽真空的方式进行不间断地脱除甲醇或乙醇；所述的共轭化料是将含亚油酸80%以上的红花籽油，经碱催化异构化制备得到的甲酯共轭化料或乙酯共轭化料。

2.根据权利要求1所述的制备共轭亚油酸的方法，其特征在于所述的甲酯共轭化料中含有80wt%的共轭亚油酸甲酯；所述的乙酯共轭化料中含有80wt%的共轭亚油酸乙酯。

3.根据权利要求1所述的制备共轭亚油酸的方法，其特征在于所述的有机酸为柠檬酸、酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸。

4.根据权利要求1所述的制备共轭亚油酸的方法，其特征在于所述的氮气流量为0.1-1.0L/min，抽真空的负压为0.3-1.0Mpa。

5.根据权利要求1所述的制备共轭亚油酸的方法，其特征在于所述的步骤（2）的酶催化反应温度为40-60℃。

6.根据权利要求1所述的制备共轭亚油酸的方法，其特征在于所述的共轭化料的水解率为90-99%。

7.如权利要求1-6所述的任一项所述的方法制备的共轭亚油酸产品。

8.根据权利要求7所述的共轭亚油酸产品，其特征在于所述共轭亚油酸产品中共轭亚油酸的含量为78～85%，其中反9，反11-共轭亚油酸与反10，反12-共轭亚油酸的含量≤1%。