CN1703516A - 制备具有不可皂化物含量降低的微生物脂肪或油的方法和所述脂肪或油 - Google Patents

制备具有不可皂化物含量降低的微生物脂肪或油的方法和所述脂肪或油 Download PDF

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Abstract

一种制备不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的粗制油的方法，其特征在于在含有2－15％氮源浓度的培养基中培养能够产生包含不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油的微生物，培养箱内装备着搅拌叶轮，满足搅拌叶轮的直径(＝d)与培养箱内径(＝D)的比率是d/D＝0.30至0.6的要求。

Description

制备具有不可皂化物含量降低的 微生物脂肪或油的方法和所述脂肪或油
技术领域
本发明涉及具有不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的粗制油(crude oil)，精炼脂肪(fat)或油(oil)的生产方法，和所述脂肪或油(粗制油或精炼脂肪或油)以及其中掺入了该脂肪或油(粗制油或精炼脂肪或油)的食品和饮料、治疗性营养食品、动物食品和药物制剂。在本发明中，″不可皂化物″和″酯型甾醇″是指从微生物中提取的那些。因此，本发明涉及的″不可皂化物″和″酯型甾醇″不包括提取以后添加到粗制油中的任何不可皂化物和酯型甾醇。
背景技术
考虑到人高不饱和脂肪酸(以下简称″PUFA″)的生物合成，有两个典型的系列，ω3和ω6系列。ω(omega)是指从脂肪酸的末端甲基到第一个双键所处碳原子的碳原子数目。例如，在ω6系列的情况下，亚油酸(18:2ω6)重复不饱和和碳链长度延长，因此变为γ-亚麻酸(18:3ω6)、二高-γ-亚麻酸(20:3ω6)，花生四烯酸(20:4ω6)和4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5ω6)。
同样地，在ω3系列的情况下，α-亚麻酸(18:3ω3)重复不饱和和碳链长度延长，因此变为二十碳五烯酸(20:5ω3)、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5ω3)和4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22:6ω3)。二十碳五烯酸(以下简称″EPA″)和二十二碳六烯酸(以下简称″DHA″)作为ω3系列的PUFA已知具有许多生理功能，特别是生活方式疾病预防作用，如动脉硬化和血栓形成，以及致癌作用和学习能力提高作用，已经进行了将这些PUFA应用于药物制剂和保健的特殊食品的各种尝试。然而，近年来，也注意到除ω3系列的PUFA(ω6和ω9系列)的生理功能。
组成重要器官如血液和肝脏的脂肪酸大约10％被认为是花生四烯酸。例如，人血液磷脂中脂肪酸具有包含11％花生四烯酸、1％二十碳五烯酸和3％二十二碳六烯酸的组成。作为细胞膜的主要组成成分，花生四烯酸参与膜流动的调节，在体内新陈代谢中显示出多种功能，此外，起着前列腺素直接前体的重要作用。
特别是，近来注意到花生四烯酸作为婴儿营养品和作为内源大麻素(cannabinoid)(2-arachidonoyl一甘油，anandamide)的成分脂肪酸，具有神经活化作用。通常，摄取富含亚油酸的食物时，亚油酸变为花生四烯酸。然而，在罹患生活方式疾病的患者和生活方式疾病后备群体(reserve group)、婴儿和老年人中，参与生物合成的酶的功能降低。因此，花生四烯酸的量可能不足。因此，期望摄取花生四烯酸直接作为脂肪或油(甘油三酯的成分脂肪酸)。
由于EPA和DHA作为ω3系列的PUFA，因此有丰富的鱼油供应源。另一方面，作为ω6系列的PUFA的γ-亚麻酸，二高-γ-亚麻酸，花生四烯酸和4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5ω6)很难从常规脂肪或油的供应源获得，而且，目前，常常使用包含由微生物发酵产生的PUFA作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)。例如，已经提出了一种方法，其中包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)是由培养能够产生包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)的多种微生物而产生的。
其中，已知使用特别是属于被孢霉属(Mortierella)的微生物制备含有高含量花生四烯酸的脂肪或油(日本未审查专利公开号(Kokai)63(1988)-44891和63(1988)-12290)。基于许多试验结果，据说这些脂肪或油是安全的。然而由于这种脂肪或油来源于微生物，在摄取方面没有满意的经验。因此，目前所述脂肪或油尚未满意地流入社会。另一方面，包含发酵产生的花生四烯酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)已经开始应用，其中花生四烯酸应该用于例如婴儿营养和尤其是婴儿配制食品中。
从天然存在的产物如动物和植物制备的脂肪或油经过提炼过程，如脱胶、脱氧、除臭、脱色、分子蒸馏和越冬(wintering)，然后作为食用脂肪或油出售。例如，从油料植物中榨取获得的脂肪或油含有大量杂质，因此本身不能用作食用脂肪或油。除了已被经常食用的芝麻油和橄榄油，这些脂肪或油在用作食用油之前通常要精炼。
例如、在脱胶过程中、未精炼的油中含有的磷脂、碳水化合物、树脂、蛋白化合物、微量金属和着色物质被除去。在脱氧(碱炼)过程中、脂肪酸、着色物质、磷脂、微量金属、含硫化合物、不溶于油的物质和氧化产物被除去。在脱色过程中、着色物质、胶粘物质、微量金属、皂成分、氧化产物和磷脂被除去。在除臭过程中、脂肪酸、单酸甘油酯、甘油二酯醛、醇类、酮、烃类、着色物质、含硫化合物、过氧化物、氧化降解产物和其它臭气组分被除去。
脂肪或油含有有机化合物，它们可溶于油并且很少会被碱降解，称作″不可皂化物″。例如，已知化合物如高级醇、甾醇、烃类，生育酚和类胡萝卜素是不可皂化物的组成成分。在脂肪或油炼制过程中，不可皂化物含量可以降低但是不能完全被除去。已知甾醇在由微生物制备的脂肪或油中作为不可皂化物的主要组分存在。
脂肪或油中存在的甾醇被分成游离型和酯型。在提炼过程中，可以除去游离型，但是，另一方面，几乎不能除去酯型。例如，在脱胶、脱氧、脱色和除臭过程以后，豆油的甾醇含量(mg/g)，游离型分别是3.4，3.0，2.0和1.6，和酯型分别是0.6，0.6，0.6和0.6(″ShokuyoYushi no Kagaku(Science of edible fat or oil) ″20-21页，SAIWAISHOBO)。
由于不能除去的甾醇等等作为不可皂化物的一部分存在，因此通常，不可皂化物含量被广泛用作精炼脂肪或油的质量指数或作为提炼过程的控制指数。例如，根据日本农业标准，食用红花油，食用大豆油和食用棕榈油中不可皂化物的含量应该不超过1.0％(农业、林业和渔业部的第523号通告(1969年3月31日))。对于婴儿，胆固醇是必需的，具有增加的胆固醇含量的婴儿配制食品(formula)被出售。蔬菜可食用脂肪或油中含有源自植物的甾醇。源自蔬菜的甾醇的存在不利地抑制婴儿对胆固醇的吸收(Shokuhin to Kaihatsu(FoodProcessing And Ingredients)，33卷，2期，42-45页(1998))。因此，当考虑到食用脂肪或油掺入婴儿配制食品的应用时，强烈期望甾醇含量低的，就是说，不可皂化物含量低的食用脂肪或油。
培养属于被孢霉属的微生物产生的脂肪或油的主要部分被认为是甘油三酯(按重量计算至少大约70％)和磷脂，并且不可皂化物作为其它成分存在。不可皂化物包含甾醇(如链甾醇)和甾醇酯作为主要组分。可食用脂肪或油是甘油三酯的形式。通过使培养微生物产生的最初脂肪或油(通过细胞提取提供的并且称作″粗制油″的脂肪或油)接受食用脂肪或油的提炼过程(脱胶，脱氧，除臭和脱色)可提供已经除去磷脂的精炼油脂或油。然而，提炼过程难以完全除去不可皂化物。
由于很难完全除去不可皂化物，而且非常期望不可皂化物含量低的食用脂肪或油，因此已经进行了如何除去不可皂化物的研究。结果，开发了用柱层析的精炼方法(日本未审查专利公开号(Kokai)10(1998)-191886)。然而在这个技术中，没有对组成不可皂化物的组分进行详细研究。精炼后不可皂化物的组分与精炼前的组分的改变，就是说，精炼除去的组分信息仍未知。
培养属于被孢霉属的微生物产生的脂肪或油在菌丝体(mycelia)内蓄积。因此，从提高生产含有高不饱和脂肪酸的脂肪或油的费用有效性的观点来看，应该进行培养以得到较高的细胞浓度。为了提供高细胞浓度，变为细胞组分的培养基的氮源浓度应该增加。根据以前的报道(日本未审查专利公开号(Kokai)10(1998)-191886和10(1998)-70992)，尽管报道了不可皂化物或总甾醇含量，但是微生物培养中使用的培养基的氮源浓度最高是大约1.5％。
此外，已经报道了甾醇含量不超过1％的含有高不饱和脂肪酸的脂肪或油(PCT公开号2000-510513的公开日文翻译)。然而在这种情况下，这个生产中使用的培养基的氮源浓度是低的，而且，在使用高山被孢霉(Mortierella alpina)生产的含有花生四烯酸的脂肪或油的生产中，在1％低氮源浓度(＝酵母抽提物0.5％+NaNO30.5％)下进行培养(PCT公开号2000-508888的公开日文翻译)。因此，由于广延期望不可皂化物含量和甾醇含量低的食用脂肪或油，因此已经进行了降低不可皂化物和/或甾醇的研究。然而，没有描述高浓度微生物培养法制备的微生物脂肪或油中含有的不可皂化物和甾醇。
如上所述，甾醇作为不可皂化物的主要成分被分成游离型甾醇和酯型甾醇。游离型甾醇可以通过提炼过程除去，而酯型甾醇很难通过提炼过程除去。因此，人们认为为了提供不可皂化物含量低，特别是甾醇含量低的精炼脂肪或油，不能通过提炼过程无困难地除去的酯型甾醇含量低的用于精炼的原料的开发，就是说，酯型甾醇含量低的粗制油的开发很重要。
发明公开
因此，本发明提供了制备具有降低的不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的粗制油的方法。此外，本发明提供了从该粗制油制备精炼油的方法。
此外，本发明提供了可以通过上述方法制备的不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的粗制油，并且提供了由这种脂肪或油制备的精炼脂肪或油。
此外，本发明提供了上述脂肪或油的多种用途。
已经报道了不可皂化物含量和甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(日本未审查专利公开号(Kokai)10(1998)-191886和10(1998)-70992，和PCT公开号2000-510513的公开日文翻译)。然而，这些制备方法不适于脂肪或油的费用有效性(cost-effective)生产，因为培养中培养基的氮源浓度低。因此，为了提高费用有效性，通过在氮源浓度提高的培养基中进行培养提高了每一培养回收的含有高不饱和脂肪酸的脂肪或油的量。然而在这种情况下，已经发现脂肪或油不可皂化物含量和甾醇含量也提高了。因此，本发明的目的是开发一种可以满足通过高浓度培养的费用有效性提高和通过降低不可皂化物含量和甾醇含量的质量提高的制备方法。
本发明人着眼于提供通过高浓度培养制备的不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(粗制油)，对含有高氮源浓度的培养基中制备的脂肪或油的培养条件和化学组分进行了广泛和充分的研究。结果，意外地，培养箱的搅拌叶轮形式的改进和培养基氮源灭菌的pH条件的改进导致建立了按重量计算不可皂化物含量不超过2.2％和按重量计算酯型甾醇含量不超过1.0％并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(粗制油)的制备方法。
众所周知满意量的氧供应对于使用微生物通过液体培养法制备高不饱和脂肪酸很重要(日本未审查专利公开号(Kokai)6(1994)-153970)。容量氧传质系数(kLa)已经广泛用作微生物液体培养中的供氧指数。Richard报道了kLa具有带有每单位量液体(Pg/V)的搅动功率消耗、通风线速度(Vs)和搅动速度(N)的公式(1)表示的关系(J.W.Richard；Prog.Ind.Microbiol.，3卷，141页，(1961))。
kLaα(Pg/V)0.4Vs0.5N0.5  (1)
根据0.2至60m3的培养箱测定值，Fukuda等人报道了比公式(1)提供了更好相关性的公式(2)(Fukuda等人，Hakkokogaku Kaishi，46卷，829页(1968))。
kLaα{(Pg/V)0.4Vs0.5N0.5}1.4  (2)
Matsushima等人证实了公式(1)和(2)的通用性并报道了通过概括为公式(3)表示的，公式(1)和(2)可以更广泛应用(Matsushima等人Hakkokogaku Kaishi，50卷，105页(1972))。
kLaα{(Pg/V)0.4Vs0.5N0.5}α  (3)
由这些相关公式，人们认为在同一搅动功率消耗(Pg/V)和同一通风线速度(Vs)的条件下，较高搅动速度(N)提供较高的容量氧传质系数(kLa)。
每单位液体量的搅动需要功率由公式(4)表示。
Pg/V＝ρNpN3d5/V  (4)
其中ρ代表液体密度，Np代表功率数和d代表搅拌叶轮的直径。
为了提供给定工作量下，就是说同一搅动需要功率下，较高的搅动速度，考虑使用较小功率数(Np)和较小搅拌叶轮直径(d)的培养箱是有利的。
Taguchi等人，(Biseibutsugaku Kisokoza 7-Biseibutu BaiyoKogaku-(Introduction to Microbiology 7-MiroorganismFermentation Engineering)，edited by Hisaharu Taguchi and ShiroNagai，Kyoritsu Shuppan Co.，Ltd.p.175(1985))描述了考虑通气搅动培养箱的标准条件，d/D比率在1/4至1/3范围内作为标准范围，典型的是1/3。
然而这仅仅是在水或细胞浓度低的培养液中确立的。为了提高该生产的费用有效性，应该增加培养基中氮源浓度，得到较高的细胞浓度。因此，本发明人想到，在高细胞浓度的培养液中，不仅应该考虑到容量氧传质系数(kLa)，而且应该考虑到整个培养液的混合。
此外，已经发现当在氮源浓度提高的培养基中进行培养时，就是说，在较高细胞浓度下，从微生物中提取的包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(粗制油)的不可皂化物含量和酯型甾醇含量增加，导致由于氮源浓度提高的培养，产生具有不想要的化学组分的脂肪或油。Iwamoto报道了全部脂质中不可皂化物含量随着细胞的脂肪或油含量增加而降低(″Biseibutsuniyoru Yushino Seisan(Microbialproduction of fat or oil)，″Hiroaki Iwamoto，(来源未知))。本发明人实施的研究也表明在较高浓度培养可能降低每个细胞的脂肪或油含量。本发明人考虑每一细胞的脂肪或油含量降低引起不可皂化物含量和酯型甾醇含量增加。
因此，本发明人考虑在培养基中氮源浓度高的高浓度培养中，重要的不仅是提高容量氧传质系数(kLa)，而且是整个培养液的混合并因此提高每一细胞的脂肪或油含量。本发明人针对改进搅拌叶轮的形状(形式)作为达到这个目标的方法并做了广泛和充分的研究。结果，本发明人通过培养中的微生物，使用d/D(搅拌叶轮的直径(＝d)与培养箱内径(＝D)的比率)＝0.34至0.6的培养箱，成功提高了每一细胞的脂肪或油含量和提高了高不饱和脂肪酸的生产量。此外，已经意外地发现，在这种情况下，从微生物中提取的包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油的酯型甾醇含量显著降低。
此外，已经发现甚至在d/D＝小于0.34的培养箱的情况下，由微生物产生的高不饱和脂肪酸的生产量提高和酯型甾醇含量降低可以通过在不超过5.0的pH值灭菌培养基的氮源来达到。
据此，本发明人进行了广泛和充分的研究，结果，通过采用一种方法，其中使用装备有d/D＝至少0.34的搅拌叶轮的培养箱进行培养，或通过采用一种方法，其中d/D＝小于0.34的培养箱的情况下，在氮源已经在不超过5的pH值下灭菌的培养基中进行培养，成功地稳定产生了不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低的脂肪或油(粗制油)。这导致本发明的完成。
因此，本发明提供了一种制备不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的粗制油的方法，其特征在于在培养箱中在含有2至15％氮源浓度的培养基中培养能够产生包含不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油的微生物，所述培养箱内装备着搅拌叶轮，满足搅拌叶轮的直径(＝d)与培养箱内径(＝D)的比率是d/D＝0.30至0.6的要求。
本发明也提供了粗制油，其特征是上述方法制备的不可皂化物含量按重量计算不超过2.2％。本发明也提供了通过精炼上述粗制油产生的精炼脂肪或油。
本发明也提供了包含掺入其中的上述粗制油和/或上述精炼脂肪或油的普通食品和饮料、功能食品、营养补充物、早产儿的婴儿配制食品(formula)、足月婴儿的婴儿配制食品、婴儿食品、预产和哺乳母亲的食品、或老年人食品。
本发明也提供了包含掺入其中的上述粗制油和/或上述精炼脂肪或油，任选连同适于口服、直肠内或肠胃外给药的中性载体的治疗性营养食品。
本发明也提供了包含掺入其中的上述粗制油和/或上述精炼脂肪或油的给予动物或鱼的食物。
本发明也提供了包含掺入其中的上述粗制油和/或上述精炼脂肪或油的药物组合物。本发明也提供了使用上述粗制油和/或上述精炼脂肪或油作为原料制备的药物组合物。
发明实施方案
本发明涉及制备不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(粗制油)的方法，所述脂肪或油(粗制油)，以及含有掺入其中的通过精炼所述脂肪或油(粗制油)而提供的精炼脂肪或油(甘油三酯)的食品和饮料、治疗营养食物、动物食品和药物制剂。
根据本发明的脂肪或油(粗制油)是从培养产物获得的微生物脂肪或油，该培养产物是在含有2至15％氮源浓度的培养基中培养能够产生包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油的微生物产生的。该脂肪或油(粗制油)的不可皂化物和/或酯型甾醇含量降低，通过在装备有搅拌叶轮的d/D＝0.34至0.6的培养箱中培养，或当使用d/D＝小于0.34的培养箱时，通过在不超过5的pH值下灭菌含有氮源的培养基中培养达到。
特别地，该脂肪或油(粗制油)的不可皂化物含量按重量计算不超过2.2％，优选按重量计算不超过2.0％，更优选按重量计算不超过1.8％，和/或酯型甾醇含量按重量计算不超过1.0％，优选按重量计算不超过0.8％，更优选按重量计算不超过0.6％，和根据脂肪或油(粗制油)的总脂肪酸，高不饱和脂肪酸含量按重量计算不少于10％，优选按重量计算不少于20％，更优选按重量计算不少于30％，最优选按重量计算不少于40％。因此，应该进行能够产生包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)的微生物的培养。
这里涉及的微生物最好是可以产生至少一种高不饱和脂肪酸主要作为甘油三酯的成分脂肪酸的微生物，高不饱和脂肪酸选自具有18个或以上碳原子和3个或以上双键的ω6高不饱和脂肪酸，具有18个或以上碳原子和2个或以上双键的ω9高不饱和脂肪酸，和具有18个或以上碳原子和3个或以上双键的ω3高不饱和脂肪酸。
具有18个或以上碳原子和3个或以上双键的ω6高不饱和脂肪酸包括γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)，二高-γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)，花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)，7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22:4ω6)，和DPAω6(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)。具有18个或以上碳原子和2个或以上双键的ω9高不饱和脂肪酸包括6，9-十八碳二烯酸，8，11-二十碳二烯酸，和Mead acid(5，8，11-二十碳三烯酸)，具有18个或以上碳原子和3个或以上双键的ω3高不饱和脂肪酸包括α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)，6，9，12，15-十八碳四烯酸(18:4ω3)，8，11，14，17-二十碳四烯酸(20:4ω3)，EPA(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)，DPAω3(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)，和DHA(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)。
因此，在本发明中，可以使用所有微生物，只要它们可以产生包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)。能够产生包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)的微生物包括例如属于被孢霉属，耳霉属(Conidiobolus)，腐霉属(Pythium)，疫霉(Phytophthora)，青霉属(Penicillium)，枝孢霉(Cladosporium)，毛霉菌属(Mucor)，镰刀菌属(Fusarium)，曲霉属(Aspergillus)，红酵母属(Rhodotorula)，虫霉属(Entomophthora)，刺孢囊霉属(Echinosporangium)和水霉属(Saprolegnia)的微生物。
属于被孢霉属的被孢霉亚属的微生物包括例如亚属长形被孢霉(Mortierella elongata)，微小被孢霉(Mortierella exigua)，喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)和高山被孢霉(Mortierellaalpina)。其具体实例包括长形被孢霉(IFO 8570)，微小被孢霉(IFO8571)，喜湿被孢霉(IFO 5941)，高山被孢霉(IFO 8568)，ATCC 16266，ATCC 32221，ATCC 42430，CBS 219.35，CBS 224.37，CBS 250.53，CBS 343.66，CBS 527.72，CBS 529.72，CBS 608.70和CBS 754.68菌株。
例如，属于Crypthecodenium，Thrautochytrium，Schizochytrium，Ulkenia，Japonochytrium或Haliphthoros属的微生物也可以被提为能够产生DHA的微生物。
所有这些菌株都可以不受限制的获自发酵研究所，Osaka(IFO)，美国典型培养物保藏中心(ATCC)和Centrralbureau voor Schimmelcultures(CBS)。此外，也可以使用参与本发明的研究组从土壤分离的菌株，即长形被孢霉SAM 0219(FERM P-8703)(FERM BP-1239)。
为了培养本发明中使用的菌株，孢子、菌丝体或预先培养获得的种子培养溶液或从种子培养收集的细胞接种于液体培养基，随后主要培养。在液体培养基的情况下，这里可用的碳源包括但不限于本领域常用的那些，例如葡萄糖，果糖，木糖，蔗糖，麦芽糖，可溶淀粉，糖蜜，甘油，甘露醇和糖化淀粉。
氮源包括天然氮源如蛋白胨，酵母抽提物，麦芽提取物，肉类抽提物，酪蛋氨基酸，玉米浆，大豆蛋白质，脱脂大豆和棉子粉，有机氮源如尿素，和无机氮源如硝酸钠，硝酸铵和硫酸铵。特别是，从大豆获得的氮源，特别是大豆，脱脂大豆，大豆薄片，食用大豆蛋白质，bean-curd refuse，豆浆和大豆粉可以被作为氮源。特别是，热变性脱脂大豆，更优选在大约70-90℃热处理脱脂大豆和除去可溶于乙醇组分而产生的产物可以单独使用或与它们中两个或更多组合或它们与上述氮源组合使用。
此外，如果需要，磷酸离子，钾离子，钠离子，镁离子，钙离子和，以及金属离子如铁，铜，锌，锰，镍和钴离子，和维生素也可以用作次要的营养。
这些培养基组分的浓度不特别限制，只要微生物的生长不被抑制。在实践中，添加的碳源总量通常按重量计算是0.1-40％，优选按重量计算1-25％，和添加的氮源总量优选按重量计算是2-15％，更优选按重量计算2-10％。更优选，添加的碳源初始量通常按重量计算是1-5％，和添加的氮源初始量按重量计算是3-8％，和，在培养过程中，可以供给碳源和氮源，更优选可以仅仅供给碳源。
为了增加不饱和脂肪酸的产量，例如，可以单独或联合使用碳氢化合物如十六烷或十八烷；脂肪酸或其盐如油酸或亚油酸，或脂肪酸酯，例如乙酯，脂肪酸甘油酯，或失水山梨糖醇脂肪酸酯；或脂肪或或油如橄榄油，大豆油，油菜籽油，棉籽油或棕榈油作为不饱和脂肪酸的前体。添加的底物量是0.001-10％，优选0.5-10％，根据培养基而定。也可以使用这些底物作为唯一碳源进行培养。
产生高不饱和脂肪酸的微生物的培养温度根据使用的微生物而变化。然而，培养温度可以是5-40℃，优选20-30℃。也可以使用一种方法，其中在20-30℃进行培养使细胞生长和接着继续在5-20℃培养而产生不饱和脂肪酸。也可以通过这个温度控制增加所产生的脂肪酸中的高不饱和脂肪酸的比例。通过通风搅拌培养，振荡培养，固体培养或固定液培养进行种子培养，和通过通风搅拌培养进行主要培养。主要培养开始时(种子培养溶液接种时)的培养基调节至pH5至7，优选5.5至6.5。主要培养通常进行2至30天，优选5至20天，更优选5至15天。
根据本发明的脂肪或油(粗制油)是从培养产物获得的微生物脂肪或油，该培养产物是通过培养能够产生包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)的微生物而产生的，并且本发明最具特征性的特征是通过在装备着d/D＝0.34至0.6的搅拌叶轮的培养箱中进行主要培养，或当使用d/D＝小于0.34的培养箱时，通过在不超过5的pH值灭菌含氮源的培养基中进行主要培养降低了粗制油的不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量。因此，本发明开发了一种方法，通过使用能够产生包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)的微生物，它可以降低粗制油中不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量。
在根据本发明的培养方法中，最具特征性的特征是通过在d/D(搅拌叶轮直径(＝d)与培养箱内径(＝D)的比率)＝0.30至0.6的培养箱中培养，优选d/D＝0.34至0.55，更优选d/D＝0.37至0.55，最优选d/D＝0.42至0.55，粗制油中不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低。为了获得d/D比率引起的更好效果，期望使用体积至少1m3的培养箱，优选至少5m3，更优选至少10m3。至于搅拌叶轮，包括涡轮叶片的搅拌叶轮可以在一个阶段使用或无特殊限制在许多阶段使用。
当在培养基灭菌以后进行培养基的pH调节时，应该无菌小心地实施调节步骤，以便不引起不需要的微生物污染。因此，pH调节通常在培养基灭菌之前进行。例如，当培养开始时调节时未引起任何pH改变的培养基被调节至pH6.0时，灭菌前培养基以非无菌方式调节至pH6.0消除了灭菌后无菌pH调节。为了降低甚至在d/D＝小于0.34的培养箱中酯型甾醇，本发明人针对并进行了灭菌步骤中pH条件对培养生产量和产物组成的影响的研究。结果，本发明人发现，优选培养基灭菌前调节pH不超过5，灭菌后pH再调节至适于开始培养的值。
特别地，含有培养基氮源的溶液pH调节为4至5，优选pH4.2至4.7，随后灭菌。照此灭菌的培养基或任选添加另一待灭菌培养基后用于制备培养起始培养基，然后pH调节为5至7，优选pH5.5至6.5。种子培养溶液接种到该培养基开始主要培养。可用于灭菌之前调节含有氮源溶液的pH的pH调节剂包括但不特别限于硫酸，盐酸，磷酸，硝酸和碳酸或其盐，单独使用或它们中的两个或更多组合使用。灭菌后培养基的pH再调节剂包括但不特别限于氢氧化物化合物如氢氧化钠和氢氧化钾和氨和铵盐，单独使用或它们中的两个或更多组合使用。
已知属于被孢霉属的被孢霉亚属的微生物能够产生包含花生四烯酸作为主要成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)。本发明人通过对上述菌株进行突变处理获得了能够产生包含二高-γ-亚麻酸作为主要成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)的微生物(日本未审查专利公开号(Kokai)5(1993)-91887)和能够产生包含ω9高不饱和脂肪酸作为主要成分脂肪酸(甘油三酯)的脂肪或油的微生物(日本未审查专利公开号(Kokai)5(1993)-91888)。
此外，本发明人也获得了耐高浓度碳源的微生物(WO98/39468)。上述微生物是属于被孢霉属的被孢霉属亚属的微生物，通过本发明的培养方法可以容易地降低粗制油的不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量，特别是通过在装备着d/D＝0.34至0.6的搅拌叶轮的培养箱中进行主要培养，或当使用d/D＝小于0.34的培养箱时，通过在不超过5的pH值和2-15％的培养基氮源浓度下，灭菌含氮源的培养基中进行主要培养。
然而本发明中使用的微生物不限于属于被孢霉属的被孢霉属亚属的那些，通过将根据本发明的培养方法应用于能够产生包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)的微生物，具体地说通过在装备着d/D＝0.34至0.6的搅拌叶轮的培养箱中进行主要培养，或当使用d/D＝小于0.34的培养箱时，通过在含氮源的培养基中进行主要培养，该氮源培养基在不超过5的pH值灭菌，并具有2-15％的培养基氮源浓度，可以产生不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低的预期粗制油。
可用于从微生物获得粗制油的方法中，培养完成后，照这样的培养液或如灭菌，浓缩或酸化的处理后，接受常规的固液分离方法，如自然沉淀，离心和/或过滤，收集培养细胞，所述微生物蓄积了不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油，它是通过在装备着d/D＝0.34至0.6的搅拌叶轮的培养箱中进行主要培养，或当使用d/D＝小于0.34的培养箱时，通过在不超过5的pH值灭菌，并含有2-15％的培养基氮源浓度的含氮源的培养基中进行主要培养产生的。
从辅助固液分离的观点来看可以添加凝结剂或过滤助剂。凝结剂包括例如氯化铝，氯化钙，褐藻胶和壳聚糖。过滤助剂包括例如硅藻土。优选培养细胞用水洗，压碎和干燥。可以如冷冻干燥，风干或流化床干燥进行干燥。从干燥细胞获得粗制油的方法可以是用有机溶剂提取或压榨。然而优选在氮气流下用有机溶剂提取。
有机溶剂包括乙醇，己烷，甲醇，乙醇，氯仿，二氯甲烷，石油醚和丙酮。也可以使用甲醇和石油醚交互提取以及用氨仿-甲醇-水单相溶剂提取。然而，获得粗制油的抽提方法不限于上述方法，并且可以使用可以有效地提取细胞内蓄积的脂肪或油的任何方法。例如，超临界提取可以用作有效方法。
通过在降低的压力或其它条件下，从用有机溶剂或超临界流体提取获得的提取物中除去有机溶剂或超临界流体成分可以获得目标粗制油。此外，可供选择地，可以使用湿细胞进行提取。在这种情况下，使用与水相容的溶剂，如甲醇，乙醇和丙酮，或与水相容并由上述溶剂和水和/或其它溶剂组成的混合溶剂。其它步骤与上面描述的那些相同。
根据本发明产生的不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的粗制油可以与动物食品混合直接使用。然而当考虑到应用于食品时，在使用之前，优选粗制油接受常规脂肪或油精炼过程。这里可用的脂肪或油精炼过程包括常规过程如脱胶，脱氧，除臭，脱色，柱处理，分子蒸馏和越冬(wintering)。精炼脂肪或油，因此，其中不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量已经空前降低的精炼脂肪或油可以通过使常规脂肪或油精炼方法难以达到的酯型甾醇含量降低的根据本发明的粗制油接受脂肪或油精炼方法获得。
使根据本发明和酯型甾醇含量低的粗制油接受脂肪或油精炼过程也可以降低提炼过程中的加工量。具体地说，例如，甚至在提炼过程处理时间减少和能源消耗减少后仍可以提供不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量等于现有技术的精炼脂肪或油。此外，使用与现有技术相同的处理时间和能源消耗可以提供不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量低于现有技术的精炼脂肪或油。
根据本发明的精炼脂肪或油(甘油三酯)可用于无限的应用范围，例如，用于食品、饮料、化妆品和药物制剂的原料和添加剂，并且使用的目的和量没有限制。
例如，可以使用精炼脂肪或油的食物组合物包括普通食品、以及功能食品、营养补充物、早产儿的配制品、足月婴儿的配制品、婴儿配制品、婴儿食品、预产和哺乳母亲的食品或老年人食品。
含有脂肪或油的食品实例包括：固有含有脂肪或油的天然食物，如肉、鱼或坚果；在烹调的时候添加脂肪或油的食品，如汤；使用脂肪或油作为载热体的食品，如油炸圈饼；脂肪或油食品如黄油；在加工的时候添加脂肪或油的加工食品，如小甜点或饼干；或在完成加工的时候喷雾或涂布脂肪或油的食品，如韧性饼干。此外，精炼脂肪或油可以添加到不含脂肪和油的农业食品、发酵食品、家畜食品、海产品或饮料中。精炼脂肪或油可以用于功能食品和药物制剂形式，例如可以用于加工形式如肠营养素，粉剂，粒剂，锭剂，内部使用的液体，悬浮液，乳剂和糖浆。
实施例
参考下列实施例更详细地描述本发明。然而，应该指出本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1：花生四烯酸的制备，d/D＝0.34，培养基中大豆粉的浓度＝6％
提供高山被孢霉(CBS 754.68)作为产生花生四烯酸的真菌。高山被孢霉的标准菌株接种到培养基(1％酵母抽提物，2％葡萄糖，pH6.3)中。在100rpm往复摇动和28℃条件下开始种子培养(第一阶段)，种子培养延续3天。接下来，在50L-体积通风搅拌培养箱中制备30L培养基(1％酵母抽提物，2％葡萄糖，0.1％豆油，pH6.3)。种子培养(第一阶段)溶液接种到该培养基。在200rpm搅动速度，温度28℃，150kPa箱内部压力条件下开始种子培养(第二阶段)，种子培养延续2天。
接下来，制备4500L培养基(培养基A：大豆粉336kg，KH2PO4 16.8kg，MgCl2·6H2O 2.8kg，CaCl2·2H2O 2.8kg，豆油5.6kg)。对于条件(1-1)培养基调节至pH6.3和对于条件(1-2)调节至pH4.5。在121℃条件下对对于条件(1-1)的培养基和对于条件(1-2)的培养基灭菌20分钟。在140℃条件下对1000L培养基(培养基B：一水合葡萄糖112kg)灭菌40秒并将该灭菌培养基添加至上述培养基A制备成另一培养基-培养基C。照这样的培养基C用于条件(1-1)，和对于条件(1-2)调节培养基C至pH6.3。然后种子培养(第二阶段)溶液接种到由此制备的培养基中，并将体积调节至总计5600L的培养液初始量(培养箱的体积：10kL)。
在温度26℃，气流速率49Nm3/小时和内部压力200kPa的条件下开始培养。
培养箱的形式是，提供分为三个平台(stage)的六个桨叶涡轮，并且搅拌叶轮直径(＝d)与该箱内径(＝D)的比率是d/D＝0.34。当补料培养基如表1所示时，主要培养进行306小时。在培养末期，由于培养基补料造成溶液量增加和溶液蒸发造成溶液量减少的影响，培养液的量是7750L。在培养末期，条件(1-1)每升培养液产生的花生四烯酸浓度是18.2g/L，条件(1-2)是18.4g/L。
表1：实施例1中的培养基补料
主要培养时间 培养基补料
19小时后 一水合葡萄糖280kg/460L
43小时后 一水合葡萄糖280kg/450L
67小时后 一水合葡萄糖252kg/390L
91小时后 一水合葡萄糖252kg/410L
120小时后 一水合葡萄糖224kg/370L
140小时后 一水合葡萄糖168kg/280L
163小时后 一水合葡萄糖168kg/270L
培养完成后，在120℃条件下对培养液灭菌20分钟。然后用连续脱水器收集湿细胞。在振动流化床干燥器中将收集的湿细胞干燥至按重量计算1％的含水率。航空运输机器(air transport machine)将干燥细胞运输至装料平台，并且连同氮气，填入体积大约1m3的铝小袋容器(container)袋。热封袋子的收口部分，然后容器袋保存在10℃或以下的冰箱。
从容器袋中取出干燥细胞并用己烷提取。通过过滤从己烷溶液中除掉固体物质。然后在降低的压力下加热滤液以除去己烷得到包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的粗制油。分析该粗制油。结果，如表2所示，粗制油的酯型甾醇含量低。
表2：含花生四烯酸的粗制油的结果
实施例 实施例1条件1-1 实施例1条件1-2
培养箱的形式，d/D 0.34 0.34
调节培养基A的pH值(灭菌前)培养基C的pH值(灭菌后和种子培养液接种前) 6.36.3 4.56.3
每个级分的重量百分比甘油三酯不可皂化物酯型甾醇 94.0％2.0％0.8％ 94.2％1.8％0.6％
粗制油中总脂肪酸中的花生四烯酸，％ 42.0％ 42.1％
实施例2：花生四烯酸的制备，d/D＝0.42，培养基中大豆粉浓度＝6％
用与实施例1相同的方法进行种子培养。在与实施例1的条件(1-1)相同的条件下进行主要培养，除了培养箱的形式如是：提供分为三个平台的d/D＝0.42的六个桨叶涡轮和制备该培养基的pH条件是变化的。对于条件(2-1)下的培养，培养基A(灭菌之前)调节至pH6.1，和对于培养基C(种子培养溶液接种之前)的pH不进行调节。对于条件(2-2)下的培养，培养基A调节至pH4.5，和培养基C调节至pH6.1。培养结果，培养末期条件(2-1)每升培养液产生的花生四烯酸浓度是19.0g/L，和条件(2-2)是19.7g/L。培养完成后，与实施例1相同方式获得包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的粗制油。分析该粗制油。结果，如表3所示，粗制油的酯型甾醇含量低。
表3：含花生四烯酸的粗制油的结果
实施例 实施例2条件2-1 实施例2条件2-2
培养箱的形式，d/D 0.42 0.42
调节培养基A的pH值(灭菌前)培养基C的pH值(灭菌后和种子培养液接种前) 6.16.1 4.56.1
每个级分的重量百分比甘油三酯不可皂化物酯型甾醇 94.2％1.8％0.6％ 93.5％1.6％0.5％
粗制油中总脂肪酸中的花生四烯酸，％ 42.2％ 41.3％
实施例3：花生四烯酸的制备，d/D＝0.3，0.25和0.2，培养基中大豆 粉的浓度＝6％
用与实施例1相同的方法进行种子培养。在与实施例1的条件(1-1)相同的条件下实施主要培养，除了关于培养箱的形式，使用装备有分为两个平台的d/D＝0.3的六个桨叶涡轮的箱，装备有分为两个平台的d/D＝0.25的六个桨叶涡轮的箱，和装备有分为两个平台的d/D＝0.2的六个桨叶涡轮的箱。培养结果，培养末期，d/D＝0.30的箱每升培养液产生的花生四烯酸浓度是17.0g/L，d/D＝0.25的箱是16.5g/L，和d/D＝0.2的箱是13.5g/L。培养完成后，与实施例1相同方式获得包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的粗制油。分析该粗制油。结果，如表4所示，对于所有情况，粗制油的酯型甾醇含量超过1％。从实施例3的结果与实施例1和2的结果比较看，认为酯型甾醇含量高可归因于d/D比率低的培养箱。
表4：含花生四烯酸的粗制油的实测值
实施例或对照实施例 实施例3对照实施例 实施例3对照实施例 实施例3对照实施例
培养箱的形式，d/D 0.30 0.25 0.20
调节培养基A的pH值(灭菌前)培养基C的pH值(灭菌后和种子培养液接种前) 6.36.3 6.36.3 6.36.3
每个级分的重量百分比甘油三酯不可皂化物酯型甾醇 93.8％2.9％1.2％ 93.1％2.9％1.2％ 93.0％2.9％1.2％
粗制油中总脂肪酸中的花生四烯酸，％ 42.0％ 41.6％ 41.5％
实施例4：花生四烯酸的制备，d/D＝0.3，0.25，和0.2，培养基中 大豆粉的浓度＝6％，低pH灭菌
用与实施例1相同的方法进行种子培养。用与实施例1的条件(1-2)相同的方式实施主要培养中培养基的pH调节(培养基A(pH4.5)→灭菌→培养基C(pH6.3))。其后，在总计三个条件下进行主要培养，即，条件4-1，其中装备有分为两个平台的d/D＝0.3的六个桨叶涡轮的箱，条件4-2，其中装备有分为两个平台的d/D＝0.2 5的六个桨叶涡轮的箱，和条件4-3，其中装备有分为两个平台的d/D＝0.2的六个桨叶涡轮的箱，与实施例1方式相同。除了上述实验，在对于条件4-4，培养基A调节至pH4.0和对于条件4-5调节至pH4.9的这样另外的两个条件下使用d/D＝0.3的箱进行培养。
主要培养的结果是，对于条件(4-1)[在pH4.5灭菌，d/D＝0.30]，培养末期每升培养液产生的花生四烯酸浓度是17.2g/L，对于条件(4-2)[在pH4.5灭菌，d/D＝0.25]是16.8g/L，对于条件(4-3)[在pH4.5灭菌，d/D＝0.20]是14.0g/L，对于条件(4-4)[在pH4.0灭菌，d/D＝0.30]是17.1g/L，和对于条件(4-5)[在pH4.9灭菌，d/D＝0.30]是17.2g/L。培养完成后，重复实施例1的步骤得到包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的粗制油。
表5显示了粗制油的分析结果。实施例3与实施例4的结果比较表明，在d/D＝0.30的培养箱中，在pH4.5对培养基的氮源进行灭菌可以降低酯型甾醇含量至不超过1％。然而在d/D＝0.25和d/D＝0.20的培养箱中，尽管在pH4.5对培养基的氮源进行灭菌，但是酯型甾醇含量不能降至不超过1％。此外，条件(4-1)，(4-4)和(4-5)的结果比较表明，在pH4.0至4.9的范围内对氮源进行灭菌可提供相等的酯型甾醇降低结果。
表5：含花生四烯酸的粗制油的实测值
实施例或对照实施例 实施例4条件4-1 实施例4条件4-2(对照实施例) 实施例4条件4-3(对照实施例) 实施例4条件4-4 实施例4条件4-5
培养箱的形式，d/D 0.30 0.25 0.20 0.30 0.30
调节培养基A的pH值(灭菌前)培养基C的pH值(灭菌后和种子培养液接种前) 4.56.3 4.56.3 4.56.3 4.06.3 4.96.3
每个级分的重量百分比甘油三酯不可皂化物酯型甾醇 93.8％2.2％1.0％ 93.1％2.5％1.1％ 93.0％2.7％1.1％ 93.5％2.1％1.0％ 93.4％2.1％1.0％
粗制油中总脂肪酸中的花生四烯酸，％ 42.0％ 40.8％ 40.8％ 41.5％ 41.7％
实施例5：精炼粗制油提供的精炼脂肪或油的分析结果
用常规脱氧和脱胶方法精炼实施例1中条件(1-1)和实施例2中条件(2-1)制备的含花生四烯酸的粗制油得到精炼脂肪或油5-A和5-B。用如刚才上面描述的同样方法精炼实施例3中在条件d/D＝0.25下制备的含有花生四烯酸的粗制油得到精炼脂肪或油5-C。表6显示了含有花生四烯酸的精炼脂肪或油的实测值。
表6：实施例5的分析结果(含有花生四烯酸的精炼脂肪或油A、B和C的实测值)
实施例或对照实施例 实施例1(条件1-1) 实施例2(条件2-1) 实施例3(d/D＝0.25)(对照实施例)
精炼脂肪或油 5-A 5-B 5-C
每个级分的重量百分比甘油三酯不可皂化物酯型甾醇 96.0％1.4％0.8％ 96.4％1.2％0.6％ 95.0％2.0％1.2％
粗制油中总脂肪酸中的花生四烯酸，％ 42.4％ 42.8％ 41.7％
实施例6：在1.5％大豆粉的条件下生产花生四烯酸
提供高山被孢霉(CBS 754.68)，用与实施例1相同的方法进行种子培养(第一阶段和第二阶段)。接下来，在121℃条件下对4500L培养基(培养基A：大豆粉84kg，KH2PO4 16.8kg，MgCl2·6H2O 2.8kg，CaCl2·2H2O 2.8kg，豆油5.6kg)进行灭菌20分钟。在140℃条件下对1000L培养基(培养基B：一水合葡萄糖112kg)灭菌40秒并将该灭菌培养基添加至上述培养基A制备成另一培养基-培养基C。
培养基C调节至pH6.1。然后种子培养(第二阶段)溶液接种到由此制备的培养基中，并将体积调节至总计5600L的培养液初始量(培养箱的体积：10kL)。在温度26℃，气流速率49Nm3/小时和内部压力200kPa的条件下开始主要培养。在主要培养箱进行主要培养，即，装备着分为两个平台的六个桨叶涡轮，d/D(搅拌叶轮直径(＝d)与该箱内径(＝D)的比率)＝0.34的培养箱和装备有分为两个平台的六个桨叶涡轮，d/D＝0.25的培养箱。当培养基补料如表7所示时，主要培养进行162小时。培养末期，d/D＝0.34的箱，每升培养液产生的花生四烯酸浓度是5.0g/L，和d/D＝0.25的箱是4.7g/L。
表7：实施例6中的培养基补料
主要培养时间 培养基补料
19小时后 一水合葡萄糖84kg/200L
43小时后 一水合葡萄糖84kg/200L
67小时后 一水合葡萄糖56kg/120L
91小时后 一水合葡萄糖56kg/125L
培养完成后，以与实施例1相同的方法，收集干燥细胞，随后用己烷提取得到包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的粗制油。表8显示了粗制油的实测值。当培养基中氮源浓度是1.5％时，对于d/D＝0.25和d/D＝0.34来说，粗制油的酯型甾醇含量都不超过1％。
表8：实施例6的结果(含有花生四烯酸的粗制油的实测值)
培养箱的形式，d/D 0.25 0.34
每个级分的重量百分比甘油三酯不可皂化物酯型甾醇 94.1％1.2％0.4％ 93.0％1.2％0.4％
粗制油中总脂肪酸中的花生四烯酸，％ 40.8％ 41.5％
实施例7：二高-γ-亚麻酸的制备；d/D＝0.30，0.34和0.25，培养 基中大豆粉浓度4％和pH4.5对氮源进行灭菌的影响
本发明人建立了包含二高-γ-亚麻酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)的制备方法。通过培养具有产生花生四烯酸能力和Δ5不饱和活性降低的微生物可以产生脂肪或油，例如，根据日本未审查专利公开号(Kokai)5(1993)-91887中所述制备方法中的突变株高山被孢霉SAM 1860菌株(FERM P-3589)。
提供高山被孢霉(SAM 1860)作为产生二高-γ-亚麻酸的真菌。高山被孢霉的标准菌株接种到500mL Erlenmeyer营养瓶中的100mL培养基(1％酵母抽提物，2％葡萄糖，pH6.3)中。在100rpm往复摇动和温度28℃条件下开始种子培养(第一阶段)，种子培养延续3天。接下来，在50L-体积通风搅拌培养箱中制备30L培养基(1％酵母抽提物，2％葡萄糖，0.1％豆油，pH6.3)。种子培养(第一阶段)溶液接种到该培养基。在200rpm搅动速度，温度28℃，和150kPa箱内部压力条件下开始种子培养(第二阶段)，种子培养延续2天。在条件(7-1)至(7-4)的四个水平条件下进行主要培养。
对于条件(7-1)，添加氢氧化钠水溶液将4500L培养基(培养基A：大豆粉224kg，KH2PO4 16.8kg，MgCl2·6H2O 2.8kg，CaCl2·2H2O 2.8kg，豆油5.6kg)调节至pH6.1，然后在121℃条件下对培养基灭菌20分钟。在140℃条件下对1000L培养基(培养基B：一水合葡萄糖112kg)灭菌40秒并将该灭菌培养基添加至上述培养基A制备成另一培养基-培养基C。测定培养基C的pH，发现pH是6.1。然后种子培养(第二阶段)溶液接种到培养基C中，并将体积调节至总计5600L的培养液初始量(培养箱的体积：10kL)。在温度26℃，气流速率49Nm3/小时和内部压力200kPa的条件下开始培养。
培养箱的形式如是，提供分为两个平台的的六个桨叶的涡轮，搅拌叶轮直径(＝d)与该箱内径(＝D)的比率是d/D＝0.34。用防沫探测器检测培养过程中的泡沫，自动添加豆油以预防培养液在起泡沫时离开箱。当培养基补料如表9所示时，主要培养进行288小时。在培养末期，由于培养基补料造成溶液量增加和溶液蒸发造成溶液量减少的影响，培养液的量是7,600L。
对于条件(7-2)，以与条件(7-1)相同方法进行主要培养，除了非无菌添加硫酸将培养基A调节至pH4.5，无菌添加氢氧化钠水溶液将培养基C调节至pH6.1，和使用d/D＝0.3的培养箱。对于条件(7-3)，以与条件(7-1)相同方法进行培养，除了使用d/D＝0.30的培养箱。对于条件(7-4)，以与条件(7-1)相同方法进行培养，除了使用d/D＝0.25的培养箱。培养末期，条件(7-1)和条件(7-2)每升培养液产生的花生四烯酸浓度都是12.3g/L，条件(7-3)是11.0g/L，和条件(7-4)是10.0g/L。
表9：实施例7中的培养基补料
  主要培养时间   培养基补料
  19小时后   一水合葡萄糖280kg/460L
  43小时后   一水合葡萄糖280kg/450L
  67小时后   一水合葡萄糖280kg/450L
  120小时后   一水合葡萄糖336kg/530L
培养完成后，在120℃条件下对培养液灭菌20分钟。然后用连续脱水器收集湿细胞。在振动流化床干燥器中将收集的湿细胞干燥至按重量计算1％的含水率。航空运输机器将干燥细胞运输至装料平台，并且连同氮气，填入体积大约1m3的铝袋容器袋。热封袋子的收口部分，然后容器袋保存在10℃或以下的冰箱。
从容器袋中取出干燥细胞并用己烷提取。通过过滤从己烷溶液中除掉固体物质。然后在降低压力下加热滤液以除去己烷得到包含二高-γ-亚麻酸作为成分脂肪酸的粗制油。分析该粗制油，表10显示了分析结果。对于d/D＝0.34的培养箱，粗制油的酯型甾醇含量不超过1％。对于d/D＝0.3的培养箱，在条件(7-3)下常规方法调节pH提供了酯型甾醇含量高的粗制油。在条件(7-2)pH4.5对培养基氮源进行灭菌使酯型甾醇含量降至不超过1％。对于d/D＝0.25的培养箱，酯型甾醇含量超过了1％。
表10：含二高-γ-亚麻酸的粗制油的实测值
  实施例或对照实施例   实施例7条件7-1   实施例7条件7-2   实施例7条件7-3(对照实施例)   实施例7条件7-4(对照实施例)
  培养箱的形式，d/D   0.34   0.30   0.30   0.25
  调节培养基A的pH值(灭菌前)培养基C的pH值(灭菌后和种子培养液接种前)   6.16.1   4.56.1   6.16.1   6.16.1
每个级分的重量百分比甘油三酯不可皂化物酯型甾醇 93.8％2.1％0.9％ 94.1％2.2％1.0％ 93.5％2.9％1.2％ 93.0％2.9％1.2％
  粗制油中总脂肪酸中的二高-γ-亚麻酸，％   42.2％   41.9％   40.7％   41.7％
实施例8：二高-γ-亚麻酸的制备：在1.5％大豆粉浓度下培养
提供高山被孢霉(SAM 1860)，以与实施例7相同方法进行种子培养。接下来，在121℃条件下对4500L培养基(培养基A：大豆粉84kg，KH2PO4 16.8kg，MgCl2·6H2O 2.8kg，CaCl2·2H2O 2.8kg，豆油5.6kg)进行灭菌20分钟。在140℃条件下对1000L培养基(培养基B：一水合葡萄糖112kg)灭菌40秒并将该灭菌培养基添加至上述培养基A制备成另一培养基-培养基C。培养基C调节至pH6.1，然后种子培养(第二阶段)溶液接种到培养基C中，并将体积调节至总计5600L的培养液初始量(培养箱的体积：10kL)。
在温度26℃，气流速率49Nm3/小时和内部压力200kPa的条件下开始培养。关于培养箱的形式，使用装备有分为两个平台的六个桨叶涡轮的培养箱，d/D(搅拌叶轮直径(＝d)与该箱内径(＝D)的比率)＝0.34和装备有分为两个平台的d/D＝0.25的六个桨叶涡轮的培养箱。用防沫探测器检测培养过程中的泡沫，自动添加豆油以预防培养液在起泡沫时离开箱。当培养基补料如表11所示时，主要培养进行162小时。培养末期，对于d/D＝0.34的箱，每升培养液产生的二高-γ-亚麻酸浓度是4.8g/L，和d/D＝0.25的箱是4.7g/L。
表11：实施例8中的培养基补料
  主要培养时间   培养基补料
  19小时后   一水合葡萄糖84kg/200L
  43小时后   一水合葡萄糖84kg/200L
  67小时后   一水合葡萄糖84kg/120L
  91小时后   一水合葡萄糖84kg/125L
培养完成后，以与实施例7相同的方法，收集干燥细胞，随后用己烷提取得到包含二高-γ-亚麻酸作为成分脂肪酸的粗制油。分析该粗制油，表12显示了粗制油的实测值。
表12：实施例8的结果(含有二高-γ-亚麻酸的粗制油的实测值)
  培养箱的形式，d/D   0.25   0.34
  每个级分的重量百分比甘油三酯不可皂化物酯型甾醇 93.5％1.2％0.4％ 93.0％1.2％0.4％
  粗制油中总脂肪酸中的二高-γ-亚麻酸，％   40.5％   41.3％
实施例9：Mead acid的制备；d/D＝0.5，培养基中大豆粉的浓度4％
本发明人建立了包含ω9高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)的制备方法。通过培养具有产生ω9高不饱和脂肪酸能力的微生物可以制备脂肪或油，例如，根据日本未审查专利公开号(Kokai)5(1993)-91888中所述制备方法中的突变株高山被孢霉(SAM1861)菌株(FERM P-3590)。
本发明人也建立了包含Mead acid作为成分脂肪酸的脂肪或油(甘油三酯)的制备方法。这种脂肪或油是通过能够产生花生四烯酸的微生物进行根据日本未审查专利公开号(Kokai)10(1998)-57085所述方法的突变处理制备的。通过培养Δ12脱氢酶降低或缺失并且Δ5去饱和活性、Δ6去饱和活性和/或链延伸活性中至少一个活性提高的突变株可以制备该脂肪或油，例如，高山被孢霉SAM 2086菌株(FERMP-15766)。
提供高山被孢霉(SAM 2086)作为产生Mead acid的真菌。高山被孢霉的标准菌株接种到2000mL Erlenmeyer烧瓶中500mL培养基(1％酵母抽提物，2％葡萄糖，pH6.3)中。在100rpm往复摇动和温度28℃条件下开始种子培养(第一阶段)，种子培养延续3天。接下来，在50L体积通风搅拌培养箱中制备30L培养基(1％酵母抽提物，2％葡萄糖，0.1％橄榄油，pH6.3)。种子培养(第一阶段)溶液接种到该培养基。在300rpm搅动速度，温度28℃，和200kPa箱内部压力条件下开始种子培养(第二阶段)，种子培养延续2天。接下来，在121℃对3200L的培养基(培养基A：大豆粉160kg，橄榄油4kg)进行灭菌20分钟。
在140℃条件下对700L培养基(培养基B：一水合葡萄糖80kg)灭菌90秒并将该灭菌培养基添加至上述培养基A制备成另一培养基-培养基C。培养基C调节至pH6.1，然后种子培养(第二阶段)溶液接种到培养基C中，并将体积调节至总计4000L的培养液初始量(培养箱的体积：10kL)。在温度24℃，气流速率49Nm3/小时，内部压力200kPa和搅动需要功率2kW的条件下开始主要培养。在培养的第4天，温度转变为20℃。关于培养箱的形式，使用装备有分为两个平台的六个桨叶涡轮的培养箱，d/D(搅拌叶轮直径(＝d)与该箱内径(＝D)的比率)＝0.5。当培养基补料如表13所示时，主要培养进行456小时。培养末期，每升培养液产生的Mead acid浓度是10.1g/L。
表13：实施例9中的培养基补料
  主要培养时间   培养基补料
  19小时后   一水合葡萄糖160kg/280L
  43小时后   一水合葡萄糖160kg/280L
  67小时后   一水合葡萄糖120kg/210L
  91小时后   一水合葡萄糖120kg/210L
  144小时后   一水合葡萄糖80kg/140L
培养完成后，在120℃条件下对培养液灭菌20分钟。然后用连续脱水器收集湿细胞。在振动流化床干燥器中将收集的湿细胞干燥至按重量计算1％的含水率。用航空运输机器将干燥细胞连同氮气装入一个填充型容器袋。热封该袋的收口部分，然后容器袋保存在10℃或以下的冰箱。
从容器袋中取出干燥细胞并用己烷提取。通过过滤从己烷溶液中除掉固体物质。然后在降低压力下加热滤液以除去己烷得到包含Meadacid作为成分脂肪酸的粗制油。分析该粗制油，表14显示了分析结果。
实施例10：Mead acid的制备，d/D＝0.25，培养基中大豆粉的浓度＝4％
与实施例9相同的方法进行种子培养。在与实施例9相同条件下进行主要培养，除了关于培养箱的形式，使用装备有分为两个平台的d/D＝0.25的六个桨叶涡轮的培养箱。结果，在培养末期，每升培养液产生的Mead acid浓度是8.0/L。培养完成后，与实施例9相同方式获得包含Mead acid作为成分脂肪酸的粗制油。
分析含有Mead acid的粗制油，表14显示了粗制油的实测值。
表14：含有Mead acid的粗制油的实测值
  实施例或对照实施例   实施例9   实施例10(对照实施例)
  培养箱的形式，d/D   0.5   0.25
  每个级分的重量百分比甘油三酯不可皂化物酯型甾醇 94.6％1.8％0.6％ 93.0％2.8％1.2％
  粗制油中总脂肪酸中的Mead acid，％   35.0％   30.6％
实施例11：Mead acid的制备，在大豆粉浓度＝1.5％的条件下培养
提供高山被孢霉(SAM 2086)，以与实施例9相同方法进行种子培养。接下来，在121℃条件下对3200L培养基(培养基A：大豆粉60kg，橄榄油4kg)进行灭菌20分钟。在140℃条件下对700L培养基(培养基B：一水合葡萄糖80kg)灭菌90秒并将该灭菌培养基添加至上述培养基A制备成另一培养基-培养基C。培养基C调节至pH6.1，然后种子培养溶液接种到培养基C中，并将体积调节至总计4000L的培养液初始量(培养箱的体积：10kL)。在温度24℃，气流速率49Nm3/小时，内部压力200kPa和搅动需要功率2kW的条件下开始主要培养。
在培养的第4天，温度转变为20℃。关于培养箱的形式，使用装备有分为两个平台的六个桨叶涡轮的培养箱，d/D(搅拌叶轮直径(＝d)与该箱内径(＝D)的比率)＝0.34和装备有分为两个平台的d/D＝0.25的六个桨叶涡轮的培养箱。当培养基补料如表15所示时，主要培养进行300小时。培养末期，d/D＝0.34的箱，每升培养液产生的Mead acid浓度是3.9g/L，和d/D＝0.25的箱是3.8g/L。
表15：实施例11中的培养基补料
  主要培养时间   培养基补料
  19小时后   一水合葡萄糖60kg/120L
  43小时后   一水合葡萄糖60kg/120L
  67小时后   一水合葡萄糖40kg/80L
  91小时后   一水合葡萄糖40kg/80L
培养完成后，以与实施例9相同的方法，收集干燥细胞，随后用己烷提取得到包含Mead acid作为成分脂肪酸的粗制油。分析该粗制油，表16显示了粗制油的实测值。
表16：实施例11的结果(含有Mead acid的粗制油的实测值)
  培养箱的形式，d/D   0.25   0.34
  每个级分的重量百分比甘油三酯不可皂化物酯型甾醇 95.0％1.3％0.5％ 95.1％1.3％0.5％
  粗制油中总脂肪酸中的Mead acid，％   34.5％   34.2％
实施例12：混合有包含花生四烯酸作为成分脂肪酸并且酯型甾醇含量 降低的精炼脂肪或油(甘油三酯)的胶囊制备
在按重量计100份的明胶和35份的甘油中添加水，化合物加热至50至60℃至溶解而制备明胶膜(film)。接下来，提供实施例5中制备的酯型甾醇含量降低并且包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的精炼脂肪或油5-A(甘油三酯)与0.05％维生素E油的混合物作为胶囊的内容物。用常规方法实施胶囊形成和干燥以制备每个胶囊含有180mg内容物的软胶囊。也使用实施例5制备的精炼脂肪或油5-B作为原料，以与使用精炼脂肪或油5-A制备胶囊相同的方法制备软胶囊。
实施例13：在脂肪输注制剂(fatty transfusion preparation)中 的应用
400g实施例5中制备的酯型甾醇含量降低并且包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的精炼脂肪或油5-A(甘油三酯)，48g精炼蛋黄卵磷脂，20g油酸，100g甘油和40ml 0.1N苛性苏打添加并在匀浆器中分散。然后注射用蒸馏水添加到该分散液中以产生4升体积的分散液，随后用高压雾化乳化机乳化以制备脂质乳剂。200ml等分的脂质乳剂分装入塑料袋中，接着在121℃进行高压蒸气灭菌20分钟以制备脂肪的输注制剂。此外，使用实施例5制备的精炼脂肪或油5-B作为原料，以与使用精炼脂肪或油5-A制备脂肪输注制剂相同的方法制备脂肪输注制剂。
实施例14：在汁中的应用
2g β-环糊精添加至20ml 20％乙醇水溶液中。用搅拌器搅拌下向其中添加100mg实施例5制备的酯型甾醇含量降低并且包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的精炼脂肪或油5-A(甘油三酯)(与0.05％维生素E混合)，混合物在50℃孵育2小时。冷却至室温(大约一个小时)后，混合物在4℃搅拌孵育另外10小时。
离心收集生成的沉淀，正己烷洗涤，然后冻干得到1.8g含有花生四烯酸的甘油三酯的环糊精包含化合物。1g这种粉末均匀混合到10L汁中而制备含有酯型甾醇含量降低并且包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的精炼脂肪或油(甘油三酯)的汁。也使用实施例5制备的精炼脂肪或油5-B作为原料，以与使用精炼脂肪或油5-A制备汁相同的方法制备汁。
实施例15：在奶粉中的应用
0.3g实施例5制备的酯型甾醇含量降低并且包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的精炼脂肪或油5-A(甘油三酯)混入100g奶粉中以制备配方粉剂。此外，也使用实施例5制备的精炼脂肪或油5-B作为原料，以与使用精炼脂肪或油5-A制备配方粉剂相同的方法制备配方粉剂。
实施例16：使用各种菌株的培养方法
长形被孢霉(IFO 8570)，喜湿被孢霉(IFO 5941)，横断刺孢囊霉(Echinosporangium transversale)(NRRL 3116)，Conidiobolusnanodes(CBS 154.56)和Saprolegnia lapponica(CBS 284.38)用作产生花生四烯酸的真菌。这些产生花生四烯酸的真菌标准菌株接种入培养基(酵母抽提物1％，葡萄糖2％，pH6.3)，在100rpm往复摇动和温度28℃条件下进行3天种子培养。
接下来，在50L体积通风搅拌培养箱中制备25L培养基(葡萄糖500g，大豆粉775g，KH2PO4 50g，MgCl2·6H2O 7.5g，CaCl2·2H2O7.5g和豆油25g，pH6.3)。种子培养溶液接种入该培养基，在200rpm搅动速度，温度28℃，和150kPa箱内部压力条件下开始主要培养。关于培养箱的形式，使用装备有分为两个平台，d/D＝0.42的六个桨叶涡轮的培养箱。培养186小时，同时以大约24小时的间隔添加50％葡萄糖溶液以便使葡萄糖浓度达到大约1至2％。
培养完成后，在120℃条件下对培养液灭菌20分钟。在降低的压力下过滤将收集湿细胞并干燥至按重量计算1％的含水率。己烷提取干燥细胞。通过过滤从己烷溶液中除掉固体物质。然后在降低的压力下加热滤液以除去己烷得到包含花生四烯酸作为成分脂肪酸的粗制油。分析含有花生四烯酸的粗制油。表17显示了粗制油的实测值。
表17：实施例16的结果(含有花生四烯酸的粗制油的实测值)
  菌株   长形被孢霉IFO 8570   喜湿被孢霉IFO 5941   横断刺孢囊霉NRRL 3116   C.nanodesCBS 154.56   S.lapponicaCBS 284.38
  每个级分的重量百分比甘油三酯不可皂化物酯型甾醇 90.0％1.9％0.8％ 88.1％1.9％0.7％ 86.0％2.0％0.7％ 83.4％2.0％0.8％ 82.6％2.0％0.8％
  粗制油中总脂肪酸中的花生四烯酸，％   30.8％   31.7％   28.6％   26.3％   20.7％

Claims (22)

1.种制备不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的粗制油的方法，其特征在于在培养箱内在含有2-15％氮源浓度的培养基中培养能够产生包含不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油的微生物，所述培养箱内装备着搅拌叶轮，满足搅拌叶轮的直径(＝d)与培养箱内径(＝D)的比率是d/D＝0.30至0.6的要求。
2.根据权利要求1的方法，其中搅拌叶轮的直径(＝d)与培养箱内径(＝D)的比率是d/D＝0.34至0.6。
3.根据权利要求1或2的方法，其中氮源含有已经在不超过5的pH下进行灭菌的氮源。
4.一种制备精炼脂肪或油的方法，其特征在于包括精炼根据权利要求1至3任一项的方法产生的粗制油。
5.根据权利要求1至3任一项的制备包含不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低的高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的粗制油的方法，或根据权利要求4的制备精炼脂肪或油的方法，其特征在于包含所述高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油的至少70％是甘油三酯。
6.根据权利要求1至5任一项的方法，其中组成脂肪或油的高不饱和脂肪酸是γ-亚麻酸(18∶3ω6)，二高-γ-亚麻酸(20∶3ω6)，花生四烯酸(20∶4ω6)，7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22∶4ω6)，4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22∶5ω6)，α-亚麻酸(18∶3ω3)，6，9，12，15-十八碳四烯酸(18∶4ω3)，8，11，14，17-二十碳四烯酸(20∶4ω3)，二十碳五烯酸(20∶5ω3)，7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22∶5ω3)，4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22∶6ω3)，6，9-十八碳二烯酸(18∶2ω9)，8，11-二十碳二烯酸20∶2ω9)或5，8，11-二十碳三烯酸(Mead acid：20∶3ω9)或它们中的两种或多种的组合。
7.根据权利要求1至6任一项的方法，其中微生物是属于被孢霉属(Mortierella)，耳霉属(Conidiobolus)，腐霉属(Pythium)，疫霉(Phytophthora)，青霉属(Penicillium)，枝孢属(Cladosporium)，毛霉菌属(Mucor)，镰刀菌属(Fusarium)，曲霉属(Aspergillus)，红酵母属(Rhodotorula)，虫霉属(Entomophthora)，刺孢囊霉属(Echinosporangium)或水霉属(Saprolegnia)的微生物。
8.根据权利要求1至7任一项的方法，其中所述微生物是属于被孢霉属、被孢霉属亚属的微生物。
9.根据权利要求8的方法，其中属于被孢霉属亚属的微生物是属于被孢霉属的高山被孢霉(alpina)种的微生物。
10.一种用根据权利要求1至9任一项的方法制备的其特征是不可皂化物含量按重量计算不超过2.2％的粗制油。
11.精炼根据权利要求10的粗制油而产生的精炼脂肪或油。
12.一种用根据权利要求1至9任一项的方法制备的其特征是酯型甾醇含量按重量计算不超过1.0％的粗制油。
13.精炼根据权利要求12的粗制油而产生的精炼脂肪或油。
14.一种包含不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油的粗制油，其特征在于脂肪或油的不可皂化物含量按重量计算不超过2.2％。
15.精炼根据权利要求14的粗制油而产生的精炼脂肪或油。
16.一种包含不可皂化物含量和/或酯型甾醇含量降低并且包含高不饱和脂肪酸作为成分脂肪酸的脂肪或油的粗制油，其特征在于脂肪或油的酯型甾醇含量按重量计算不超过1.0％。
17.精炼根据权利要求16的粗制油而产生的精炼脂肪或油。
18.普通食品和饮料、功能食品、营养补充物、早产儿的配制品、足月婴儿的配制品、婴儿食品、预产和哺乳母亲的食品或老年人食品，包含掺入其中的根据权利要求10至17任一项的粗制油和/或精炼脂肪或油。
19.一种治疗性营养食品，包含掺入其中的根据权利要求10至17任一项的粗制油和/或精炼脂肪或油，任选连同适于口服、直肠内或肠胃外给药的中性载体。
20.一种给予动物或鱼的食品，包含掺入其中的根据权利要求10至17任一项的粗制油和/或精炼脂肪或油。
21.一种药物组合物，包含掺入其中的根据权利要求10至17任一项的粗制油和/或精炼脂肪或油。
22.一种使用根据权利要求10至17任一项的粗制油和/或精炼脂肪或油作为原料而制备的药物组合物。
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