TWI352122B - A crude oil, a refined oil, and a general food and - Google Patents

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六、發明說明： 【明戶斤屬々貝 發明領域 本發明係關於一種具有經降低之非可皂化物質含量及 /或酯型固醇含量且包含高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪 酸之未加工油，一種製造精煉油脂之方法，以及該油脂（未 加工油或精煉油脂）以及摻混油脂（未加工油或精煉油脂）之 食品及飲料、治療性營養食品、動物飼料及醫藥製劑。本 發明中「非可皂化物質」以及「酯型固醇J表示由微生物 萃取而得之物質。因此於本發明述及「非可皂化物質」及 「酯型固醇」排除任何於萃取後添加至未加工油之非可皂 化物質及酯型固醇。 L先前技術J 發明背景 有關人類高度不飽和脂肪酸(後文稱作為「PUFA」）之 生物合成，有兩大系列包括ω3及ω6系列。ω(亞米茄）表示由 脂肪酸端末甲基至第一個雙鍵所在碳原子之碳原子數目。 例如以ω6系列為例，亞油酸（18:2 ω6)重複接受不飽和化以 及碳鏈長度延長，結果被轉成Y-亞麻酸（18:3 ω6)、二同-γ-亞麻酸(20:3 ω6)、花生四烯酸(2〇:4 ω6)及4,7，10，13，16-廿二 碳五烯酸(22:5 ω6)。 同理於ω3系列之情況下，α-亞麻酸（18:3 ω3)重複接受 不飽和化及碳鏈長度延長，結果被轉成廿碳五烯酸(2〇:5 〇3)、7,1〇，13，16，19-廿二竣五烯酸（22:5(〇3)及4,7，10，13,16, 1352122 19-廿二碳六烯酸(22:6ω3)。作為®3系列PUFAs之廿碳五烯 酸（後文稱之為「EPA」）以及廿二碳六烯酸（後文稱之為 「DHA」）為已知具有多項生理功能，特別為生活方式疾病 (如動脈硬化及血栓)之預防功效，癌症抑制功效及學習能力 提升作用；多方面嘗試應用此等PUFAs至醫藥製劑以及特 定健康食品。但近年來的注意力也轉移到ω3以外之 PUFAs((d6及ω9系列）之生理功能。

約10%組成主要器官（如如液及肝臟）之脂肪酸為花生 四烯酸。例如人類jk液之填脂質之脂肪酸具有組成，包含 11%花生四稀酸，1%廿碳五烯酸及3%廿二碳六稀酸。花生 四烯酸作為細胞膜之主要組成分’花生四稀酸涉及膜的流 動調節’於身體代謝作用有各項功能，進一步作為前列腺 素之直接前驅物扮演重要角色。 特別’近年來注意到花生四烯酸作為嬰兒營養品以及 作為内生性類大麻酚(2-花生四烯醯基一甘油、阿南達麥 (anandamide))之組成脂肪酸具有神經活化作用。通常告食

用亞油酸含量豐富食物時，亞油酸被轉成花生四稀酸。、 文於 患有生活方式疾病以及屬於生活方式疾病風險族群病人 嬰兒及老人，該項生物合成牵涉的酵素活性降低。因此 花生四烯酸的濃度可能不足。因此理由故需要直接攝取_ 生四烯酸作為油脂（三酸甘油酯之成分脂肪酸）。 魚油可作為 對於EPA及DHA用作為ω3系列之PUFAs， 豐富供應源。另一方面’ ω6系列之PUFAs例如亞麻酸、-同-γ-亞麻酸、花生四烯酸及4,7，10，13，16-廿二碳五稀酸(225 4 1352122- - ω6)幾乎無法由習知油脂供應源獲得；目前一般使用包含微 • 生物發酵製造之pU FA s作為成分脂肪酸之油脂（三酸甘油 酯）。例如曾經提出一種方法，其中包含花生四烯酸作為成 分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）係經由培養多種微生物而製 造，該等微生物可製造包含花生四烯酸作為成分脂肪酸之 » 油脂（三酸甘油酯）。 其中經由使用屬於被孢霉屬（genus Mortierella)之特定 微生物製造含高花生四烯酸含量之油脂（三酸甘油酯）為已 籲 知（日本專利公開案第63(1988)-44891及63(1988)-12290 號）。基於多項試驗結果，據稱此等油脂為安全。但因此等 油脂係衍生自微生物，因此於食用上不滿意。目前該種油 脂尚未滿意地為社會所普遍接受。另一方面，包含發酵製 造之花生四烯酸作為成分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）開始 用於應使用花生四烯酸的領域，例如用於嬰兒營養領域且 特別用於嬰兒配方。 φ 由天然產品（例如動物及植物）製造的油脂接受精煉處 理，例如脫膠、去氧化、脫臭、脫色、分子蒸德及冬化， 隨後上市作為食用油脂。例如由產油植物壓榨所得之油脂 • 含有大量雜質，無法就此用作為食用油脂。只有芝麻油及 • 撖欖油除外其可直接食用，否則此等油脂通常於用作為食 用油之前先經過精煉。 例如於脫膠處理，含於未經精煉油之磷脂質、碳水化 合物、樹脂類、蛋白質化合物、微量金屬及著色物質被去 除。於去氧化(鹼精煉)處理，脂肪酸、著色物質、磷脂質、 5 微量金屬、硫化合物、油不溶物及氧化產物被去除。於脫 色處理，著色物質、膠狀物質、微量金屬、皂成分、氧化 產物及磷脂質被去除。於脫臭處理，脂肪酸類、一酸甘油 酯類、二酸甘油酯類、搭類、醇類、酮類、烴類、著色物 質、硫化合物、過氧化物、氧化分解產物及其它有氣味物 質皆被去除。 油脂含有可溶於油且較不可能以鹼分解之有機化合 物，稱做「非可皂化物質」。例如，已知高碳醇類、固醇類、 烴類、生育酚類'及類胡蘿蔔素等化合物為非可皂化物質 之組成成分。於油脂精練過程，非可皂化物質含量可被降 低，但無法完全被去除。固醇已知存在於微生物製造之油 脂作為非可皂化物質之主要成分。 存在於油脂之固醇被分成自由態型及酯型。於精煉過 程中，自由態型可被去除，但另一方面，酯型固醇幾乎無 法被去除。例如經脫膠、去氧化、脫色及脫臭處理後，大 豆油之固醇含量（毫克/克)對自由態型而言分別為3 4、3 〇、 2.0及1.6 ’而對酯型而言分別為〇 6、〇 6、〇 6及〇 6(「食用 油脂科學」’ 20-21頁，幸書房）。 因無法去除之固醇類等被包含作為非可皂化物質之— 部分，故通常非可皂化物質含量廣泛被用作為精煉油脂之 品質指標、或作為精煉過程之品管指標。舉例言之，根據 日本農業標準，例如於食用紅花籽油、食用大豆油及食用 栋櫚油之非可4化物f含量不可高於1G%(日本農林漁牧 部第523说公告（觸年3月31日））。嬰兒需要膽固醇，膽固 1352-122., 醇含畺增TBJ的嬰兒配方已經問世。植物衍生之固醇類含於 植物丨生β用油脂。植物衍生之固醇的存在會不利地抑制嬰 兒對膽固醇的吸收（「食品加工及成分」，第33卷，第2期， 42-45頁（1998年)）。因此，當考慮食用油脂換混於嬰兒配方 用途時，強力需要含低固醇含量，換言之，具有低非可皂 化物質含量之食用油脂。 經由培養屬於被孢霉屬之微生物製造的油脂之主要部 分為三酸甘油酯（不低於約70%重量比）及磷脂質，含有非可 皂化物貝作為其它成分。非可皁化物質包含固醇類(如鍵固 醇)及固醇S旨類作為主要成分。食用油脂係呈三酸甘油醋形 式其中已經去除碟脂質之精煉油脂可如下提供，將經由 培養微生物製造之原先油脂(經由細胞萃取所得之油脂，稱 作為「未加工油」)接受食用油脂之精煉處理(脫膠、去氧化、 脫六及脫色）。但難以藉精煉處理完全去除非可皂化物質。 由於儿全去除非可皂化物質困難，以及廣泛需要有含 有低非可皂化物質之食用油脂，從事研究如何去除非可皂 化物質。結紐展㈣管柱層析術精煉之枝（日本專利公 開案第10(1998)-191886號）。但此種技術未對非可皂化物質 之組成成分做詳細研究。精煉後之非可皂化物質成分與精 煉前之成分變化，換言之，藉精煉去除之成分f訊仍然未 知。 經由培養被孢霉屬微生物製造之油脂係積聚於菌絲 體。因此由製造含高度不飽和脂肪酸油脂之成本效益改進 觀點視之，因培養而獲得較高細胞濃度。為了提供高細胞 7 1352122 濃度，培養基中可轉成細胞成分之氣源濃度係提高。根據 * 先前報告（日本專利公開案第10(1998)-191886及 10(1998)-70992號），雖然報告非可皂化物質含量或總固醇 含量，但微生物培養使用之培養基之氮源濃度至多約為 1.5%。

A 此外，曾經報告含固醇含量不超過1%之含高度不飽和 脂肪酸之油脂（PCT公告案第2000-510513號之日文公告譯 本）。但此種情況下，用於此種製造之培養基之氮源濃度 低，於使用高山莫拉氏菌（Mortierella alpina)製造含花生四 · 烯酸之油脂時’培養係於1%(=酵母萃取物〇5%+硝酸鈉 0.5%)之低氮源濃度進行(PCT公告案第2000-508888號之公 告曰文譯本）。如此由於極端需要具有低非可皂化物質含量 及固醇含$之食用油脂，從事降低非可息化物質及/或固醇 之相關研究。但未曾敘述有關由高濃度微生物培養製造之 微生物油脂所含非可皂化物質或固醇。 如前文說明，作為非可皂化物質主要成分之固醇被分 成自由’4型畴及s旨型m醇。自由態型固醇可藉精煉過程 # 去除，而醋型固醇幾乎無法藉精煉過程去除。因此為了提 供具有低非可皂化㈣含量特職固醇含量之精煉油脂， ， 考慮相當重要地必需發展一種具有低含量自旨型固醇，其無 法毫無困難地藉精煉處理去除之供精煉用原料，換言之， ' 發展一種具有低酯型固醇含量之未加工油。 C 明内】 發明概要

8 1352.122,,. 如此本發明提供一種具有經降低之非可皂化物質含量 及/或醋型_含量且包含高度不肿脂—作為組成脂 肪酸之未加工油。此外，本發明提供一種由未加工油製造 精煉油之方法。 ‘ &外，本發明提供一種未加工油，其具有經降低之非 * 可4化物f含量及/或㈣固醇含量’且包含如前述方法製 造之高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸，以及提供由此種 油脂製造的精煉油脂。 此外，本發明提供前述油脂之多項用途。 已經報告具有經降低之非可皂化物質含量及固醇含 - 量’且包含高度不飽和脂肪酸之油脂（日本專利公開案第 1〇(1998)-191886 及 10(1998)-70992號，以及 pcT公告案第 誦-5腦3號之日文譯本）。但此等製法因培養基之氣源濃 度低，故不適合用於成本效益生產油脂。因此為了提升成 本效益，必需經由於培養基之升高氮源濃度進行培養來 改良每次培養時含高度不飽和脂肪酸之油脂之回收量。但 於此種情況下，發現油脂之非可皂化物質含量及固醇含量 也提高。如此本發明之目的係發展一種製造方法，其可滿 , 足藉高濃度培養改良成本效益，且可經由降低非可皂化物 . 質含量及固醇含量而改善品質。 發明人對於含高氮源濃度之培養基之培養條件以及製 造的油脂之化學組成進行廣泛徹底研究，意圖提供一種藉 咼浪度培養製造的油脂（未加工油），其具有較低非可息化物 質含量及/或酯型固醇含量’且包含高度不飽和脂肪酸作為 9 1352122 成分脂肪酸。結果出乎意外地，就培養槽攪動葉輪形式的 改良，以及培養基氮源滅菌時之pH條件，結果導致確立一 種油脂（未加工油）之製造方法，該油脂具有非可皂化物質含 量不大於2.2%重量比’及/或酯型固醇含量不大於1〇%重量 比，且包含高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸。 4 已知供給滿意數量之氧氣對於藉液體培養方法使用微 生物製造高度不飽和脂肪酸相當重要（日本專利公開案第 6(1994)-153970號）。容積氧移轉係數(kLa)廣為人接受用作 為微生物液態培養之氣供應指標。Richard報告kLa與每單位 鲁 液體量之攪動功率消耗(Pg/V)、通氣線性速度(Vs)以及攪動 速度(N)具有式（1)表示之關係式(J w Richard ;工業微生物 學之進展，第3期，141頁（1961年)）。 kLa〇c(Pg/V)°-4Vs0-5N0·5 ⑴ " 基於容積為0.2至60立方米之培養測量值，Fukuda等人 報告式(2)可獲得優於式⑴之關係式(Fukuda等人，所藏和雜 誌，第46期，829頁（1968年)）。 kLaocKPgAOWVsQ.V.S}1.4 ⑵ _

Matsushima等人證實式（1)及式（2)之通用性，且報告式 ⑴及式（2)藉通式表示為式⑶可獲得更寬廣應用 ， (Matsushima等人，守藏和雜誌，第5〇期，1〇5頁（1972年)）。 kLa〇c{(Pg/v)0-4Vs0-5N0-5}a ⑶ 由此等關係式’討論於相同功率消耗(Pg/V)以及相同 通氣線性速度(Vs)條件下，較高攪動速度(N)將獲得較高容 積氧移轉係數(kLa)。 10 1352122. 每單位液體量之攪動功率需求巧·以式(4)表示。 Pg/V=pNpN3d5/V (4) 其中p表示液體密度，Νρ表示功率值，以及d表示授動 葉輪直徑。 為了於指定工作，換言之，授動功率需求相同，提供 較高攪動速度(N)，考慮以使用具有較小功率值(Np)及較小 攪動葉輪直徑(d)之培養槽為佳。

Taguchi等人（「微生物學介紹7-微生物發酵工程」，

Hisaharu Taguchi及Shiro Nagai編輯，共立出版公司，175 頁（1985年))敘述有關通氣-檀動培養槽之標準條件，比 於1/4至1/3之範圍作為標準範圍，典型為1/3。 但此條件僅於水或有低細胞濃度之培養溶液建立。為 了改進製造之成本效益，須提供培養基之氮源濃度來獲得 較高細胞濃度。因此發明人認為於具有高細胞濃度之培養 溶液，不僅因考慮容積氧移轉係數(kLa)，同時也需將全體 培養液之混合列入考慮。 此外發現當培養係於有較高氮源濃度之培養基進行 時，換s之，於較咼細胞濃度進行時，由微生物萃取所得 包含高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之油脂（未加工油） 之非可皂化物質含量及酯型固醇含量增高，結果導致因培 養含有較南氮源濃度，導致製造含有非期望化學組成之油 脂。Iwamoto報告總脂質之非可皂化物質含量隨著細胞油脂 含量的下降而降低（「油脂之微生物製造」，Hiroaki Iwamoto ’（來源未知)）。發明人進行研究也顯示於較高濃度 11 培養可降低每細胞的油脂含量。發明人考慮每個細胞之油 脂含量降低，造成非可皂化物質含量及執行固醇含量的增 高。 如此，發明人考慮於高濃度培養，其中培養基之氮源 濃度高，要緊地不僅改良容積氧移轉係數(kLa)，同時也改 良全體培養液的混合’因而提升母個細胞的油脂含量。發 明人針對改良授動葉輪形狀(形式）’作為達成此項目的之手 段並進行廣泛徹底研究。結果，發明人經由使用培養槽具 有d/D[攪動葉輪直徑(=d)對培養槽内部直徑(=D)] = 0.34至 0·6，經由培養微生物，成功地提升每個細胞的油脂含量， 且改良高度不飽和脂肪酸的產能。此外出乎意外地發現， 此種情況下，由微生物萃取所得包含高度不飽和脂肪酸作 為成分脂肪酸之油脂具有較低酯型固醇含量。 此外，發現即使於具有d/D=小於〇·34之培養槽的情況 下，經由於pH值不大於5.0滅菌培養基的氮源，可達成微生 物製造高度不飽和脂肪酸產能的改進，以及酯型固醇含量 的降低。 如此，發明人進行全面性徹底研究，結果成功地製造 一種油脂（未加工油）其具有較低非可皂化物質含量及/或酯 型固醇含量，其方式係採用一種方法，其中培養係使用裝 配有d/D=不小於0.34之攪動葉輪之培養槽進行；或採用一 種方法其中當培養槽具有d/D=小於0.34時，培養係於含有 已經於pH不大於5滅菌之氮源的培養基進行。結果導致完成 本發明。 12 1352122 如此，本發明提供一種製造未加工油之方法，該未加 工油具有較低非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量，且包 含高度不飽和脂騎作為成分脂⑽，其賴在於可製造 一種油脂，該油脂包含不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之該 種微生物於培養槽内，於含2至15%氮源濃度之培養基培 養，培養槽裝配有齡葉輪及滿足騎葉輪直徑（=d)對培 養槽内部直徑(=E>)之比為d/D=0.30至0.6。 本發明也提供一種由前述方法製造之未加工油，其特 徵在於具有非可皂化物質含量不高於2.2%。本發明也提供 種經由精煉前述未加工油所得之精煉油脂。 本發明也提供包含前述未加工油及/或前述精練油脂 摻混於其中之一般性食品及飲料、機能性食品、營養補充 品、早產嬰兒及嬰兒配方、足月產嬰兒之嬰兒配方、嬰兒 食品、孕婦及哺乳婦用食品、以及老人食品。 本發明也徒供一種治療性營養食品，包含前述未加工 油及/或精煉油脂摻混於其中，選擇性連同一種適合經口、 直腸内或腸道外投藥用之中性載劑。 本發明也提供一種動物或魚類用飼料，包含前述未加 工油及/或前述精煉油脂摻混於其中。 本發明也提供一種醫藥組成物，包含前述未加工油及/ 或前述精煉油脂摻混於其中。本發明也提供一種經由使用 前述未加工油及/或前述精煉油脂作為原料而製備之醫藥 組成物。 【^方包】 13 較佳實施例之詳細說明 本發明係有關-種製造油脂(未加工油）之方法，該油脂 具有較低非可皂化物質含量及/或g旨型固醇含量，且包含古 度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸，該油脂（未加工油），以及 帶有經由精煉油脂（未加卫油）所得精煉油脂（三酸甘油㈤ 摻混於其巾之食品及題、治雜㈣食品、動物飼料及 醫藥製劑。 根據本發明之油脂(未加工油）為經由於含氮源濃度2% 至15%之培養基，培養可製造包含高度殘和脂肪酸作為 成分脂賊之㈣讀生物，製叙培養絲所得之微生 物油脂。該油脂（未加工油）係經由於裝配有攪動葉輪 d/D=0.34至0.6之培㈣培養，或#培養槽小於〇 34 時，經由於pH值不大於5滅菌之含氮源培養基培養，而具有 較低非可皂化物質含量及/或執行固醇含量。 特別，油脂（未加工油）具有非可皂化物質含量不大於 2.2%重量比，較佳不大於2 〇%重量比及更佳不大於18%重 量比及/或酯型固醇含量不大於1〇%重量比，較佳不大於 0.8%重量比及更佳不大於〇·6%重量比；以及以油脂（未加工 油）之總脂肪酸為基準，高度不飽和脂肪酸含量不低於1〇% 重篁比，較佳不低於20%重量比，更佳不低於3〇%重量比， 最佳不低於40%重量比。因此因進行可製造包含高度不飽 和脂肪酸作為成分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）之微生物培 養。 此處所述微生物較佳為可製造一種選自含18個或以上 14 ^52122.., 碳原子以及3個或以上雙鍵之ω6高度不飽和脂肪酸、含18 個或以上碳原子以及2或以上雙鍵之0)9高度不飽和脂肪 酸、以及含18個或以上碳原子及3個或以上雙鍵之①]南度不 飽和脂肪酸之高度不飽和脂肪酸，主要係作為三酸甘油酯 • 之成分脂肪酸。 . 含丨8個或以上碳原子及3個或以上雙鍵之ω6高度不飽 和脂肪酸包括γ-亞麻酸(6,9，ΐ2-十八碳三稀酸）、二同-γ-亞麻 鲁 酸（8,11,14-廿碳三晞酸）、花生四稀酸廿碳四稀 酸）、7，10，13，16-廿二碳四浠酸（22:4(〇6)以及〇?八〇)6(4,7，10, 13,16-廿二碳五稀酸）。含18個或以上碳原子及兩個或以上 雙鍵之ω9高度不飽和脂肪酸包括6,9-十八碳二烯酸、8,11-- 廿碳二烯酸以及梅德酸(Mead acid)(5,8，ll-廿碳三稀酸）；以 及含18個或以上碳原子及3個或以上雙鍵之ω3高度不飽和 脂肪酸包括(X-亞麻酸(9,12,15-十八碳三稀酸）、6,9,12,15-十 八碳四烯酸（18:4 ω3)、8，11，14，17-廿碳四烯酸(20:4〇)3)、 • 丑卩八(5,8，11，14，17-廿碳五烯酸）、0?八〇)3(7，10，13，16，19-廿二 碳五烯酸)及DHA (4,7，10，13，16，19-廿二碳六烯酸）。 如此於本發明，任一種微生物皆可使用’只要該微生 . 物可製造包含高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之油脂 . (三酸甘油酯）即可。可製造包含花生四烯酸作為成分脂肪酸 之油脂（三酸甘油酯）之微生物包括屬於下列菌屬之微生 物：被抱霉、耳霉（Conidiobolus)、腐霉（Pythium)、疫霉 (Phytophthora)、青霉（Penicillium)、枝孢（Cladosporium)、 毛霉（Mucor)、鐮抱(Fusarium)、曲霉（Aspergillus)、紅酵母 15 1352122 (Rhodotorula)、蟲霉（Entomophthora)、次孢囊霉 (Echinosporangium)、及水霉（Saprolegnia)。 屬於被孢霉屬被孢霉亞屬之微生物包括例如亞屬長形 被抱霉（Mortierella elongata)、微小被抱霉（Mortierella exigua)、喜濕被抱霉(Mortierella hygrophila)、及高山被抱 霉。其特例包括長形被孢霉(IFO 8570)、微小被孢霉(IFO 8571)、喜濕被孢霉（IFO 5941)、高山被孢霉（IFO 8568)、 ATCC 16266、ATCC 32221、ATCC 42430、CBS 219.35、 CBS 224.37、CBS 250.53、CBS 343.66、CBS 527.72、CBS 529.72、CBS 608.70及CBS 754.68 菌株。 例如屬於種屬克席科德菌（Crypthecodenium)、破囊壺 菌（Thrautochytrium)、分裂壺菌（Schizochytrium)、烏奇尼亞 菌（Ulkenia)、日本壺菌（Japonochytrium)或海壺菌 (Haliphthoros)之微生物也值得一提作為製造DHA之微生 物。 全部菌株皆可使用而非僅限於得自大阪發酵研究所 (IFO)、美國種型培養收集會(ATCC)及微生物培養局（CBS) 之菌株。此外，本發明研究小組由土壤分離的菌株亦即長 形被孢霉SAM 0219(FERM P-8703)(PERM BP-1239)也可使 用。 為了培養本發明可使用之菌株，經由事先培養所得的 孢子、菌絲體或種子培養液、或由種子培養收集所得細胞 接種於液態培養基，接著進行主培養。於液態培養基，此 處有用之碳源包括（但非限制性）業界常用之碳源例如葡萄 16 丄叫1.22.. 糖、果糖、木糖、嚴糖、麥芽糖、可溶性殿粉、糖蜜、甘 油'甘露糖醇及醣化澱粉。

氮源包括天然氮源例如蛋白蔴、酵母萃取物、麥芽萃 取物、肉萃取物、卡斯胺基酸(casamino acids)、玉米稳輪 浸液 '大豆蛋白、脫脂大豆及棉籽粉；有機氮源如尿素； 及無機氮源如硝酸鈉、硝酸銨、及硫酸銨。特別得自大豆 之気源，待別大豆、脫脂大豆、大豆片、食用大豆蛋白、 腐渣、兄漿及i粉為值得-提之氮源，肖別熱變性脱脂 大^，更佳為於約7(rc至就加熱處理脫脂大豆以及去除 乙％可溶性成分而製備之產物可單獨使用或組合兩種或兩 種以上或纽合前述其它氮源使用。 齙2 -丨哪丁、奶離千、鎂 _ = 金屬離子如鐵、銅、鋅、㈣及 卞以及維生素也可用作小量營養素。

長不ίΓ養基成分濃度並無特殊_，只要微生物之生 重量:：::。實際上’碳源之總添加量通常為ο.1至40% 至25%重量比’氮源總添加量較佳為2至 15%重量L錢邮至剩h 2為2至 為1至柯重量比，氮源添加初量 :源:力，量 程饋進碳源及氮源且更佳只饋進麵㈣重量比’於培養過 六燒t提高不飽和脂肪酸之產率，例如可使用煙類如十 酿類如油Γ酸或其鹽類如油酸或亞油酸或脂肪酸 料如崎油、大豆油，油菜軒油、棉籽油、或棕網油^ 17 1352122 獨或組合使用作為不飽和脂肪酸之前驅物。添加之基質量 係占培養基之0_001至10%，且較佳0.5至10%。培養也可使 用此等基質作為唯一碳源進行。可製造高度不飽和脂肪酸 之微生物之培養溫度係依據使用的微生物種類而改變。但 培養溫度可為5至40°c且較佳為20至3〇°C。也可使用—種方 法其中培養係於20至30°C來進行來生長細胞，然後繼續於5 ' 至20 C培養來製造不飽和脂肪酸。製得之脂肪酸中之高声 - 不飽和脂肪酸比例也可藉此種溫度控制而升高。種子培養 需經由通氣-攪動培養、振搖培養、固態培養或靜態液體培 鲁 養進行；而主培養係藉通氣-攪動培養進行。主培養開始時 (接種種子培養液時）培養基調整至pH 5至7且較佳5 5至 6.5。主培養通常進行2至30日，且較佳5至20日，更佳5至 15日。 根據本發明之油脂（未加工油）為經由培養可製造包含 高度不飽和脂㈣作為齡脂肪酸之油脂（三酸甘油酿）之 該種微生物製備之培養產物所得之微生物油脂，本發明之 最大特色在於未加工油之非可皂化物質含量及⑷旨型固 φ 醇含量可藉下述方式降低，經由於裝配有d/D=G.34至〇.6之 搜動葉輪之培養槽進行主培養；或當使用培養槽秦小於 〇·34時’經由於_不大於5滅菌之含氮源培養基進行主培 · 養如此本發明發展出一種經由使用可製造包含高度不飽 f月曰肪k作為成分脂贿之油脂（三酸甘油自旨）之微生物，而 降低未加4之非可4化物質含量及沿旨_醇含量。 本發明之培養方法中，最大特色為未加 工油之非可皂 18 13521.22. 化物質含量及/或酯型固醇含量係經由於培養槽培養而降 低，該培養槽具有d/D(攪動葉輪直徑(=d)對培養槽内部直徑 (=D)之比)=0·30至〇 6，較佳d/D=〇 34至〇 55，更佳 至，及最佳d/D=0.42至〇.55。為了藉d/D比達成更佳效 果，需要使用容積不小於丨立方米，較佳不小於5立方米， 及更佳不小於10立方米之培養槽。有關攪動葉輪，可使用 〇括渦輪葉片之授動葉輪可用於單一階段或多個階段，並 無特殊限制。 於培養基滅菌後當進行培養基之pH調整時，可小心以 無菌方式進行調整，俾不致於造成非期望的微生物污染。 因此pH的調整通常係於培養基滅菌之前進行。例如滅菌時 不會造成任何pH變化之培養基，於培養開始時調整至pH 6.0,於培養前培養基以無菌方式調整pH至6.0,可免除於滅 菌後需要做無gpH調整。為了即使於培養槽_=小於〇 34 也可降低酯型固醇含量，發明人針對此點進行研究，研究 滅菌步驟之pH條件對培養生產力以及產物組成的影響。結 果發明人發現，於被調整至pH不大於5之培養基滅菌前，再 度調整pH至適合滅菌後開始培養需要的阳值為佳。 特別，含培養基氮源溶液於滅菌後被調整至pH4至5且 較佳pH 4.2至4.7。滅菌後之培養基就此使用，或選擇性添 加另種有待滅菌的培養基後用來製備開始培養之培養 基，然後調整至pH 5至7且較佳pH 5.5至6_5。種子培養接種 入培養基而開始主培養。滅菌前可用於調整含氮源溶液之 pH之pH調節劑包括（但非特別限制)硫酸、鹽酸、磷酸、硝 19 1352122 酸及碳酸或其鹽，可單獨使用或組合兩種或兩種以上使 用。滅菌後培養基pH之再度調節劑包括（但非限制性）氫氧 化物如氫氧化鈉及氫氡化鉀、以及氨及銨鹽，其讦單獨使 用或組合兩種或兩種以上使用。 屬於被孢霉屬被孢霉亞屬之微生物已知可製造包含花 生四烯酸作為主要成分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）。發明人 經由讓前述菌株接受突變處理，獲得可製造包含二同-γ-亞 麻酸作為主要成分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）之微生物（曰 本專利公開案第5(1993)-91887號）、以及可製造包含》9高度 不飽和脂肪酸作為主要成分脂肪酸之油脂（三酸甘油醋）之 微生物（日本專利公開案第5(1993)-91888號）。 此外，發明人也取得對高度濃縮碳源有抗性的微生物 (W0 98/39468)。前述微生物係屬於被孢霉屬被孢霉亞屬之 微生物’藉本發明方法培養容易降低未加工油之朴可皂化 物質含量及/或酯型固醇含量，培養方法特別係經由於裝配 有攪動葉輪d/D=0.34至0.6之培養槽進行主培養；或當培養 槽d/D=小於0.34時，於pH值不大於5經滅菌且具有中等氮源 濃度為2%至15%之含氮源培養基進行主培養，可降低未加 工油之非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量。 但本發明使用之微生物非僅限於屬於被孢霉屬被孢霉 亞屬之微生物，經由應用本發明之培養方法至可製造含高 度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）之微 生物，可製造期望之具有較低非可皂化物質含量及/或酯型 固醇含量之未加工油，特別該方法係經由於裝配有攪動葉 20 1352122. 輪d/D=〇.34至0.6之培養槽進行主培養；或當培養槽d/I^ + 於0.34時，於PH值不大於5經滅菌且具有中等氮源濃度為 2%至15%之含氮源培養基進行主培養，可降低未加工油: 非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量。 經由於裝配有授動葉輪d/D=〇.34至〇.6之培養槽進行主 培養’·或當培養槽d/D=小於0.34時，於pH值不大於5經蜮菌 且具有中等氮源濃度為2%至15%之含氮源培養基進行主拉 養，可降低未加工油之非可皂化物質含量及/或酯型固醇= 直，製造包含高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之油脂且 具有較低非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量之^ 物，由該種微生物獲得未加工油之方法包括一種方法，^ 中於培養完成後’培養溶液就此、或培養溶液於滅菌、農 縮或酸化等處理後接受習知固_液分離(例如殿積、離心及二 或過濾）來收集培養細胞。 由輔助固-液分離之觀點，可添加凝結劑或過濾劑來補 助。凝結劑包括例如氣㈣、氣化㉝、藻蛋白及幾丁聚糖。 過遽助劑包括例如石夕藻土。培養細胞較佳以水洗條、札碎 及乾燥。錢例如可經由;東乾、風乾錢化床乾燥進行。 由乾燥後細胞獲得未加工油之手段可為以有機溶劑萃取或 擠壓。但以於氮氣流下以有機溶劑萃取為較佳。 5 有機溶劑包括乙醇、己烷、甲醇、乙醇、氣仿、二氣 甲院、石油趟及丙綱。也可使用以曱醇及石油喊萃取與以 氯仿-甲醇-水之單相溶劑萃取交替進行。但獲得未加工油之 萃取方法非僅限於前述方法，任何可有效萃取積聚於細胞 21 内部之油脂之方法皆可使用。例如超臨界萃取可用作為有 效萃取方法》 目標未加工油之獲得方式，係經由使用有機溶劑或超 臨界流體於減壓或其它條件下萃取，由所得萃取物去除有 機溶劑成分或超臨界流體成分來獲得目標未加工油。此外 可使用濕細胞進行萃取。此種情況下’使用與水相容之溶 劑如甲醇、乙醇及丙酮，或與水相容且由前述溶劑與水及/ 或其它溶劑組成之混合溶劑。其它程序係如前文說明。 根據本發明製造之具有較低非可皂化物質含量及/或 酉Θ型固醇含量且包含高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之 未加工油，可摻混動物飼料直接使用。但應用至食物前， 較佳於使用前將未加工油接受習知的精煉油脂處理。此處 可使用之油脂精煉處理包括例如脫膠、去氧化、脫臭、脫 色、官柱處理、分子蒸餾及冬化等習知處理。因此將本發 明之未加工油（其具有習知油脂精煉處理所無法達成之低 酯型固醇含量)接受油脂精煉處理，可獲得含有空前降低之 非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量之精煉油脂。 經由將本發明之具有較低酯型固醇含量之未加工油接 受油脂精煉處理，也可降低精煉處理的處理負擔。特別例 如即使縮短精煉處理時間以及降低能量成本，仍然可獲得 具有非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量等於先前技術 之精煉油脂。此外，使用與先前技術相等處理時間及能量 成本，可獲得比先前技術更低的非可皂化物質含量及/或酯 型固醇含量之精煉油脂。 13521.22. 根據本發㈤之精練力脂（三酸甘㈣）可帛於無限應用 範圍，例如用於食物、飲料、化妝品及醫藥製劑之原料及 添加劑’而其使用目的及用量並無特殊限制。 例如其中可使用精煉油脂之食品組成物包括一般食 〇〇以及額外包括機能性食品、營養補充物、早產嬰兒配 方足月嬰兒配方、嬰兒配方、嬰兒食品、孕婦及哺乳婦 食品或老人食品。 含有庙脂之食品例如包括：本質上含有油脂之天然食 DO如肉、魚或核果；烹煮時添加油脂之食品例如湯·食用 油脂作為加熱媒介之食品如圈餅；油脂食品例如乳油；加 工時添加’由月曰之力口工食品如小點心或餅乾；或加工完成時 噴灑或塗覆油脂之食品❹硬餅。此外精煉油脂添加至不 含油脂之農產品、發酵食品、牲口飼料、漁產飼料或飲料。 精煉油脂可以機能性食品及醫藥製劑形式使用，例如以加 工後形式使用，例如口服營養品、散劑、粒劑、片劑、内 服液劑、懸浮液劑、乳液劑及糖漿劑。 實施例 將參照下列實施例說明本發明之進一步細節。但須了 解本發明非僅囿限於此等實施例。 宜製造，d/p=o.34，大豆拾协拉f早 澧度=6% 提供高山被孢霉（CBS 754.68)作為花生四烯酸的生產 性真菌。高山被孢霉之標準菌株接種於培養基（1%酵母萃取 物，2%葡萄糖，pH 6.3)。於100 rpm之往復式振搖及28乞 23 溫度開始種子培養（第一階段），種子培養連續3日。其次， 於5〇升容積之通氣-攪動培養槽内準備3〇升培養基（1%酵母 萃取物，2%葡萄糖，0.1%大豆油，pH 6 3)。種子培養（第 一階段）溶液接種於培養基。於攪動速度2〇〇 rpm，溫度28 C，以及槽内壓150 kPa之條件下開始種子培養（第二階 段）’該種子培養連續2日。 其次準備4500升培養基(培養基八：大豆粉336千克， KH2P〇4 16.8^-^ , MgClr6H2〇 2.8-f ^ , CaCl2.2H20 2.8 千克，大豆油5.6千克）。用於條件（1·υ培養基調整至pH 6.3 ’對條件U-2)調整至pH 4·5。條件（1_υ及條件(Μ)之培 養基白係於121 C及20分鐘條件下滅ϋ。於14代4()秒條件 下滅菌1GGG升培養基（培養μ:葡萄糖—水合物ιΐ2千 克)添加錢菌後之培養基之前述培養基Α而準備培養基C 作為另-培養基。培養基c就此用於條件（ι ι)，培養基⑽ 整至pH6.3用於條件⑽。然後種子培養（第二階段)溶液接 種於如此料之料基，容義㈣料餘量共獅升 (培養槽容積：1〇千升）。 培養係於溫度26t，空氣流速49牛頓立方米/小時及内 壓200 kPa之條件下開始培養。 培養槽之形式為於三個階段裝配六葉片渦輪，授動葉 輪直徑（ = d)對槽内部直徑(=D)之比為氣〇34。當饋進表】 所示之培養基時，進行主培養3陶、時。培養結束時，受到 饋進培養基而使溶液f增加、以及溶液蒸發而使溶液量減 少等影響，培魏總量為775时。培養結料，每升培養 13521.22.. · 溶液製造的花生四烯酸濃度對條件（1-1)為18.2克/升及對條 件（1-2)為18.4克/升。 表1 :實施例1進給之培養基 主培養時間 進給之培養基 19小時後 葡萄糖一水合物280千克/460升 43小時後 葡萄糖一水合物280千克/450升 67小時後 葡萄糖一水合物252千克/390升 91小時後 葡萄糖一水合物252千克/410升 120小時後 葡萄糖一水合物224千克/370升 140小時後 葡萄糖一水合物168千克/280升 163小時後 葡萄糖一水合物168千克/270升 培養完成後，培養液於12(TC 20分鐘條件下滅菌。藉連 續脫水器收集濕細胞。收集所得濕細胞於擺動流化床乾燥 器乾燥至水含量為1%重量比。乾燥後之細胞藉空氣運送機 運送至填裝處所，連同氮氣一起填裝入容積約丨立方米之鋁 帶容器内。袋口部經熱熔封，然後帶狀容器儲存於1〇。〇或 以下之冰箱。 乾燥後細胞由容器袋中取出，接受己烧萃取。藉過渡 由己燒溶液擔m體物質mu賴下加熱去除己 燒，獲得含花生四_作為成分脂㈣之未加卫油\未加 油^析。結果如表2所示未加工油具有低酷型固醇含 重〇 25 1352122 表2 :含花生四稀酸之未加工油之實測值 實施例 實施例1 條件1-1 實施例1 條件1-2 培養槽形式，d/D 0.34 0.34 培養基A經調整後之pH值(滅菌前） 培養基C之pH值(滅菌後而於接種種子培養液之前） 6.3 6.3 4.5 6.3 各分量之wt% 三酸甘油醋 非可皂化物質 酯型固醇 94.0% 2.0% 0.8% 94.2% 1.8% 0.6% 未加工油之花生四烯酸於總脂肪酸，％ 42.0% 42.1% 复梅例2 :花生四烯酸之製造，d/D=〇42，大台扮於拉· 濃唐=6% 種子培養係以實施例1之相同方式進行。主培養係於實 知例1條件（Μ)之相同條件下進行，但培養槽形式為 d/D=0.42之六葉片渦輪裝配於三個階段，培養基準備時之 - pH條件各異。供於條件(2_υ培養，培養基八(滅菌前)調整至 pH 6.1，未對培養基c(接種種子培養液前）進行ρΗ調整。供 於條件(2-2)培養，培養基人調整至ρΗ 4 5，培養基(：調整至 pH 6.1。培養結果，培養結束時每升培養液製造的花生四烯 · 酸濃度’條件(2-1)為19.0克/升及條件(2_2)為19 7克/升。拉 養完成後，以實施例丨之相同方式獲得包含花生四烯醆作為 成分脂肪酸之未加工油。未加工油經分析。結果如表_ * 示，未加工油具有低酯型固醇含量。 - 26 13521.22 表3 ··含花生四烯酸之未加工油之實測值 實施例 實施例2 實施例2 條件2-1 條件2-2 培養槽形式，d/D 0.42 0.42 培養基A經調整後之pH值(滅菌前） 6.1 4.5 培養基C之pH值(滅菌後而於接種種子培養液之前） 6.1 6.1 各分量之wt% 三酸甘油酯 94.2% 93.5% 非可皂化物質 1.8% 1.6% 酯型固醇 0.6% 0.5% 未加工油之花生四烯酸於總脂肪酸，％ 42.2% 41.3% 實施例3 :花生四烯酸之製造，d/D=0.3、0.25及0.2，大豆 粉於培養基濃度=6% 種子培養係以實施例1之相同方式進行。主培養係與實 施例1條件（1-1)之相同條件下進行，但有關培養槽形式，二 階段使用裝配有六葉片渦輪d/D = 0.3之培養槽，二階段使 用裝配有六葉片渦輪d/D=0.25之培養槽，以及二階段使用 裝配有六葉片渦輪d/D=0.2之培養槽。培養結果，培養結束 φ 時每升培養液產生的花生四烯酸濃度，d/D=0.3之槽為17.0 克/升，（1/0=0_25之槽為16.5克/升，及(1/0=0.2之槽為13.5克 /升。培養完成後，以實施例1之相同方式獲得包含花生四 烯酸作為成分脂肪酸之未加工油。未加工油經分析。結果 •如表4所示，各種情況之酯型固醇含量皆超過1%。經由實 施例3結果與實施例1及2結果比較，酯型固醇含量高考慮係 歸咎於培養槽具有低d/D比。 27 表4 :含花生四烯酸之未加工油之實測值 實施例或對照例 實施例3 對照例 實施例3 對照例 實施例3 對照例 培養槽形式，d/D 0.30 0.25 0.20 培養基A經調整後之pH值(滅菌前） 培養基C之pH值(滅菌後而於接種種子培養液 之前） 6.3 6.3 6.3 6.3 6.3 6.3 各分量之wt% 三酸甘油醋 93.8% 93.1% 93.0% 非可皂化物質 2.9% 2.9% 2.9% 酯型固醇 1.2% 1.2% 1.2% 未加工油之花生四稀g复於總脂肪酸，％ 42.0% 41.6% 41.5% 1352122 實施例4 :花生四烯酸之製造，d/D=0.3、0.25及0.2，大吞 粉於培養基漠唐=6%，低pH滅菌 種子培養係以實施例1之相同方式進行。主培養之培養 基pH調整係以實施例1條件（1-2)之相同方式進行（培養基 A(pH 4.5)—滅菌—培養基C(pH 6·3)。隨後共於三種條件下 進行主培養，換言之，條件4-1，其中於二階段槽中配有六 葉片渦輪d/D=0.3;條件4-2,其中於二階段槽中配有六葉片 渦輪d/D=0.25 ;以及條件4-3，其中於二階段槽中配有六葉 片渦輪d/D=0.2，主培養係以實施例1之相同方式進行。除 前述實驗之外，使用槽d/D=0.3於另二條件下進行培養，條 件4-4培養基A調整至pH 4.0，以及條件4·5為PH 4.9。 主培養結果，培養結束時每升培養液製造的花生四烯 酸濃度’條件(4-1)[於pH 4.5滅菌，d/D=0.30]為17.2克升’ 條件（4-2)[於pH 4.5滅菌，d/D=0.25]為16.8克升’條件 (4-3)[於？114.5滅菌，〇1/0=0.20]為14.〇克升’條件(4-4)[於？11 4.0滅菌’（5/0=0.30]為17.1克升，以及條件(4_5)[於阳4.9滅 28 13521.22 菌，d/D=0.30]為17.2克升。培養完成後，重複實施例1之程 序獲得含花生四稀酸作為成分脂肪酸之未加工油。

未加工油分析結果顯示於表5。比較實施例3與實施例4 結果顯不’於d/D=0.30之培養槽，於pH 4.5滅菌培養基氣 源，可降低酯型固醇含量至不超過1%。但於d/D=0.25之槽 及〇1/0=0.20之槽培養，儘管氮源係於1)114.5滅菌，酯型固醇 含量無法降至不超過1%。此外，比較條件(4-1)、（4-4)及(4-5) 結果’顯示於4.0至4_9之pH範圍滅菌氮源，被考慮為可獲得 同等酯型固醇降低效果。 表5 :含花生四烯酸之未加工油之實測值 實施例或對照例 實施例4 條件4~1 實施例4 條料2 (對照例） 實施例4 條 #4*3 (對照例） 實施例4 條件丰4 實施例4 條件‘5 培養槽形式，d/D 0.30 0.25 0.20 0.30 0.30 培養基A經調整後之pH值(滅菌前） 4.5 4.5 4.5 4.0 4.9 培養基C之pH值(滅菌後而於接種種子 培養液之前） 6.3 6.3 6.3 6.3 6.3 各分量之wt% 三酸甘油酯 93.8% 93.1% 93.0% 93.5% 93.4% 非可皂彳b物質 2.2% 2.5% 2.7% 2.1% 2.1% 酯型固醇 1.0% 1.1% 1.1% 1.0% 1.0% 未加工油之花生四烯酸於總脂肪酸，％ 42.0% 40.8% 40.8% 41.5% 41.7%

f施例5」經由精煉未加工油所得艢煉油脂分柄钴果 貫施例1條件（1 -1)及實施例2條件（2-1)製備之含花生四 烯酸之未加工油藉習知去氧化及脫膠方法精煉，獲得精煉 油脂5-A及5-B。於實施例3條件d/D=0.25製備之含花生四烯 酸之未加工油係以前述相同方式精煉獲得精煉油脂5 _ C。含 花生四烯酸之精煉油脂之實測值顯示於表6。 29 表6 :實施例5分析結果 ί今花生四烯酸之精煉油脂t 6及匚之實測值) 實施例或對照例 實施例1 (條件卜” 實施例2 (條件2-1) 實施例3 (d/D=0.25) (對照例） 精煉油脂 5-A 5-B 5-C 各分量之wt% 96.0% 96.4% 三酸甘油醋 95.0% 非可皂化物質 1.4% 1.2% 2.0% 酯型固醇 0.8% 0.6% 1.2% 花生四烯酸於精煉油脂之總脂肪酸，％ 42.4% 42.8% 41.7% 1352122 實施例6 :於1.5%大豆粉條件下劁造花生 提供高山被孢霉(CBS 754_68)，種子培養（第一階段及 第一階段)係以實施例1之相同方式進行。其次，於121 °C及 20分鐘條件下滅菌4500升培養基（培養基a :大豆粉84千 克 ’ KH2P〇4 16.8千克，MgCl2.6H20 2.8千克，CaCl2.2H2〇 2 8 千克’大豆油5·6千克）。經由將1000升培養基(培養基B :葡 萄糖一水合物112千克)於14(TC40秒條件下滅菌，添加滅菌 後培養基至前述培養基A，製備培養基c作為另一培養基。 培養基C調整至PH 6.1。然後種子培養（第二階段）溶液 接種於如此製備的培養基，容積調整為培養液初量·升 (培養槽容積：1G怖。主培養始於溫度耽，空氣流速49 牛頓立方米/小時及内壓· kPa之條件。主培養係於主培養 之，於二階段培養槽裝配有d/職動葉輪直 徑㈣對槽内部直徑(=D)之比卜〇处六葉片祕， 二階段培養槽裝配d/D=〇 25之六葉 本 _ 培養基時，亍主培養162小時，養：饋進表7:示 製.化生四稀酸濃度對d/D=〇.34之槽為呢/升對

Cs> 30 1352122 d/D=〇.25之槽為4.7克/升。 表7 :實施例6之培養基進料 主培養時間 培養基進料 19小時後 葡萄糖一水合物84·千克/200升 43小時後 葡萄糖一水合物84千克/200升 67小時後 葡萄糖一水合物56千克/120升 91小時後 葡萄糖一水合物56千克/125升 培養完成後，以實施例1之相同方式，收集乾燥細胞， 接著使用己烷萃取獲得含花生四烯酸作為成分脂肪酸之未 加工油。未加工油之實測值顯示於表8。當培養基氮源濃度 為1.5%時，對d/D=0.25及d/D=0.34二者，未加工油皆具有酯 型固醇含量不超過1%。 表8 :實施例6結果(含花生四烯酸之未加工油實測值) 培養槽形式，d/D 0.25 0.34 各分量之wt% 三酸甘油醋 94.1% 93.0% 非可皂化物質 酯型固醇 1.2% 0.4% 1.2% 0.4% 花生四稀酸於未加工油之總脂肪酸，％ 40.8% 41.5% 實施例7 :二同-γ-亞窳醢之盤造；d/D=0.30、〇·34及0·25^ 影響，大豆粉於焙卷基潆唐4%，氮源滅菌pH 4.5

發明人確立一種包含二同-γ-亞麻酸作為成分脂肪酸之 油脂（三酸甘油酯）之製法。油脂之製法係根據日本專利公開 案第5(1993)-91887號所述製法，培養具有花生四烯酸生產 能力以及較低Δ5不飽和活性之微生物，例如高山被孢霉 SAM 1860突變株(FERM P-3589)而製造油脂。 31 1352122

高山被孢霉(SAM I860)提供為二同-γ-亞麻酸生產性真 菌。高山被孢霉之標準菌株接種於500毫升錐形瓶内之1〇〇 毫升培養基(1%酵母萃取物，2%葡萄糖，pH 6.3)。種子培 養（第一階段)係始於100 rpm往復振搖及溫度28充之條件， 種子培養連續3日。其次，於50升容積之通氣-攪動培養槽 内準備30升培養基（1%酵母萃取物，2%葡萄糖，01%大豆 油’ pH 6.3)。種子培養（第一階段)溶液接種於培養基。種 子培養（第二階段)始於授動速度200 rpm，溫度28°C及槽内 部壓力150 kPa之條件；種子培養持續2日。主培養係於條 件（7，1)至（7-4)之四個階段進行。 至於條件(7-1)，4500升培養基（培養基a :大豆粉224

千克 ’ KH2PO4 16.8千克，MgCl2.6H2〇 2.8千克，CaCl2.2H2〇 2·8千克，大豆油5.6千克）藉添加氫氧化鈉水溶液調整至pH 6.1，培養基於121 C及20分鐘條件下滅菌。培養基匚準備作 為另一培養基，係經由於14(TC40秒條件下滅菌1〇〇〇升培養基 (培養基B :葡萄糖一水合物112千克），將滅菌後之培養基 添加至前述培養基A。測定培養基c之PH，發現為pH6a。 然後種子培養（第二階段)溶液接種於培養基c，容積調整^ 培養液初量為5600升(培養槽容積：1〇千升）。培養始於溫肩 26 C，空氣流速49牛頓立方米/小時及内壓2〇〇 kPa之條件 培養槽形式為二階段裝設六葉片渦輪，授動葉輪直和 ( = d)對槽内部直徑(=D)之比為d/D=〇 34e培養期間的發^ 使用消泡偵測器偵測，自動添加大豆油來防止培養液因令 泡而由培養槽内排放出。當饋入表9所示之培養基時進/ 32 13521.22. 主培養288小時。培養結束時’受到培養基進料造成溶液量 增加、以及培養液蒸散造成溶液量減少的影響，培養液量 至於條件（7·2)，主培養係以條件（7_丨）之相同方式進 行，但培養基Α係藉非無菌添加硫酸調整至ρΗ 4 5，培養基 c係藉無菌添加氫氧化鈉水溶液調整至ρΗ6 ]，使用d/D=〇3 之k養槽至於條件(7_3) ’培養係以條件(7 i)之相同方式 進行使用d/D=G.3Q之培養槽。至於條件(7 4)，培養係 以條件(7 1)之相同方錢行但制…㈣Μ之培養槽。

屹養液於120 C20分鐘條件滅菌。然後藉

實施例7之培養基進料

至填死位置，連同氮氣一起填充 包。袋口部經熱熔封。然後綠 肩胞。收集所得濕細胞於振搖流化床乾 為1%重篁比。乾細胞藉空氣運送機轉運 入容積約1立方米之鋁箱 相0 、。然後容器袋儲存於UTC或以下之冰 33

*乾燥後細胞由容器袋内取出，使用己料取。固體物 質藉過2己燒溶液去除。然後濾液於減壓下加熱去除己 院’ Μ含二同_γ_亞麻酸作為成分脂肪酸之未加工油。未 油7刀析’分析結果顯示於表10。至於d/D=0.34之培 養槽:未加^油具有6旨型固醇含量不超過1%。至於d/D=0.3 之土。養槽藉習知方法於條件(7_3)進行pH調整，獲得含高 自曰型固醇3量之未加工油。於條件(7 2)於pH 4.5滅菌培養

基單兀可降低自旨型固醇含量至不高於⑽。至於_=〇 25 之培養槽’ 型gj醇含量超過1%。

p-~-二同-γ-亞麻酸之未加工油之實測傕 實施例或對照例 實施例7 條件7-1 實施例7 條件7-2 實施例7 條件7-3 (對照例） 實施例7 條件1Μ (對照例） 培養槽形式，d/D 0.34 0.30 〇.3〇 0.25 (滅菌後而於接種種子培養 6.1 6.1 4.5 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 各分量之wt% 三酸甘油酯 非可皂化物質 酯型固醇 93.8% 2.1% 0.9% 94.1% 2.2% 1.0% 93.5% 2.9% 1.2% 93.0% 2.9% 12% 未加工油之二同-γ-亞麻酸於總脂肪酸，％ 42.2% 41.9% 40.7% 41.7% 提供高山被孢霉(SAM 1960)，種子培養係以實施例i 之相同方式進行。其次’於121°C及20分鐘條件下滅菌4500 升培養基（培養基A :大豆粉84千克’ KH2P〇4 16 8千克， Mgcl2.6H20 2.8千克，CaCl2.2H20 2.8千克，大豆油5 6千 克）。經由將1000升培養基(培養基B :葡萄糖一水合物112 千克)於140eC40秒條件下滅菌，添加滅菌後培養基至前述 34 1352122.. 培養基A，製備培養基C作為另一培養基。培養基(：調整至 pH 6.1，然後種子培養溶液接種培養基c，於如此製備=培 養基’容積調整為培養液初量5600升(培養槽容積：1〇千升） 主培養始於溫度26t，空氣流速49牛頓立方米/小時及 内壓200 kPa之條件。主培養係於主培養槽進行，換言之， 於二階段培養槽裝配有d/D(攪動葉輪直徑（ = d)對槽内部直 徑（=D)之比）=0.34之六葉片渦輪，以及二階段培養槽裝配 d/D=0.25之六葉片渦輪。培養期間的發泡係使用消泡偵測 器偵測，大豆油係自動添加以防止培養液因發泡而由槽中 排放出。當饋進表π所示培養基時，進行主培養162小時。 - 培養結束時，每升培養液製造的二同-γ-亞麻酸濃度對 d/D=0.34之槽為4.8克/升，對d/D=〇 25之槽為4 7克/升。 表11 :實施例8之培養基進料 主培養時間 培養基進料 19小時後 葡萄糖一水合物84千克/200升 43小時後 葡萄糖一水合物84千克/200升 67小時後 葡萄糖一水合物56千克/120升 91小時後 葡萄糖一水合物56千克/125升 培養完成後，以實施例7之相同方式，收集乾燥細胞， 接著使用i ’料取獲得含二同_γ_聽酸作為成分脂肪酸之 未加工油。分析未加工油，未加工油之實測值顯示於表12。 35 表12 :實施例8結果(含二同-γ-亞麻酸之未加工油實測值) 培養槽形式，d/D 0.25 0.34 各分量之wt% 三酸甘油酯 93.5% 93.0% 非可皂化物質 1.2% 1.2% 酯型固醇 0.4% 0.4% 二同-γ·亞麻酸於未加工油之總脂肪酸，％ 40.5% 41.3% 1352122 實施例9 :梅德酸之贺造；d/D=0.5，大豆粉於培養基濃度 4% 發明人確立一種包含ω9高度不飽和脂肪酸作為成分脂 肪酸之油脂（三酸甘油酯）之製法。該油脂之製法係經由根據 曰本專利公開案第5(1993)-91888號所述製法，培養具有ω9 高度不飽和脂肪酸生產能力的微生物，例如高山被孢霉 (SAM 1861)突變株(FERM P-3590)。 發明人也確立一種包含梅德酸作為成分脂肪酸之油脂 (三酸甘油酯）之製法。此種油脂之製法係將可製造花生四稀 酸之微生物根據日本專利公開案第10(1998)-57085號所述 方法接受突變處理。油脂之製法係培養突變株，該突變株 具有被降低的或被刪除的Δ12去飽和苷、以及至少一種提升 的Δ5去飽和活性、A6去飽和活性及/或鏈延長活性，例如高 山被孢霉(SAM 2086)(FERM P-15766)。 高山被孢霉(SAM 2086)作為梅德酸生產性微生物。高 山被孢霉之標準菌株接種於2000毫升錐形瓶内之5〇〇〇毫升 培養基（1%酵母萃取物’ 2%葡萄糖，ρΗ6·3ρ種子培養（第 一階段)係始於往復振搖10 〇 r p m及溫度2 8它之條件，種子典 36 13521.22. 養持續3日。其次於50升容積之通氣_攪動培養槽準備3〇升 培養基（1%酵母萃取物，2%葡萄糖，0.1%撖欖油，pH 6.3)。 種子培養（第一階段)溶液接種於培養基。種子培養（第二階 段)係始於下述條件’搜動速度300 rpm，溫度28°C及槽内壓 200 kPa ;種子培養持續2日》其次，3200升培養基(培養基 A :大豆粉160千克，橄欖油4千克)於121。(：滅菌20分鐘。 培養基C準備作為另一培養基，經由於丨奶艽90秒條件 下滅菌700升培養基(培養基b :葡萄糖一水合物8〇千克）， 添加滅菌後之培養基至前述培養基A而製備培養基c。培養 基C調整至pH 6.1，然後種子培養（第二階段）溶液接種於培 養基C ’谷積調整為培養液的初量共4〇〇〇升(培養槽容積： 10千升）。主培養始於下述條件：溫度24t：，空氣流速49牛 頓立方米/小時，内壓200 kPa，攪動功率要求2千瓦。於培 養第4曰，溫度改成20°C。有關培養槽形式，使用於二階段 裝配有d/D(攪動葉輪直徑（ = d)對槽内部直徑(=D)之比)=〇 5 之六葉片渦輪之培養槽。當饋進入表13所示之培養基時， 主培養進行456小時。培養結束時，每升培養液製造之梅德 酸濃度為10.1克/升。 表13 :實施例9之培養基進料 主培養時間 培養基進料 19小時後 葡萄糖—水合物280千克/460升 43小時後 葡萄糖—水合物280千克/450升 67小時後 葡萄糖—水合物280千克/450升 91小時後 葡萄糖—水合物336千克/530升 144小時後 合物80千克 37 1352122 培養完成後，培養液於12(TC20分鐘條件滅菌。然後藉 連續脫水器收集濕細胞。收集所得濕細胞於振搖流化床乾 燥器乾燥至水含量為1%重量比。乾燥後細胞連同氮氣藉空 氣運送機填裝入填裝型容器袋内。袋口部經熱熔封。然後 谷器袋儲存於1〇。匚或以下之冰箱。 乾燥後細胞由容器袋内取出’接受己烷萃取。固體物 質藉過遽由己烷溶液移出。然後濾液於減壓下加熱去除己 烷，獲得含梅德酸之未加工油。未加工油經分析，結果顯 不於表14。 1_施例10 :梅德酸之唧梏，d/D=0.25，大互粉於培卷某澧 度=4% 種子培養係以實施例9之相同方式進行。主培養係於實 施例9之相同條件下進行’但有關培養槽形式’使用二階段 裝配有d/D=〇.25之六葉片渦輪之培養槽。結果培養結束時 每升培養液製造的梅德酸濃度為8 〇克/升。培養完成後，以 實施例9之相同方式獲得含梅德酸作為成分脂肪酸之未加 工油。 實施例10 (對照例） 分析含梅德酸之未加工油，未加工油之實測值顯示表14。 表14:含梅德酸之未加工油之實測值 實施例或對照例 實施例9 0.5 培養槽形式 % 酸 肪 脂 總 質-31/ %酯物 加 wt油化醇未 之甘皂固於 量酸可型酸 分三非酯德 0.25 94.6% 1.8% 0.6% 35.0%

30.6% 8 3 (S> 1352122·. 實施例11 :梅德酸之製造，於大豆粉灑崖5%之格杜下 培養 提供高山被孢霉（SAM 2086)，種子培養係以實施例9 之相同方式進行。其次於121°C20分鐘條件下滅菌32〇〇升培 養基(培養基A :大豆粉60千克，撖欖油4千克）。培養基c準 備作為另一培養基，經由於140°C90秒條件下滅菌7〇〇升培 養基(培養基B :葡萄糖一水合物80千克），添加滅菌後之培 養基至前述培養基A而製備培養基C。培養基c調整至pH 6.1 ’然後種子培養（第二階段)溶液接種於培養基匚，容積調 整為培養液的初量共4000升(培養槽容積：1〇千升）。主培養 始於下述條件：溫度24°C，空氣流速49牛頓立方米/小時， 内壓200 kPa，攪動功率要求2千瓦。 於培養第4日，溫度改成2〇t。有關培養槽形式使用 於二階段裝配有d/D(攪動葉輪直徑（ = d)對槽内部直徑(=D) 之比）0.34之葉片滿輪之培養槽以及使用二階段裝配有 d/D=0.25之六葉片渦輪之培養槽。當饋進入表15所示之培 養基時，主培養進行3〇〇小時。培養結束時，每升培養液製 造之梅德酸濃度為，d/D=〇34之培養槽為39克/升，而 d/D=0.25之培養槽為3 8克/升。 表15 :實施例11之培養基進料 主培養日^~~~ 培養基進料 19小時後 43小時後 葡萄糖一水合物60千克/120升 葡萄糖一水合物6〇千克/12〇升 67小時後 --- 葡萄糖一水合物40千克/80升 91小時後 -----___ 葡萄糖一水合物40千克/80升 39 1352122 培養完成後’以實施例9之相同方式，收集乾燥後之細 胞’接著以己院举取而獲得包含梅德酸作為成分脂肪酸之 未加工油。未加工油經分析’未加工油之實測值顯示於表16。 表16 :實施例11結果(含梅德酸之未加工油實測值) 培養槽形式，d/D 0.25 ---- 0.34 ----- 各分量之wt% 三酸甘油醋 95.0% Oc 1 m 非可皂化物質 1.3% yj.l% 酯型固醇 0.5% 0.5% 梅德酸於未加工油之總脂肪酸，％ 34.5% 34.2% 宜典例12 :摻混包_含花生四烯酸作為成分脂肪 低酯型固醇含量之精煉油脂（三酸甘油酯）之塍壘^ 加水至100份重量比明膠及35份重量比食用甘油，混合 物於50至6(TC加熱溶解來製備明膠薄膜。其次提供精煉油 脂5 - A (三酸甘油酯）與〇. 〇 5 %維生素E油之混合物作為膠囊 内容物，5-A為實施例5製備之具有經降低之酯型固醇含量 且包含花生四烯酸作為成分脂肪酸。膠囊之成形及乾燥係 以習知方法進行，來製備每顆膠囊含18〇毫克内容物之軟膠 囊。也使用實施例5製備之精煉油脂5-B作為原料，以使用 精煉油脂5-A之製備膠囊劑之相同方式製備軟膠囊。 f施例13 :用於質肪輪注擊査ί 400克實施例5製備之具有經降低之酯型固醇含量，且 包含花生四稀酸作為成分脂肪酸之精煉油脂5-Α(三酸甘油 Θ旨）’ 48克精製卵黃卵磷脂，2〇克油酸，1〇〇克甘油及4〇毫 升0.1Ν苛性蘇打添加及於均化器内分散。然後添加注射用 40 ⑤ 13521.22.. 霧乳化劑乳化而製備脂質乳液。 入塑膠袋内， 備脂質輸注製 蒸館水至分舰，難分散液容積至4升，接著使用高壓喷 份200毫升脂質乳液分配

做原料如脂質輸注製劑，係以使用精煉油脂μ製備脂質輸 注製劑之相同方式製備。 實施例丨i:用於果汁 2克点-環糊精添加至20毫升20%乙醇水溶液。1〇〇毫克 實施例5製備之具有經降低之酯型固醇含量、且包含花生四 烯酸作為成分脂肪酸（摻混〇 〇5%維生素E)之精煉油脂 5-A(三酸甘油酯）添加至其中，伴以藉攪拌器攪拌，混合物 於50 C培養2小時。冷卻至室溫（約丨小時)後，混合物又以攪 拌於4°C培養4小時。 所得沈澱藉過濾收集，以正己烷洗滌，然後凍乾獲得 1.8克包含含花生四烯酸之三酸甘油酯的環糊精包含體化 合物。1克粉末均勻混合於10升果汁來製備含有精煉油脂 (二酸甘油酯）之果汁，該油脂具有經降低之酯型固醇含量， 且包含饱生四烯酸作為成分脂肪酸。使用實施例5製備之精 煉油脂5-B作為原料之果汁也係以使用精煉油脂5_a製備果 汁之相同方式製備。 用於奶粉 〇.3克實施例5製備之具有經降低之酯型固醇含量，且 包含彳t*生四烯酸作為成分脂肪酸之精煉油脂5 _ A(三酸甘油 S曰）混合於克奶粉來製備配方奶粉。此外，使用實施 41 1352122 例5製備之精煉油脂5-B作為原料之配方奶粉也係以使用精 煉油脂5-A製備配方奶粉之相同方式製備。 f施例16 :使用各種菌株之培春方法 長形被孢苷（IFO 8570)、喜濕被孢霉(IFO 5941)、橫刺 孢囊霉（Echinosporangium transversale) (NRRL 3116)、矮耳 霉(Conidiobolusnanodes) (CBS 154.56)及刺水霉（Saprolegnia lapponica) (CBS 284.38)用作為花生四烯酸之生產性真菌。 此等花生四烯酸生產性真菌之標準菌株接種於培養基（酵 母萃取物1%，葡萄糖2%，PH 6.3)，種子培養於往復振搖1〇〇 rpm及溫度28°C條件進行3日。 其次’於50升容積之通氣-攪動培養槽内準備25升培養 基（葡萄糖500克，大豆粉775克，KH2P04 50克，MgCl2.6H20 7.5克，CaCl2.2H20 7.5克，及大豆油25克，pH 6.3)。種子 培養液接種於培養基’主培養始於攪動速度2〇〇 rpm，溫度 28°C及槽内壓150 kPa條件。至於培養槽形式，於二階段使 用裝配有d/D=0.42之六葉片渦輪之培養槽。培養進行186小 時，同時約24小時間隔添加50%葡萄糖溶液，將葡萄糖濃 度調整至約1%至2%。 培養元成後，培養液於120 C及20分鐘條件滅菌。濕細 胞於減壓下藉過濾收集，乾燥至水含量為1%重量比。乾燥 後細胞以己烷萃取。固體物質藉過濾由己烷溶液中移除。 然後濾液於減壓下加熱去除己烷，獲得含花生四烯酸作為 成分fla肪酸之未加工油。分析含花生四稀酸之未加工油。 未加工油之實測值示於表17。 ⑤ 42 1352122.. 表17 :實施例16結果(含花生四烯酸之未加工油實測值) 菌株 長形被抱霉 IFO8570 喜濕被抱霉 IF05941 橫刺孢囊霉 NRRL3116 矮耳霉 CBS 154.56 刺水霉 CBS 284.38 各分量之wt% 三酸甘油酯 90.0% 88.1% 86.0% 83.4% 82.6% 非可皂勿質 1.9% 1.9% 2.0% 2.0% 2.0% 酯型固醇 0.8% 0.7% 0.7% 0.8% 0.8% 花生四烯酸於未加工油之 總脂肪酸，％ 30.8% 31.7% 28.6% 26.3% 20.7% I：圖式簡單說明：! (無） 【主要元件符號說明】 (無） 43

Claims (1)

13521.22.， •雙面影印

七、申請專利範圍： 5 1. 一種未加工油’包含一具有經降低之非可皂化物質含量 及/或酯型固醇含量之脂質或油質，且包含一作為成分 脂肪酸之高度不飽和脂肪酸，其中以在該脂質或油質中 之總脂肪酸為基準，該脂質或油質之酯型固醇含量為〇 8 wt%或更低；該高度不飽和脂肪酸含量為30 wt%或更 高；及該三酸甘油酯之含量為90 wt%或更高。 2.如申請專利範圍第1項之未加工油，其中該三酸甘油酯 之含量為94 wt%或更高。 10 3. —種精煉油質，其包含一具有經降低之非可皂化物質含 量及/或酯型固醇含量之脂質或油質’且包含一作為成 分脂肪酸之高度不飽和脂肪酸，其中以在該脂質或油質 中之總脂肪酸為基準’該脂質或油質之酯型固醇含量為 0.8 wt%或更低；該高度不飽和脂肪酸含量為3〇 wt%或 15 更尚；及該三酸甘油酯之含量為90 wt%或更高。 4.如申請專利範圍第3項之精煉油質，其中該三酸甘油醋 之含量為94 wt%或更高。 5. —種可食用性組成物，其包含如申請專利範圍第1項之 未加工油及/或如申請專利範圍第3項之精煉油質，其中 該可食用性組成物係一選自於由一般性食品及飲料、機 月色性食品、營養補充物、早產兒配方、足月嬰兒配方、 嬰兒食品、孕婦及哺乳婦食品及老人食品所構成之組群 的食品或飲料。 44 1352122 第99130181號專利申請案申請專利範圍修正本 100年6月28曰 6. —種動物用或魚用飼料，包含如申請專利範圍第1項之 未加工油及/或藉由精煉該未加工油所獲得之經精煉脂 質或油質。 5 7. —種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第1項之未加工 油及/或藉由精煉該未加工油所獲得之經精煉脂質或油 質。 8.如申請專利範圍第7項之醫藥組成物，進一步包含一適 合供經口、經直腸或經腸道外投藥之中性載劑。 10 45