ES2350926T3

ES2350926T3 - Procedimiento para producir grasa o aceite microbiano que tiene bajo contenido de materia insaponificable.

Info

Publication number: ES2350926T3
Application number: ES03754068T
Authority: ES
Inventors: Kenichi Higashiyama; Kengo Akimoto; Motoo Sumida; Hiroshi Kawashima
Original assignee: Nippon Suisan Kaisha Ltd
Current assignee: Nissui Corp
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2011-01-28
Anticipated expiration: 2023-10-09
Also published as: SI2966172T1; DK1549753T3; ES2661674T3; WO2004033698A3; DK2267142T3; EP1549753B1; ATE480633T1; DE60334129D1; TWI352122B; HK1219759A1; HK1257077A1; KR101460259B1; EP2966172A1; HUE037467T2; KR20130006530A; AU2003272095B2; US7709236B2; CN101310622A; JP2011139707A; KR101451415B1

Abstract

Un proceso para la producción de un aceite crudo que tiene un contenido de materia insaponificable no mayor al 2,2% en peso y/o de esterol de tipo éster no mayor al 1,0% en peso y que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente, caracterizado porque un microorganismo capaz de producir una grasa o aceite que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente se cultiva en un medio que contiene una concentración de fuente de nitrógeno entre el 2 y 15% dentro de un tanque de cultivo equipado con un impulsor de agitación que cumple con el requisito de que la relación entre el diámetro del impulsor de agitación (= d) y el diámetro interno del tanque de cultivo (=D) es d/D = entre 0,30 y 0,6.

Description

Campo técnico

La presente invención se refiere a la producción de un aceite crudo que tiene menor contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster y que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente, un proceso de producción de una grasa o aceite refinados y al uso de dicha grasa o aceite (aceite crudo o grasa o aceite refinados) en alimentos y bebidas, alimentos para nutrición terapéuticos, alimentos para animales y preparaciones farmacéuticas. En la presente invención, "materia insaponificable" y "esterol de tipo éster" se refieren a aquellos extraídos de microorganismos. Por lo tanto, la "materia insaponificable" y el "esterol de tipo éster" mencionados en la presente invención excluyen toda materia

insaponificable y esterol de tipo éster agregado al aceite crudo luego de la extracción.

Técnica anterior

Con respecto a la biosíntesis de ácidos grasos altamente insaturados humanos (en adelante denominados "PUFA"), existen dos series típicas: las series �3y �6. � (omega) se refiere a la cantidad de átomos de carbono desde el grupo metilo terminal del ácido graso hasta el átomo de carbono en el cual se encuentra el primer enlace doble. Por ejemplo, en el caso de la serie �6, el ácido linoleico (18:2 �6) se somete repetidamente a insaturación y extensión del largo de la cadena de carbonos y se convierte como consecuencia en ácido �-linolénico (18:3 �6), ácido dihomo-�linolénico (20:3 �6), ácido araquidónico (20:4 �6) y ácido 4,7,10,13,16docosapentaenoico (22:5 �6).

Del mismo modo, en el caso de la serie �3, el ácido �-linolénico (18:3 �3) se somete repetidamente a insaturación y extensión del largo de la cadena de carbonos y se convierte como consecuencia en ácido eicosapentaenoico (20:5 �3), ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico (22:5 �3) y ácido 4,7,10,13,16,19docosahexaenoico (22:6 �3). Se sabe que el ácido eicosapentaenoico (en adelante denominado "EPA") y el ácido docosahexaenoico (en adelante denominado "DHA"), como PUFA de la serie �3, tienen muchas funciones fisiológicas, en particular efectos profilácticos para enfermedades que afectan el estilo de vida, tales como esclerosis arterial y trombosis, y acción carcinostática y acción potenciadora de la capacidad de aprendizaje, y se han realizado varios intentos por aplicar estos PUFA a preparaciones farmacéuticas y productos alimenticios específicos para el cuidado de la salud. En los últimos años, sin embargo, se ha prestado atención a las funciones fisiológicas de los PUFA que no son de la serie �3 (serie �6y �9).

El ácido araquidónico representa aproximadamente el 10% de los ácidos grasos que constituyen órganos importantes tales como la sangre y el hígado. Por ejemplo, los ácidos grasos en fosfolípidos de sangre humana tienen una composición que comprende 11% de ácido araquidónico, 1% de ácido eicosapentaenoico y 3% de ácido docosahexaenoico. El ácido araquidónico está implicado, por ser un importante constituyente de la membrana celular, en la regulación del flujo en la membrana y exhibe varias funciones en el metabolismo corporal y, además, tiene un papel importante como precursor directo de prostaglandinas.

En particular, se ha prestado atención recientemente al ácido araquidónico como un nutriente para lactante y como ácido graso constituyente de cannabinoide endógeno (2-araquidonoil monoglicerol, anandamida) que tiene una acción de activación nerviosa. En general, tras la ingestión de alimentos ricos en ácido linoleico, éste se convierte en ácido araquidónico. Sin embargo, en pacientes que padecen enfermedades relacionadas con el estilo de vida y un grupo reservado de enfermedades relacionadas con el estilo de vida, lactantes y personas mayores, la función de la enzima implicada en la biosíntesis se ve disminuida. Por lo tanto, es posible que la cantidad de ácido araquidónico sea deficiente. Por esta razón, es deseable ingerir el ácido araquidónico directamente como una grasa o aceite (ácido graso constituyente de triglicérido).

Para el EPA y el DHA, como PUFA de la serie �3, existe el aceite de pescado como una fuente abundante de suministro. Por otro lado, el ácido �-linolénico, el ácido dihomo-�-linolénico, el ácido araquidónico y el ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico

(22:5 �6) como PUFA de la serie �6 casi nunca se obtienen de fuentes convencionales de suministro de grasa o aceite, y, actualmente, en general se utilizan las grasas o aceites (triglicéridos) que comprenden como ácido graso constituyente, PUFA producidos por la fermentación de microorganismos. Por ejemplo, se ha propuesto un método en el que una grasa o aceite (triglicérido) que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente se produce mediante el cultivo de varios microorganismos capaces de producir grasa o aceite (triglicéridos) que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente.

Entre otros, se conoce la producción de grasa o aceite que contiene un alto contenido de ácido araquidónico (triglicéridos) mediante el uso, particularmente, de microorganismos pertenecientes al género Mortierella (Publicación de Patente Japonesa Pendiente de Revisión (Kokai) Nos. 63 (1988)-44891 y 63 (1988)-12290). En base a numerosos resultados de pruebas, se sostiene que estas grasas o aceites son seguras. Sin embargo, como esta grasa o aceite es derivada de microorganismos, no hay experiencias satisfactorias con respecto a la ingestión. Por lo tanto, actualmente, la grasa o aceite en cuestión, todavía no se han infiltrado de forma satisfactoria en la sociedad. Por otro lado, se han comenzado a usar grasas o aceites (triglicéridos) que comprenden, como ácido graso constituyente, un ácido araquidónico producido por fermentación, en aplicaciones donde debería usarse un ácido araquidónico, por ejemplo, en el campo de la nutrición de lactantes y, específicamente, en fórmulas para lactantes.

La grasa o aceite producidos a partir de producto natural, como por ejemplo, animales y plantas, están sujetos a procesos de refinado, tales como, desgomado, desoxidación, desodorización, decoloración, destilación molecular e hibernación y luego se lanzan al mercado como grasa o aceite comestible. Por ejemplo, la grasa o aceite obtenidos mediante el exprimido de plantas de aceite contienen una gran cantidad de impurezas y por lo tanto, como tales, no pueden ser usados como grasa o aceite comestible. Salvo los aceites de sésamo y los aceites de oliva que han sido frecuentemente consumidos, estas grasas o aceites generalmente se refinan antes de su uso como aceites comestibles.

Por ejemplo, en el proceso de desgomado, se eliminan los fosfolípidos, los carbohidratos, las resinas, los compuestos proteicos, los metales traza y los colorantes contenidos en los aceites no refinados. En el proceso de desoxidación (refinado alcalino), se eliminan los ácidos grasos, los colorantes, los fosfolípidos, los metales traza, los compuestos azufrados, los insolubles del aceite y los productos de oxidación. En el proceso de decoloración, se eliminan los colorantes, la materia gomosa, los metales traza, los componentes jabonosos, los productos de oxidación y los fosfolípidos. En el proceso de desodorización, se eliminan los ácidos grasos, los monoglicéridos, los diglicéridos, los aldehídos, los alcoholes, las cetonas, los hidrocarburos, los colorantes, los compuestos azufrados, los peróxidos, los productos de degradación oxidativa y otros componentes olorosos.

La grasa o aceite contiene compuestos orgánicos que son solubles en aceites y son menos propensos a degradarse con un álcali denominado "materia insaponificable." Por ejemplo, los compuestos tales como, los alcoholes superiores, los esteroles, los hidrocarburos, los tocoferoles y los carotenoides se conocen como componentes constituyentes de materia insaponificable. En los procesos de refinado de grasa o aceite, el contenido de materia insaponificable se puede reducir pero no eliminar por completo. Se sabe que los esteroles existen como componentes principales de la materia insaponificable en grasa o aceite producidos por microorganismos.

Los esteroles presentes en grasas o aceites se dividen en tipos libre y en tipos éster. En los procesos de refinado, se puede eliminar el tipo libre pero, por otro lado, apenas se puede eliminar el tipo éster. Por ejemplo, luego de los procesos de desgomado, desoxidación, decoloración y desodorización los contenidos de contenido de esterol (mg/g) del aceite de soja son 3,4, 3,0, 2,0 y 1,6, respectivamente, para el tipo libre y 0,6, 0,6, 0,6 y 0,6, respectivamente, para el tipo éster (ver “Shokuyo Yushi no Kagaku” (“Science of edible fat or oil”) I. Aratani, Saiwai Shobo 1989, págs. 20-21.

Dado que los esteroles inamovibles y similares están presentes como una parte de materia insaponificable, en general, el contenido de materia insaponificable es ampliamente usado como un índice de la calidad de grasa o aceite refinados o como un índice de control del proceso de refinado. Por ejemplo, de acuerdo con los Estándares Agrícolas Japoneses, el contenido de materia insaponificable, por ej., en aceites de cártamo comestibles, aceites de soja comestibles y aceites de palma comestibles, no debe superar el 1,0% (la 523ª notificación (31 de marzo de 1969) del Ministerio de Agricultura, Forestación y Pesca). Para los lactantes, el colesterol es necesario y existe en el mercado una fórmula para lactantes con un alto contenido de colesterol. Los esteroles derivados de las plantas se encuentran presentes en grasa o aceite comestible vegetal. La presencia de esteroles derivados de vegetales desventajosamente inhibe la absorción del colesterol en los lactantes (Shokuhin y Kaihatsu (Food Processing And Ingredients). Vol. 33, No. 2, págs. 42-45 (1998)). Por lo tanto, cuando se tienen en cuenta aplicaciones en las cuales se incorporan grasa o aceite comestible en fórmulas para lactantes, son muy deseables las grasas o aceites comestibles con bajo contenido de esterol, es decir, con bajo contenido de materia insaponificable.

Los triglicéridos (no menos de aproximadamente 70% en peso) y los fosfolípidos representan la mayor parte de grasas o aceites producida mediante el cultivo de microorganismos pertenecientes al género Mortierella, y la materia insaponificable está presente como otro componente. La materia insaponificable comprende esteroles, tales como desmosterol y ésteres de esterol, como componentes principales. Las grasas o aceites comestibles se encuentran en forma de triglicéridos. La grasa o aceite refinados, de los cuales se han eliminado los fosfolípidos, se pueden proporcionar sometiendo la grasa o aceite originales producidos mediante el cultivo de microorganismos (grasa o aceite obtenidos por medio de la extracción de células y denominados "aceite crudo") a procesos de refinado para grasa o aceite comestible (desgomado, desoxidación, desodorización y decoloración). Sin embargo es difícil eliminar por completo la materia insaponificable por medio de los procesos de refinado.

Dado que es difícil eliminar por completo la materia insaponificable y son muy deseables las grasas o aceites comestibles con bajo contenido de materia insaponificable, se han realizado estudios sobre la forma de eliminar la materia insaponificable. Como resultado, se ha desarrollado el refinado mediante cromatografía en columna: ver JP-A-10/191886 y EP-A-0958774. En esta técnica, sin embargo, no se han realizado estudios detallados sobre los componentes constitutivos de la materia insaponificable. Se desconoce el cambio que se produce en los componentes de la materia insaponificable luego del refinado en relación a los componentes antes del refinado, es decir, la información sobre cuáles componentes han sido eliminados durante el refinado.

La grasa o aceite producidos mediante el cultivo de microorganismos pertenecientes al género Mortierella se acumulan dentro de los micelios. Por lo tanto, el cultivo se debe llevar a cabo para producir una mayor concentración celular desde el punto de vista de una mejor rentabilidad de la producción de grasa o aceite que contiene ácido graso altamente insaturado. Con el fin de proporcionar una alta concentración celular, se debe aumentar la concentración de la fuente de nitrógeno del medio convertido en componentes celulares. De acuerdo con informes anteriores, (JPA-10/191886 y JP-A-10/070992, correspondientes a EP-A-0956774 y EP-A-0957173) si bien informan sobre la materia insaponificable o el contenido total de esterol, la concentración de la fuente de nitrógeno en el medio usado en el cultivo de microorganismos es aproximadamente 1,5% como máximo.

Asimismo, se ha informado sobre una grasa o aceite que contiene ácido graso altamente insaturado con un contenido de esterol no mayor al 1% (WO 97/43362). En este caso, sin embargo, la concentración de una fuente de nitrógeno en un medio usado en esta producción es baja y, en la producción una grasa o aceite que contiene un ácido araquidónico producido mediante el uso de Mortierella alpina, el cultivo se lleva a cabo en una baja concentración de fuente de nitrógeno de 1% (= extracto de levadura al 0,5% + NaNO3 al 0,5%; ver WO 97/37032). Por consiguiente, dado que es ampliamente deseable una grasa o aceite comestible con bajo contenido de materia insaponificable y de esterol, se han realizado estudios sobre la reducción de la materia insaponificable y/o de los esteroles. Sin embargo, no hay descripción de la materia insaponificable y de los esteroles contenidos en la grasa o aceite microbianos producidos mediante un cultivo de alta concentración de microorganismos.

Como se describe anteriormente, los esteroles, como componente principal de la materia insaponificable, se dividen en esteroles de tipo libre y esteroles de tipo éster. Los esteroles de tipo libre se pueden eliminar mediante el proceso de refinado, mientras que los esteroles de tipo éster apenas se pueden eliminar mediante los procesos de refinado. Por lo tanto, se considera que, con el fin de proporcionar grasa o aceite refinados con bajo contenido de materia insaponificable, específicamente, bajo contenido de esterol, es importante el desarrollo de una materia prima para el refinado que tenga un bajo contenido de esteroles de tipo éster, que no pueden eliminarse por los procesos de refinado sin dificultad, es decir, un aceite crudo con un contenido bajo de esterol de tipo éster.

Por consiguiente, la presente invención pretende proporcionar un proceso para la producción de un aceite crudo con bajo contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster y que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente. Asimismo, la presente invención proporciona un proceso para la producción de un aceite refinado a partir del aceite crudo.

Asimismo, la presente invención proporciona varios usos de la grasa o el aceite mencionados anteriormente.

Ya se han dado a conocer grasas o aceites que tienen menor contenido de materia insaponificable y de esterol y que comprenden un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente (EP-A-0956774, EP-A-0957178, WO97/43362). Estos procesos de producción, sin embargo, no son adecuados para una producción rentable de grasa o aceite, dado que la concentración de la fuente de nitrógeno del medio en el cultivo es baja. Por lo tanto, con el fin de mejorar la rentabilidad, la cantidad de grasa o aceite que contiene ácido graso altamente insaturado, recuperada por cultivo, ha sido mejorada llevando a cabo el cultivo con una mayor concentración de fuente de nitrógeno del medio. En este caso, sin embargo, se ha encontrado que también mejoran el contenido de materia insaponificable y el contenido de esterol de la grasa o aceite. En consecuencia, un objeto de la presente invención es el desarrollo de un proceso de producción que pueda cumplir tanto con una mejora en la rentabilidad mediante un cultivo de alta concentración y una mejora en la calidad mediante la reducción del contenido de materia insaponificable y del contenido de esterol.

Los inventores de la presente invención han realizado estudios extensivos e intensivos sobre las condiciones de cultivo y las composiciones químicas de la grasa o aceite producidos en medios que tienen una alta concentración de fuente de nitrógeno con el fin de proporcionar una grasa o aceite (aceite crudo) con bajo contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster y que comprenden un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente producido mediante un cultivo de alta concentración. Como resultado, sorprendentemente, una mejora en la forma de un impulsor de agitación de un tanque de cultivo y una mejora en las condiciones de pH para la esterilización de la fuente de nitrógeno del medio determinaron la creación de un proceso de producción de una grasa o aceite (aceite crudo) con un contenido de materia insaponificable no mayor al 2,2% en peso y/o un contenido de esterol de tipo éster no mayor al 1,0% en peso y que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente.

Se sabe que el suministro de una cantidad satisfactoria de oxígeno es importante para la producción de ácido graso altamente insaturado mediante el uso de microorganismos mediante un método de cultivo líquido (Publicación de Patente Japonesa Pendiente de Revisión (Kokai) No. 6 (1994)-153970). Un coeficiente de transferencia volumétrica de oxígeno (kLa) ha sido ampliamente usado como un índice de suministro de oxígeno en cultivos líquidos de microorganismos. Richard ha informado que el kLa tiene una relación representada por la fórmula (1) con un consumo de energía de agitación por unidad de cantidad de líquido (Pg/V), velocidad lineal de aireación (Vs) y velocidad de agitación (N) (J. W. Richard; Prog. Ind. Microbiol., vol. 3, p. 141, (1961)).

kLa�(Pg/V)0,4Vs0,5N0,5 (1)

En base a valores medidos en un tanque de cultivo con un volumen entre 0,2 y 60 m3, Fukuda et al. informaron que la fórmula (2) presenta una mejor correlación que la fórmula (1) (Fukuda et al., Hakkokogaku Kaishi, vol. 46, p. 829 (1968)).

kLa�{(Pg/V)0,4Vs0,5N0,5}1,4 (2)

Matsushima et al. verificaron la universalidad de las fórmulas (1) y (2) e informaron que las fórmulas (1) y (2) pueden ser más extensamente aplicadas por generalización como lo representa la fórmula (3) (Matsushima et al., Hakkokogaku Kaishi, vol. 50, p. 105 (1972)).

kLa�{(Pg/V)0,4Vs0,5N0,5}� (3)

A partir de estas formulas de correlación, se considera que, en condiciones idénticas de consumo de energía de agitación (Pg/V) y de velocidad lineal de aireación (Vs), una mayor velocidad de agitación (N) proporciona un mayor coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (kLa).

El requisito de energía de agitación por unidad de cantidad de líquido se representa en la fórmula (4)

Pg/V = pNpN3d5/V (4)

en la que p representa la densidad del líquido, Np representa el número de energía y d representa el diámetro del impulsor de agitación.

Con el fin de proporcionar una mayor velocidad de agitación (N) por trabajo realizado, es decir, idéntico requisito de energía de agitación, se considera ventajoso el uso de un tanque de cultivo con un número menor de energía (Np) y un diámetro menor del impulsor de agitación (d).

Taguchi et al., (Biseibutsugaku Kisokoza 7-Biseibutsu Baiyo Kogaku(Introduction to Microbiology 7-Microorganism Fermentation Engineering), editado por Hisaharu Taguchi y Shiro Nagai, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd. p. 175 (1985)) describe que, con respecto a las condiciones estándares para un tanque de cultivo de aireación-agitación, la relación d/D se encuentra en el rango de 1/4 y 1/3 como un rango estándar y es típicamente 1/3.

Esto, sin embargo, se establece únicamente en agua o una solución de cultivo con una baja concentración celular. Con el fin de mejorar la rentabilidad de la producción, se debe aumentar la concentración de una fuente de nitrógeno en un medio para producir una mayor concentración celular. Por lo tanto, los inventores de la presente invención, han pensado que, en una solución de cultivo con una alta concentración celular, se debe tener en cuenta, no solo el coeficiente de transferencia volumétrica de oxígeno (kLa), sino también, la mezcla de la totalidad de la solución de cultivo.

Asimismo, se ha encontrado que, cuando el cultivo se llevó a cabo en un medio con una mayor concentración de fuente de nitrógeno, es decir, a una mayor concentración celular, se aumenta el contenido de materia insaponificable y de esterol de tipo éster de una grasa o aceite (aceite crudo) que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente extraído de microorganismos, provocando la producción de una grasa o aceite con una composición química no deseada, dado que el cultivo tiene una mayor concentración de fuente de nitrógeno.

Iwamoto ha informado que el contenido de materia insaponificable en los lípidos totales disminuye con el aumento del contenido de grasa o aceite de las células ("Biseibutsuniyoru Yushino Seisan (Microbial production of fat or oil)," Hiroaki Iwamoto, (fuente desconocida)). Estudios llevados adelante por los inventores de la presente invención también demostraron que el cultivo con una concentración mayor, tiende a bajar el contenido de grasa o aceite por célula. Los inventores de la presente invención han considerado que un contenido más bajo de grasa o aceite por célula provoca un aumento en el contenido de materia insaponificable y de esterol de tipo éster.

En consecuencia, los inventores de la presente invención, han considerado que, en cultivos de alta concentración en los que la concentración de la fuente de nitrógeno en el medio es alta, lo que es importante es mejorar no solo el coeficiente de transferencia volumétrica de oxígeno (kLa) sino también la mezcla de toda la solución de cultivo y por consiguiente mejorar el contenido de grasa o aceite por célula. Los inventores de la presente invención han apuntado a una mejora en la forma (apariencia) del impulsor de agitación como medio para lograr este objetivo y han llevado adelante estudios extensivos e intensivos. Como resultado, los inventores de la presente invención han logrado mejorar el contenido de grasa o aceite por célula y aumentar la productividad de ácidos grasos altamente insaturados mediante microorganismos en un cultivo, empleando un tanque de cultivo con d/D (la relación del diámetro del impulsor de agitación (= d) y el diámetro interno del tanque de cultivo (= D) = entre 0,34 y 0,6. Asimismo, sorprendentemente se ha encontrado que, en este caso, una grasa o aceite que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente extraído de microorganismos, tienen un contenido significativamente más bajo de esterol de tipo éster.

Asimismo, se ha encontrado que, incluso en el caso de un tanque de cultivo con d/D = menor a 0,34, se puede lograr un aumento en la productividad de un ácido graso altamente insaturado mediante microorganismos y una reducción en el contenido de esterol de tipo éster mediante la esterilización de la fuente de nitrógeno en el medio con un valor de pH no mayor a 5,0.

En base a esto, los inventores de la presente invención han llevado adelante estudios extensivos e intensivos y, como resultado, han logrado producir de forma estable grasa o aceite (aceite crudo) con un menor contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster adoptando un método en el que el cultivo se lleva a cabo en un tanque de cultivo con un impulsor de agitación con d/D no menor a 0,34, o adoptando un método en el que, en el caso del tanque de cultivo con d/D = menor a 0,34, el cultivo se lleva a cabo en un medio que contiene una fuente de nitrógeno que ha sido esterilizada a un valor de pH no mayor a 5. Esto condujo a que se completara la presente invención.

La presente invención de acuerdo con la reivindicación 1 proporciona un proceso para la producción de un aceite crudo con un contenido de materia insaponificable no mayor al 2,2 % en peso y/o con un contenido de esterol de tipo éster no mayor al 1,0 % en peso y que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente, que se caracteriza por un microorganismo capaz de producir una grasa o aceite que comprende un ácido graso insaturado como ácido graso constituyente, se cultiva en un medio que contiene una concentración de fuente de nitrógeno entre 2 y 15% dentro de un tanque de cultivo equipado con un impulsor de agitación que cumple con el requisito de que la relación del diámetro del impulsor de agitación (= d) y el diámetro interno del tanque de cultivo (= D) es d/D = entre 0,30 y 0,6.

Una grasa o aceite refinados se producen refinando el aceite crudo anteriormente mencionado.

Un alimento y una bebida general, un alimento funcional, un suplemento de nutrición, una fórmula infantil para bebés prematuros, una fórmula infantil para bebés maduros, un alimento para lactantes, un alimento para madres embarazadas y en período de lactancia o un alimento para personas mayores, puede tener incorporado un aceite crudo y/o una grasa o aceite refinados, preparados de la forma descrita.

Un alimento para nutrición terapéutico puede tener incorporado aceite crudo y/o grasa o aceite refinados, preparados de la forma descrita, opcionalmente, junto con un vehículo adecuado para administración oral, intrarectal o parenteral.

Un alimento para animales o peces puede tener incorporado aceite crudo y/o grasa o aceite refinados, preparados de la forma descrita.

Una composición farmacéutica puede tener incorporado aceite crudo y/o grasa

o aceite refinados, preparados de la forma descrita o puede emplearse como materia prima. Realizaciones de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para la producción de grasa o aceite (aceite crudo) con menor contenido de materia insaponificable y/o esterol de tipo éster y que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente, y para la producción de alimentos y bebidas, alimentos para nutrición terapéuticos, alimentos para animales y preparaciones farmacéuticas mediante la incorporación de grasa o aceite refinados (triglicérido) producto del refinado de la grasa o aceite (aceite crudo).

La grasa o aceite (aceite crudo) son grasa o aceite microbianos obtenidos a partir un producto de un cultivo preparado mediante el cultivo de un microorganismo capaz de producir una grasa o aceite que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente en un medio que contiene una concentración de fuente de nitrógeno entre 2 % y 15%. La grasa o aceite (aceite crudo) tiene un menor contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster obtenido a través del cultivo en un tanque de cultivo equipado con un impulsor de agitación de d/D = 0,34 hasta 0,6 o del cultivo en un medio que contiene una fuente de nitrógeno esterilizado a un valor de pH no mayor a 5 cuando se emplea un tanque de cultivo de d/D = menor a 0,34.

Específicamente, la grasa o aceite (aceite crudo) tiene un contenido de materia insaponificable no mayor al 2,2% en peso, preferentemente no mayor al 2,0% en peso, más preferentemente no mayor al 1,8% en peso y/o un contenido de esterol de tipo éster no mayor al 1,0% en peso, preferentemente no mayor al 0,8% en peso, más preferentemente no mayor al 0,6% en peso, y un contenido de ácido graso altamente insaturado, basado en el ácido graso total en la grasa o aceite (aceite crudo), de no menos del 10% en peso, preferentemente no menos del 20% en peso, más preferentemente no menos del 30% en peso, incluso más preferentemente no menos del 40% en peso. Por lo tanto, se debe llevar a cabo el cultivo de un microorganismo capaz de producir una grasa o aceite (triglicérido) que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente.

Es deseable que los microorganismos referidos en la presente sean microorganismos que puedan producir, principalmente como un ácido graso constituyente de triglicérido, al menos un ácido graso altamente insaturado seleccionado de ácidos grasos altamente insaturados �6 con 18 o más átomos de carbono y 3 o más enlaces dobles, ácidos grasos altamente insaturados �9 con 18 o más átomos de carbono y 2 o más enlaces dobles y ácidos grasos altamente insaturados �3 con 18 o más átomos de carbono y 3 o más enlaces dobles.

Los ácidos grasos altamente insaturados �6 con 18 o más átomos de carbono y 3 o más enlaces dobles incluyen ácido �-linolénico (ácido 6,9,12-octadecatrienoico), ácido dihomo-�-linolénico (ácido 8,11,14-eicosatrienoico), ácido araquidónico (ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico), ácido 7,10,13,16-docosatetraenoico (22:4 �6) y DPA �6 (ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico). Los ácidos grasos altamente insaturados �9 con 18 o más átomos de carbono y 2 o más enlaces dobles incluyen ácido 6,9octadecadienoico, ácido 8,11-eicosadienoico y ácido Mead (ácido 5,8,11eicosatrienoico) y ácidos grasos altamente insaturados �3 con 18 o más átomos de carbono y 3 o más enlaces dobles, incluyen ácido �-linolénico (ácido 9,12,15octadecatrienoico), ácido 6,9,12,15-octadecatetraenoico (18:4 �3), ácido 8,11,14,17eicosatetraenoico (20:4 �3), EPA (ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico), DPA�3 (ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico) y DHA (ácido 4,7,10,13,16,19docosahexaenoico).

En consecuencia, en la presente invención se pueden usar todos los microorganismos, siempre y cuando puedan producir grasa o aceite (triglicéridos) que comprenda ácidos grasos altamente insaturados como ácidos grasos constituyentes. Los microorganismos capaces de producir grasa o aceite (triglicéridos) que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente incluyen, por ejemplo, microorganismos pertenecientes al género Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophtbora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium y Saprolegnia.

Los microorganismos pertenecientes al subgénero Mortierella incluyen, por ejemplo, el subgénero Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, y Mortierella alpina. Ejemplos específicos de los mismos incluyen cepas de Mortierella elongata (IFO 8570), Mortierella exigua (IFO 8571), Mortierella hygrophila (IFO 5941), Mortierella alpina (IFO 8568), ATCC 16266, ATCC 32221, ATCC 42430, CBS 219,35, CBS 224,37, CBS 250,53, CBS 343,66, CBS 527,72, CBS 529,72, CBS 608,70 y CBS 754,68.

Por ejemplo, también se pueden mencionar los microorganismos pertenecientes al género Crypthecodenium, Thraustochytrium, Schizochytrium, Ulkenia, Japonochytrium o Haliphthoros como microorganismos capaces de producir DHA.

Todas estas cepas están disponibles sin ninguna restricción en el Institute for Fermentation, Osaka (IFO), American Type Culture Collection (ATCC) y Centraalbureau voor Schimmelelcultures (CBS). Asimismo, también se puede utilizar una cepa aislada del suelo por parte de un grupo de investigadores de la presente invención, es decir, Mortierella elongata SAM 0219 (FERM P-8703) (FERM BP-1239).

Con el fin de cultivar la cepa utilizada en la presente invención, se inoculan esporas, micelios o una solución de cultivo de siembra obtenida mediante un cultivo previo o células recogidas a partir de un cultivo de siembra, en un medio líquido seguido de un cultivo principal. En el caso de un medio líquido, las fuentes de carbono utilizables en la presente incluyen, a modo no taxativo, aquellas utilizadas comúnmente en la técnica, por ejemplo, glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melaza, glicerol, manitol y almidones sacarificados.

Las fuentes de nitrógeno incluyen fuentes naturales de nitrógeno, tales como peptonas, extractos de levadura, extractos de malta, extractos de carne, ácidos casamino, licor de maceración del maíz, proteínas de soja, soja desgrasada y comidas de semilla de algodón, fuentes orgánicas de nitrógeno, tales como urea y fuentes inorgánicas de nitrógeno, tales como nitrato de sodio, nitrato de amonio y sulfato de amonio. En particular, como fuentes de nitrógeno se pueden mencionar las fuentes de nitrógeno obtenidas a partir de la soja, específicamente soja, soja desgrasada, hojuelas de soja, proteínas de soja comestibles, residuos de la cuajada de soja, leche de soja y harina de soja. En particular, soja desgrasada desnaturalizada por calor, más preferentemente, se pueden utilizar productos preparados mediante tratamiento por calor de soja desgrasada entre aproximadamente 70 y 90°C y eliminando un componente soluble en etanol, solos o en una combinación de dos o más de ellos o en una combinación de los mismos con la fuente de nitrógeno mencionada anteriormente.

Asimismo, de ser necesario, se pueden utilizar iones de fosfato, iones de potasio, iones de sodio, iones de magnesio, iones de calcio, y, además, iones metálicos, como por ejemplo, hierro, cobre, zinc, manganeso, níquel e iones de cobalto y vitaminas como nutrientes menores.

Las concentraciones de estos componentes de medios hasta ahora no están particularmente limitadas ya que no se inhibe el crecimiento de microorganismos. En la práctica, la cantidad total de las fuentes de carbono agregada es generalmente entre 0,1 y 40% en peso, preferentemente entre 1 y 25% en peso, y la cantidad total de fuentes de nitrógeno agregada es entre 2 y 15% en peso, más preferentemente entre 2 y 10% en peso. Más preferentemente, la cantidad inicial de fuentes de carbono agregada es entre 1 y 5% en peso, y la cantidad inicial de fuentes de nitrógeno agregada es entre 3 y 8% en peso, y, en el curso del cultivo, se alimenta la fuente de carbono y la fuente de nitrógeno y, más preferentemente, únicamente la fuente de carbono.

Con el fin de aumentar el rendimiento de los ácidos grasos insaturados, se pueden utilizar, por ejemplo, hidrocarburos tales como hexadecano u octadecano; ácidos grasos o sales de los mismos, tales como ácido oleico o ácido linoleico; o ésteres de ácido graso, tales como ésteres de etilo, ésteres de ácido graso de glicerina

o ésteres de ácido graso de sorbitán; o grasa o aceite tales como aceites de oliva, aceites de soja, aceites de colza, aceites de semilla de algodón o aceites de palma, como precursores de ácido grasos insaturados, solos o en combinación. La cantidad de sustrato agregado es entre 0,001 y 10%, preferentemente entre 0,5 y 10 % dependiendo del medio. También se puede llevar a cabo el cultivo utilizando estos sustratos como única fuente de carbono.

La temperatura de cultivo de los microorganismos, que producen ácidos grasos altamente insaturados, varía dependiendo del microorganismo usado. Sin embargo, la temperatura del cultivo puede ser entre 5 y 40 ºC, preferentemente entre 20 y 30 °C. También se puede utilizar un método en el que el cultivo se lleva a cabo entre 20 y 30 °C para cultivar células y el cultivo se continúa luego entre 5 y 20°C para producir ácidos grasos insaturados. También se puede aumentar la proporción de un ácido graso altamente insaturado en el ácido graso producido con este control de temperatura.

El cultivo de siembra se lleva a cabo mediante un cultivo de aireación-agitación un cultivo de trepidación, un cultivo sólido o un cultivo líquido estacionario y el cultivo principal se lleva a cabo mediante un cultivo de aireación-agitación. Al momento de comenzar el cultivo principal (momento de la inoculación de la solución del cultivo de siembra) se ajusta el medio a un pH entre 5 y 7, preferentemente entre 5,5 y 6,5. Generalmente, el cultivo general se lleva a cabo durante 2 a 30 días, preferentemente 5 a 20 días, más preferentemente 5 a 15 días.

La grasa o aceite (aceite crudo) son grasa o aceite microbianos obtenidos a partir de un producto de cultivo preparado mediante el cultivo de un microorganismo capaz de producir una grasa o aceite (triglicérido) que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente, y la característica más importante de la presente invención es que se reduce el contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster del aceite crudo realizando el cultivo principal en un tanque de cultivo equipado con un impulsor de agitación de d/D = entre 0,34 y 0,6 o realizando el cultivo en un medio que contiene una fuente de nitrógeno esterilizado a un valor de pH no mayor a 5 cuando se emplea un tanque de cultivo de d/D = menor a 0,34. Por consiguiente, la presente invención ha desarrollado un método que puede disminuir el contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster en el aceite crudo mediante el uso de microorganismos capaces de producir grasa o aceite (triglicéridos) que comprende ácidos grasos altamente insaturados como ácido graso constituyente.

En el método de cultivo de acuerdo con la presente invención, la característica más importante es que se puede reducir el contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster en el aceite crudo mediante el cultivo en un tanque de cultivo con d/D (la relación del diámetro del impulsor de agitación (= d) y el diámetro interno del tanque de cultivo (= D)) = entre 0,34 y 0,6, preferentemente d/D = entre 0,34 y 0,55, más preferentemente d/D = entre 0,37 y 0,55, incluso más preferentemente d/D = entre 0,42 y 0,55. Con el fin de obtener un mejor efecto con la relación d/D, es deseable el uso de un tanque de cultivo con un volumen no menor a 1 m3, preferentemente no menor a 5 m3, más preferentemente no menor a 10 m3. Con respecto al impulsor de agitación, se pueden emplear impulsores de agitación con aspas de turbina en una etapa o en una pluralidad de etapas sin ninguna limitación particular.

Cuando se realiza un ajuste del pH del medio luego de la esterilización del medio, el procedimiento de ajuste debe llevarse a cabo de forma aséptica con cuidado de no contaminarse de microorganismos no deseables. Por lo tanto, el ajuste del pH se lleva a cabo generalmente antes de la esterilización del medio. Por ejemplo, cuando un medio, que no causa ningún cambio de pH tras la esterilización, se ajusta a un pH 6,0 al momento de iniciar el cultivo, el ajuste del pH del medio de una forma no aséptica en 6,0 antes de la esterilización, elimina la necesidad del ajuste de pH aséptico luego de la esterilización. Con el fin de reducir el esterol de tipo éster incluso en un tanque de cultivo de d/D = menor a 0,34, los inventores de la presente invención apuntaron a y realizaron estudios sobre la influencia de las condiciones de pH en el paso de la esterilización sobre la productividad del cultivo y la composición del cultivo. Como resultado, los inventores de la presente invención encontraron que, antes de la esterilización de un medio ajustado a un pH no mayor a 5, es preferible el reajuste del pH a un valor adecuado para el inicio del cultivo luego de la esterilización.

Específicamente, una solución que contiene una fuente de nitrógeno del medio se ajusta a un pH entre 4 y 5, preferentemente un pH entre 4,2 y 4,7, seguido de la esterilización. Se utiliza el medio esterilizado como tal u, opcionalmente, luego de la adición de otro medio que debe ser esterilizado, para preparar un medio de inicio del cultivo que luego se ajusta a un pH entre 5 y 7, preferentemente entre 5,5 y 6,5. Se inocula una solución de cultivo de siembra en el medio para iniciar el cultivo principal. Los ajustadores del pH utilizables para ajustar el pH de la fuente de nitrógeno que contiene la solución antes de la esterilización incluyen, a modo no taxativo, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y ácido carbónico o sales de los mismos, utilizados solos o en una combinación de dos o más de ellos. Los reajustadores del pH del medio luego de la esterilización incluyen, a modo no taxativo, compuestos hidróxidos, tales como hidróxido de sodio e hidróxido de potasio y amoníaco y sales de amonio, utilizados solos o en una combinación de dos o más de ellos.

Se sabe que los microorganismos pertenecientes al subgénero Mortierella del género Mortierella son capaces de producir una grasa o aceite (triglicéridos) que comprende ácido araquidónico como principal acido graso constituyente. Los inventores de la presente invención han obtenido microorganismos capaces de producir una grasa o aceite (triglicérido) que comprende ácido dihomo-�-linolénico como principal ácido graso constituyente (JP-A-5/091887 y EP-A-0525940) y microorganismos capaces de producir grasa o aceite que comprende ácidos grasos altamente insaturados �9 como principal ácido graso (triglicérido) constituyente (JP-A5/091888 y EP-A-0535939 sometiendo las cepas anteriormente mencionadas a tratamiento de mutación.

Asimismo, los inventores de la presente invención también han obtenido microorganismos resistentes a una fuente de carbono altamente concentrada (WO 98/39468). Los microorganismos anteriormente mencionados son microorganismos pertenecientes al subgénero Mortierella del género Mortierella, y el contenido de materia insaponificable y/o esterol de tipo éster de un aceite crudo puede disminuirse fácilmente mediante el método de cultivo de la presente invención, específicamente mediante el cultivo principal en un tanque equipado con un impulsor de agitación de d/D = entre 0,34 y 0,6, o mediante el cultivo principal en un medio que contiene una fuente de nitrógeno esterilizado a un valor de pH de no más de 5 y con una concentración de fuente de nitrógeno en el medio entre 2 y 15 % cuando se emplea un tanque de cultivo de d/D = menor a 0,34.

Los microorganismos utilizados en la presente invención, sin embargo, no se limitan a los pertenecientes al subgénero Mortierella del género Mortierella y se pueden producir los aceites crudos contemplados con menor contenido de materia insaponificable y/o esterol de tipo éster mediante la aplicación, a microorganismos capaces de producir grasa o aceite (triglicéridos) que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente, del método de cultivo de acuerdo con la presente invención, específicamente mediante el cultivo principal en un tanque de cultivo equipado con un impulsor de agitación de d/D = entre 0,34 y 0,6, o mediante el cultivo principal en un medio que contiene una fuente de nitrógeno esterilizado a un valor de pH de no más de 5 y con una concentración de fuente de nitrógeno en el medio entre 2 y 15 % cuando se emplea un tanque de cultivo de d/D = menor a 0,34.

Los métodos aplicables para proporcionar un aceite crudo a partir de microorganismos que han acumulado una grasa o aceite que contiene un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente con menor contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster producido mediante el cultivo principal en un tanque de cultivo equipado con un impulsor de agitación de d/D = 0,34 a 0,6, o mediante el cultivo principal en un medio que contiene una fuente de nitrógeno esterilizada a un valor de pH de no más de 5 y con una concentración de fuente de nitrógeno en el medio entre 2 y 15 % cuando se emplea un tanque de cultivo de d/D = menor a 0,34, incluyen un método en el que, luego de finalizado el cultivo, la solución de cultivo como tal, o luego de un tratamiento, tal como esterilización, concentración o acidificación, se somete a medios de separación sólido-líquido convencionales, tales como sedimentación simple, centrifugación y/o filtración, para recoger las células cultivadas.

Se pueden agregar los agentes coagulantes o adyuvantes de filtración para auxiliar la separación sólido-líquido. Los agentes coagulantes incluyen, por ejemplo, cloruro de aluminio, cloruro de calcio, algina y quitosano. Los adyuvantes de filtración incluyen, por ejemplo, tierras de diatomeas. Las células cultivadas se lavan preferentemente con agua, se trituran y se secan. El secado se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante liofilización, secado por aire o secado por lecho fluidizado. Los medios de obtención de aceite crudo a partir de células secas pueden ser extracción con un disolvente orgánico o exprimido. Sin embargo, es preferible, la extracción con un disolvente orgánico bajo vapor de gas de nitrógeno.

Los disolventes orgánicos incluyen etanol, hexano, metanol, etanol, cloroformo, diclorometano, éter de petróleo y acetona. También se puede utilizar la alternación de la extracción con metanol y éter de petróleo y la extracción con un disolvente de fase única de cloroformo-metanol-agua. Sin embargo, los métodos de extracción para la obtención de aceite crudo no se limitan a los métodos anteriormente mencionados y se puede utilizar cualquier método que pueda extraer de forma eficiente grasa o aceite acumulados dentro de las células. Por ejemplo, se puede utilizar la extracción supercrítica como un método efectivo.

Un aceite crudo objetivo se puede obtener mediante la eliminación del disolvente orgánico o el componente de fluido supercrítico del extracto obtenido mediante la extracción de un disolvente orgánico o un fluido supercrítico bajo presión reducida u otras condiciones. Asimismo, alternativamente, la extracción puede llevarse a cabo empleando células húmedas. En este caso, se utilizan disolventes compatibles con agua, como por ejemplo, metanol, etanol y acetona o disolventes mezclados compatibles con agua y formados por los disolventes mencionados anteriormente y agua y/u otros disolventes. Los otros procedimientos son iguales a los descritos anteriormente.

El aceite crudo con menor contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster y que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente producido de acuerdo con la presente invención se puede mezclar con un alimento animal para uso directo. Cuando se toma en consideración su aplicación en alimentos, sin embargo, antes de usarse, preferentemente el aceite crudo se somete a un proceso de refinado de grasa o aceite convencional. Los procesos de refinado de grasa o aceite, aplicables en la presente, incluyen procesos convencionales, tales como desgomado, desoxidación, desodorización, decoloración, tratamiento por columna, destilación molecular e hibernación. Por lo tanto, se puede obtener grasa o aceite refinados, de los cuales se ha reducido el contenido de materia insaponificable contenido y/o esterol de tipo éster de una forma sin precedentes, sometiendo el aceite crudo obtenido de acuerdo con el presente proceso, con un contenido bajo de esterol de tipo éster inalcanzable mediante los procesos convencionales de refinado de grasa o aceite, a procesos de refinado de grasa y aceite.

También se puede disminuir la carga del proceso en el proceso de refinado sometiendo el aceite crudo obtenido de acuerdo con el presente proceso al proceso de refinado de grasa o aceite. Específicamente, por ejemplo, se puede proporcionar una grasa o aceite refinados con un contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster igual al de la técnica anterior incluso después de una reducción en el tiempo de tratamiento del proceso de refinado y una reducción en el costo energético. Asimismo, se puede proporcionar una grasa o aceite refinados con un contenido de materia insaponificable y/o de esterol de tipo éster menor que el de la técnica anterior, empleando el mismo tiempo de tratamiento y costo energético que en la técnica anterior.

La grasa o aceite refinados (triglicérido) son aplicables en un rango infinito de aplicaciones, por ejemplo, en materias primas y aditivos para alimentos, bebidas, cosméticos y preparaciones farmacéuticas, y su propósito y cantidad de uso no están limitados.

Por ejemplo, las composiciones, en las que se puede utilizar grasa o aceite refinados, incluyen alimentos en general y, además, alimentos funcionales, suplementos de nutrición, formulas para bebes prematuros, fórmulas para bebes maduros, fórmulas infantiles, alimentos para lactantes, alimentos para mujeres embarazadas y en período de lactancia o alimentos para personas mayores.

Ejemplos de alimentos que contienen grasa o aceite incluyen: alimentos naturales que contienen inherentemente grasa o aceite, tales como carne, pescado o avellanas; alimentos a los cuales se les agrega grasa o aceite al momento de la cocción, tales como sopas; alimentos que utilizan grasa o aceite como medio de calentamiento, tales como rosquillas; alimentos con grasa o aceite, como por ejemplo, manteca; alimentos procesados a los cuales se agregan grasa o aceite al momento del procesamiento, tales como galletitas o bizcochos; o alimentos que se espolvorean o cubren con grasa o aceite al momento de la finalización del proceso, tales como galletas marineras. Asimismo, se puede agregar grasa o aceite refinados a alimentos agrícolas libres de grasa y aceite, alimentos fermentados, alimentos ganaderos, alimentos marinos o bebidas. La grasa o aceite refinados se pueden utilizar en forma de alimentos funcionales y preparaciones farmacéuticas, por ejemplo, se pueden utilizar en formas procesadas como por ejemplo, nutrientes enterales, polvos, gránulos, pastillas, líquidos para uso interno, suspensiones, emulsiones y jarabes.

EJEMPLOS

La presente invención se describirá más detalladamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, se debe tener en cuenta que la presente invención no se limita únicamente a estos ejemplos.

Ejemplo 1: Producción de ácido araquidónico, d/D = 0,34, concentración de harina de soja en medio = 6%

Se proporcionó Mortierella alpina (CBS 754,68) como un hongo que produce ácido araquidónico. Se inoculó una cepa estándar de Mortierella alpina en un medio (extracto de levadura al 1%, glucosa al 2%, pH 6,3). El cultivo de siembra (primera

etapa) se inició en condiciones de agitación recíproca a 100 rpm y a una temperatura de 28°C y el cultivo de siembra se continuó durante 3 días. Luego, se prepararon 30 L de un medio (extracto de levadura al 1%, glucosa al 2%, aceite de soja al 0,1%, pH 6,3) en un tanque de cultivo de aireación-agitación con un volumen de 50 L. Se inoculó la solución de cultivo de siembra (primera etapa) en el medio. Se comenzó el cultivo de siembra (segunda etapa) en condiciones de velocidad de agitación de 200 rpm, 28°C de temperatura y 150 kPa de presión interna del tanque, y se continuó el cultivo de siembra durante 2 días.

Luego, se prepararon 4500 L de un medio (medio A: 336 kg de harina de soja, 16,8 kg de KH2PO4, 2,8 kg de MgCl2 6H2O, 2,8 kg de CaCl2 2H2O, 5,6 kg de aceite de soja). El medio se ajustó a pH 6,3 para la condición (1-1) y a pH 4,5 para la condición (1-2). Tanto el medio para la condición (1-1) como el medio para la condición (1-2) se esterilizaron en condiciones de 121°C y 20 min. El medio C se preparó como otro medio esterilizando 1000 L de un medio (medio B: 112 kg de monohidrato de glucosa) en condiciones de 140°C durante 40 seg. y agregando el medio esterilizado al medio A mencionado anteriormente. El medio C como tal, se utilizó para la condición (1-1), y el medio C se ajustó a pH 6,3 para la condición (1-2). El cultivo de siembra (segunda etapa) se inoculó en el medio así preparado y el volumen se ajustó a una cantidad inicial de la solución de la solución de cultivo de 5600 L en total (volumen del tanque de cultivo: 10 kL).

El cultivo se inició en condiciones de 26°C de temperatura, velocidad de flujo de aire de 49 Nm3/ h y presión interna 200 kPa.

La forma del tanque de cultivo era tal que se proporcionaron turbinas de seis aspas en tres etapas y la relación del diámetro del impulsor de agitación (= d) y el diámetro interno del tanque (= D) era d/D = 0,34. Mientras se alimentaba un medio, como se indica en la Tabla 1, el cultivo principal se llevó a cabo durante 306 hs. Al final del cultivo, la cantidad de solución de cultivo era 7750 L debido a la influencia de un aumento en la cantidad de la solución mediante la alimentación de un medio y una reducción en la cantidad de solución mediante la evaporación de la solución. Al final del cultivo, la concentración de ácido araquidónico producido por litro de solución de cultivo fue de 18,2 g/L para la condición (1-1) y 18,4 g/L para la condición (1-2).

21 Tabla 1: Alimentación del medio en el Ejemplo 1

Tiempo del cultivo principal: Alimentación del medio

Luego de 19 horas: monohidrato de glucosa 280 kg/460 L

Luego de 43 horas: monohidrato de glucosa 280 kg/450 L

Luego de 67 horas: monohidrato de glucosa 252 kg/390 L

Luego de 91 horas: monohidrato de glucosa 252 kg/410 L

Luego de 120 horas: monohidrato de glucosa 224 kg/370 L

Luego de 140 horas: monohidrato de glucosa 168 kg/280 L

Luego de 163 horas: monohidrato de glucosa 168 kg/270 L

Luego de finalizado el cultivo, se esterilizó la solución de cultivo en condiciones de 120°C durante 20 min. Luego se recolectaron las células húmedas mediante un 5 deshidratador continuo. Las células húmedas recolectadas se secaron en un secador de lecho fluidizado por vibración hasta alcanzar un contenido de agua del 1% en peso. Las células secas se transportaron por una máquina de transporte de aire a un espacio de llenado y junto con el gas de nitrógeno se colocaron dentro de un saco contenedor de una bolsa de aluminio con un volumen de aproximadamente 1 m3. Se

10 selló la abertura y luego el saco contenedor se almacenó en un refrigerador a 10 ºC o menos.

Se retiraron las células secas del saco contenedor y se sometieron a extracción con hexano. Se eliminó la materia sólida de la solución de hexano por filtración. Luego se calentó el filtrado bajo presión reducida para el eliminar hexano y producir un aceite

15 crudo que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente. Se analizó el aceite crudo. Como resultado, como se indica en la Tabla 2, el aceite crudo tuvo un contenido bajo de esterol de tipo éster.

20

22 Tabla 2: Valor encontrado para aceite crudo que contiene ácido araquidónico

Ejemplo: Ejemplo 1 Condición 1-1 Ejemplo 1 Condición 1-2

Forma del tanque de cultivo, d/D: 0,34 0,34

Valor del pH ajustado del medio A (antes de la esterilización) Valor del pH del medio C (luego de la esterilización y antes de la inoculación de la solución de cultivo de siembra): 6,3 6,3 4,5 6,3

%p de cada fracción Triglicérido Materia insaponificable Esterol de tipo éter: 94,0% 2,0% 0,8% 94,2% 1,8% 0,6%

Acido araquidónico en total de ácido graso en aceite crudo, %: 42,0% 42,1%

Ejemplo 2: Producción de ácido araquidónico, d/D = 0,42, concentración de harina de soja en medio = 6%

5 El cultivo de siembra se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 1. El cultivo principal se llevó a cabo en las mismas condiciones que en la condición (1-1) del Ejemplo 1, excepto que la forma del tanque de cultivo era tal que las turbinas de 6 aspas de d/D = 0,42 se proporcionaron en tres etapas y se variaron las condiciones de pH para la preparación del medio. Para el cultivo en la condición (2-1), el medio A

10 (antes de la esterilización) se ajustó a pH 6,1 y no se realizó ningún ajuste de pH para el medio C (antes de la inoculación de la solución de cultivo de siembra). Para el cultivo en la condición (2-2), el medio A se ajustó a pH 4,5, y el medio C se ajustó a pH 6,1. Como resultado del cultivo, la concentración de ácido araquidónico producido por litro de solución de cultivo al final del cultivo fue de 19,0 g/L para la condición (2-1) y

15 19,7 g/L para la condición (2-2). Luego de finalizado el cultivo, se obtuvo un aceite crudo que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente, de la misma manera que en el Ejemplo 1. Se analizó el aceite crudo. Como resultado, como se indica en la Tabla 3, el aceite crudo tuvo un contenido bajo de esterol de tipo éster.

23 Tabla 3: Valor encontrado para el aceite crudo que contiene ácido araquidónico

Ejemplo: Ejemplo 2 Condición 2-1 Ejemplo 2 Condición 2-2

Forma del tanque de cultivo, d/D: 0,42 0,42

Valor del pH ajustado del medio A (antes de la esterilización) Valor del pH del medio C (luego de la esterilización y antes de la inoculación de la solución de cultivo de siembra): 6,1 6,1 4,5 6,1

%p de cada fracción Triglicérido Materia insaponificable Esterol de tipo éter: 94,2% 1,8% 0,6% 93,5% 1,6% 0,5%

Acido araquidónico en total de ácido graso en aceite crudo, %: 42,2% 41,3%

Ejemplo 3: Producción de ácido araquidónico, d/D = 0,3, 0,25 y 0,2, concentración de harina de soja en el medio = 6 %

5 El cultivo de siembra se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 1. El cultivo principal se llevó a cabo en las mismas condiciones que en la condición (1-1) en el Ejemplo 1, excepto que, con respecto a la forma del tanque de cultivo, se utilizaron un tanque equipado con turbinas de seis aspas de d/D = 0,3 en dos etapas, un tanque equipado con turbinas de seis aspas de d/D = 0,25 en dos etapas y un

10 tanque equipado con turbinas de seis aspas de d/D = 0,2 en dos etapas. Como resultado del cultivo, la concentración de ácido araquidónico producida por litro de solución de cultivo al final del cultivo fue de 17,0 g/L para el tanque de d/D = 0,30, 16,5 g/L para el tanque de d/D = 0,25 y 13,5 g/L para el tanque de d/D = 0,2. Luego de finalizado el cultivo, el aceite crudo que comprende ácido araquidónico como ácido

15 graso constituyente se obtuvo de la misma manera que en el Ejemplo 1. Se analizó el aceite crudo. Como resultado, como se indica en la Tabla 4, para todos los casos, el contenido de esterol de tipo éster excedió el 1 %. De la comparación de los resultados del Ejemplo 3 con los resultados de los Ejemplos 1 y 2, se considera que el alto contenido de esterol de tipo éster responde al tanque de cultivo con una baja relación

20 d/D.

Tabla 4. Valores encontrados para el aceite crudo que contiene ácido araquidónico

Ejemplo o ejemplo testigo: Ejemplo 3 Ej. testigo Ejemplo 3 Ej. testigo Ejemplo 3 Ej. testigo

Forma del tanque de cultivo, d/D: 0,30 0,25 0,20

Valor del pH ajustado del medio A (antes de la: 6,3 6,3 6,3

esterilización) Valor del pH del medio C (luego de la esterilización y antes de la inoculación de la solución de cultivo de siembra): 6,3 6,3 6,3

%p de cada fracción

Triglicérido: 93,8% 93,1% 93,0%

Materia insaponificable: 2,9% 2,9% 2,9%

Esterol de tipo éter: 1,2% 1,2% 1,2%

Acido araquidónico en total de ácido graso en aceite crudo, %: 42,0% 41,6% 41,5%

Ejemplo 4: Producción de ácido araquidónico, d/D = 0,3, 0,25, y 0,2, 5 concentración de harina de soja en el medio = 6 %, baja esterilización de pH

El cultivo de siembra se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 1. El ajuste del pH del medio en el cultivo principal se llevó a cabo de la misma manera que en la condición (1-2) del Ejemplo 1 (medio A (pH 4,5) � esterilización � medio C (pH 6,3)). A continuación, el cultivo principal se llevó a cabo en tres condiciones en

10 total, es decir, condición 4-1 con un tanque equipado con turbinas de seis aspas de d/D = 0,3 en dos etapas, condición 4-2 con un tanque equipado con turbinas de seis aspas de d/D = 0,25 en dos etapas y condición 4-3 con un tanque equipado con turbinas de seis aspas de d/D = 0,2 en dos etapas de la misma manera que en el Ejemplo 1. Además de los experimentos mencionados anteriormente, el cultivo se

15 llevó a cabo empleando un tanque de d/D = 0,3 en esas dos condiciones adicionales, el medio A se ajustó a pH 4,0 para la condición 4-4 y a pH 4,9 para la condición 4-5.

Como resultado del cultivo principal, la concentración de ácido araquidónico

producido por litro de solución de cultivo al término del cultivo fue de 17,2 g/L para la

condición (4-1) [esterilización a pH 4,5, d/D = 0,30], 16,8 g/L para la condición (4-2)

20 [esterilización a pH 4,5, d/D = 0,25], 14,0 g/L para la condición (4-3) [esterilización a pH 4,5, d/D = 0,20), 17,1 g/L para la condición (4-4) [esterilización a pH 4,0, d/D = 0,30], y 17,2 g/L para la condición (4-5) [esterilización a pH 4,9, d/D = 0,30]. Luego de finalizado el cultivo, se repitió el procedimiento del Ejemplo 1 para producir un ácido araquidónico como un ácido graso constituyente.

5 Los resultados del análisis del aceite crudo se muestran en la Tabla 5. La comparación de los resultados del Ejemplo 3 con los resultados del Ejemplo 4 muestra que en el tanque de cultivo de d/D = 0,30, la esterilización de la fuente de nitrógeno del medio a pH 4,5 podría reducir el contenido de esterol de tipo éster a no más del 1 %. En el tanque de cultivo de d/D = 0,25 y el tanque de d/D = 0,20, sin embargo, a pesar

10 de la esterilización de la fuente de nitrógeno a pH 4,5, el contenido de esterol de tipo éster no pudo reducirse a más del 1%. Asimismo, la comparación entre los resultados de las condiciones (4-1), (4-4) y (4-5) indica que la esterilización de la fuente de nitrógeno a un pH en el rango de 4,0 a 4,9 se considera que presenta iguales resultados de reducción de esterol de tipo éster.

15 Tabla 5: Valores encontrados para el aceite crudo que contiene ácido

araquidónico.

Ejemplo o: Ejemplo 4 Ejemplo 4 Ejemplo 4 Ejemplo 4 Ejemplo 4

ejemplo testigo: Condición 4-1 Condición 4-2 (Ej. testigo) Condición 4-3 (Ej. testigo) Condición 4-4 Condición 4-5

Forma del tanque de cultivo, d/D: 0,30 0,25 0,20 0,30 0,30

Valor del pH

ajustado del medio A (antes de la esterilización) Valor del pH del medio C (luego de: 4,5 4,5 4,5 4,0 4,9

la esterilización y antes de la inoculación de la solución de cultivo de siembra): 6,3 6,3 6,3 6,3 6,3

%p de cada fracción

Triglicérido: 93,8% 93,1% 93,0% 93,5% 93,4%

Materia insaponificable: 2,2% 2,5% 2,7% 2,1% 2,1%

Esterol de tipo éter: 1,0% 1,1% 1,1% 1,0% 1,0%

Acido araquidónico en total de ácido graso en aceite crudo, %: 42,0% 40,8% 40,8% 41,5% 41,7%

Ejemplo 5: Resultados del análisis de grasa o aceite refinados obtenidos por el refinado de aceite crudo Se refinaron aceites crudos que contienen ácido araquidónico preparados

5 según la condición (1-1) del Ejemplo 1 y la condición (2-1) del Ejemplo 2 mediante métodos convencionales de desoxidación y desgomado para producir grasa o aceite refinados 5-A y 5-B. Se refinó el aceite crudo que contiene ácido araquidónico preparado en la condición d/D = 0,25 del Ejemplo 3 de la misma manera descrita anteriormente para producir grasa o aceite refinados 5-C. Los valores encontrados

10 para la grasa o aceite refinados que contienen ácido araquidónico se indican en la Tabla 6. Tabla 6. Resultados del análisis del Ejemplo 5 (valores encontrados para grasa

o aceite refinados A, B y C que contiene ácido araquidónico)

Ejemplo o ejemplo testigo: Ejemplo 1 (Condición 11) Ejemplo 2 (Condición 21) Ejemplo 3 (d/D = 0,25) (Ej. testigo)

Grasa o aceite refinados: 5-A 5-B 5-C

%p de cada fracción Triglicérido Materia insaponificable Esterol de tipo éter: 96,0% 1,4% 0,8% 96,4% 1,2% 0,6% 95,0% 2,0% 1,2%

Acido araquidónico en total de ácido graso en aceite crudo, %: 42,4% 42,8% 41,7%

15 Ejemplo 6: Producción de ácido araquidónico en condición de 1,5% de harina de soja

Se proporcionó Mortierella alpina (CBS 754,68) y el cultivo de siembra (primera etapa y segunda etapa) se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 1. Luego, se esterilizaron 4500 L de un medio (medio A: 84 kg de harina de soja, 16,8 kg

20 de KH2PO4, 2,8 kg de MgCl2 6H2O, 2,8 kg de CaCl2 2H2O, 5,6 kg de aceite de soja) en condiciones de 121°C y 20 min. El medio C se preparó como otro medio, esterilizando 1000 L de un medio (medio B: 112 kg de monohidrato de glucosa) en condiciones de

140°C durante 40 seg. y agregando el medio esterilizado al medio A anteriormente mencionado. El medio C se ajustó a pH 6,1. Luego se inoculó la solución del cultivo de siembra (segunda etapa) en los medios así preparados y se ajustó el volumen a una

5 cantidad inicial de solución de cultivo de 5600 L en total (volumen del tanque de cultivo: 10 kL). El cultivo principal se inició en condiciones de 26°C de temperatura, velocidad de flujo de aire 49 Nm3/h y presión interna 200 kPa. El cultivo principal se llevó a cabo en los tanques de cultivo principales, es decir, en el tanque de cultivo equipado con turbinas de seis aspas d/D (relación del diámetro del impulsor de

10 agitación (= d) y el diámetro interno del tanque (= D)) = 0,34 en dos etapas y un tanque de cultivo equipado con turbinas de seis aspas d/D = 0,25 en dos etapas. Mientras se alimentaba un medio, como se indica en la Tabla 7, el cultivo principal se llevó a cabo durante 162 hs. Al término del cultivo, la concentración de ácido araquidónico producido por litro de la solución de cultivo fue de 5,0 g/L para el tanque de d/D = 0,34

15 y 4,7 g/L para el tanque de d/D = 0,25. Tabla 7: Alimentación del medio en el Ejemplo 6

Tiempo del cultivo principal: Alimentación del medio

Luego de 19 horas: monohidrato de glucosa 84 kg/200 L

Luego de 43 horas: monohidrato de glucosa 84 kg/200 L

Luego de 67 horas: monohidrato de glucosa 56 kg/120 L

Luego de 91 horas: monohidrato de glucosa 56 kg/125 L

Luego de finalizado el cultivo, de la misma manera que en el Ejemplo 1, se recolectaron las células secas mediante extracción con hexano para producir un aceite crudo que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente. Los valores

20 encontrados para el aceite crudo se indican en la Tabla 8. Cuando la concentración de una fuente de nitrógeno en el medio fue de 1,5%, para ambas d/D = 0,25 y d/D = 0,34, el aceite crudo tenía un contenido de esterol de tipo éster de no más del 1%.

Tabla 8. Resultados del Ejemplo 6 (valores encontrados para el aceite crudo que contiene ácido araquidónico)

Forma del tanque de cultivo, d/D: 0,25 0,34

%p de cada fracción Triglicérido Materia insaponificable Esterol de tipo éter: 94,1% 1,2% 0,4% 93,0% 1,2% 0,4%

Acido araquidónico en total de ácido graso en aceite crudo %: 40,8% 41,5%

Ejemplo 7: Producción de ácido dihomo-�-linolénico; influencia de d/D = 0,30, 0,34 y 0,25, concentración de harina de soja en el medio al 4% y esterilización de fuente de nitrógeno pH 4,5

Los inventores de la presente invención establecieron un proceso de producción de una grasa o aceite (triglicérido) que comprende ácido dihomo-�linolénico como ácido graso constituyente. La grasa o aceite se puede producir mediante el cultivo de microorganismos que tienen ácido araquidónico que producen capacidad y menor actividad insaturada A5, por ejemplo, una cepa mutante Mortierella alpina SAM 1860 (FERM P-3589) de acuerdo con el proceso de producción descrito en un Publicación de Patente Japonesa Pendiente de Revisión (Kokai) No. 5 (1993)91887.

Se proporcionó Mortierella alpina (SAM 1860) como un hongo que produce ácido dihomo-�-linolénico. Se inoculó una cepa estándar de Mortierella alpina en un medio (extracto de levadura al 1%, glucosa al 2%, pH 6,3) en una cantidad de 100 mL contenidos en un matraz de Erlenmeyer de 500 mL. El cultivo de siembra (primera etapa) se inició en condiciones de agitación recíproca a 100 rpm y 28ºC de temperatura y el cultivo de siembra se continuó durante 3 días. Luego se prepararon 30 L de un medio (extracto de levadura al 1%, glucosa al 2%, aceite de soja de 0,1%, pH 6,3) en un tanque de cultivo de aireación-agitación con un volumen de 50 L. Se inoculó la solución de cultivo de siembra (primera etapa) en el medio. Se inició el cultivo de siembra (segunda etapa) en condiciones de velocidad de agitación de 200 rpm, 28°C de temperatura y 150 kPa de presión interna del tanque, y el cultivo de siembra se continuó durante 2 días. El cultivo principal se llevó a cabo en tres niveles de condiciones (7-1) a (7-4).

Para la condición (7-1), se ajustaron 4500 L de un medio (medio A: 224 kg de harina de soja, 16,8 kg de KH2PO4, 2,8 kg de MgCl2 6H2O, 2,8 kg de CaCl2 2H2O, 5,6 kg de aceite de soja) a un pH 6,1 mediante la adición de una solución acuosa de hidróxido de sodio y luego el medio se esterilizó en condiciones de 121°C y 20 min. El medio C se preparó como otro medio esterilizando 1000 L de un medio (medio B: 112 kg de monohidrato de glucosa) en condiciones de 140°C durante 40 seg y agregando el medio esterilizado al medio A anteriormente mencionado. Se midió el pH del medio C y se encontró que era pH 6,1. Luego se inoculó la solución del cultivo de siembra (segunda etapa) en el medio C, y el volumen se ajustó a una cantidad inicial de solución de cultivo de 5600 L en total (volumen del tanque de cultivo: 10 kL). El cultivo

se inició en condiciones 26°C de temperatura, 49 Nm3/h de velocidad de flujo de aire y 200 kPa de presión interna. La forma del tanque de cultivo era tal que las turbinas de seis aspas se proporcionaron en dos etapas y la relación del diámetro del impulsor de agitación (= d)

5 y el diámetro interior del tanque (= D) fue d/D = 0,34. Se detectó espuma durante el cultivo con un sensor antiespuma y se agregó automáticamente un aceite de soja para evitar que la solución de cultivo se descargara del tanque debido a la espuma. Mientras se alimentaba un medio como se indica en la Tabla 9, se llevó a cabo el cultivo principal durante 288 hs. Al término del cultivo, la cantidad de solución de

10 cultivo fue de 7,600 L debido a la influencia de un aumento en la cantidad de solución por la alimentación del medio y una disminución en la cantidad de solución por la evaporación de la solución.

Para la condición (7-2), el cultivo principal se llevó a cabo de la misma manera que en la condición (7-1), excepto que se ajustó el medio A a un pH 4,5 mediante la 15 adición no aséptica de ácido sulfúrico, el medio C se ajustó a pH 6,1 mediante la adición aséptica de una solución acuosa de hidróxido de sodio y se utilizó un tanque de cultivo de d/D = 0,3. Para la condición (7-3), el cultivo se llevó a cabo de la misma manera que en la condición (7-1), excepto que se utilizó un tanque de cultivo de d/D = 0,30. Para la condición (7-4), el cultivo se llevó a cabo de la misma manera que en la

20 condición (7-1), excepto que se utilizó un tanque de cultivo de d/D = 0,25. La concentración ácido dihomo-�-linolénico producido por litro de solución de cultivo al término del cultivo fue 12,3 g/L para la condición (7-2) y la condición (7-2), fue 11,0 g/L para la condición (7-3) y fue 10,0 g/L para la condición (7-4).

Tabla 9: Alimentación del medio en el Ejemplo 7

Tiempo del cultivo principal: Alimentación del medio

Luego de 19 horas: monohidrato de glucosa 280 kg/460 L

Luego de 43 horas: monohidrato de glucosa 280 kg/450 L

Luego de 67 horas: monohidrato de glucosa 280 kg/450 L

Luego de 120 horas: monohidrato de glucosa 336 kg/530 L

25 Luego de finalizado el cultivo, la solución de cultivo se esterilizó en condiciones de 120 ºC durante 20 min. Luego se recolectaron las células húmedas mediante un deshidratador continuo. Las células húmedas recolectadas se secaron en un secador de lecho fluidizado por vibración hasta alcanzar un contenido de agua del 1% en peso. 30 Las células secas se transportaron mediante una máquina de transporte por aire y

junto con gas de nitrógeno se colocaron en un saco contenedor de una bolsa de aluminio con un volumen de aproximadamente 1 m3. La abertura de la bolsa se selló por calor y luego se almacenó el saco contenedor en un refrigerador a 10 ºC o menos.

Se retiraron las células secas del saco contenedor y se sometieron a extracción

5 con hexano. La materia sólida se eliminó de la solución de hexano mediante filtración. Luego el filtrado se calentó bajo presión reducida para eliminar el hexano y producir un aceite crudo que comprende ácido dihomo-�-linolénico como ácido graso constituyente. Se analizó el aceite crudo y los resultados de los análisis se indican en la Tabla 10. Para el tanque de cultivo de d/D = 0,34, el aceite crudo tenía un contenido

10 de esterol de tipo éster de no más de 1%. Para el tanque de cultivo de d/D = 0,3, el ajuste del pH en la condición (7-3) por el método convencional proporcionó un aceite crudo con un alto contenido de esterol de tipo éster. La esterilización de la fuente de nitrógeno del medio a un pH 4,5 como en la condición (7-2) disminuyó el contenido de esterol de tipo éster a no más de 1%. Para el tanque de cultivo de d/D = 0,25, el

15 contenido de esterol de tipo éster excedió el 1 %. Tabla 10: Valores encontrados para el aceite crudo que contiene ácido dihomo

�-linolénico

Ejemplo o ejemplo testigo: Ejemplo 7 Condición 7-1 Ejemplo 7 Condición 7-2 Ejemplo 7 Condición 7-3 (Ej. testigo) Ejemplo 7 Condición 7-4 (Ej. testigo)

Forma del tanque de cultivo, d/D: 0,34 0,30 0,30 0,25

Valor del pH ajustado del

medio A (antes de la esterilización) Valor del pH del medio C (luego de la esterilización y: 6,1 4,5 6,1 6,1

antes de la inoculación de la solución de cultivo de siembra): 6,1 6,1 6,1 6,1

%p de cada fracción

Triglicérido: 93,8% 94,1% 93,5% 93,0%

Materia insaponificable: 2,1% 2,2% 2,9% 2,9%

Esterol tipo éter: 0,9% 1,0% 1,2% 1,2%

Acido dihomo-�-linolénico en total de ácido graso en aceite crudo, %: 42,2% 41,9% 40,7% 41,7%

Ejemplo 8: Producción de ácido dihomo-�-linolénico: cultivo bajo concentración de harina de soja al 1,5% Se proporcionó Moltierella alpina (SAM 1860) y el cultivo de siembra se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 7. Luego se esterilizaron 4500 L de un

5 medio (medio A: 84 kg de harina de soja, 16,8 kg de KH2P04, 2,8 kg de MgCl2 6H2O, 2,8 kg de CaCl2 2H2O, 5,6 kg de aceite de soja) en condiciones de 121°C y 20 min. El medio C se preparó como otro medio, esterilizando 1000 L de un medio (medio B: 112 kg de monohidrato de glucosa) en condiciones de 140°C durante 40 seg y agregando el medio esterilizado al medio A anteriormente mencionado. El medio C se ajustó a pH

10 6,1 y luego se inoculó la solución de cultivo de siembra en el medio C, y el volumen se ajustó a una cantidad inicial de solución de cultivo de 5600 L en total (volumen del tanque de cultivo: 10 kL).

El cultivo se inició en condiciones de 26°C de temperatura, 49 Nm3/h de velocidad de flujo de aire y 200 kPa de presión interna. Con respecto a la forma del 15 tanque de cultivo, se utilizaron un tanque de cultivo equipado con turbinas de seis aspas d/D (relación del diámetro del impulsor de agitación (= d) y el diámetro interno del tanque (= D)) = 0,34 en dos etapas y un tanque de cultivo equipado con turbinas de seis aspas d/D = 0,25 en dos etapas. Durante el cultivo, se detectó espuma con un sensor antiespuma y se agregó un aceite de soja automáticamente para evitar que la

20 solución de cultivo se descargara del tanque debido a la espuma. Mientras se alimentaba un medio como se indica en la Tabla 11, se llevó a cabo el cultivo principal durante 162 hs. Al término del cultivo, la concentración de ácido dihomo-�-linolénico producido por litro de solución de cultivo fue 4,8 g/L para el tanque de d/D = 0,34 y fue 4,7 g/L para el tanque de d/D = 0,25.

25 Tabla 11: Alimentación del medio en el Ejemplo 8

Tiempo del cultivo principal: Alimentación del medio

Luego de 19 horas: monohidrato de glucosa 84 kg/200 L

Luego de 43 horas: monohidrato de glucosa 84 kg/200 L

Luego de 67 horas: monohidrato de glucosa 84 kg/120 L

Luego de 91 horas: monohidrato de glucosa 84 kg/125 L

Luego de finalizado el cultivo, de la misma manera que en el Ejemplo 7, se recolectaron las células secas seguido por la extracción con hexano para producir un aceite crudo que comprende ácido dihomo-�-linolénico como ácido graso

constituyente. Se analizó el aceite crudo y los valores encontrados para el aceite crudo se indican en la Tabla 12.

Tabla 12: Resultados del Ejemplo 8 (valores encontrados para aceite crudo que contiene ácido dihomo-�-linolénico)

Forma del tanque de cultivo, d/D: 0,25 0,34

%p de cada fracción Triglicérido Materia insaponificable Esterol de tipo éter: 93,5% 1,2% 0,4% 93,0% 1,2% 0,4%

Acido dihomo-�-linolénico en total de ácido graso en aceite crudo, %: 40,5% 41,3%

5 Ejemplo 9: Producción de ácido Mead, d/D = 0,5, concentración de harina de soja en medio al 4% Los inventores de la presente invención establecieron un proceso de producción de una grasa o aceite (triglicérido) que comprende un ácido graso 10 altamente insaturado como ácido graso constituyente. La grasa o aceite se puede producir mediante el cultivo de microorganismos capaces de producir ácido graso altamente insaturado �9, por ejemplo, una cepa mutante Mortierella alpina (SAM 1861) (FERM P-3590) de acuerdo con el proceso de producción descrito en la Publicación de Patente Japonesa Pendiente de Revisión (Kokai) No. 5 (1993)-91888. 15 Los inventores de la presente invención también establecieron un proceso de producción de una grasa o aceite (triglicérido) que comprende un ácido Mead como ácido graso constituyente. Esta grasa o aceite se produce sometiendo un microorganismo capaz de producir ácido araquidónico a un tratamiento de mutación de acuerdo con el método descrito en la Publicación de Patente Japonesa Pendiente de 20 Revisión (Kokai) No. 10 (1998)-57085. La grasa o aceite se puede producir mediante el cultivo de una cepa mutante con �12-desaturasa disminuida o borrada y al menos una actividad mejorada de desaturación �5, desaturación �6 y/o actividad de extensión de cadena, por ejemplo, Mortierella alpina (SAM 2086) (FERM P-15766). Se proporcionó Mortierella alpina (SAM 2086) como un hongo que produce 25 ácido Mead. Se inoculó una cepa estándar de Mortierella alpina en un medio ( extracto de levadura al 1%, glucosa al 2%, pH 6,3) en una cantidad de 500 mL contenida en un matraz de Erlenmeyer de 2000 mL. El cultivo de siembra (primera etapa) se inició en condiciones de agitación recíproca de 100 rpm y 28°C de temperatura, y el cultivo de

siembra se continuó durante 3 días. Luego se prepararon 30 L de un medio (extracto de levadura al 1%, glucosa al 2%, aceite de oliva al 0,1%, pH 6,3) en un tanque de cultivo de aireación-agitación con un volumen de 50 L. Se inoculó la solución de cultivo de siembra (primera etapa) en el medio. El cultivo de siembra (segunda etapa) se

5 inició en condiciones de 300 rpm de velocidad de agitación, 28°C de temperatura y 200 kPa de presión interna del tanque, y el cultivo de siembra se continuó durante 2 días. Luego se esterilizaron 3200 L de un medio (medio A: 160 kg de harina de soja, 4kg de aceite de oliva) a 121°C durante 20 min.

El medio C se preparó como otro medio, esterilizando 700 L de un medio

10 (medio B: monohidrato de glucosa 80 kg) en condiciones de 140 ºC durante 90 seg y agregando el medio esterilizado al medio A anteriormente mencionado. El medio C se ajustó a pH 6,1 y se inoculó la solución de cultivo de siembra (segunda etapa) en el medio C, y el volumen se ajustó a una cantidad inicial de solución de cultivo de 4000 L en total (volumen del tanque de cultivo: 10 kL). El cultivo principal se inició en

15 condiciones de 24°C de temperatura, 49 Nm3/hs de velocidad de flujo de aire , 200 kPa de presión interna, y 2 kw de requisito de energía de agitación. En el 4ºdía de cultivo, la temperatura se modificó a 20°C. Con respecto a la forma del tanque de cultivo, se utilizó un tanque de cultivo equipado con turbinas de seis aspas d/D (relación del diámetro del impulsor de agitación (= d) y el diámetro interno del tanque (= D)) = 0,5 en

20 dos etapas. Mientras se alimentaba un medio como se indica en la Tabla 13, se llevó a cabo el cultivo principal durante 456 hs. Al término del cultivo, la concentración de ácido Mead producido por litro de solución de cultivo fue 10,1 g/L.

Tabla 13. Alimentación del medio en el Ejemplo 9.

Tiempo del cultivo principal: Alimentación del medio

Luego de 19 horas: monohidrato de glucosa 160 kg/280 L

Luego de 43 horas: monohidrato de glucosa 160 kg/280 L

Luego de 67 horas: monohidrato de glucosa 120 kg/210 L

Luego de 91 horas: monohidrato de glucosa 120 kg/210 L

Luego de 144 horas: monohidrato de glucosa 80 kg/140 L

Luego de finalizado el cultivo, la solución de cultivo se esterilizó en condiciones de 120 ºC durante 20 min. Luego se recolectaron las células húmedas mediante un deshidratador continuo. Las células húmedas recolectadas se secaron en un secador de lecho fluidizado por vibración hasta alcanzar un contenido de agua del 1% en peso. Las células secas, junto con el gas de nitrógeno, se colocaron en un saco contenedor

de llenado mediante una máquina de transporte por aire. La abertura del saco se selló por calor y luego el saco contenedor se almacenó en un refrigerador a 10 ºC o menos. Se retiraron las células secas del saco contenedor y se sometieron a extracción con hexano. La materia sólida se eliminó de la solución de hexano mediante filtración.

5 Luego el filtrado se calentó bajo presión reducida para eliminar el hexano y producir un aceite crudo que comprende ácido Mead. Se analizó el aceite crudo y los resultados se indican en la Tabla 14.

Ejemplo 10: Producción de ácido Mead, d/D = 0,25, concentración de harina de soja en el medio = 4 %

10 El cultivo de siembra se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 9. El cultivo principal se llevó a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 9, excepto que, con respecto a la forma del tanque de cultivo, se utilizó un tanque de cultivo equipado con turbinas de seis aspas d/D = 0,25 en dos etapas. Como consecuencia, la concentración de ácido Mead producido por litro de solución de

15 cultivo al término del cultivo fue de 8,0 g/L. Luego de finalizado el cultivo, se obtuvo un aceite crudo que comprende ácido Mead como ácido graso constituyente, de la misma manera que en el Ejemplo 9.

Se analizó el aceite crudo que contenía ácido Mead y los valores encontrados para el aceite crudo se indican en la Tabla 14. 20 Tabla 14. Valores encontrados para el aceite crudo que contiene ácido Mead

Ejemplo o ejemplo testigo: Ejemplo 9 Ejemplo 10 (Ejemplo testigo)

Forma del tanque de cultivo, d/D: 0,5 0,25

%p de cada fracción Triglicérido Materia insaponificable Esterol tipo éter: 94,6% 1,8% 0,6% 93,0% 2,8% 1,2%

Acido Mead en total de ácido graso en aceite crudo, %: 35,0% 30,6%

Ejemplo 11: Producción de ácido Mead, cultivo en condición de concentración de harina de soja = 1,5%

Se proporcionó Mortierella alpina (SAM 2086) y el cultivo de siembra se llevó a 25 cabo de la misma manera que en el Ejemplo 9. Luego se esterilizaron 3200 L de un medio (medio A: 60 kg de harina de soja, 4 kg de aceite de oliva) en condiciones de

121°C durante 20 min. El medio C se preparó como otro medio, esterilizando 700 L de un medio (medio B: 80 kg de monohidrato de glucosa) en condiciones de 140°C durante 90 seg y agregando el medio esterilizado al medio A anteriormente mencionado. El medio C se ajustó a pH 6,1, y se inoculó la solución de cultivo de

5 siembra en el medio C, y se ajustó el volumen a una cantidad inicial de solución de cultivo de 4000 L en total (volumen del tanque de cultivo: 10 kL). El cultivo principal se inició en condiciones de 24°C de temperatura, 49 Nm3/hs de velocidad de flujo de aire, 200 kPa de presión interna y 2 kw de requisito de energía de agitación.

Al 4ºdía del cultivo, la temperatura se modificó a 20°C. Con respecto a la forma

10 del tanque de cultivo, se utilizaron un tanque de cultivo equipado con turbinas de seis aspas d/D (relación del diámetro del impulsor de agitación (= d) y el diámetro interno del tanque (= D)) = 0,34 en dos etapas y un tanque de cultivo equipado con turbinas de seis aspas d/D = 0,25 en dos etapas. Mientras se alimentaba un medio, como se indica en la Tabla 15, se llevó a cabo el cultivo principal durante 300 hs. Al término del

15 cultivo, la concentración de ácido Mead producido por litro de solución de cultivo fue 3,9 g/L para el tanque de d/D = 0,34 y 3,8 g/L para el tanque de d/D = 0,25. Tabla 15. Alimentación del medio en el Ejemplo 11

Tiempo del cultivo principal: Alimentación del medio

Luego de 19 horas: monohidrato de glucosa 60 kg/120 L

Luego de 43 horas: monohidrato de glucosa 60 kg/120 L

Luego de 67 horas: monohidrato de glucosa 40 kg/80 L

Luego de 91 horas: monohidrato de glucosa 40 kg/80 L

Luego de finalizado el cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 9, se recolectaron las células secas, seguido de la extracción con hexano para producir un 20 aceite crudo que comprende ácido Mead como ácido graso constituyente. Se analizó el aceite crudo y los valores encontrados para el aceite crudo se indican en la Tabla

16.

Tabla 16: Resultados del Ejemplo 11 (valores encontrados para el aceite crudo que contiene ácido Mead)

Forma del tanque de cultivo, d/D: 0,25 0,34

%p de cada fracción Triglicérido Materia insaponificable Esterol de tipo éter: 95,0% 1,3% 0,5% 95,1% 1,3% 0,5%

Acido Mead en total de ácido graso en aceite crudo, %: 34,5% 34,2%

Ejemplo 12: preparación de una cápsula combinada con grasa o ácido refinados (triglicéridos) que comprenden ácido araquidónico como ácido graso constituyente y con menor contenido de esterol de tipo éster

Se agregó agua a 100 partes en peso de gelatina y 35 partes en peso de glicerina comestible y la mezcla se calentó entre 50 y 60 ºC hasta su disolución para preparar una película de gelatina. Luego se proporcionó una mezcla de grasa y aceite refinados 5-A (triglicérido) con menor contenido de esterol de tipo éster y que comprenden ácido araquidónico como un ácido graso constituyente preparado en el Ejemplo 5 con 0,05% de un aceite de vitamina E, como contenido para cápsulas. La formación y secado de cápsulas se llevó adelante según un método convencional de preparado de cápsulas blandas que contiene 180 mg de contenido por cápsula. Las cápsulas blandas también se prepararon utilizando grasa o aceite refinados 5-B, preparados en el Ejemplo 5, como materia prima, de la misma manera que en la preparación de cápsulas utilizando grasa o aceite refinados 5-A.

Ejemplo 13: Uso en preparación de transfusión de grasas

Se agregaron 400 g de grasa o aceite refinados 5-A (triglicérido) con menor contenido de esterol de tipo éster y que comprenden ácido araquidónico como ácido graso constituyente preparados en el Ejemplo 5, 48 g de lecitina de yema de huevo, 20 g de ácido oleico, 100 g de glicerina y 40 ml de soda cáustica 0,1 N y se dispersaron en un homogenizador.

Luego se agregó el agua destilada a la dispersión por inyecciones hasta alcanzar un volumen de dispersión de 4 litros, seguido de emulsificación con una máquina de emulsionado por atomización a alta presión para preparar una emulsión lípida. Se dispensaron 200 ml alícuotas de la emulsión lípida en sacos plásticos y se llevó a cabo una esterilización por vapor a alta presión a 121 ºC durante 20 min para formular preparaciones de transfusión grasas. Asimismo, se formuló una preparación de transfusión grasa utilizando grasa o aceite 5-B preparado en el Ejemplo 5 como una materia prima, de la misma manera que en la formulación de la preparación de

transfusión grasa utilizando la grasa o aceite 5-A.

Ejemplo 14: Uso en jugos

Se agregaron 2 g de �-ciclodextrina a 20 ml de una solución acuosa de etanol al 20%. Se agregaron 100 mg de grasa o aceite refinados 5-A (triglicérido), preparados en el Ejemplo 5, con menor contenido de esterol de tipo éster y que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente (combinado con 0,05% de vitamina E) con agitación por medio de un agitador y la mezcla se incubó a 50°C durante 2 hs. Luego de enfriar hasta temperatura ambiente (aproximadamente 1 hora), la mezcla se incubó a 4ºC durante otras 10 hs con agitación.

El precipitado resultante se recolectó por centrifugación, se lavó con hexano y se liofilizó para producir 1,9 g de un compuesto con inclusión de ciclodextrina que contiene triglicérido con ácido araquidónico. Se mezcló 1 g de este polvo homogéneamente en 10 L de jugo para preparar jugo que contiene grasa o aceite refinados (triglicérido) con menor contenido de esterol de tipo éster y que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente. También se preparó jugo que utiliza grasa o aceite refinados 5-B preparados en el Ejemplo 5 como materia prima, de la misma manera que en la preparación del jugo que utiliza grasa o aceite refinados 5

A. Ejemplo 15: Uso en leche en polvo Se mezclaron 0,3 g de grasa o aceite refinados 5-A (triglicérido) preparados en

el Ejemplo 5, con menor contenido de esterol de tipo éster y que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente en 100 g de leche en polvo para preparar un polvo de fórmula. Asimismo, se preparó polvo de fórmula que utiliza grasa

o aceite refinados 5-B preparados en el Ejemplo 5 como materia prima, de la misma manera que en la preparación del polvo de fórmula que utiliza la grasa o aceite refinados 5-A.

Ejemplo 16: Método de cultivo que emplea varias cepas Se utilizaron Mortierella elongata (IFO 8570), Mortierella hygrophila (IFO 5941), Echinosporangium transversale (NRRL 3116), Conidiobolus nanodes (CBS 154,56) y Saprolegnia lapponica (CBS 284,38) como hongos que producen ácido araquidónico. Se inocularon cepas estándares de estos hongos que producen ácidos araquidónicos en un medio (extracto de levadura al 1%, glucosa al 2%, pH 6,3), y el cultivo de siembra se llevó a cabo durante 3 días en condiciones de agitación recíproca a 100 rpm y temperatura 28°C. Luego se prepararon 25 L de un medio (500 g de glucosa, 775 g harina de soja, 50 g de KH2PO4, 7,5 g de MgCl2 6H2O, 7,5 g de CaCl2 2H2O y 25 g de aceite de soja, pH 6,3) en un tanque de cultivo de aireación-agitación de un volumen de 50 L. Se inoculó la solución del cultivo de siembra en el medio, y el cultivo principal se inició en condiciones de 200 rpm de velocidad de agitación, 28°C de temperatura y 150 kPa de

presión interna del tanque. Con respecto a la forma del tanque, se utilizó un tanque de cultivo equipado con turbinas de seis aspas de d/D = 0,42 en dos etapas. El cultivo se llevó a cabo durante 186 hs mientras se agregaba una solución de glucosa al 50% en intervalos de 24 hs para llevar la concentración de glucosa entre aproximadamente 1 y

5 2%. Luego de finalizado el cultivo, se esterilizó la solución en condiciones de 120°C y 20 min. Las células húmedas se recolectaron por filtración presión reducida y se secaron hasta alcanzar un contenido de agua del 1% en peso. Las células secas se extrajeron con hexano. La materia sólida se eliminó de la solución de hexano por 10 filtración. Luego, el filtrado se calentó bajo presión reducida para eliminar el hexano y producir un aceite crudo que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente. Se analizó el aceite crudo que contiene ácido araquidónico. Los valores encontrados para el aceite crudo se indican en la Tabla 17. Tabla 17: Resultados del Ejemplo 16 (valores encontrados para el ácido crudo 15 que contiene ácido araquidónico)

Cepa: M. elongata IFO 8570 M. hygrophila IFO 5941 E. transversale NRRL 3116 C. nanodes CBS 154,56 S. lapponica CBS 284,38

%p de cada fracción Triglicérido Materia insaponificable Esterol de tipo éter: 90,0% 1,9% 0,8% 88,1% 1,9% 0,7% 86,0% 2,0% 0,7% 83,4% 2,0% 0,8% 82,6% 2,0% 0,8%

Acido araquidónico en total de ácido graso en aceite crudo, %: 30,8% 31,7% 28,6% 26,3% 20,7%

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un proceso para la producción de un aceite crudo que tiene un contenido de materia insaponificable no mayor al 2,2% en peso y/o de esterol de tipo éster no mayor al 1,0% en peso y que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente, caracterizado porque un microorganismo capaz de producir una grasa o aceite que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente se cultiva en un medio que contiene una concentración de fuente de nitrógeno entre el 2 y 15% dentro de un tanque de cultivo equipado con un impulsor de agitación que cumple con el requisito de que la relación entre el diámetro del impulsor de agitación (= d) y el diámetro interno del tanque de cultivo (=D) es d/D = entre 0,30 y 0,6.
2.

Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la relación entre el diámetro del impulsor de agitación (= d) y el diámetro interno del tanque de cultivo (=D) es d/D = entre 0,34 y 0,6.
3.

Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la fuente de nitrógeno contiene una fuente de nitrógeno que ha sido esterilizada a un pH no mayor a 5.
4.

Un proceso para la producción de una grasa o aceite refinados, caracterizado porque comprende el refinado del aceite crudo producido mediante el proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5.

Un proceso para la producción de un aceite crudo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un proceso para la producción de grasa o aceite refinados de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque un triglicérido representa no menos del 70% de la grasa o aceite que comprende dicho ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente.
6.

Un proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido graso altamente insaturado que constituye la grasa o el aceite es ácido �linolénico (18:3 �6), ácido dihomo-�-linolénico (20:3 �6), ácido araquidónico (20:4 �6), ácido 7,10,13,16-docosatetraenoico (22:4 �6), ácido 4,7,10,13,16docosapentaenoico (22:5 �6), ácido �-linolénico (18:3 �3), ácido 6,9,12,15octadecatetraenoico (18:4 �3), ácido 8,11,14,17-eicosatetraeoico (20:4 �3), ácido eicosapentaenoico (20:5 �3), ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico (22:5 �3), ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico (22:5 �3), ácido 6,9-octadecadienoico (18:2 �9),

ácido 8,11-eicosadienoico (20:2 �9) o ácido 5,8,11-eicosatrienoico (ácido Mead: 20:3

�9) o una combinación de dos o más de ellos.
7.

Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el contenido de dicho ácido graso altamente insaturado en el aceite crudo, basado en el total de ácido graso en el aceite crudo, es no menos que el 30% en peso.
8.

Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el microorganismo pertenece al género Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium o Saprolegnia.
9.

Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el microorganismo pertenece al género Mortierella, subgénero Mortierella.
10.

Un proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el microorganismo que pertenece al subgénero Mortierella es de la especie alpina perteneciente al género Mortierella.
11.

Un proceso para la producción de un alimento o bebida general, un alimento funcional, un suplemento nutritivo, una fórmula para bebés prematuros, un alimento para lactantes, un alimento para madres embarazadas o un alimento para personas mayores que comprende la producción de un aceite crudo o grasa o aceite refinados mediante un proceso de acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones 1 a 10, y su incorporación en un alimento o bebida general, un alimento funcional, un suplemento nutritivo, una fórmula para bebés prematuros, un alimento para lactantes, un alimento para madres embarazadas o un alimento para personas mayores.
12.

Un proceso para la producción de un alimento para nutrición terapéutico que comprende la producción de un aceite crudo o una grasa u aceite refinados mediante un proceso de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 10 y su incorporación en un alimento para nutrición terapéutico opcionalmente junto con un vehículo neutro adecuado para administración oral, intrarectal o parenteral.
13.

Un proceso para la producción de un alimento para animales o peces que comprende la producción de un aceite crudo o una grasa o aceite refinados mediante un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y su incorporación en el alimento para animales o peces.
14.

Un proceso para la producción de una composición farmacéutica que comprende la producción de un aceite crudo o una grasa o aceite refinados mediante

un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y su incorporación en la composición farmacéutica.