ES2661674T3

ES2661674T3 - Procedimiento de producción de grasa o aceite microbiano que tiene un contenido rebajado de materia no saponificable y dicha grasa o aceite

Info

Publication number: ES2661674T3
Application number: ES15177837.0T
Authority: ES
Inventors: Kengo Akimoto; Kenichi Higashiyama; Hiroshi Kawashima; Motoo Sumida
Original assignee: Nippon Suisan Kaisha Ltd
Current assignee: Nissui Corp
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2018-04-03
Anticipated expiration: 2023-10-09
Also published as: US20050287651A1; CN101310622A; HK1219759A1; EP2966172A1; ES2550468T3; DK1549753T3; EP2267142A1; EP2966172B1; CA2501880A1; KR101175773B1; CY1120231T1; ATE480633T1; EP1549753A2; HK1257077A1; DK2267142T3; MY148374A; DK2966172T3; HUE026450T2; EP1549753B1; US7709236B2

Abstract

Un aceite microbiano bruto que comprende una grasa o un aceite que comprende un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente, siendo dicho ácido graso altamente insaturado ácido araquidónico (20:4 ω6) y siendo el contenido de dicho ácido graso altamente insaturado, basándose en el ácido graso total en el aceite bruto, no menor de 30% en peso y siendo el contenido de esteroles de tipo éster de la grasa o el aceite no mayor que 1,0% en peso.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de producción de grasa o aceite microbiano que tiene un contenido rebajado de materia no saponificable y dicha grasa o aceite

Campo técnico

La presente invención se refiere a un aceite bruto que tiene un contenido rebajado de esteroles de tipo éster y que comprende un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente, a un procedimiento de producción de una grasa o aceite refinado, y a dicha grasa o aceite (aceite bruto) y alimentos y bebidas, alimentos nutritivos terapéuticos, alimentos para animales y preparaciones farmacéuticas con la grasa o el aceite (aceite bruto o grasa o aceite refinado) incorporado en los mismos. En la presente invención, la "materia no saponificable" y el "esterol de tipo éster" se refieren a los extraídos de microorganismos. Por lo tanto, la "materia no saponificable" y el "esterol de tipo éster" mencionados en la presente invención excluyen cualquier materia no saponificable y esterol de tipo éster añadidos al aceite bruto después de la extracción.

Técnica anterior

En lo referente a la biosíntesis de ácidos grasos altamente insaturados humanos (en lo sucesivo denominados en la presente memoria "PUFA"), existen dos series típicas, las series u>3 y w6. w (omega) se refiere al número de átomos de carbono desde el grupo metilo terminal del ácido graso hasta el átomo de carbono en el que está situado el primer doble enlace. Por ejemplo, en el caso de la serie w6, el ácido linoleico (18:2 w6) se somete repetidamente a insaturación y extensión de la longitud de la cadena de carbonos y por consiguiente se convierte en ácido Y- linolénico (18:3 w6), ácido dihomo-Y-linolénico (20:3 w6), ácido araquidónico (20:4 w6) y ácido 4,7,10,13,16- docosapentaenoico (22:5 w6).

Asimismo, en el caso de la serie w3, el ácido a-linolénico (18:3 w3) se somete repetidamente a insaturación y extensión de la longitud de la cadena de carbonos y por consiguiente se convierte en ácido eicosapentaenoico (20:5 w3), ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico (22:5 w3) y ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico (22:6 w3). Se sabe que el ácido eicosapentaenoico (denominado en lo sucesivo en la presente memoria "EPA") y el ácido docosahexaenoico (denominado en lo sucesivo en la presente memoria "DHA") como PUFA de la serie w3 tienen muchas funciones fisiológicas, particularmente efectos profilácticos para enfermedades relacionadas con el estilo de vida, tales como esclerosis arterial y trombosis, y acción carcinostática y acción potenciadora de la capacidad de aprendizaje, y se han realizado diversos intentos de aplicar estos PUFA a preparaciones farmacéuticas y productos alimenticios específicos para atención sanitaria. Sin embargo, en los últimos años se ha prestado atención a las funciones fisiológicas de PUFA distintos a la serie w3 (series w6 y w9).

Aproximadamente 10% de los ácidos grasos que constituyen órganos importantes tales como la sangre y el hígado corresponde al ácido araquidónico. Por ejemplo, los ácidos grasos en los fosfolípidos de la sangre humana tienen una composición que comprende 11% de ácido araquidónico, 1% de ácido eicosapentaenoico y 3% de ácido docosahexaenoico. El ácido araquidónico está implicado, como un componente constituyente principal de una membrana celular, en la regulación del flujo al interior de la membrana para exhibir diversas funciones en el metabolismo del cuerpo y, además, representa un papel importante como un precursor directo de prostaglandinas.

En particular, el ácido araquidónico ha recibido atención recientemente como un nutriente para lactantes y como un ácido graso constituyente de un cannabinoide endógeno (2-araquidonoilmonoglicerol, anandamida) que tiene una acción de activación nerviosa. En general, al ingerir un alimento rico en ácido linoleico, el ácido linoleico se convierte en ácido araquidónico. Sin embargo, en pacientes que sufren enfermedades relacionadas con el estilo de vida y un grupo de reserva de enfermedades relacionadas con el estilo de vida, los lactantes y los ancianos, se rebaja la función de la enzima implicada en la biosíntesis. Por lo tanto, es probable que la cantidad de ácido araquidónico sea deficiente. Por esta razón, es deseable ingerir el ácido araquidónico directamente como una grasa o un aceite (ácido graso constituyente de triglicérido) .

Para el EPA y el DHA como PUFA de la serie w3, está el aceite de pescado como una fuente de suministro abundante. Por otra parte, el ácido Y-linolénico, el ácido dihomo-Y-linolénico, el ácido araquidónico y el ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico (22:5 w6) como PUFA de la serie w6 se obtienen difícilmente a partir de fuentes de suministro de grasas o aceites convencionales, y, actualmente, se usa generalmente una grasa o un aceite (triglicéridos) que comprende, como un ácido graso constituyente, PUFA producidos mediante fermentación de microorganismos. Por ejemplo, se ha propuesto un método en el que se produce una grasa o un aceite (triglicérido) que comprende ácido araquidónico como un ácido graso constituyente cultivando diversos microorganismos capaces de producir una grasa o un aceite (triglicéridos) que comprende ácido araquidónico como un ácido graso constituyente.

Entre otras, se conoce la producción de una grasa o un aceite que contiene un alto contenido de ácido araquidónico (triglicéridos) usando particularmente microorganismos pertenecientes al género Mortierella (documentos JP-A- 63(1988)/44891 y JP-A-63(1988)/12290). Basándose en muchos resultados de ensayo, se dice que esta grasa o aceite es seguro. Sin embargo, como esta grasa o aceite se deriva de microorganismos, no hay experiencias satisfactorias en la ingestión. Por lo tanto, sin embargo, actualmente, las grasas o aceites en cuestión no se han

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introducido satisfactoriamente en la sociedad. Por otra parte, las grasas o aceites (triglicéridos) que comprenden, como un ácido graso constituyente, ácido araquidónico producido mediante fermentación se han empezado a usar en aplicaciones en las que se usaría ácido araquidónico, por ejemplo, en el campo de la nutrición de lactantes y, específicamente, en una leche de inicio.

La grasa o el aceite producidos a partir de productos naturales tales como animales y plantas se someten a procedimientos de refinado, tales como desgomado, desoxidación, desodorización, decoloración, destilación molecular y frigelización y a continuación se comercializan como grasa o aceite comestible. Por ejemplo, una grasa o un aceite obtenidos mediante expresión de plantas oleaginosas contienen una gran cantidad de impurezas y así no se pueden usar como tales como grasa o aceite comestible. Excepto para aceites de sésamo y aceites de oliva que se consumen a menudo, esta grasa o aceite generalmente se refina antes de usar como aceites comestibles.

Por ejemplo, en el procedimiento de desgomado, se eliminan fosfolípidos, carbohidratos, resinas, compuestos proteínicos, oligoelementos metálicos y materia colorante contenidos en los aceites no refinados. En el procedimiento de desoxidación (refinado alcalino), se eliminan ácidos grasos, materia colorante, fosfolípidos, oligoelementos metálicos, compuestos de azufre, materiales insolubles en aceite, y productos de oxidación. En el procedimiento de decoloración, se eliminan materia colorante, materia gomosa, oligoelementos metálicos, componentes de jabón, productos de oxidación y fosfolípidos. En el procedimiento de desodorización, se eliminan ácidos grasos, monoglicéridos, diglicéridos, aldehídos, alcoholes, cetonas, hidrocarburos, materia colorante, compuestos de azufre, peróxidos, productos de degradación oxidativa y otros componentes olorosos.

La grasa o el aceite contienen compuestos orgánicos, que son solubles en aceites y es menos probable que se degraden con un álcali, llamados "materia no saponificable". Por ejemplo, compuestos tales como alcoholes superiores, esteroles, hidrocarburos, tocoferoles y carotenoides se conocen como componentes constituyentes de la materia no saponificable. En los procedimientos de refinado de la grasa o el aceite, los contenidos de materia no saponificable se pueden reducir pero no se pueden eliminar completamente. Se sabe que los esteroles existen como componentes principales de la materia no saponificable en grasa o aceite producidos por microorganismos.

Los esteroles presentes en grasa o aceite se dividen en tipos libres y tipos éster. En los procedimientos de refinado, el tipo libre se puede eliminar, pero, por otra parte, el tipo éster difícilmente se puede eliminar. Por ejemplo, después de procedimientos de desgomado, desoxidación, decoloración y desodorización, los contenidos de esterol (mg/g) de aceite de soja son 3,4, 3,0, 2,0 y 1,6, respectivamente, para el tipo libre, y es 0,6, 0,6, 0,6 y 0,6, respectivamente, para el tipo éster (véase ("Shokuyo Yushi no Kagaku" (Science of edible fat or oil), I. Aratani, Saiwai Shobo 1989 pp. 20-21).

Como los esteroles no eliminables y similares están contenidos como una parte de la materia no saponificable, en general, el contenido de materia no saponificable se usa ampliamente como un índice de la calidad de la grasa o el aceite refinado o como un índice de control del procedimiento de refinado. Por ejemplo, según Japanese Agricultural Standards, el contenido de materia no saponificable, p. ej., en aceites de cártamo comestibles, aceites de soja comestibles y aceites de palma comestibles, no debe ser mayor que 1,0% (523a notificación (31 de marzo de 1969) del Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries). Para los lactantes, el colesterol es necesario, y se comercializa una leche de inicio que tiene un contenido de colesterol incrementado. Los esteroles derivados de plantas están contenidos en grasa o aceite vegetal comestible. La presencia de los esteroles derivados de vegetales inhibe perjudicialmente la absorción de colesterol en lactantes (Shokuhin to Kaihatsu (Food Processing And Ingredients), Vol. 33, N° 2, pp. 42-45 (1998)). Por lo tanto, cuando se tienen en cuenta aplicaciones en las que se incorporan grasas o aceites comestibles en una leche de inicio, se desean intensamente grasas o aceites comestibles que tienen un bajo contenido de esteroles, esto es, que tiene un bajo contenido de materia no saponificable.

La mayor parte de la grasa o el aceite producido cultivando microorganismos pertenecientes al género Mortierella corresponde a triglicéridos (no menos de aproximadamente 70% en peso) y fosfolípidos, y la materia no saponificable está contenida como otro componente. La materia no saponificable comprende esteroles, tales como desmosterol, y ésteres esterólicos como componentes principales. La grasa o el aceite comestible están en forma de triglicéridos. Se puede proporcionar una grasa o un aceite refinado, del que se han eliminado fosfolípidos, sometiendo la grasa o el aceite original producido cultivando microorganismos (grasa o aceite que se han proporcionado mediante extracción de células y se denominan "aceite bruto") a procedimientos de refinado para grasa o aceite comestible (desgomado, desoxidación, desodorización y decoloración). Sin embargo, es difícil eliminar completamente la materia no saponificable mediante los procedimientos de refinado.

Por las razones de que es difícil la eliminación completa de la materia no saponificable y se desean generalmente una grasa o un aceite comestibles que tienen bajo contenido de materia no saponificable, se han realizado estudios sobre cómo eliminar la materia no saponificable. Como resultado, se ha investigado el refinado mediante cromatografía en columna: véanse los documentos JP-A-10/191886 y EP-A-0956774. Sin embargo, en esta técnica no se han realizado estudios detallados sobre los componentes que constituyen la materia no saponificable. Sigue desconociéndose un cambio en los componentes de la materia no saponificable después de refinar con respecto a los componentes antes del refinado, esto es, la información sobre qué componentes se han eliminado mediante refinado.

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La grasa o el aceite producidos cultivando microorganismos pertenecientes al género Mortierella se acumulan dentro del micelio. Por lo tanto, se debe lleva a cabo un cultivo para dar una concentración de células superior desde el punto de vista de la mejora de la rentabilidad de la producción de grasa o aceite que contiene ácidos grasos altamente insaturados. A fin de proporcionar una alta concentración de células, se debe incrementar la concentración de fuente de nitrógeno del medio convertido en componentes celulares. Según informes previos (los anteriores documentos EP-A-0956774 y JP-A-10/070992 correspondiente a EP-A-0957173), aunque se presente el contenido de materia no saponificable o de esteroles totales, la concentración de la fuente de nitrógeno en el medio usado en el cultivo de microorganismos es aproximadamente 1,5% como máximo.

Además, se ha presentado grasa o aceite que contiene ácidos grasos altamente insaturados que tiene un contenido de esteroles no mayor que 1% (documento WO 97/43362). En este caso, sin embargo, la concentración de fuente de nitrógeno en el medio usado en esta producción es baja y, en la producción de una grasa o un aceite que contiene ácido araquidónico producido usando Mortierella alpina, el cultivo se lleva a cabo en una baja concentración de fuente de nitrógeno de 1% (= extracto de levadura 0,5% + NaNO3 0,5%) (documento WO 97/37032). Así, por la razón de que se desean genaralmente una grasa o un aceite comestible que tiene bajos contenido de materia no saponificable y contenido de esteroles, se han realizado estudios sobre una reducción en la materia no saponificable y/o los esteroles. Sin embargo, no hay ninguna descripción de materia no saponificable y los esteroles contenidos en grasa o aceite microbiano producido por un cultivo de microorganismos a alta concentración.

Según se describe anteriormente, los esteroles como un componente principal de la materia no saponificable se dividen en esteroles de tipo libre y esteroles de tipo éster. Los esteroles de tipo libre se pueden eliminar mediante los procedimientos de refinado, mientras que los esteroles de tipo éster difícilmente se pueden eliminar mediante los procedimientos de refinado. Por lo tanto, se considera que, a fin de proporcionar una grasa o un aceite refinado que tiene bajo contenido de materia no saponificable, específicamente bajo contenido de esteroles, es importante el desarrollo de una materia prima para refinado que tiene un bajo contenido de esteroles de tipo éster, que no se pueden eliminar mediante los procedimientos de refinado sin dificultades, esto es, un aceite bruto que tiene bajo contenido de esteroles de tipo éster.

Divulgación de la invención

Así, la presente invención proporciona un aceite bruto que tiene un contenido rebajado de esteroles de tipo éster, y opcionalmente un contenido de materia no saponificable rebajado, que comprende un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente, según se indica en la reivindicación 1, concretamente:

un aceite microbiano bruto que comprende una grasa o aceite que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente, siendo dicho ácido graso altamente insaturado ácido araquidónico (20:4 w6) y siendo el contenido de dicho ácido graso altamente insaturado, basado en el ácido graso total en el aceite crudo, no inferior a 30% en peso y siendo el contenido de esterol de tipo éster de la grasa o el aceite no no mayor que 0,8% en peso. Además, la presente invención proporciona un proceso para producir un aceite refinado a partir del aceite bruto.

Por otra parte, la presente invención proporciona diversos usos de la grasa o el aceite anterior.

Ya se ha presentado una grasa o un aceite que tiene un contenido de materia no saponificable y un contenido de esteroles rebajado y que comprende un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente (EP-A- 0956774, EP-A-0957173, WO97/43362). Sin embargo, estos procedimientos de producción no son adecuados para la producción rentable de grasa o aceite, debido a que la concentración de la fuente de nitrógeno del medio en el cultivo es baja. Por lo tanto, a fin de aumentar la rentabilidad, se ha mejorado la cantidad de grasa o aceite que contiene ácidos grasos altamente insaturados recuperada por cultivo realizando el cultivo en una concentración aumentada de fuente de nitrógeno del medio. Sin embargo, en este caso, se ha encontrado que el contenido de materia no saponificable y el contenido de esteroles de la grasa o el aceite también se aumentan. Por consiguiente, es deseable desarrollar un procedimiento de producción que pueda satisfacer tanto una mejora en la rentabilidad mediante cultivo a alta concentración como una mejora en la calidad mediante una reducción en el contenido de materia no saponificable y el contenido de esteroles.

Los presentes inventores han realizado estudios extensos e intensivos sobre las condiciones de cultivo y las composiciones químicas de grasa o aceite producidos en medios que contienen una alta concentración de fuente de nitrógeno con vistas a proporcionar una grasa o un aceite (aceite bruto) que tiene un contenido rebajado de materia no saponificable y/o un contenido rebajado de esteroles de tipo éster y que comprenda un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente producido mediante cultivo a alta concentración. Como resultado, sorprendentemente, una mejora en la forma de un rotor de agitación de un depósito de cultivo y una mejora en las condiciones de pH para la esterilización de la fuente de nitrógeno del medio han conducido al establecimiento de un procedimiento de producción de una grasa o un aceite (aceite bruto) que tiene un contenido de materia no saponificable no mayor que 2,2% en peso y/o un contenido de esteroles de tipo éster no mayor que 1,0% en peso y que comprende un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente.

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Se sabe que el aporte de una cantidad de oxígeno satisfactoria es importante para la producción de ácidos grasos altamente insaturados usando microorganismos mediante un método de cultivo líquido JP-A-6(1994)/153970). Un coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (kLa) se ha usado extensivamente como un índice de aporte de oxígeno en el cultivo líquido de microorganismos. Richard ha presentado que el kLa tiene una relación representada por la fórmula (1) con el consumo de energía por agitación por unidad de cantidad de líquido (Pg/V), la velocidad lineal de aireación (Vs) y la velocidad de agitación (N) (J. W. Richard; Prog. Ind. Microbiol., vol. 3, p. 141, (1961)) .

kLaoc (Pg/V) °-4Vs°-5N0-5 (1)

Basándose en los valores medidos de un depósito de cultivo que tiene un volumen de 0,2 a 60 m3, Fukuda et al. han presentado que la fórmula (2) proporciona una mejor correlación que la fórmula (1) (Fukuda et al., Hakkokogaku Kaishi, vol. 46, p. 829 (1968)).

kLa<x{ (Pg/V) °-4Vs°-5N0-5}1-4 (2)

Matsushima et al. han verificado la universalidad de las fórmulas (1) y (2) y han presentado que las fórmulas (1) y (2) se pueden aplicar más ampliamente mediante la generalización que se representa mediante la fórmula (3) (Matsushima et al., Hakkokogaku Kaishi, vol. 50, p. 105 (1972)).

kLaoc{ (Pg/V) °-4Vs°-5N°-5}a (3)

A partir de estas fórmulas de correlación, se considera que, bajo condiciones de consumo de energía por agitación (Pg/V) idéntica y velocidad lineal de aireación (Vs) idéntica, una velocidad de agitación (N) superior proporciona un coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (kLa) superior.

La demanda de energía de agitación por unidad de cantidad de líquido se representa mediante la fórmula (4).

Pg/V = pNpN3d5/V (4)

en la que p representa la densidad del líquido, Np representa el número de potencia y d representa el diámetro del rotor de agitación.

A fin de proporcionar una velocidad de agitación (N) superior en un trabajo dado realizado, esto es, una demanda de energía de agitación idéntica, se considera ventajoso el uso de un depósito de cultivo que tiene un número de potencia (Np) menor y un diámetro del rotor de agitación (d) menor.

Taguchi et al., (Biseibutsugaku Kisokoza 7-Biseibutu Baiyo Kogaku- (Introduction to Microbiology 7-Miroorganism Fermentation Engineering), editado por Hisaharu Taguchi y Shiro Nagai, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd. p. 175 (1985)) describe que, considerando condiciones estándar para un depósito de cultivo con aireación-agitación, la relación d/D está en el intervalo de 1/4 a 1/3 como un intervalo estándar y típicamente es 1/3.

Sin embargo, esto solamente se establece en agua o una solución de cultivo que tiene una baja concentración de células. A fin de mejorar la rentabilidad de la producción, la concentración de una fuente de nitrógeno en el medio se debe incrementar para dar una concentración de células superior. Por lo tanto, los presentes inventores han pensado que, en una solución de cultivo que tiene una alta concentración de células, se debe tener en cuenta no solo el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (kLa) sino también la mezcladura de toda la solución de cultivo.

Además, se ha encontrado que, cuando el cultivo se llevaba a cabo en un medio que tenía una concentración aumentada de fuente de nitrógeno, esto es, a una concentración superior, se incrementan el contenido de materia no saponificable y el contenido de esteroles de tipo éster de una grasa o un aceite (aceite bruto) que comprendía un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente extraído de microorganismos, dando como resultado la producción de una grasa o un aceite que tiene una composición química no deseada debido a que el cultivo tenía una concentración aumentada de fuente de nitrógeno. Iwamoto ha presentado que el contenido de materia no saponificable en lípidos totales disminuye con un incremento en el contenido de grasa o aceite de las células ("Biseibutsuniyoru Yushino Seisan (Microbial production of fat or oil)", Hiroaki Iwamoto, (fuente desconocida)). Estudios efectuados por los presentes inventores también han mostrado que es probable que el cultivo en una concentración superior disminuya el contenido de grasa o aceite por célula. Los presentes inventores han considerado que el contenido de grasa o aceite por célula rebajado provocaba un contenido de materia no saponificable y un contenido de esteroles de tipo éster incrementados.

Por consiguiente, los presentes inventores han considerado que, en el cultivo a alta concentración en el que la concentración de la fuente de nitrógeno en el medio es alta, lo que es importante es mejorar no solo el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (kLa) sino también la mezcladura de toda la solución de cultivo y así mejorar el contenido de grasa o aceite por célula. Los presentes inventores se han dirigido a una mejora en la conformación (forma) del rotor de agitación como un medio para conseguir este fin y han realizado estudios extensos e intensivos. Como resultado, los presentes inventores han tenido éxito en el aumento del contenido de

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grasa o aceite por célula y en la mejora de la productividad de ácidos grasos altamente insaturados, mediante microorganismos en un cultivo, usando un depósito de cultivo con d/D (la relación del diámetro del rotor de agitación (= d) al diámetro interno del depósito de cultivo (= D) = 0,34 a 0,6. Además, se ha encontrado sorprendentemente que, en este caso, la grasa o el aceite que comprende un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente extraído del microorganismo tenía un contenido de esteroles de tipo éster significativamente rebajado.

Además, se ha encontrado que, incluso en el caso de un depósito de cultivo con d/D = menor de 0,34, se puede conseguir una mejora en la productividad de un ácido graso altamente insaturado mediante microorganismos y una reducción en el contenido de esteroles de tipo éster esterilizando la fuente de nitrógeno en el medio a un valor de pH no mayor que 5,0.

Basándose en esto, los presentes inventores han realizado estudios extensos e intensivos y, como resultado, han tenido éxito en la producción estable de una grasa o un aceite (aceite bruto) que tiene un contenido de materia no saponificable y/o un contenido rebajado de esteroles de tipo éster adoptando un método en el que el cultivo se lleva a cabo usando un depósito de cultivo provisto de un rotor de agitación con una d/D = no menor de 0,34, o adaptando un método en el que, en el caso de un depósito de cultivo con una d/D = menor de 0,34, el cultivo se lleva a cabo en un medio que contiene una fuente de nitrógeno que se ha esterilizado a un valor de pH no mayor que 5. Esto ha llevado a la realización de la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un aceite bruto tal como se reivindica que tiene un contenido rebajado de esteroles de tipo éster y opcionalmente un contenido rebajado de materia no saponificable, que comprende ácido araquidónico como un ácido graso constituyente, en que un microorganismo capaz de producir una grasa o un aceite que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente se cultiva en un medio que contiene una concentración de la fuente de nitrógeno de 2 a 15% dentro de un depósito de cultivo equipado con un rotor de agitación que satisface la demanda de que la relación del diámetro del rotor de agitación (= d) al diámetro interno del depósito de cultivo (= D) sea d/D = 0,30 a 0,6.

El aceite bruto se puede caracterizar por que tiene un contenido de materia no saponificable no mayor que 2,2% en peso, producido mediante el procedimiento anterior. Se puede producir una grasa o un aceite refinado refinando el aceite bruto anterior.

La presente descripción también proporciona un alimento o una bebida general, un alimento funcional, un complemento nutricional, una leche de inicio para prematuros, una leche de inicio para recién nacidos a término, un alimento para lactantes, un alimento para madres gestantes y lactantes o un alimento para ancianos, que comprende el aceite bruto anterior y/o la grasa o el aceite refinado anterior incorporado en los mismos.

La presente descripción también proporciona un alimento nutritivo terapéutico que comprende el aceite bruto anterior y/o la grasa o el aceite refinado anterior incorporado en el mismo opcionalmente junto con un vehículo neutro adecuado para la administración bucal, intrarrectal o parenteral.

La presente descripción también proporciona un alimento para animales o peces, que comprende el aceite bruto anterior y/o la grasa o el aceite refinado anterior incorporado en el mismo.

La presente descripción también proporciona una composición farmacéutica, que comprende el aceite bruto anterior y/o la grasa o el aceite refinado anterior incorporado en la misma. La presente descripción también proporciona una composición farmacéutica preparada usando como materia prima el aceite bruto anterior y/o la grasa o el aceite refinado anterior.

Realizaciones de la invención

Se describe aquí un procedimiento para producir una grasa o un aceite (aceite bruto) que tiene un contenido rebajado de esteroles de tipo éster, y opcionalmente un contenido de materia no saponificable rebajado, que comprende un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente, dicha grasa o aceite (aceite bruto), y alimentos y bebidas, alimentos nutricionales terapéuticos, alimentos para animales y preparaciones farmacéuticas, con una grasa o aceite (triglicérido) refinado proporcionado por refino de la grasa o aceite (aceite bruto) incorporado en los mismos.

La grasa o el aceite (aceite bruto) es una grasa o un aceite microbiano obtenido de un producto de cultivo preparado cultivando un microorganismo capaz de producir una grasa o un aceite que comprende el ácido graso altamente insaturado, a saber ácido araquidónico, como un ácido graso constituyente en un medio que contiene una concentración de la fuente de nitrógeno de 2 a 15%. La grasa o el aceite (aceite bruto) tiene un contenido rebajado de materia no saponificable y/o esteroles de tipo éster que se puede conseguir mediante el cultivo en un depósito de cultivo provisto de un rotor de agitación de d/D = 0,34 a 0,6, o mediante el cultivo en un medio que contiene una fuente de nitrógeno esterilizado a un valor del pH no mayor que 5 cuando se usa un depósito de cultivo de d/D menor de 0,34.

Específicamente, la grasa o el aceite (aceite bruto) puede tener un contenido de materia no saponificable no mayor que 2,2% en peso, preferiblemente no más de 2,0% en peso, más preferiblemente no más de 1,8% en peso. Tiene

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un contenido de esteróles de tipo éster no mayor que 1,0% en peso, preferiblemente no no mayor que 0,8% en peso, más preferiblemente no más de 0,6% en peso. Tiene un contenido de ácido graso altamente insaturado, basado en el ácido graso total en la grasa o el aceite (aceite bruto), no mayor que 30% en peso, preferiblemente no más de 40% en peso. Por lo tanto, se debe llevar a cabo el cultivo de un microorganismo capaz de producir una grasa o un aceite (triglicérido) que comprende un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente.

Los microorganismos mencionados en la presente memoria son microorganismos que pueden producir, principalmente como un ácido graso constituyente de triglicérido, al menos ácido araquidónico (ácido 5,8,11,14- eicosatetraenoico) que es un ácido graso altamente insaturado w6.

Incidentalmente, los ácidos grasos altamente insaturados u>6 que tienen 18 o más átomos de carbono y 3 o más dobles enlaces incluyen ácido Y-linolénico (ácido 6,9,12-octadecatrienoico), ácido dihomo-Y-linolénico (ácido 8,11,14- eicosatrienoico), ácido araquidónico (ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico), ácido 7,10,13,16-docosatetraenoico (22:4 w6) y DPA w6 (ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico). Ácidos grasos altamente insaturados w9 que tiene 18 o más átomos de carbono y 2 o más dobles enlaces incluyen ácido 6,9-octadecadienoico, ácido 8,11-eicosadienoico y ácido de Mead (ácido 5,8,11-eicosatrienoico). Ácidos grasos altamente insaturados w3 que tienen 18 o más átomos de carbono y 3 o más dobles enlaces incluyen ácido a-linolénico (ácido 9,12,15-octadecatrienoico), ácido 6,9,12,15- octadecatetraenoico (18:4 w3), ácido 8,11,14,17-eicosatetraenoico (20:4 u>3), EPA (ácido 5,8,11,14,17- eicosapentaenoico), DPAw3 (ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico) y DHA (ácido 4,7,10,13,16,19- docosahexaenoico).

Por consiguiente, en la presente invención, se pueden usar todos los microorganismos con tal de que puedan producir una grasa o un aceite (triglicéridos) que comprenda ácido araquidónico como ácido graso constituyente. Microorganismos capaces de producir una grasa o un aceite (triglicéridos) que comprende ácido araquidónico como ácidos grasos constituyentes incluyen, por ejemplo, microorganismos pertenecientes al género Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium y Saprolegnia.

Microorganismos pertenecientes al subgénero Mortierella del género Mortierella incluyen, por ejemplo, el subgénero Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila y Mortierella alpina. Ejemplos específicos de los mismos incluyen las cepas Mortierella elongata (IFO 8570), Mortierella exigua (IFO 8571), Mortierella hygrophila (IFO 5941), Mortierella alpina (IFO 8568), ATCC 16266, ATCC 32221, ATCC 42430, CBS 219.35, CBS 224.37, CBS 250.53, CBS 343.66, CBS 527.72, CBS 529.72, CBS 608.70 y CBS 754.68.

Todas estas cepas están disponibles sin restricción de the Institute for Fermentation, Osaka (IFO), American Type Culture Collection (ATCC) y Centrralbureau voor Schimmelcultures (CBS). Además, también se puede usar una cepa aislada del suelo por un grupo de investigación implicado en la presente invención, es decir, Mortierella elongata SAM 0219 (FERM P-8703) (FERM BP-1239).

A fin de cultivar la cepa usada en la presente invención, esporas, micelios o una solución del cultivo de siembra obtenida cultivando por adelantado o células recogidas del cultivo de siembra se inoculan en un medio líquido, seguido por un cultivo principal. En el caso de un medio líquido, fuentes de carbono utilizables en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, las usadas comúnmente en la técnica, por ejemplo, glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melaza, glicerol, manitol y almidones sacarificados.

Fuentes de nitrógeno incluyen fuentes de nitrógeno naturales tales como peptonas, extractos de levadura, extractos de malta, extractos de carne, casaminoácidos, licores de maceración de maíz, proteínas de habas de soja, habas de soja desengrasadas y harinas de semillas de algodón, fuentes de nitrógeno orgánicas tales como urea, y fuentes de nitrógeno inorgánicas tales como nitrato sódico, nitrato amónico y sulfato amónico. En particular, se pueden mencionar como la fuente de nitrógeno fuentes de nitrógeno obtenidas de habas de soja, específicamente habas de soja, habas de soja desengrasadas, escamas de habas de soja, proteínas de haba de soja comestibles, restos de cuajada de habas, leche de soja y harina de soja. En particular, se pueden usar sojas desengrasadas desnaturalizadas térmicamente, más preferiblemente productos preparados tratando térmicamente habas de soja desengrasadas a aproximadamente 70 a 90°C y eliminando un componente soluble en etanol, individualmente o en una combinación de dos o más de ellas con la fuente de nitrógeno anterior.

Además, si es necesario, también se pueden usar como nutrientes secundarios iones fosfato, iones potasio, iones sodio, iones magnesio, iones calcio y, además, iones metálicos tales como iones hierro, cobre, cinc, manganeso, níquel y cobalto, y una vitamina.

Las concentraciones de estos componentes del medio no están particularmente limitadas con tal de que no se inhiba el crecimiento de los microorganismos. En la práctica, la cantidad total de las fuentes de carbono añadida es generalmente de 0,1 a 40% en peso, preferiblemente de 1 a 25% en peso, y la cantidad total de las fuentes de nitrógeno añadida es preferiblemente de 2 a 15% en peso, más preferiblemente de 2 a 10% en peso. Más preferiblemente, la cantidad inicial de las fuentes de carbono añadida es de 1 a 5% en peso, y la cantidad inicial de las fuentes de nitrógeno añadida es de 3 a 8% en peso, y, en el transcurso del cultivo, se pueden alimentar la fuente

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de carbono y la fuente de nitrógeno y, más preferiblemente, solamente la fuente de carbono.

A fin de incrementar el rendimiento de ácidos grasos insaturados, por ejemplo, se pueden usar hidrocarburos tales como hexadecano u octadecano; ácidos grasos o sus sales tales como ácido oleico o ácido linoleico, o ésteres de ácido graso, por ejemplo, ésteres etílicos, ésteres de ácido graso de glicerina o ésteres de ácido graso de sorbitano; o una grasa o un aceite tales como aceites de oliva, aceites de soja, aceites de colza, aceites de algodón o aceites de palma, como precursores de ácidos grasos insaturados, bien individualmente o bien en combinación. La cantidad del sustrato añadida es de 0,001 a 10%, preferiblemente de 0,5 a 10%, basado en el medio. El cultivo también se puede llevar a cabo usando estos sustratos como una única fuente de carbono.

La temperatura de cultivo de microorganismos, que producen ácidos grasos altamente insaturados, varía dependiendo del microorganismo usado. Sin embargo, la temperatura de cultivo puede ser de 5 a 40°C, preferiblemente de 20 a 30°C. Se puede usar un método en el que el cultivo se lleva a cabo a de 20 a 30°C para hacer crecer las células y entonces el cultivo se continúa a de 5 a 20°C para producir ácidos grasos insaturados. La proporción de un ácido graso altamente insaturado en el ácido graso producido también se puede incrementar mediante este control de la temperatura. Se lleva a cabo un cultivo de siembra mediante un cultivo con aireación- agitación, cultivo con oscilación, cultivo sólido o cultivo en líquido estacionario, y el cultivo principal se lleva a cabo mediante cultivo con aireación-agitación. El medio en el momento del comienzo del cultivo principal (en el momento de la inoculación de la solución del cultivo de siembra) se ajusta hasta un pH de 5 a 7, preferiblemente de 5,5 a 6,5. El cultivo principal se lleva a cabo generalmente durante de 2 a 30 días, preferiblemente de 5 a 20 días, más preferiblemente de 5 a 15 días.

La grasa o el aceite (aceite bruto) según la presente invención es una grasa o un aceite microbiano obtenido de un producto de cultivo preparado cultivando un microorganismo capaz de producir una grasa o un aceite (triglicérido) que comprende el ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente, y el rasgo más característico de la presente invención es que se reduce el contenido de esteroles de tipo éster del aceite bruto, opcionalmente también el contenido de materia no saponificable. Esto puede ser por cultivo principal en un depósito de cultivo provisto de un rotor de agitación de d/D = 0,34 a 0,6, o mediante cultivo principal en un medio que contiene una fuente de nitrógeno esterilizado a un valor de pH no mayor que 5 cuando se usa un depósito de cultivo de d/D = menor de 0,34. Así, la presebte invención ha desarrollado un método que puede rebajar el contenido de esteroles de tipo éster, opcionalmente rebajar también el contenido de materia no saponificable, en el aceite bruto usando microorganismos capaces de producir una grasa o un aceite (triglicéridos) que comprende el ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente.

En el método de cultivo aquí el contenido de materia no saponificable y el contenido de esteroles de tipo éster en el aceite bruto se rebaja mediante el cultivo en un depósito de cultivo de d/D (la relación del diámetro del rotor de agitación (= d) al diámetro interno del depósito de cultivo (= D)) = 0,30 a 0,6, preferiblemente d/D = 0,34 a 0,55, más preferiblemente d/D = 0,37 a 0,55, lo más preferiblemente d/D = 0,42 a 0,55. A fin de conseguir un mejor efecto mediante la relación d/D, se desea el uso de un depósito de cultivo que tiene un volumen de no menos de 1 m3, preferiblemente no menos de 5 m3, más preferiblemente no menos de 10 m3. En cuanto al rotor de agitación, se pueden usar rotores de agitación que incluyen álabes de turbina en una fase o en una pluralidad de fases sin limitación particular.

Cuando se lleva a cabo un ajuste del pH del medio después de la esterilización del medio, el procedimiento de ajuste se debe llevar a cabo asépticamente con precaución, de modo que no se provoque una contaminación con un microorganismo no deseado. Por lo tanto, el ajuste del pH se lleva a cabo generalmente antes de la esterilización del medio. Por ejemplo, cuando un medio, que no provoca ningún cambio de pH durante la esterilización, se ajusta hasta pH 6,0 en el momento del comienzo del cultivo, el ajuste del pH del medio de un modo no aséptico hasta 6,0 antes de la esterilización elimina la necesidad de un ajuste aséptico del pH después de la esterilización. A fin de reducir el esterol de tipo éster incluso en un depósito de cultivo de d/D = menor de 0,34, los presentes inventores han apuntado a y han realizado estudios sobre la influencia de la condición de pH en la etapa de esterilización sobre la productividad del cultivo y la composición del producto. Como resultado, los presentes inventores han encontrado que, antes de la esterilización de un medio ajustado hasta un pH no mayor que 5, se prefiere el reajuste del pH hasta un valor adecuado para el comienzo del cultivo después de la esterilización.

Específicamente, una solución que contiene una fuente de nitrógeno del medio se ajusta hasta un pH de 4 a 5, preferiblemente un pH de 4,2 a 4,7, seguido por esterilización. El medio esterilizado como tal u opcionalmente después de la adición de otro medio que se va a esterilizar se usa para preparar un medio de inicio de cultivo que a continuación se ajusta hasta un pH de 5 a 7, preferiblemente un pH de 5,5 a 6,5. Una solución del cultivo de siembra se inocula al medio para comenzar el cultivo principal. Ajustadores del pH utilizables para ajustar el pH de la solución que contiene la fuente de nitrógeno antes de la esterilización incluyen, pero no se limitan particularmente a, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y ácido carbónico o sus sales, que se usan individualmente o en una combinación de dos o más de ellos. Reajustadores para el pH del medio después de la esterilización incluyen, pero no se limitan particularmente a, compuestos de hidróxido tales como hidróxido sódico e hidróxido potásico y amoníaco y sales de amonio, que se usan individualmente o en una combinación de dos o más de ellos.

Se sabe que microorganismos pertenecientes al subgénero Mortierella del género Mortierella son capaces de

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producir grasa o aceite (triglicéridos) que comprende ácido araquidónico como un ácido graso constituyente principal.

Además, los presentes inventores también han obtenido microorganismos resistentes a una fuente de carbono muy concentrada (documento WO 98/39468). Los anteriores microorganismos son también microorganismos pertenecientes al subgénero Mortierella del género Mortierella, y el contenido de materia no saponificable y/o el contenido de esteroles de tipo éster de un aceite bruto se puede reducir fácilmente mediante el método de cultivo divulgado en la presente memoria, específicamente mediante cultivo principal en un depósito de cultivo provisto de un rotor de agitación de d/D = 0,34 a 0,6, o mediante cultivo principal en un medio que contiene una fuente de nitrógeno esterilizado a un valor de pH no mayor que 5 y que tiene una concentración de la fuente de nitrógeno en el medio de 2 a 15% cuando se usa un depósito de cultivo de d/D = menor de 0,34.no mayor que

Métodos utilizables para obtener un aceite bruto a partir de microorganismos, que han acumulado una grasa o aceite que comprende un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente que tiene un contenido de materia no saponificable y/o un contenido rebajado de esteroles de tipo éster producido mediante cultivo principal en un depósito de cultivo provisto de un rotor de agitación de d/D = 0,34 a 0,6, o mediante cultivo principal en un medio que contiene una fuente de nitrógeno esterilizado a un valor de pH no mayor que 5 y que tiene una concentración de la fuente de nitrógeno en el medio de 2 a 15% cuando se usa un depósito de cultivo de d/D = menor de 0,34, incluyen un método en el que, después de la terminación del cultivo, la solución de cultivo como tal o después de un tratamiento tal como esterilización, concentración o acidificación, se somete a medios de separación sólido-líquido convencionales, tales como sedimentación simple, centrifugación y/o filtración, para recoger las células cultivadas.

Se pueden añadir agentes coagulantes o adyuvantes de la filtración desde el punto de vista del favorecimiento de la separación sólido-líquido. Agentes coagulantes incluyen, por ejemplo, cloruro de aluminio, cloruro cálcico, algina y quitosano. Adyuvantes de la filtración incluyen, por ejemplo, tierra diatomácea. Preferiblemente, las células cultivadas se lavan con agua, se trituran y se secan. El secado se puede llevar a cabo, p. ej., mediante liofilización, secado al aire o secado en lecho fluidizado. Medios para obtener un aceite bruto a partir de células secadas pueden ser extracción con un disolvente orgánico o expresión. Sin embargo, se prefiere la extracción con un disolvente orgánico bajo una corriente de nitrógeno gaseoso.

Disolventes orgánicos incluyen etanol, hexano, metanol, etanol, cloroformo, diclorometano, éter de petróleo y acetona. También se puede usar una alternancia de extracción con metanol y éter de petróleo y extracción con un disolvente monofásico de cloroformo-metanol-agua. Sin embargo, los métodos de extracción para obtener el aceite bruto no están limitados a los métodos anteriores, y se puede usar cualquier método, que pueda extraer eficazmente grasa o aceite acumulado dentro de las células. Por ejemplo, se puede usar la extracción supercrítica como un método eficaz.

Un aceite bruto buscado se puede obtener eliminando el componente de disolvente orgánico o fluido supercrítico del extracto obtenido mediante la extracción con el disolvente orgánico o el fluido supercrítico bajo presión reducida u otras condiciones. Además, alternativamente, la extracción se puede llevar a cabo usando células húmedas. En este caso, se usan disolventes compatibles con agua, tales como metanol, etanol y acetona, o disolventes mixtos compatibles con agua y compuestos por los disolventes anteriores y agua y/u otros disolventes. Los otros procedimientos son iguales que los descritos anteriormente.

El aceite bruto que tiene un contenido rebajado de esteroles de tipo éster y opcionalmente un contenido rebajado de materia no saponificable y que comprende ácido araquidónico como un ácido graso constituyente se puede combinar con un alimento para animales para uso directo. Sin embargo, cuando se tiene en cuenta la aplicación a alimentos, antes del uso, el aceite bruto se somete preferiblemente a un procedimiento de refinado de grasa o aceite convencional. Procedimientos de refinado de grasa o aceite utilizables en la presente memoria incluyen procedimientos convencionales tales como desgomado, desoxidación, desodorización, decoloración, un tratamiento en columna, destilación molecular y frigelización. Por lo tanto, se puede obtener una grasa o un aceite refinado, de los que se ha rebajado impredeciblemente el contenido de materia no saponificable y/o el contenido de esteroles de tipo éster, sometiendo el aceite bruto según la presente invención, que tiene un contenido rebajado de esteroles de tipo éster inalcanzable mediante el procedimiento de refinado de grasa o aceite convencional, a procedimientos de refinado de grasa o aceite.

La carga de procesamiento en el procedimiento de refinado también se puede disminuir sometiendo el aceite bruto, según la presente invención, al procedimiento de refinado de grasa o aceite. Específicamente, por ejemplo, se puede proporcionar una grasa o un aceite refinado que tiene un contenido de materia no saponificable y/o un contenido de esteroles de tipo éster igual al de la técnica anterior con una reducción en el tiempo de tratamiento del procedimiento de refinado y una reducción en el coste energético. Además, se puede proporcionar una grasa o aceite refinado que tiene un contenido de esteroles de tipo éster, y opcionalmente un contenido de materia insaponificable inferior al de la técnica anterior usando el mismo tiempo de tratamiento y coste energético que la técnica anterior.

La grasa o el aceite (triglicérido) refinado es utilizable en una gama infinita de aplicaciones, por ejemplo, en materias primas y aditivos para alimentos, bebidas, cosméticos y preparaciones farmacéuticas, y el propósito y la cantidad de

uso no están limitados.

Por ejemplo, composiciones alimenticias, en las que se puede usar la grasa o el aceite refinado, incluyen alimentos generales y, además, alimentos funcionales, complementos nutricionales, leche de inicio para prematuros, leche de inicio para recién nacidos a término, leche de inicio para lactantes, alimentos para lactantes, alimentos para madres 5 gestantes y lactantes o alimentos para ancianos.

Ejemplos de alimentos que contienen grasa o aceite incluyen: alimentos naturales que contienen inherentemente grasa o aceite, tales como carne, pescado o nueces; alimentos a los que se añaden grasa o aceite en el momento de cocinar, tales como sopas; alimentos que usan grasa o aceite como medio de calentamiento, tales como rosquillas; alimentos grasos u oleosos tales como mantequilla; alimentos procesados a los que se añade grasa o 10 aceite en el momento del procesamiento, tales como galletas o bizcochos; o alimentos sobre los que se pulveriza o reviste grasa o aceite en el momento del procesamiento final, tales como bizcochos duros. Además, la grasa o el aceite refinado se puede añadir a alimentos agrícolas, alimentos fermentados, alimentos para ganado, alimentos marinos o bebidas libres de grasa y aceite. La grasa o el aceite refinado se puede usar en la forma de alimentos funcionales y preparaciones farmacéuticas, por ejemplo, se puede usar en formas procesadas tales como nutrientes 15 enterales, polvos, gránulos, pastillas para chupar, líquidos para uso interno, suspensiones, emulsiones y jarabes.

Ejemplos

La presente invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, se debe apuntar que la presente invención no está limitada solo a estos ejemplos.

Ejemplo 1: Producción de ácido araquidónico, d/D = 0,34, concentración de harina de soja en el medio = 6%

20 Se proporcionó Mortierella alpina (CBS 754.68) como un hongo productor de ácido araquidónico. Una cepa estándar de Mortierella alpina se inoculó en un medio (extracto de levadura al 1%, glucosa al 2%, pH 6,3). Se inició un cultivo de siembra (primera fase) bajo condiciones de oscilación alternativa a 100 rpm y una temperatura de 28°C, y el cultivo de siembra se continuó durante 3 días. Posteriormente, se prepararon 30 l de un medio (extracto de levadura al 1%, glucosa al 2%, aceite de soja al 0,1%, pH 6,3) en un depósito de cultivo de aireación-agitación de 50 l de 25 volumen. La solución del cultivo de siembra (primera fase) se inoculó en el medio. El cultivo de siembra (segunda fase) se comenzó bajo condiciones de velocidad de agitación 200 rpm, temperatura 28°C y presión interna del depósito 150 kPa, y el cultivo de siembra se continuó durante 2 días.

Posteriormente, se prepararon 4.500 l de un medio (medio A: harina de soja 336 kg, KH2PO4 16,8 kg, MgCl2-6H2O 2,8 kg, CaCl2'2H2O 2,8 kg, aceite de soja 5,6 kg). El medio se ajustó hasta pH 6,3 para la condición (1-1) y hasta pH 30 4,5 para la condición (1-2). Tanto el medio para la condición (1-1) como el medio para la condición (1-2) se

esterilizaban bajo condiciones de 121°C y 20 min. Se preparó medio C como otro medio esterilizando 1.000 l de un medio (medio B: monohidrato de glucosa 112 kg) bajo condiciones de 140°C durante 40 s y añadiendo el medio esterilizado al medio A anterior. El medio C como tal se usó para la condición (1-1) y el medio C se ajustó hasta pH 6,3 para la condición (1-2). La solución del cultivo de siembra (segunda fase) se inoculó a continuación en los 35 medios así preparados, y el volumen se ajustó hasta una cantidad inicial de solución de cultivo de 5.600 l en total (volumen del depósito de cultivo: 10 kl).

El cultivo se comenzó bajo condiciones de temperatura 26°C, caudal de aire 49 Nm3/h y presión interna 200 kPa.

La forma del depósito de cultivo era tal que se proporcionaban turbinas de seis álabes en tres fases y la relación del diámetro del rotor de agitación (= d) al diámetro interno del depósito (= D) era d/D = 0,34. Mientras se alimentaba un 40 medio como el mostrado en la Tabla 1, se llevaba a cabo un cultivo principal durante 306 h. Al final del cultivo, la cantidad de la solución de cultivo era 7.750 l debido a la influencia de un incremento en la cantidad de la solución por la alimentación del medio y una disminución en la cantidad de la solución por evaporación de la solución. Al final del cultivo, la concentración de ácido araquidónico producido por litro de la solución de cultivo era 18,2 g/l para la condición (1-1) y 18,4 g/l para la condición (1-2).

45 Tabla 1: Alimentación al medio en el Ejemplo 1

Momento del cultivo principal: Medio alimentado

Después de 19 horas: monohidrato de glucosa 280 kg/460 l

Después de 43 horas: monohidrato de glucosa 280 kg/450 l

Después de 67 horas: monohidrato de glucosa 252 kg/390 l

Después de 91 horas: monohidrato de glucosa 252 kg/410 l

Después de 120 horas: monohidrato de glucosa 224 kg/370 l

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Después de 140 horas: monohidrato de glucosa 168 kg/280 l

Después de 163 horas: monohidrato de glucosa 168 kg/270 l

Después de la terminación del cultivo, la solución de cultivo se esterilizó bajo condiciones de 120°C durante 20 min. A continuación, se recogieron células húmedas mediante un deshidratador continuo. Las células húmedas recogidas se secaron en una secadora de lecho fluidizado con vibración hasta un contenido de agua de 1% en peso. Las células secadas se transportaron mediante una máquina de transporte por aire hasta una zona de carga y, junto con nitrógeno gaseoso, se cargaron en una bolsa contenedora de aluminio que tenía un volumen de aproximadamente 1 m3. La parte abierta de la bolsa se termoselló, y la bolsa contenedora se almacenó en una nevera de 10°C o menos.

Las células secadas se extrajeron de la bolsa contenedora y se sometieron a extracción con hexano. La materia sólida se retiró de la solución de hexano mediante filtración. A continuación, el filtrado se calentó bajo presión reducida para eliminar el hexano para dar un aceite bruto que comprendía ácido araquidónico como un ácido graso constituyente. El aceite bruto se analizó. Como resultado, según se muestra en la Tabla 2, el aceite bruto tenía un bajo contenido de esteroles de tipo éster.

Tabla 2: Encontrado para aceite bruto que contiene ácido araquidónico

Ejemplo: Ejemplo 1 Condición 1-1 Ejemplo 2 Condición 1-2

Forma del depósito de cultivo, d/D: 0,34 0,34

Valor de pH ajustado del medio A (antes de la esterilización): 6,3 4,5

Valor de pH ajustado del medio C (después de la esterilización y antes de la inoculación de la solución del cultivo de siembra): 6,3 6,3

% en peso de cada fracción

Triglicérido: 94,0% 94,2%

Materia no saponificable: 2,0% 1,8%

Esterol de tipo éster: 0,8% 0,6%

Ácido araquidónico en ácido graso total en aceite bruto, %: 42,0% 42,1%

Ejemplo 2: Producción de ácido araquidónico, d/D = 0,42, concentración de harina de soja en el medio = 6%

Se llevó a cabo un cultivo de siembra del mismo modo que en el Ejemplo 1. El cultivo principal se llevó a cabo bajo las mismas condiciones que en la condición (1-1) en el Ejemplo 1, excepto que la forma del depósito de cultivo era tal que se proporcionaban turbinas de seis álabes de d/D = 0,42 en tres fases diferentes y se variaban las condiciones de pH para la preparación del medio. Para el cultivo bajo la condición (2-1), el medio A (antes de la esterilización) se ajustó hasta pH 6,1, y no se llevó a cabo ajuste del pH para el medio C (antes de la inoculación de la solución del cultivo de siembra). Para el cultivo bajo la condición (2-2), el medio A se ajustó hasta pH 4,5, y el medio C se ajustó hasta pH 6,1. Como resultado del cultivo, la concentración de ácido araquidónico producido por litro de solución de cultivo al final del cultivo era 19,0 g/l para la condición (2-1) y 19,7 g/l para la condición (2-2). Después de la terminación del cultivo, se obtuvo un aceite bruto que comprendía ácido araquidónico como un ácido graso constituyente del mismo modo que en el Ejemplo 1. El aceite bruto se analizó. Como resultado, según se muestra en la Tabla 3, el aceite bruto tenía un bajo contenido de esteroles de tipo éster.

Ejemplo: Ejemplo 2 Ejemplo 2

: Condición 2-1 Condición 2-2

Forma del depósito de cultivo, d/D: 0,42 0,42

Valor de pH ajustado del medio A (antes de la esterilización): 6,1 4,5

Valor de pH ajustado del medio C (después de la esterilización y antes de la inoculación de la solución del cultivo de siembra): 6,1 6,1

% en peso de cada fracción

Triglicérido: 94,2% 93,5%

Materia no saponificable: 1,8% 1,8%

Esterol de tipo éster: 0,6% 0,5%

Ácido araquidónico en ácido graso total en aceite bruto, %: 42,2% 41,3%

Ejemplo 3 [control]: Producción de ácido araquidónico, d/D = 0,3, 0,25 y 0,2, concentración de harina de soja en el medio = 6%

5 Se llevó a cabo un cultivo de siembra del mismo modo que en el Ejemplo 1. El cultivo principal se llevó a cabo bajo las mismas condiciones que en la condición (1-1) en el Ejemplo 1, excepto que, en lo referente a la forma del depósito de cultivo, se usaban un depósito provisto de turbinas de seis álabes de d/D = 0,3 en dos fases, un depósito provisto de turbinas de seis álabes de d/D = 0,25 en dos fases y un depósito provisto de turbinas de seis álabes de d/D = 0,2 en dos fases. Como resultado del cultivo, la concentración de ácido araquidónico producido por 10 litro de solución de cultivo al final del cultivo era 17,0 g/l para el depósito de d/D = 0,30, 16,5 g/l para el depósito de d/D = 0,25 y 13,5 g/l para el depósito de d/D = 0,2. Después de la terminación del cultivo, se obtuvo un aceite bruto que comprendía ácido araquidónico como un ácido graso constituyente del mismo modo que en el Ejemplo 1. El aceite bruto se analizó. Como resultado, según se muestra en la Tabla 4, para todos los casos, el contenido de esteroles de tipo éster superaba 1%. A partir de la comparación de los resultados del Ejemplo 3 con los resultados 15 de los Ejemplos 1 y 2, el alto contenido de esteroles de tipo éster se considera atribuible al depósito de cultivo con una baja relación d/D.

Tabla 4: Encontrado para aceite bruto que contiene ácido araquidónico

Ejemplo o ejemplo de control: Ejemplo 3 Ejemplo 3 Ejemplo 3

: Ejemplo de control Ejemplo de control Ejemplo de control

Forma del depósito de cultivo, d/D: 0,30 0,25 6,3

Valor de pH ajustado del medio A (antes de la esterilización): 6,3 6,3 6,3

Valor de pH ajustado del medio C (después de la esterilización y antes de la inoculación de la solución del cultivo de siembra): 6,3 6,3 6,3

% en peso de cada fracción

Triglicérido: 93,8% 93,1% 93,0%

Materia no saponificable: 2,9% 2,9% 2,9%

Esterol de tipo éster: 1,2% 1,2% 1,2%

Ácido araquidónico en ácido graso total en aceite bruto, %: 42,0% 41,6% 41,5%

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30

Se llevó a cabo un cultivo de siembra del mismo modo que en el Ejemplo 1. El ajuste del pH del medio en el cultivo principal se llevó a cabo del mismo modo que en la condición (1-2) en el Ejemplo 1 (medio A (pH 4,5) esterilización medio C (pH 6,3)). Posteriormente, el cultivo principal se llevó a cabo bajo tres condiciones en total, es decir, la condición 4-1 en la que se usaba un depósito provisto de turbinas de seis álabes de d/D = 0,3 en dos fases, la condición 4-2 en la que se usaba un depósito provisto de turbinas de seis álabes de d/D = 0,25 en dos fases y la condición 4-3 en la que se usaba un depósito provisto de turbinas de seis álabes de d/D = 0,2 en dos fases del mismo modo que en el Ejemplo 1. Además de los experimentos anteriores, se llevó a cabo un cultivo usando un depósito de d/D = 0,3 bajo dos condiciones adicionales tales que el medio A se ajustaba hasta pH 4,0 para la condición 4-4 y pH 4,9 para la condición 4-5.

Como resultado del cultivo principal, la concentración de ácido araquidónico producido por litro de solución de cultivo al final del cultivo era 17,2 g/l para la condición (4-1) [esterilización a pH 4,5, d/D = 0,30], 16,8 g/l para la condición (4-2) [esterilización a pH 4,5, d/D = 0,25], 14,0 g/l para la condición (4-3) [esterilización a pH 4,5, d/D = 0,20], 17,1 g/l para la condición (4-4) [esterilización a pH 4,0, d/D = 0,30] y 17,2 g/l para la condición (4-5) [esterilización a pH 4,9, d/D = 0,30]. Después de la terminación del cultivo, se repitió el procedimiento del Ejemplo 1 para dar un aceite bruto que comprendía ácido araquidónico como un ácido graso constituyente.

Los resultados del análisis del aceite bruto se muestran en la Tabla 5. Una comparación de los resultados del Ejemplo 3 con los resultados del Ejemplo 4 muestra que, en el depósito de cultivo de d/D = 0,30, la esterilización de la fuente de nitrógeno del medio a pH 4,5 podría reducir el contenido de esteroles de tipo éster hasta no más de 1%. Sin embargo, en el depósito de cultivo de d/D = 0,25 y el depósito de d/D = 0,20, a pesar de la esterilización de la fuente de nitrógeno a pH 4,5, el contenido de esteroles de tipo éster no se podía reducir hasta no más de 1%. Además, la comparación entre los resultados de las condiciones (4-1), (4-4) y (4-5) muestra que se considera que la esterilización de la fuente de nitrógeno a un pH en el intervalo de 4,0 a 4,9 proporciona resultados iguales de la reducción de esteroles de tipo éster.

Tabla 5: Encontrado para aceite bruto que contiene ácido araquidónico

Ejemplo o ejemplo de control: Ejemplo 4 Ejemplo 4 Ejemplo 4 Ejemplo 4 Ejemplo 4

: Condición 4-1 (ejemplo de control) Condición 4-2 (ejemplo de control) Condición 4-3 (ejemplo de control) Condición 4-4 (ejemplo de control) Condición 4-5 (ejemplo de control)

Forma del depósito de cultivo, d/D: 0,30 0,25 0,20 0,30 0,30

Valor de pH ajustado del medio A (antes de la esterilización): 4,5 4,5 4,5 4,0 4,9

Valor de pH ajustado del medio C (después de la esterilización y antes de la inoculación de la solución del cultivo de siembra): 6,3 6,3 6,3 6,3 6,3

% en peso de cada fracción

Triglicérido: 93,8% 93,1% 93,0% 93,5% 93,4%

Materia no saponificable: 2,2% 2,5% 2,7% 2,1% 2,1%

Esterol de tipo éster: 1,0% 1,1% 1,1% 1,0% 1,0%

Ácido araquidónico en ácido graso total en aceite bruto, %: 42,0% 40,8% 40,8% 41,5% 41,7%

Ejemplo 5: Resultados del análisis de grasa o aceite refinado proporcionado refinando aceite bruto

Aceites bruto que contenían ácido araquidónico preparados en la condición (1-1) en el Ejemplo 1 y la condición (2-1) en el Ejemplo 2 se refinaron mediante métodos de desoxidación y desgomado convencionales para dar grasa o aceite refinado 5-A y 5-B. El aceite bruto que contenía ácido araquidónico bruto preparado en la condición d/D = 0,25 en el Ejemplo 3 se refinó del mismo modo que se acaba de describir para dar grasa o aceite refinado 5-C. Los valores encontrados para la grasa o el aceite refinado que contiene ácido araquidónico se muestran en la Tabla 6.

5

10

15

20

25

Ejemplo o ejemplo de control: Ejemplo 1 Ejemplo 2 Ejemplo 3

: (Condición 11) (Condición 21) (d/D = 0,25) (Ejemplo de control)

Grasa o aceite refinado: 5-A 5-B 5-C

% en peso de cada fracción

Triglicérido: 96,0% 96,4% 95,05

Materia no saponificable: 1,4% 1,2% 2,0%

Esterol de tipo éster: 0,8% 0,6% 1,2%

Ácido araquidónico en ácido graso total en grasa y aceite refinado, %: 42,4% 42,8% 41,7%

Ejemplo 6: Producción de ácido araquidónico bajo la condición de 1,5% de harina de soja

Se proporcionó Mortierella alpina (CBS 754.68) y se llevó a cabo un cultivo de siembra (primera fase y segunda fase) del mismo modo que en el Ejemplo 1. Posteriormente, 4.500 l de un medio (medio A: harina de soja 84 kg, KH2P04 16,8 kg, MgCl2'6H2O 2,8 kg, CaCl2-2H2O 2,8 kg, aceite de soja 5,6 kg) se esterilizaron bajo condiciones de 121°C y 20 min. Se preparó medio C como otro medio esterilizando 1.000 l de un medio (medio B: monohidrato de glucosa 112 kg) bajo condiciones de 140°C durante 40 s y añadiendo el medio esterilizado al medio A anterior.

El medio C se ajustó hasta pH 6,1. A continuación, la solución del cultivo de siembra (segunda fase) se inoculó a los medios así preparados, y el volumen se ajustó hasta una cantidad inicial de solución de cultivo de 5.600 l en total (volumen del depósito de cultivo: 10 kl). Se comenzó un cultivo principal bajo condiciones de temperatura 26°C, caudal de aire 49 Nm3/h y presión interna 200 kPa. El cultivo principal se llevó a cabo en depósitos de cultivo principal, es decir, un depósito de cultivo provisto de turbinas de seis álabes de d/D (relación del diámetro del rotor de agitación (= d) al diámetro interno del depósito (= D)) = 0,34 en dos fases y un depósito de cultivo provisto de turbinas de seis álabes de d/D = 0,25 en dos fases. Mientras se alimentaba un medio según se muestra en la Tabla 7, se llevó a a cabo un cultivo principal durante 162 h. Al final del cultivo, la concentración de ácido araquidónico producido por litro de la solución de cultivo era 5,0 g/l para el depósito de d/D = 0,34 y 4,7 g/l para el depósito de d/D = 0,25.

Tabla 7: Alimentación de medio en el Ejemplo 6

Momento del cultivo principal: Medio alimentado

Después de 19 horas: monohidrato de glucosa 84 kg/200 l

Después de 43 horas: monohidrato de glucosa 84 kg/200 l

Después de 67 horas: monohidrato de glucosa 56 kg/120 l

Después de 91 horas: monohidrato de glucosa 56 kg/125 l

Después de la terminación del cultivo, del mismo modo que en el Ejemplo 1, se recogieron células secadas, seguido por extracción con hexano para dar un aceite bruto que comprendía ácido araquidónico como un ácido graso constituyente. Los valores encontrados para el aceite bruto se muestran en la Tabla 8. Cuando la concentración de una fuente de nitrógeno en el medio era 1,5%, tanto para d/D = 0,25 como para d/D = 0,34, el aceite bruto tenía un contenido de esteroles de tipo éster no mayor que 1%.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Forma del depósito de cultivo, d/D: 0,25 0,34

% en peso de cada fracción

Triglicérido: 94,1% 93,0%

Materia no saponificable: 1,2% 1,2%

Esterol de tipo éster: 0,4% 0,4%

Ácido araquidónico en ácido graso total en aceite bruto, %: 40,8% 41,5%

no mayor queEjemplo 7: Preparación de una cápsula combinada con grasa o aceite (triglicérido) refinado que comprende ácido araquidónico como ácido graso constituyente y que tiene un contenido rebajado de esteroles de tipo éster

Se añadió agua a 100 partes en peso de gelatina y 35 partes en peso de glicerina comestible, y la mezcla se calentó a de 50 a 60°C para la disolución para preparar una película de gelatina. Posteriormente, una mezcla de la grasa o el aceite refinado 5-A (triglicérido) que tiene un contenido rebajado de esteroles de tipo éster y que comprende ácido araquidónico como un ácido graso constituyente preparado en el Ejemplo 5 con 0,05% de un aceite de vitamina E se proporcionó como contenido de cápsulas. La formación y el secado de las cápsulas se llevaron a cabo mediante un método convencional para preparar cápsulas blandas que contenían 180 mg de contenido por cápsula. También se prepararon cápsulas blandas usando como una materia prima la grasa o el aceite 5-B refinado, preparado en el Ejemplo 5, del mismo modo que en la preparación de cápsulas usando la grasa o el aceite refinado 5-A.

Ejemplo 8: Uso en una preparación grasa para transfusiones

Se añadieron y se dispersaron en un homogeneizador 400 g de la grasa o el aceite refinado 5-A (triglicérido) que tiene un contenido rebajado de esteroles de tipo éster y que comprende ácido araquidónico como un ácido graso constituyente preparado en el Ejemplo 5, 48 g de lecitina de yema de huevo refinada, 20 g de ácido oleico, 100 g de glicerina y 40 ml de sosa cáustica 0,1 N. A continuación, se añadió a la dispersión agua destilada para inyecciones para llevar el volumen de la dispersión hasta 4 litros, seguido por emulsionamiento con una máquina de emulsionamiento por atomización a alta presión para preparar una emulsión lipídica. Se distribuyeron en bolsas de plástico partes alícuotas de 200 ml de la emulsión lipídica, y a continuación se llevó a cabo esterilización con vapor de agua a alta presión a 121°C durante 20 min. para elaborar preparaciones grasas para transfusiones. Además, se preparó una preparación grasa para transfusiones usando como una materia prima la grasa o el aceite 5-B refinado preparado en el Ejemplo 5, del mismo modo que en la elaboración de la preparación grasa para transfusiones que usaba la grasa o el aceite refinado 5-A.

Ejemplo 9: Uso en un zumo

Se añadieron 2 g de 13-ciclodextrina a 20 ml de una solución acuosa de etanol al 20%. 100 mg de la grasa o el aceite refinado 5-A (triglicérido), preparado en el Ejemplo 5, que tiene un contenido rebajado de esteroles de tipo éster y que comprende ácido araquidónico como un ácido graso constituyente (combinado con 0,05% de vitamina E) se añadió a esto con remoción por medio de una varilla, y la mezcla se incubó a 50°C durante 2 h. Después de enfriar hasta temperatura ambiente (alrededor de una h), la mezcla se incubó a 4°C durante 10 h adicionales con remoción.

El precipitado resultante se recogió mediante centrifugación, se lavó con n-hexano y a continuación se liofilizó para dar 1,8 g de un compuesto de inclusión de ciclodextrina que contenía triglicérido que contenía ácido araquidónico. 1 g de este polvo se mezcló homogéneamente en 10 l de zumo para preparar zumo que contenía una grasa o un aceite (triglicérido) refinado que tenía un contenido rebajado de esteroles de tipo éster y que comprendía ácido araquidónico como un ácido graso constituyente. También se preparó zumo que usaba como una materia prima la grasa o el aceite refinado 5-B preparado en el Ejemplo 5 del mismo modo que en la preparación del zumo que usaba la grasa o el aceite refinado 5- A.

Ejemplo 10: Uso en leche en polvo

Se mezclaron 0,3 g de la grasa o el aceite refinado 5-A (triglicérido), preparado en el Ejemplo 5, que tenía un contenido rebajado de esteroles de tipo éster y que comprendía ácido araquidónico como un ácido graso constituyente en 100 g de leche en polvo para preparar leche de inicio en polvo. Además, también se preparó leche de inicio en polvo que usaba como una materia prima la grasa o el aceite refinado 5-B preparado en el Ejemplo 5, del mismo modo que en la preparación de la leche de inicio en polvo que usaba la grasa o el aceite refinado 5-A.

Ejemplo 11: Método de cultivo que usa diversas cepas

Se usaron Mortierella elongata (IFO 8570), Mortierella hygrophila (IFO 5941), Echinosporangium transversale (NRRL 3116), Conidiobolus nanodes (CBS 154.56) y Saprolegnia lapponica (CBS 284.38) como hongos productores de ácido araquidónico. Cepas estándar de estos hongos productores de ácido araquidónico se inocularon en un medio 5 (extracto de levadura 1%, glucosa 2%, pH 6,3), y se llevó a cabo un cultivo de siembra durante 3 días bajo condiciones de oscilación alternativa a 100 rpm y una temperatura de 28°C.

Posteriormente, se prepararon 25 l de un medio (glucosa 500 g, harina de soja 775 g, KH2PO4 50 g, MgCl2-6H2O 7,5 g, CaCl2'2H2O 7,5 g y aceite de soja 25 g, pH 6,3) en un depósito de cultivo de aireación-agitación de 50 l de volumen. La solución del cultivo de siembra se inoculó en el medio, y se inició un cultivo principal bajo condiciones 10 de velocidad de agitación de 200 rpm, temperatura 28°C y presión interna del depósito 150 kPa. En cuanto a la forma del depósito de cultivo, se usaba un depósito de cultivo provisto de turbinas de seis álabes de d/D = 0,42 en dos fases. El cultivo se llevó a cabo durante 186 h mientras se añadía una solución de glucosa al 50% a intervalos de aproximadamente 24 h de modo que se llevaba la concentración de glucosa hasta aproximadamente de 1 a 2%.

Después de la terminación del cultivo, la solución de cultivo se esterilizó bajo condiciones de 120°C y 20 min. Se 15 recogieron células húmedas mediante filtración bajo presión reducida y se secaron hasta un contenido de agua de 1% en peso. Las células secadas se extrajeron con hexano. La materia sólida se retiró de la solución de hexano mediante filtración. A continuación, el filtrado se calentó bajo presión reducida para eliminar el hexano para dar un aceite bruto que comprendía ácido araquidónico como un ácido graso constituyente. El aceite bruto que contenía ácido araquidónico se analizó. Valores encontrados para el aceite bruto se muestran en la Tabla 9.

20 Tabla 9: Resultados del Ejemplo 11 (valores encontrados para aceite bruto que contiene ácido araquidónico)

Cepa: M. elongata IFO 8570 M. hygrophila IFO 5941 E. transversale NRRL 3116 C. nanodes CBS 154.56 S. lapponica CBS 284.38



: (Referencia) (Referencia) (Referencia)

% en peso de cada fracción

Triglicérido: 90,0% 88,1% 86,0% 83,4% 82,6%

Materia no saponificable: 1,9% 1,9% 2,0% 2,0% 2,0%

Esterol de tipo éster: 0,8% 0,7% 0,7% 0,8% 0,8%

Ácido araquidónico en ácido graso total en aceite bruto, %: 30,8% 31,7% 28,6% 26,3% 20,7%

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Un aceite microbiano bruto que comprende una grasa o un aceite que comprende un ácido graso altamente insaturado como un ácido graso constituyente, siendo dicho ácido graso altamente insaturado ácido araquidónico (20:4 w6) y siendo el contenido de dicho ácido graso altamente insaturado, basándose en el ácido graso total en el aceite bruto, no menor de 30% en peso y siendo el contenido de esteroles de tipo éster de la grasa o el aceite no mayor que 1,0% en peso.
2. Un aceite microbiano bruto según la reivindicación 1, que tiene un contenido de esteroles de tipo éster no mayor que 0,6% en peso.
3. Un aceite microbiano bruto según la reivindicación 1 o 2, en el que el contenido de materia no saponificable de la grasa o el aceite no es mayor que 2,0% en peso.
4. Un aceite microbiano bruto según la reivindicación 1, que tiene un contenido de materia no saponificable no mayor que 1,8% en peso.
5. Un aceite microbiano bruto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho contenido de ácido graso altamente insaturado es no menor que 40% en peso.
6. Un aceite microbiano bruto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que no menos de 70% de la grasa o el aceite que comprende dicho ácido graso altamente insaturado como el ácido graso constituyente corresponde a triglicérido.
7. Un aceite microbiano bruto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es de un microorganismo perteneciente al género Mortierella, subgénero Mortierella.
8. Un procedimiento para producir una grasa o un aceite refinado, que comprende refinar un aceite microbiano bruto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho refinado es mediante desgomado, desoxidación, esodorización, decoloración, tratamiento en columna, destilación molecular o frigelización.
10. Un procedimienti para producir aceite bruto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que se cultiva un microorganismo capaz de producir dicha grasa o aceite que comprende el ácido graso insaturado como un ácido graso constituyente en un medio que contiene una concentración de fuente de nitrógeno de 2 a 15% dentro de un tanque de cultivo equipado con un impulsor de agitación que satisface el requisito de que la razón entre diámetro del impulsor de agitación (= d) y diámetro interior del tanque de cultivo (= D) es d/D = de 0,30 a 0,6, preferiblemente de 0,34 a 0,6.
11. Un procedimiento de la reivindicación 10, que comprende esterilizar en primer lugar la fuente de nitrógeno a un pH no superior a 5.
12. Un procedimiento de la reivindicación 10 u 11, en el que en el cultivo una cantidad inicial de una fuente de carbono añadida es de 1 a 5% en peso y una cantidad inicial de la fuente de nitrógeno añadida es de 3 a 8% en peso.
13. Un procedimiento de la reivindicación 10, 11 o 12, en el que el microorganismo es un microorganismo que pertenece al género Mortierella, subgénero Mortierella.
14. Un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que el tanque de cultivo tiene un volumen no inferior a 1 m3.
15. Un

alimento y bebida general,

alimento funcional,

complemento nutricional,

leche de inicio para prematuros,

leche de inicio para recién nacidos a término,

alimento para lactantes,

alimento para madres gestantes y lactantes o

alimento para ancianos,

alimento para animales o peces o

alimento nutricional terapéutico, opcionalmente junto con un vehículo neutro adecuado para la administración bucal, intrarrectal o parenteral;

que comprende aceite microbiano bruto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 incorporado en el 5 mismo.
16. Una composición farmacéutica, que comprende un aceite microbiano bruto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 incorporado en la misma, o preparada usando un aceite microbiano bruto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 como una materia prima.