CN109749944A - 用于木薯渣基质发酵的复合微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于木薯渣基质发酵的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。一种用于木薯渣基质发酵的复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂由高地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、灰略红链霉菌及绿色木霉组成。本发明用于木薯渣基质发酵的复合微生物菌剂，可以加快木薯渣发酵前期温度的升高，提高发酵温度，延长高温期的时间，并且发酵产品的腐熟程度，减少对植物的毒害作用，提高发酵质量。本发明方法的提出，对木薯渣基质化利用具有很重要的科学意义与应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基质微生物发酵技术领域，涉及用于木薯渣基质发酵的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
木薯是我国南方重要的经济作物，木薯渣作为木薯加工工业酒精后剩下的有机固体废弃物，主要以纤维素、半纤维素和木质素为主，富含多种对动植物有益的微量元素。目前，新鲜木薯渣因其湿度大，利用起来还存在较多困难，除很少一部分用于动物饲料外，大多数都是未经处理就直接排放到环境中，不仅造成资源浪费，而且对生态环境威胁较大。因此，木薯渣的资源化再利用已成为我国南方地区固体废弃物管理急需解决的难题。
木薯渣基质化利用是解决这一难题的最好途径之一。目前，有关利用发酵后的木薯渣作为蔬菜栽培基质或作为辣椒、黄瓜等作物育苗基质的研究取得了一定的进展，并且木薯渣可部分替代草炭，一定程度上弥补了草炭资源紧张的问题。但木薯渣基质发酵进程研究较少，尤其影响木薯渣发酵进程的微生物研究较少。因此，急需开发出对木薯渣基质发酵有益的微生物菌剂，对降低木薯渣污染环境，提高固体废弃物资源化利用具有重要的现实意义。
一般传统的木薯渣发酵主要是采用自然发酵，自然发酵往往发酵的过程比较长，升温缓慢，并且后期的发酵产品腐熟程度不高，影响发酵质量，不利于大规模的工业化生产。而接种外源的微生物菌剂可以解决自然发酵的不足，接种复合微生物菌剂可以加快木薯渣基料的分解，从而加快堆体温度的升高，另一方面可以加快木质纤维素的分解，促进发酵堆体的腐熟，缩短发酵周期，提高发酵的产品质量。目前市场有很多复合微生物发酵菌剂，但它们对木薯渣的发酵适应性比较差，每一种专门针对于木薯渣发酵的复合微生物菌剂。
发明内容
本发明目的正是基于上述现有技术的不足，提供用于木薯渣基质发酵的复合微生物菌剂。
本发明的另一目的是提供该复合微生物菌剂的制备方法。
本发明的又一目的是提供该复合微生物菌剂的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种用于木薯渣基质发酵的复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂由高地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、灰略红链霉菌及绿色木霉组成。所述的四种微生物的来源并没有特定的要求，只要分类学上满足上述种属分类的就可以用于制备本发明菌剂。这四种微生物可以自行筛选，也可以通过商业化途径购买。
所述的复合微生物菌剂优选主要由高地芽孢杆菌发酵液、地衣芽孢杆菌发酵液、灰略红链霉菌菌液及绿色木霉菌液组成。
所述的复合微生物菌剂进一步优选由高地芽孢杆菌发酵液与地衣芽孢杆菌发酵液等体积组成的细菌类菌液与灰略红链霉菌菌液和绿色木霉菌液按照体积1～2:1～2:1～2比例混合成复合微生物菌剂。
本发明所述的复合微生物菌剂的制备方法，将所述的4类微生物进行各自单独培养扩繁，达到接种条件后，先将细菌类的高地芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌按照等体积混合后，再将细菌类菌液、放线菌类的灰略红链霉菌菌液、真菌类的绿色木霉菌液按照体积1～2:1～2:1～2比例混合成复合微生物菌剂。
本发明所述的制备方法优选：高地芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的培养扩繁运用牛肉膏蛋白胨液体培养基，放线菌类的培养扩繁运用高氏一号液体培养基，真菌类的培养扩繁运用马铃薯葡萄糖液体培养基。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000ml，pH7.4～7.6；高氏一号液体培养基：KNO3 1g/L，可溶性淀粉20g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L， NaCl 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，蒸馏水1000ml、pH 7.4-7.6；马铃薯葡萄糖液体培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉18g/L，自来水1000mL。
所述的接种条件优选：细菌类微生物的菌液OD值不能低于1，放线菌与真菌类微生物的菌液孢子浓度不低于1×10-7个/ml。
本发明所述的制备方法，进一步优选包括如下步骤：
步骤一：分别将高地芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌分别接种在两瓶牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28℃，270转的摇床中扩增培养6-8天；
将灰略红链霉菌接种在高氏一号液体培养基中，在28℃，270转的摇床中培养8-10天；
将绿色木霉接种在马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃，270转的摇床中培养8-10天；
步骤二：用蒸馏水将地衣芽孢杆菌与高地芽孢杆菌的OD直稀释到1-1.5，然后将两种微生物菌液按照体积比1:1混合在一起，配制成细菌类菌液；用蒸馏水将放线菌类的灰略红链霉菌的孢子浓度稀释到1×10-7个/ml，用蒸馏水将真菌类绿色木霉的孢子浓度也稀释到1×10-7个/ml；
步骤三：将细菌类菌液、放线菌类菌液、真菌类菌液按照体积比1～2:1～2:1～2混合在一起，配制成复合微生物菌剂备用。
本发明所述的复合微生物菌剂在发酵木薯渣中的应用。
有益效果：
本发明用于木薯渣基质发酵的复合微生物菌剂，可以加快木薯渣发酵前期温度的升高，提高发酵温度，延长高温期的时间，并且发酵产品的腐熟程度，减少对植物的毒害作用，提高发酵质量。本发明方法的提出，对木薯渣基质化利用具有很重要的科学意义与应用价值。
附图说明：
图1、复合微生物菌剂中四类微生物的图
图2、复合微生物菌剂应用试验图
图3、复合微生物菌剂应用试验温度变化曲线图
图4、复合微生物菌剂应用试验含水率变化曲线图
图5、复合微生物菌剂应用试验种子发芽指数变化曲线图
表1、复合微生物菌剂应用试验发酵结束时种子发芽指数
具体实施方式：
下面结合发明人给出的具体实施例与实验来进一步说明本发明的步骤。
实施例一、微生物菌剂的制备方法
培养基：(1)肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水 1000ml，pH 7.4～7.6；(2)高氏一号液体培养基：KNO3 1g/L，可溶性淀粉20g/L，K2HPO40.5g/L， MgSO4.7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，蒸馏水1000ml、pH 7.4-7.6；(3)马铃薯葡萄糖液体培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉18g/L，自来水1000mL。
步骤一：分别将高地芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌分别接种在两瓶牛肉膏蛋白胨液体培养基中，并在28℃，270转的摇床中扩增培养7天。
放线菌类的微生物灰略红链霉菌运用高氏一号液体培养基进行扩增培养，并在28℃，270 转的摇床中培养8天。
真菌类的微生物绿色木霉运用马铃薯葡萄糖液体培养基进行扩增培养，并在28℃，270 转的摇床中培养9天。
步骤二：运用蒸馏水将细菌类的地衣芽孢杆菌与高地芽孢杆菌的OD直稀释到1-1.5，然后将两种微生物按照体积比1:1混合在一起，配制成细菌类菌液。运用蒸馏水将放线菌类的灰略红链霉菌的孢子浓度稀释到1×10-7个/ml。运用蒸馏水将真菌类绿色木霉的孢子浓度也稀释到1×10-7个/ml。
步骤三：将细菌类菌液、放线菌类菌液、真菌类菌液按照体积比1～2:1～2:1～2混合在一起，配制成复合微生物菌剂备用。
实施例2
按照实施例1方法制备的复合微生物菌剂，其中高地芽孢杆菌(实验室分离)发酵液与地衣芽孢杆菌(实验室分离)发酵液等体积组成的细菌类菌液与灰略红链霉菌(实验室分离)菌液和绿色木霉(实验室分离)菌液按照体积1:1:1比例混合成复合微生物菌剂。
实施例3
按照实施例1方法制备的复合微生物菌剂，其中高地芽孢杆菌(CGMCC1.8639)发酵液与地衣芽孢杆菌(BNCC165853)发酵液等体积组成的细菌类菌液与灰略红链霉菌(BNCC156263) 菌液和绿色木霉(GIM3.141)菌液按照体积1:2:1比例混合成复合微生物菌剂。
实施例4
按照实施例1方法制备的复合微生物菌剂，其中高地芽孢杆菌(BNCC165853)发酵液与地衣芽孢杆菌(GIM1.362)发酵液等体积组成的细菌类菌液与灰略红链霉菌(CGMCC4.6407)菌液和绿色木霉(CGMCC1.7461)菌液按照体积2:2:1比例混合成复合微生物菌剂。
实施例5
按照实施例1方法制备的复合微生物菌剂，其中高地芽孢杆菌(BNCC165853)发酵液与地衣芽孢杆菌(CGMCC1.7461)发酵液等体积组成的细菌类菌液与灰略红链霉菌(CGMCC4.6407) 菌液和绿色木霉(ACCC30206)菌液按照体积1:2:2比例混合成复合微生物菌剂。
实施例6
按照实施例1方法制备的复合微生物菌剂，其中高地芽孢杆菌(CGMCC1.7461)发酵液与地衣芽孢杆菌(ACCC01958)发酵液等体积组成的细菌类菌液与灰略红链霉菌(ACCC41309)菌液和绿色木霉(BNCC182475)菌液按照体积1:1:2比例混合成复合微生物菌剂。
实施例7、复合微生物菌剂的发酵应用
一、试验材料
新鲜的木薯渣取自江苏省兴化市新土源基质肥料有限公司，自制复合微生物菌剂是之前混配而成，商业固体发酵剂是新土源公司木薯渣发酵一直在用的菌剂。
二、试验方法
试验是2018年11月份在江苏省兴化市新土源基质肥料有限公司的木薯渣发酵厂进行，试验一共设置了5个长为2.5m、宽1.5m、高1m发酵堆，并覆盖塑料薄膜，每4天翻堆一次。5 发酵堆体的处理分别为T1：对照CK(添加0‰的自制复合菌剂)，T2：添加堆体质量2‰(质量比)的实施例6复合微生物菌剂，T3:添加堆体质量5‰(质量比)的实施例6复合微生物菌剂,T4:添加堆体质量8‰的实施例6复合微生物菌剂,T5:添加堆体体积1％(体积比)商业固体发酵剂。
取样：分别在发酵过程的0、4、9、19、27、38、49、53天在上午运用五点取样法在堆体40cm处取样。
温度的测量：运用酒精温度计，每两天在上午10：00把温度计插到堆体的前、后、左、右和中心5个位置40cm处的测量。
含水率的测量：采用烘干称重法测量，称取W1保存于4℃冰箱的新鲜样品，放在9cm的玻璃培养皿中，平摊在培养皿的底部，然后放在75℃的电热鼓风恒温干燥箱中，烘干至恒重为止，之后在干燥箱中放置1h等待冷却，再将玻璃培养皿中样品移出，称其重量w2，每个样品称取三次，设置三个重复。按照如下的公式计算含水率：含水率(％)＝(w1-w2)/w1
发芽指数的测量：称取风干基质20g与100mL的超纯水混均，置于摇床振荡浸提2-3h，利用定性滤纸进行过滤，取6mL滤液，滴入铺有无菌滤纸的培养皿(直径为9cm)中，每个培养皿中放入20粒萝卜种子，并且将超纯水作为对照，每个处理设置3个重复，置入26℃恒温培养箱中48h，计算其发芽率与根长，并利用如下公式计算发芽指数：
三、结果
1、发酵过程温度的变化
如附图中的图3所示，所有处理发酵过程的温度变化都与自然发酵温度变化的趋势大体一致，都是先升高在降低，温度的变化特征从客观上面反映了堆体中微生物的活性变化。如图中，处理T2，T3，T4在前期的升温速度比较T1，T5处理要快，T2，T3，T4处理在堆肥第16 天的时候，温度都到达了50℃，提前进入高温期。并且T2高温期的持续时间为6天，T3高温期的持续时间为10天，T4处理持续为14天。T3与T4的最高温度都为52℃，T1与T5处理的最高温度均没有达到50℃。各处理在木薯渣发酵50天以后，温度都下降到室温。由此可见添加混合微生物菌剂的处理明显比不加菌剂和添加商业菌剂的处理可以加快堆体升温，并且延长高温期，从而促进木薯渣发酵进程，提高发酵效果。
2、含水率的变化
如附图中的图4所示，所有处理的含水率都随着发酵过程的进展而下降，并在发酵结束时都趋于稳定。其中添加自制复合菌剂的处理T2、T3、T4的含水率下降的幅度都比对照处理 T1与添加商业菌剂处理T5的要大，特别是处理T3与T4处理。其中主要原因是T3与T4处理相比其他处理升温快，温度高，高温期比较长。
3、种子发芽指数的变化
种子的发芽指数是反应发酵产品对植物是否有毒害作用，是反应发酵腐熟程度最具说服力的方法。如附图中图5，所有处理的种子发芽指数变化都是一致的，都呈现出逐渐升高的趋势。附图中的表1表示发酵结束时腐熟产品的发芽指数中处理T3与T4的指数最高，比对照高 10％左右，这说明T3与T4的腐熟程度比较其他处理效果要好。
表1、复合微生物菌剂应用试验发酵结束时种子发芽指数：
注：不同字母表示处理间在0.05水平上差异显著。Different letters meansignificant different at 0.05level.The same as follows。
Claims (8)
1.一种用于木薯渣基质发酵的复合微生物菌剂，其特征在于，所述的复合微生物菌剂由高地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、灰略红链霉菌及绿色木霉组成。
2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述的复合微生物菌剂主要由高地芽孢杆菌发酵液、地衣芽孢杆菌发酵液、灰略红链霉菌菌液及绿色木霉菌液组成。
3.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述的复合微生物菌剂由高地芽孢杆菌发酵液与地衣芽孢杆菌发酵液等体积组成的细菌类菌液与灰略红链霉菌菌液和绿色木霉菌液按照体积1～2:1～2:1～2比例混合成复合微生物菌剂。
4.权利要求1-3中任一项所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1-3中任一项中所述的4类微生物进行各自单独培养扩繁，达到接种条件后，先将细菌类的高地芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌按照等体积混合后，再将细菌类菌液、放线菌类的灰略红链霉菌菌液、真菌类的绿色木霉菌液按照体积1～2:1～2:1～2比例混合成复合微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，高地芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的培养扩繁运用牛肉膏蛋白胨液体培养基，放线菌类的培养扩繁运用高氏一号液体培养基，真菌类的培养扩繁运用马铃薯葡萄糖液体培养基。
6.根据权利要求4所述的制备方法，，其特征在于，所述的接种条件为细菌类微生物的菌液OD值不能低于1，放线菌与真菌类微生物的菌液孢子浓度不低于1×10-7个/ml。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：分别将高地芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌分别接种在两瓶牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28℃，270转的摇床中扩增培养6-8天；
将灰略红链霉菌接种在高氏一号液体培养基中，在28℃，270转的摇床中培养8-10天；
将绿色木霉接种在马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃，270转的摇床中培养8-10天；
步骤二：用蒸馏水将地衣芽孢杆菌与高地芽孢杆菌的OD直稀释到1-1.5，然后将两种微生物菌液按照体积比1:1混合在一起，配制成细菌类菌液；用蒸馏水将放线菌类的灰略红链霉菌的孢子浓度稀释到1×10-7个/ml，用蒸馏水将真菌类绿色木霉的孢子浓度也稀释到1×10-7个/ml；
步骤三：将细菌类菌液、放线菌类菌液、真菌类菌液按照体积比1～2:1～2:1～2混合在一起，配制成复合微生物菌剂备用。
8.权利要求1-3中任一项所述的复合微生物菌剂在发酵木薯渣中的应用。
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| CN110358704A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-10-22 | 南京农业大学 | 一种木薯渣发酵专用菌剂及其制备方法 |
| CN111423998A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-07-17 | 南京农业大学 | 一种用于菇渣基质化的复合微生物菌剂及其制备方法和应用 |
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