CN115968910A

CN115968910A - 一株球毛壳菌dx-ths3菌肥、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN115968910A
Application number: CN202310021048.XA
Authority: CN
Inventors: 朱笃; 江玉梅; 冶霞; 廖宏娟; 张志斌
Original assignee: Jiangxi Normal University
Current assignee: Jiangxi Normal University
Priority date: 2023-01-07
Filing date: 2023-01-07
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明属于微生物应用领域，具体涉及一株球毛壳菌DX‑THS3菌肥、制备方法及其应用。本发明发现球毛壳菌DX‑THS3对于辣椒的生长具有显著的促进作用，同时，不仅对于土壤中的桃褐腐病菌和鞘腐霉具有明显的抑制作用，还对于土壤本身具有一定的改良效果；大大拓宽了球毛壳菌的应用范围，也对土壤的调控及辣椒的促生长提供了一种新的技术手段。

Description

一株球毛壳菌DX-THS3菌肥、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物应用领域，具体涉及一株球毛壳菌DX-THS3菌肥、制备方法及其应用。

背景技术

球毛壳菌(Chaetomium globosum)隶属于子囊菌门(Ascomycota)、核菌纲(Pyrenomy cetes)、粪壳菌目(Sordariales)、毛壳菌科(Chaetomiaceae)、毛壳菌属(Chaetomium spp.)，它是公认的生产碳水化合物活性酶和抗生素的重要家族。

有关球毛壳菌菌肥的研究主要集中在球毛壳菌ND35这一菌株上，球毛壳菌ND35是从健康毛白杨(Populus tomentosa)中分离得到的一株内生优势菌株。部分研究结果表明，球毛壳菌ND35菌肥可以更好地改善苹果连作土壤微生物区系，增加平邑甜茶幼苗根系活力和生物量；能在一定程度上能提高杨树的根系生理活性，提高杨树叶片对光能的利用效率；对核桃实生苗生长及生物量具有明显的促生作用。而另外一株从丹参(Salviamiltiorrhiza)毛状根中分离出的球毛壳菌D38，可以极大地促进丹参的生长，提高丹参的丹酚酸和丹参酮的产量。

发明内容

本发明发现了一株球毛壳菌，其名称为Chaetomium globosum DX-THS3，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年1月4日，保藏编号为CCTCC NO：M 2016005。该菌株发酵提取物对桃褐腐病菌和鞘腐霉具有明显的抑制作用，抑制率分别能够达到83.90％和66.18％，这是现有技术中未曾报道过的。同时，还具备对辣椒疫霉、水稻稻瘟病菌、核盘菌、水稻纹枯病菌、尖孢镰刀菌、黄色镰刀菌和禾谷镰刀菌具有抑制作用的能力。

在一些优选的实施情况中，所述发酵提取物由所述球毛壳菌接种于秸秆固态培养基中培养后，避光发酵制得。具体制备过程如下：将球毛壳菌接种至PDA培养基中活化，然后接入至PDB培养基中，于28℃、160r/min条件下避光培养4d-5d，得到种子液，随后接种至秸秆固态培养基中避光发酵；随后将产物提取并萃取后得到所述发酵提取物。

发明人发现当接种至秸秆固态培养基中避光发酵为以下具体过程时，其发酵产物对于上述致病菌的抑制效果最佳，具体为：于26℃的条件下避光发酵24d。

发酵结束后的具体过程包括：发酵结束后，用玻璃棒搅动发酵物，尽量使其粉碎，将两瓶发酵物合为一瓶。在瓶中加入500mL丙酮，超声辅助提取30min，重复3次，收集丙酮提取液并减压浓缩。然后用乙酸乙酯1:1萃取三次，收集乙酸乙酯层，并将其减压浓缩制得浸膏。

秸秆是主要的农业废弃物，富含可利用的纤维素资源，但秸秆具致密的木质纤维素结构，因而存在难降解和难以资源化的问题。而本发明中的球毛壳菌能够以秸秆为底物进行固态发酵(与液态发酵相比，固态发酵在降低原料成本、降低能耗、提高产物浓度和无废水排放方面具有显著优势)，既可以产生对上述致病菌具有抑制作用的活性物质，在一定程度上减少化学农药的使用；同时也实现了对秸秆废弃物的循环利用，对于环境保护和农业的可持续发展具有重要意义。

此外，发明人还发现上述球毛壳菌作为植物促进剂或肥料可以促进辣椒的生长，提高辣椒的产量，这是现有技术中未曾报道过的。发明人基于此还提出了一种促进辣椒生长的菌肥，包括以下原料：上述球毛壳菌的种子液，小麦秸秆，麦麸，水。其中，球毛壳菌的种子液、小麦秸秆(粉碎至60目-100目)、麦麸和水的用量比为10mL：16g：4g：80mL。具体制备过程如下：已粉碎的小麦秸秆、麦麸和水按比例混匀于121℃灭菌20分钟，待其冷却后接种球毛壳菌的种子液并搅拌均匀，于26℃的条件下避光静置发酵24d制得。

采用本发明的菌肥种植辣椒苗30d和120d后，植株鲜重比对照分别增加98％和61.88％，根鲜重分别增加61.00％和73.59％，株高分别增加31.00％和12.62％，茎粗分别增加78.00％和23.67％，叶片数分别增加15.00％和37.60％。此外，施用本发明的菌肥可使辣椒果实的产量和品质得到明显提升。与对照相比，每株辣椒的果实数量增加60.71％，果实重量增加82.49％；辣椒果实的可溶性蛋白含量增加24.42％，可溶性糖含量增加7.49％，有机酸含量增加34.32％，Vc含量增加44.82％。

发明人还发现相比于传统化肥，采用本发明的菌肥除了能够促进辣椒生长之外，还避免了传统化肥所存在的弊端(使土壤中微生物的生长环境遭到破坏，土壤板结、肥力下降、土壤酸碱化、环境污染等问题)，同时对于土壤也具有一定的改良效果。

本发明的有益效果为：本发明发现球毛壳菌DX-THS3对于辣椒的生长具有显著的促进作用，同时，不仅对于土壤中的桃褐腐病菌和鞘腐霉具有明显的抑制作用，还对于土壤本身具有一定的改良效果；大大拓宽了球毛壳菌的应用范围，也对土壤的调控及辣椒的促生长提供了一种新的技术手段。

附图说明

图1所示为球毛壳菌DX-THS3发酵条件优化后发酵粗提物的抑菌圈实验结果图；

图2所示为球毛壳菌DX-THS3发酵条件优化前发酵粗提物的抑菌圈实验结果图；

图3所示为盆栽实验30d各组的生长外观图；

图4所示为盆栽实验50d各组的生长外观图；

图5所示为盆栽实验120d各组的生长外观图；

图6所示为盆栽实验120d各组的根系生长情况图；

图7所示为盆栽实验120d各组的辣椒果实外观图。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。

实施例1：

(1)菌株的分离及保藏

本发明所提出的球毛壳菌DX-THS3是从东乡野生稻茎中分离筛选获得的内生真菌，名称为Chaetomium globosum DX-THS3，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年1月4日，保藏编号为CCTCC NO：M 2016005。

(2)球毛壳菌DX-THS3发酵粗提物的制备

将球毛壳菌DX-THS3接种至PDA培养基中，在28℃培养箱中培养一周使其活化。待菌株活化后，少量多次刮取菌丝接入到含有150mL PDB培养基的锥形瓶中，并于28℃、160r/min摇床中培养5d，即可得到种子液。然后将种子液接种到秸秆固态培养基中并拌匀，每瓶接种量为10mL，于26℃培养箱中静置避光发酵24d。

发酵结束后，用玻璃棒搅动发酵物，尽量使其粉碎，将两瓶发酵物合为一瓶。在瓶中加入500mL丙酮，超声辅助提取30min，重复3次，收集丙酮提取液并减压浓缩。然后用乙酸乙酯1:1萃取三次，收集乙酸乙酯层，并将其减压浓缩制得浸膏，即发酵粗提物。

(3)球毛壳菌DX-THS3菌肥的制备

参照发酵粗提物制备的发酵方法，球毛壳菌在秸秆固态培养基中静置避光发酵24d，然后收集发酵物，使用粉碎机将发酵物粉碎，即可制得菌肥。

实施例2：

球毛壳菌DX-THS3发酵粗提物(实施例1制得)对多种植物病原真菌的抑制圈实验：

采用菌丝生长抑制法测定粗提物的抗真菌活性。将浸膏(粗产物)用甲醇充分溶解，溶液经0.22μm无菌滤头过滤后与50℃左右的PDA培养基混匀，制成1mg/mL的含药平板，以等体积不含浸膏的甲醇为空白对照。用直径为6mm的圆形打孔器在已活化好的植物病原真菌菌落边缘上取相同大小的菌饼，并分别接种于含药平板中央，每个处理3个重复，于28℃恒温培养箱中黑暗培养。待空白对照组中病原真菌生长至近培养皿边缘时，采用十字交叉法测量菌丝生长直径(除去菌饼直径6mm)，计算抑菌率。

其结果如图1(A～I依次为核盘菌、辣椒疫霉、水稻稻瘟病菌、桃褐腐病菌、尖孢镰刀菌、黄色镰刀菌、鞘腐霉、禾谷镰刀菌、水稻纹枯病菌的空白对照图；a～i依次为各病原真菌的粗提物处理图)所示。试验结果表明，本发明菌株球毛壳菌DX-THS3发酵粗提物对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe or yzae)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、黄色镰刀菌(F.culmorum)、鞘腐霉(Sarocladium oryzae)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的抑制率依次为100％、92.86％、85.94％、83.90％、76.12％、73.02％、66.18％、58.96％、52.99％。与球毛壳菌发酵条件优化前相比，发酵粗提物的抑菌活性有明显提升(如图2，A～I、a～i同上)，依次提升17.72％、24.86％、14.05％、12.60％、12.88％、10.86％、15.68％、9.60％、10.13％。

实施例3：

球毛壳菌DX-THS3菌肥(实施例1制得)对辣椒生长的作用实验：

选取健康的辣椒种子放入55℃水浴中灭菌15min，再放入30℃温水中浸种6h。然后将种子放在铺有湿润滤纸的培养皿中，28℃保湿避光催芽4d，待种子发芽后种植到育苗盘中。等辣椒长至四叶一心后，即可移植到塑料盆中进行盆栽实验。

5个处理分别为:①原土(不做任何添加)；②土壤+100g小麦秸秆与麦麸混合物；③土壤+100g含球毛壳菌的菌肥；④土壤+100g灭菌菌肥；⑤土壤+2g化肥。每个处理5个重复，共计25个盆栽试验。首先将等量的土壤分别装入25个盆中，5盆土壤不做处理，5盆添加秸秆与麦麸混合物，5盆添加含球毛壳菌的菌肥，5盆添加灭菌菌肥，5盆添加化肥。各个添加物质量一致并都与土壤充分混合。然后挑选长势一致的辣椒幼苗移栽于塑料花盆中，种植深度约为2.5cm。每盆2株幼苗，苗间隔约6cm。移栽完成后，将塑料花盆置于温室内培养，顺序随机排列，定时浇水，每周对植物进行拍照，记录生长状况。待辣椒长出许多果实(约120d)，即可结束盆栽实验，对辣椒和土壤的各个指标进行测定。

实验结果如图3-7所示(图3、4、5从左至右依次为处理①、②、③、④、⑤)，采用本发明的菌肥种植辣椒苗30d和120d后，植株鲜重比对照(不做任何添加)分别增加98％和61.88％，根鲜重分别增加61.00％和73.59％，株高分别增加31.00％和12.62％，茎粗分别增加78.00％和23.67％，叶片数分别增加15.00％和37.60％。此外，施用本发明的菌肥可使辣椒果实的产量和品质得到明显提升。与对照相比，每株辣椒的果实数量增加60.71％，果实重量增加82.49％；辣椒果实的可溶性蛋白含量增加24.42％，可溶性糖含量增加7.49％，有机酸含量增加34.32％，Vc含量增加44.82％。具体数据如表1和表2所示。值得注意的是添加该菌肥与添加化肥的促生效果相当，并优于直接添加秸秆，而且该菌肥灭菌后，其促生效果虽略有降低，但促生效果尚可，并优于直接添加秸秆。

据报道，施加复合内生芽孢杆菌菌肥可使辣椒株高增加5.24％，茎粗增加11.83％，果实数量增加72.22％，果实重量增加72.55％，果实可溶性糖含量增加28.88％，果实Vc含量增加1.29％，果实可溶性蛋白含量降低7.02％。(引自微生物菌肥及土壤修复剂对干制辣椒生长、品质及产量的影响)因此，与复合内生芽孢杆菌菌肥相比，本发明的球毛壳菌菌肥在促进辣椒植株生长、提高辣椒果实产量和品质方面效果良好。

表1

表2

同时，通过监测30d和120d土壤的特性指标(土壤的pH、含水量、有机质、总氮、总磷、总钾、硝态氮、铵态氮、速效磷和速效钾含量)使用土壤养分分析仪测定；土壤的脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、纤维素酶和芳基硫酸酯酶使用相应的试剂盒进行测定。与不做任何添加的处理①相比，添加含菌菌肥(处理④)对土壤肥力和土壤酶活有不同程度的提升，其具体结果如表3-6所示。

微生物菌肥“宁盾”的主要成分为芽孢杆菌，施用该菌肥30d能使辣椒土壤中的有机质、速效磷和速效钾含量依次提高11％、21％、19％；使土壤脲酶、磷酸酶、纤维素酶和过氧化氢酶活性依次提高20％、29％、100％、40％、但会使蔗糖酶活降低(引自施用微生物菌肥“宁盾”对辣椒根围细菌多样性及土壤酶活性的影响)。本发明的菌肥在施用30d时，土壤中的有机质、速效氮、速效磷和速效钾含量依次提高17.28％、194.57％、59.66％；使土壤脲酶、磷酸酶、纤维素酶、过氧化氢酶和蔗糖酶活性依次提高39.23％、11.33％、13.38％、41.3％、37.66％。因此在提高土壤肥力方面，本发明菌肥完全优于微生物菌肥“宁盾”，且对土壤脲酶、过氧化氢酶和蔗糖酶活的提高优于微生物菌肥“宁盾”。

表3

表4

表5

表6

以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。

Claims

1.球毛壳菌发酵提取物在制备抑制桃褐腐病菌和/或鞘腐霉产品中的应用，其特征在于，所述球毛壳菌的名称为Chaetomium globosum DX-THS3，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年1月4日，保藏编号为CCTCC NO：M 2016005。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述球毛壳菌发酵提取物由球毛壳菌接种于秸秆固态培养基中培养后，避光发酵制得。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵提取物的具体制备过程如下：将球毛壳菌接种至PDA培养基中活化，然后接入至PDB培养基中，于28℃、160r/min条件下避光培养4d-5d，得到种子液，随后接种至秸秆固态培养基中避光发酵，随后将产物提取并萃取后得到所述发酵提取物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，接种至秸秆固态培养基中发酵的具体过程为：于26℃的条件下避光发酵24d。

5.球毛壳菌在制备促进辣椒生长的肥料中的应用，其特征在于，所述球毛壳菌的名称为Chaetomium globosum DX-THS3，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年1月4日，保藏编号为CCTCC NO：M 2016005。

6.一种促进辣椒生长的菌肥，其特征在于，按照重量份计，包括以下原料：球毛壳菌的种子液，小麦秸秆，麦麸，水；所述球毛壳菌的名称为Chaetomium globosum DX-THS3，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年1月4日，保藏编号为CCTCC NO：M2016005。

7.根据权利要求6所述的菌肥，其特征在于，所述球毛壳菌的种子液、小麦秸秆、麦麸和水的用量比为10mL：16g：4g：80mL。

8.根据权利要求6所述的菌肥，其特征在于，小麦秸秆粉碎至60目-100目。

9.一种权利要求6至8任一项所述的菌肥的制备方法，其特征在于，已粉碎的小麦秸秆、麦麸和水混匀于121℃灭菌20分钟，待其冷却后接种所述球毛壳菌的种子液并搅拌均匀，于26℃的条件下避光静置发酵24d制得。

10.权利要求6至8任一项所述的菌肥在制备土壤改良剂中的应用。