CN102586386B - 一种分析维生素c生产菌株传代过程磷脂组变化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，包括如下步骤：(1)固体培养：取氧化葡糖杆菌和巨大芽孢杆菌分别接种于固体培养基上，培养；(2)种子培养：(3)分纯；(4)发酵；(5)细胞磷脂组的提取；(6)LC-MS检测；(7)多元统计分析；(8)过程分析；本发明通过对细胞总磷脂的提取和分析，多元统计方法分析所获得的磷脂组学数据，对不同传代数的维生素C生产菌株在单独和混合培养条件下的磷脂分子分别进行定性和定量分析，找到与增强维生素C生产菌株两菌相互作用相关的磷脂分子和代谢途径的分析提供了方法，对以提高2-酮基-L-古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化具有重要的意义。
Description
发明领域
本发明属于工业微生物领域，涉及一种分析维生素C生产菌株混菌传代培养过程磷脂组变化的方法。
背景技术
随着经济发展和生活水平不断提高，人类对健康越来越重视，各种维生素类保健品的需求量逐年增加。在各种维生素中，维生素C是一种高效抗氧化剂，参与人体新陈代谢中重要的生物合成过程，是维持机体营养、生长所必需的维生素。它还在药品、食品和化妆品添加等方面有极为广泛的应用。
目前，我国通过使用巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)混合发酵生产维生素C。其中，前者为伴生菌，后者为产酸菌。两菌在混合发酵的过程中，通过相互作用促进产酸菌的生长和产酸。在不加入伴生菌时，产酸菌生长缓慢，产酸效率极低，不适合工业生产；而混合培养时，产酸菌也会影响伴生菌的生长和形态。改造两菌相互作用模式，进一步提高发酵产物2-酮基-L-古龙酸(维生素C的前体)的产量，可以减少能源消耗和环境污染，极大的降低生产成本。
在两菌混合培养中，它们之间的交流最先经由感受外界信号的细胞膜，再进一步传递到胞内，并产生一系列的信号事件。研究两菌传代培养，不断强化相互作用的过程中，细胞膜磷脂组的变化，可从这一角度找到两菌相互作用促进产酸的原因，并为进一步的菌种筛选和改造，以及生产工艺优化等提供支持。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，包括如下步骤：
(1)固体培养：
取10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)和10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24h-48h；
(2)种子培养：
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养，24h-48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×108-2×1011cfu/mL，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养，以24h-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天，在0-100或0-150天选3-5个取样时间取3-5个样；
(3)分纯：
将步骤(2)获得的3-5个传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24h-48h；再分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24h-48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；
(4)发酵：
将所述进化了的巨大芽孢杆菌、进化了的氧化葡糖杆菌以及混合的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/mL，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×108-2×1011cfu/mL，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养10h-15h；
(5)细胞磷脂组的提取：
①取在步骤(4)摇床振荡培养10h-15h的三种细胞悬液100-200mL，1000-3000rpm离心3-10min，去除上清液，保留细胞，用pH＝7.2-7.4的磷酸盐缓冲液洗细胞1-3次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；
②将步骤①所得细胞制成干粉，称取200-300mg细胞干粉，置于离心管A中，加入0.5-0.8mL超纯水，充分混匀；
③向离心管A中再加入2-4mL提取液，充分混匀；1000-3000rpm离心3-10min，使溶液分层，取下层有机溶剂层，置于离心管B中；
④重复步骤③2-4次，至细胞完全沉降；
⑤向离心管B中，加入0.8-1.2mol/L KCl水溶液0.5-1.5mL，充分混匀，2000-4000rpm离心3-10min，除去含水溶性杂质的上清；
⑥再向离心管B加入1-3mL超纯水，充分混匀，2000-4000rpm离心3-10min，去上清；
⑦蒸馏或氮气吹干步骤⑥所得混合物中的有机溶剂，得到总磷脂提取混合物；
⑧将所述总磷脂提取混合物溶于0.2-2mL储存液中制成样品，冷冻-40℃以下保存；
⑨检测前，向所述样品内加入磷脂标准品，使磷脂标准品终浓度为0.5-1.5μg/mL；
所述提取液是含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1-2∶1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.005-0.01％；
所述储存液为含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1-4∶1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.005-0.01％；
(6)LC-MS检测
采用LC-MS对步骤(5)获得的加入了磷脂标准品的样品进行检测，得到维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子结构和含量数据；
(7)多元统计分析
将步骤(6)获得的维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子含量数据，进行多元统计分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的差异磷脂分子标志物；
(8)过程分析
将步骤(7)获得的差异磷脂分子标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些磷脂分子变化的规律，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的磷脂分子及相关代谢途径，从而为以提高2-酮基-L-古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向。
所述细胞制成干粉的方法优选为使用液氮在研钵内研磨细胞。
所述步骤(5)⑦中所述蒸馏优选为30-40℃减压蒸馏。
所述磷脂标准品为磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰乙醇胺和磷脂酸至少两种。
所述磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，溶血性磷脂酰乙醇胺或磷脂酸的脂肪酸疏水尾长度为每条10-20个碳原子。
所述LC-MS检测条件优选为：
色谱柱：Hypersil GOLD Silica，其规格为150mm×2.1mm，5μm；
进样量：10μL；
柱温：25℃；
流动相A(％)：氯仿(89.5)，甲醇(10)，氢氧化铵(0.5)；
流动相B(％)：氯仿(55)，甲醇(39)，氢氧化铵(0.5)，水(5.5)；
梯度程序：0-7min，20-30％B；7-15min 30-40％B；15-20min 40-50％B；20-25min 50％B；25-35min，50-20％B；35-45min，20％B；
离子化方式：ESI(负离子方式)；
扫描方式：MS Scan；
扫描范围：m/z 400-900；
扫描速度：1000scan/s；
毛细管电压：3KV；
锥孔电压：30V；
萃取电压3V；
离子源温度：100℃；
脱溶剂气温度：350℃；
锥孔气流量：50L/Hr
脱溶剂气流量：400L/Hr；
进/出口能量：50；
碰撞能量：2；
HM1/LM1/HM2/LM2：15.0；
IonEnergy 1：1.0；
Ion Energy 2：2.0。
所述多元统计分析方法为Pareto预处理后进行主成分分析。
本发明提供了一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的手段，这种手段涉及细胞总磷脂的提取和分析，多元统计方法分析所获得的磷脂组学数据，通过对不同传代数的维生素C生产菌株在单独和混合培养条件下的磷脂分子分别进行定性和定量分析，找到与增强维生素C生产菌株两菌相互作用相关的磷脂分子和代谢途径的分析提供了方法，对以提高2-酮基-L-古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化具有重要的意义。
附图说明
图1为不同传代时间的巨大芽孢杆菌的磷脂含量变化；
图2为不同传代时间的巨大芽孢杆菌的主成分分析得分图(图2-1)和荷载图(图2-2)；
图3为不同传代时间的巨大芽孢杆菌的磷脂分子标志物含量变化；
图4为不同传代时间的氧化葡糖杆菌的磷脂含量变化；
图5为不同传代时间的氧化葡糖杆菌的主成分分析得分图(图5-1)和荷载图(图5-2)；
图6为不同传代时间的氧化葡糖杆菌的磷脂分子标志物含量变化；
图7为不同传代时间的混菌的磷脂含量变化；
图8为不同传代时间的混菌的主成分分析得分图(图8-1)和荷载图(图8-2)；
图9为不同传代时间的混菌的磷脂分子标志物含量变化。
具体实施方式
下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何限制。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)固体培养：
取100μL保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)和100μL保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)分别接种于固体培养基上，30℃，培养36小时；
(2)种子培养：
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在30℃，240rpm摇床振荡培养，36h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×108cfu/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×1010cfu/mL，在30℃，240rpm摇床振荡培养，以36h为传代周期，以体积比为5％为传代比接入新的种子培养基中，传代150天，分别在第0天、第50天、第100天和第150天取4个样；
(3)分纯：
将步骤(2)获得的4个传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，30℃培养36小时；再分别转入种子培养基，在30℃，240rpm摇床振荡培养36h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；
(4)发酵：
将进化了的巨大芽孢杆菌、进化了的氧化葡糖杆菌以及混合的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×108cfu/mL，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×1010cfu/mL，在30℃，240rpm摇床振荡培养13h；
(5)细胞磷脂组的提取：
①取在步骤(4)摇床振荡培养13h的三种细胞悬液150mL，2000rpm离心5min，去除上清液，保留细胞，用pH＝7.3的磷酸盐缓冲液洗细胞2次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；
②将步骤①所得三种细胞使用液氮在研钵内分别研磨制成干粉，每种称取250mg细胞干粉，置于三支离心管A中，分别加入0.6mL超纯水，充分混匀；
③向三支离心管A中分别再加入3mL提取液，充分混匀；2000rpm离心5min，使溶液分层，取下层有机溶剂层，置于三支离心管B中；
④重复步骤③3次，至三种细胞完全沉降；
⑤向三支离心管B中，各加入1.0mol/L KCl水溶液1.0mL，充分混匀，3000rpm离心5min，除去含水溶性杂质的上清；
⑥再向三支离心管B各加入2mL超纯水，充分混匀，3000rpm离心5min，去上清；
⑦30℃减压蒸馏步骤⑥所得混合物中的有机溶剂，得到三种总磷脂提取混合物；
⑧将三种总磷脂提取混合物溶于1mL储存液中制成样品，冷冻-40℃以下保存；
⑨检测前，向三个样品内分别加入磷脂标准品，磷脂标准品为双十二烷酰磷脂酰甘油、双十二烷酰磷脂酰乙醇胺、十二烷酰溶血性磷脂酰乙醇胺和双十二烷酰磷脂酸，这四种磷脂标准品终浓度均为1.0μg/mL；
所述提取液是含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1.5∶1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.007％；
所述储存液为含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为2∶1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.007％；
(6)LC-MS检测
采用LC-MS对步骤(5)获得的三个加入了磷脂标准品的样品进行检测，得到维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子结构见表1、表2和表3和含量数据见图1、图4和图7；LC-MS检测条件为：
色谱柱：Hypersil GOLD Silica，其规格为150mm×2.1mm，5μm；
进样量：10μL；
柱温：25℃；
流动相A(％)：氯仿(89.5)，甲醇(10)，氢氧化铵(0.5)；
流动相B(％)：氯仿(55)，甲醇(39)，氢氧化铵(0.5)，水(5.5)；
梯度程序：0-7min，20-30％B；7-15min 30-40％B；15-20min 40-50％B；20-25min 50％B；25-35min，50-20％B；35-45min，20％B；
离子化方式：ESI(负离子方式)；
扫描方式：MS Scan；
扫描范围：m/z 400-900；
扫描速度：1000scan/s；
毛细管电压：3KV；
锥孔电压：30V；
萃取电压3V；
离子源温度：100℃；
脱溶剂气温度：350℃；
锥孔气流量：50L/Hr
脱溶剂气流量：400L/Hr；
进/出口能量：50；
碰撞能量：2；
HM1/LM1/HM2/LM2：15.0；
IonEnergy 1：1.0；
Ion Energy 2：2.0；
(7)多元统计分析
将步骤(6)获得的维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子含量数据，进行多元统计分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的差异磷脂分子标志物；多元统计分析方法为Pareto预处理后进行主成分分析；见图2、图5和图8；
(8)过程分析
将步骤(7)获得的差异磷脂分子标志物的含量按照不同传代时间制成图表图3、图6和图9，观察并分析这些磷脂分子变化的规律，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的磷脂分子及相关代谢途径，从而为以提高2-酮基-L-古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向。
表1巨大芽孢杆菌磷脂分子鉴定表
如表1所示，通过本发明的方法提取并检测维生素C生产菌株(巨大芽孢杆菌)传代过程磷脂组磷脂分子共58种，其中磷脂酰甘油分子21种，磷脂酰乙醇胺分子22种，溶血性磷脂酰乙醇胺分子4种，磷脂酸分子11种。
表2氧化葡糖杆菌磷脂分子鉴定表
如表2所示，通过本发明的方法提取并检测维生素C生产菌株氧化葡糖杆菌磷脂分子共22种，其中磷脂酰甘油分子21种，磷脂酸分子1种。
表3混菌磷脂分子鉴定表
如表3所示，通过本发明的方法提取并检测维生素C生产菌株混菌磷脂分子共63种，其中磷脂酰甘油分子21种，磷脂酰乙醇胺分子20种，溶血性磷脂酰乙醇胺分子6种，磷脂酸分子16种。
图1中，巨大芽孢杆菌细胞在传代时间为0、50、100和150天时，细胞磷脂总含量分别为10.89，6.80，7.06和8.64nmol/mg细胞干重，显示出在两菌共同传代时间到第50天时，巨大芽孢杆菌细胞磷脂总量显著下降，再随传代增加(100、150天)而缓慢上升的变化趋势。以0、50、100和150天的巨大芽孢杆菌磷脂样本中的所有磷脂分子的含量为矩阵，进行主成分分析(图2)，得分图显示传代0天和50天细胞磷脂成分区别最大(距离最远)，而100和150天逐渐接近0天细胞；荷载图显示大多数PG分子与0天细胞成正相关，而传代50天后，若干PE和LPE分子含量显著增加，而在100天时，PA分子含量较高。图3为主成分分析荷载图中离群点(分子标志物)的含量变化。其中PE34:2、PE34:1和LPE16:0在50天细胞中含量最高；一系列PG分子在50天含量最低，之后逐渐上升；一系列PA分子在50天明显下降，在100天又发生激增。以上变化表明，随两菌传代共同传代时间增加，磷脂代谢过程发生重大变化。在巨大芽孢杆菌中，LPE和PA分子的增加，表明诱导细胞凋亡的信号转导事件发生的概率增加，而这种信号事件可能与巨大芽孢杆菌产孢密切相关，进而影响小菌，即氧化葡糖杆菌的生长和生产。
图4中，氧化葡糖杆菌细胞在传代时间为0、50、100和150天时，细胞磷脂总含量分别为5.92，1.42，0.96和0.85nmol/mg细胞干重，表明氧化葡糖杆菌细胞磷脂总含量在传代50天后，显著下降。以0、50、100和150天的氧化葡糖杆菌磷脂样本中的所有磷脂分子的含量为矩阵，进行主成分分析(图5)，得分图显示0和50天细胞磷脂成分明显区分，而100和150天细胞与50天细胞差异不大；荷载图显示传代50天后，PA分子含量增加。图6为区分不同传代时间的分子标志物百分含量变化图，其中PA28:0含量随传代时间延长呈上升趋势。
图7中，混菌细胞在传代数为0、50、100和150天时，细胞磷脂总含量分别为8.39，6.33，6.62和7.91nmol/mg细胞干重，显示细胞磷脂总含量在传代50天时显著下降，而后增加的趋势。以0、50、100和150天的混菌磷脂样本中的所有磷脂分子的含量为矩阵，进行主成分分析(图8)，得分图显示0、50、100和150天细胞磷脂成分明显区分，且在第一主成分方向顺序分布，表明混菌细胞磷脂组成随传代数增加而逐渐变化的趋势；荷载图显示大多数PG和LPE分子与0天细胞成正相关，而随传代进行，PE和PA分子含量增加。图9为区分不同传代数的混菌的磷脂分子标志物。其中一系列PG和LPE分子随传代下降，而PE和PA分子，有随之增加的趋势。这表明随两菌传代时间增加，相互作用时间延长，磷脂代谢发生变化；LPE的减少和PA的增加，提示不同的磷脂代谢相关酶类在两菌共同传代和细胞膜信号转导中的不同作用。
实施例2
一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)固体培养：
取10μL保藏于体积浓度为15％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10μL保藏于体积浓度为15％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28℃，培养48小时；
(2)种子培养：
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28℃，200rpm摇床振荡培养，48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×108cfu/mL，在28℃，200rpm摇床振荡培养，以24h为传代周期，以体积比为1％为传代比接入新的种子培养基中，传代130天，分别在第0天、第20天、第40天、第80天和第130天取5个样；
(3)分纯：
将步骤(2)获得的5个传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28℃培养24小时；再分别转入种子培养基，在28℃，200rpm摇床振荡培养48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；
(4)发酵：
将所述进化了的巨大芽孢杆菌、进化了的氧化葡糖杆菌以及混合的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/mL，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×108cfu/mL，在28℃，200rpm摇床振荡培养15h；
(5)细胞磷脂组的提取：
①取在步骤(4)摇床振荡培养10h的三种细胞悬液100mL，1000rpm离心10min，去除上清液，保留细胞，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液洗细胞1次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；
②将步骤①所得细胞使用液氮在研钵内研磨制成干粉，称取200mg细胞干粉，置于离心管A中，加入0.5mL超纯水，充分混匀；
③向离心管A中再加入2mL提取液，充分混匀；1000rpm离心10min，使溶液分层，取下层有机溶剂层，置于离心管B中；
④重复步骤③2次，至细胞完全沉降；
⑤向离心管B中，加入0.8mol/L KCl水溶液0.5mL，充分混匀，2000rpm离心10min，除去含水溶性杂质的上清；
⑥再向离心管B加入1mL超纯水，充分混匀，2000rpm离心10min，去上清；
⑦40℃减压蒸馏步骤⑥所得混合物中的有机溶剂，得到总磷脂提取混合物；
⑧将所述总磷脂提取混合物溶于0.2mL储存液中制成样品，冷冻-40℃以下保存；
⑨检测前，向所述样品内加入磷脂标准品，磷脂标准品为双二十烷酰磷脂酰甘油、双二十烷酰磷脂酰乙醇胺，这两种磷脂标准品终浓度均为0.5μg/mL；
所述提取液是含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1∶1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.005％；
所述储存液为含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1∶1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.005％；
(6)LC-MS检测
采用LC-MS对步骤(5)获得的加入了磷脂标准品的样品进行检测，得到维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子结构和含量数据；
LC-MS检测条件为同实施例1；
(7)多元统计分析
将步骤(6)获得的维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子含量数据，进行多元统计分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的差异磷脂分子标志物；多元统计分析方法为Pareto预处理后进行主成分分析；
(8)过程分析
将步骤(7)获得的差异磷脂分子标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些磷脂分子变化的规律，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的磷脂分子及相关代谢途径，从而为以提高2-酮基-L-古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向。
实施例3
一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)固体培养：
取500μL保藏于体积浓度为30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)和500μL保藏于体积浓度为30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)分别接种于固体培养基上，35℃，培养24小时；
(2)种子培养：
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在35℃，280rpm摇床振荡培养，24h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×1010cfu/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/mL，在35℃，280rpm摇床振荡培养，以48h为传代周期，以体积比为10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100天，分别在第0天、第50天和第100天取3个样；
(3)分纯：
将步骤(2)获得的3个传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，35℃培养48小时；再分别转入种子培养基，在35℃，280rpm摇床振荡培养24h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；
(4)发酵：
将所述进化了的巨大芽孢杆菌、进化了的氧化葡糖杆菌以及混合的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×1010cfu/mL，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/mL，在35℃，280rpm摇床振荡培养10h；
(5)细胞磷脂组的提取：
①取在步骤(4)摇床振荡培养15h的三种细胞悬液200mL，3000rpm离心3min，去除上清液，保留细胞，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液洗细胞3次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；
②将步骤①所得细胞使用液氮在研钵内研磨制成干粉，称取300mg细胞干粉，置于离心管A中，加入0.8mL超纯水，充分混匀；
③向离心管A中再加入4mL提取液，充分混匀；3000rpm离心3min，使溶液分层，取下层有机溶剂层，置于离心管B中；
④重复步骤③4次，至细胞完全沉降；
⑤向离心管B中，加入1.2mol/L KCl水溶液1.5mL，充分混匀，4000rpm离心3min，除去含水溶性杂质的上清；
⑥再向离心管B加入3mL超纯水，充分混匀，4000rpm离心3min，去上清；
⑦氮气吹干步骤⑥所得混合物中的有机溶剂，得到总磷脂提取混合物；
⑧将所述总磷脂提取混合物溶于2mL储存液中制成样品，冷冻-40℃以下保存；
⑨检测前，向所述样品内加入磷脂标准品，磷脂标准品为双癸烷酰磷脂酰甘油、双癸烷酰磷脂酰乙醇胺和双十二烷酰磷脂酸，使这三个磷脂标准品终浓度均为1.5μg/mL；
所述提取液是含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为2∶1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.01％；
所述储存液为含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为4∶1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.01％；
(6)LC-MS检测
采用LC-MS对步骤(5)获得的加入了磷脂标准品的样品进行检测，得到维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子结构和含量数据；
LC-MS检测条件为同实施例1；
(7)多元统计分析
将步骤(6)获得的维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子含量数据，进行多元统计分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的差异磷脂分子标志物；多元统计分析方法为Pareto预处理后进行主成分分析；
(8)过程分析
将步骤(7)获得的差异磷脂分子标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些磷脂分子变化的规律，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的磷脂分子及相关代谢途径，从而为以提高2-酮基-L-古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向。
实验证明，实施例2和实施例3与实施例1的结果类似。
本发明所采用的固体培养基、种子培养基和发酵培养基的组成选自中国专利申请号为201110314740.9公开的培养基，例如：
固体培养基：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，琼脂20g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.2g，CaCO3 1g，加水至1L，调pH＝6.8，121℃灭菌20min，制成固体培养基。
种子培养基：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO40.2g，CaCO31g，加水至1L，调pH＝6.8，121℃灭菌20min，制成种子培养基。
发酵培养基的：按比例称取L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO4 1g，MgSO40.5g，CaCO3 1g，加水至1L，调pH＝7.0，121℃灭菌20min，制成发酵培养基。
Claims (7)
1.一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）固体培养：
取10–500μL保藏于体积浓度为15–30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌（Gluconobacteroxydans）和10–500μL保藏于体积浓度为15–30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)分别接种于固体培养基上，28–35℃，培养24h–48h；
（2）种子培养：
将经步骤（1）培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28–35℃，200–280rpm摇床振荡培养，24h–48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×107–2×1010cfu/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×108–2×1011cfu/mL，在28–35℃，200–280rpm摇床振荡培养，以24h–48h为传代周期，以体积比为1%–10%为传代比接入新的种子培养基中，传代100–150天，在0–100或0–150天选3–5个取样时间取3–5个样；
（3）分纯：
将步骤（2）获得的3–5个传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28–35℃培养24h–48h；再分别转入种子培养基，在28–35℃，200–280rpm摇床振荡培养24h–48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；
（4）发酵：
将所述进化了的巨大芽孢杆菌、进化了的氧化葡糖杆菌以及混合的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×107–2×1010cfu/mL，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×108–2×1011cfu/mL，在28–35℃，200–280rpm摇床振荡培养10h–15h；
（5）细胞磷脂组的提取：
①取在步骤（4）摇床振荡培养10h–15h的三种细胞悬液100–200mL，1000–3000rpm离心3–10min，去除上清液，保留细胞，用pH=7.2–7.4的磷酸盐缓冲液洗细胞1–3次，相同条件离心，去除上清，得到细胞；
②将步骤①所得细胞制成干粉，称取200–300mg细胞干粉，置于离心管A中，加入0.5–0.8mL超纯水，充分混匀；
③向离心管A中再加入2–4mL提取液，充分混匀；1000–3000rpm离心3–10min，使溶液分层，取下层有机溶剂层，置于离心管B中；
④重复步骤③2–4次，至细胞完全沉降；
⑤向离心管B中，加入0.8–1.2mol/L KCl水溶液0.5–1.5mL，充分混匀，2000–4000rpm离心3–10min，除去含水溶性杂质的上清；
⑥再向离心管B加入1–3mL超纯水，充分混匀，2000–4000rpm离心3–10min，去上清；
⑦蒸馏或氮气吹干步骤⑥所得混合物中的有机溶剂，得到总磷脂提取混合物；
⑧将所述总磷脂提取混合物溶于0.2–2mL储存液中制成样品，冷冻-40℃以下保存；
⑨检测前，向所述样品内加入磷脂标准品，使磷脂标准品终浓度为0.5–1.5μg/mL；
所述提取液是含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1–2:1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.005–0.01%；
所述储存液为含有二丁基羟基甲苯的氯仿/甲醇溶液，所述氯仿/甲醇的体积比为1–4:1，所述二丁基羟基甲苯的质量分数为0.005–0.01%；
（6）LC–MS检测
采用LC–MS对步骤（5）获得的加入了磷脂标准品的样品进行检测，得到维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子结构和含量数据；
（7）多元统计分析
将步骤（6）获得的维生素C生产菌株传代过程的磷脂组的分子含量数据，进行多元统计分析，得到区分不同传代时间维生素C生产菌株的差异磷脂分子标志物；
（8）过程分析
将步骤（7）获得的差异磷脂分子标志物的含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些磷脂分子变化的规律，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的磷脂分子及相关代谢途径，从而为以提高2–酮基–L–古龙酸为目的的菌种改造和培养条件优化提供方向。
2.根据权利要求1所述的一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是所述细胞制成干粉的方法为使用液氮在研钵内研磨细胞。
3.根据权利要求1所述的一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是所述步骤（5）⑦中所述蒸馏为30–40℃减压蒸馏。
4.根据权利要求1所述的一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是所述磷脂标准品为磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰乙醇胺和磷脂酸至少两种。
5.根据权利要求4所述的一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是所述磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，溶血性磷脂酰乙醇胺或磷脂酸的脂肪酸疏水尾长度为每条10–20个碳原子。
6.根据权利要求1所述的一种分析维生素C生产菌株磷传代过程脂组变化的方法，其特征是所述LC–MS检测条件为：
色谱柱：Hypersil GOLD Silica，其规格为150mm×2.1mm，5μm；
进样量：10μL；
柱温：25℃；
流动相A：氯仿89.5%，甲醇10%，氢氧化铵0.5%；
流动相B：氯仿55%，甲醇39%，氢氧化铵0.5%，水5.5%；
梯度程序：0–7min，20–30%B；7–15min30–40%B；15–20min40–50%B；20–25min50%B；25–35min，50–20%B；35–45min，20%B；
离子化方式：ESI负离子方式；
扫描方式：MS Scan；
扫描范围：m/z400–900；
扫描速度：1000scan/s；
毛细管电压：3KV；
锥孔电压：30V；
萃取电压3V；
离子源温度：100℃；
脱溶剂气温度：350℃；
锥孔气流量：50L/Hr
脱溶剂气流量：400L/Hr；
进/出口能量：50；
碰撞能量：2；
HM1/LM1/HM2/LM2：15.0；
Ion Energy1：1.0；
Ion Energy2：2.0。
7.根据权利要求1所述的一种分析维生素C生产菌株传代过程磷脂组变化的方法，其特征是所述多元统计分析方法为Pareto预处理后进行主成分分析。
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| Jin－Mei Xia 等.Comparative Lipidomics of Four Strains of Saccharomyces cerevisiae Reveals Different Responses to Furfural, Phenol, and Acetic Acid.《Journal of Agricultural and Food Chemistry》.2009,第57卷(第1期),第99-108页. * |
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