CN105567751A - 枯草芽孢杆菌产绿原酸的发酵方法 - Google Patents

Abstract

以红薯叶为基础材料发酵内生菌是一种新的发酵方法，属于微生物发酵领域。绿原酸是一种缩酚酸，通常通过莽草酸途径产生，在植物如杜仲、金银花、野菊花中存在。它是一种重要的生物活性物质和名贵中药，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用。绿原酸的来源主要为从天然植物中提取，其技术复杂且得率不高。找到一种新方法以生产绿原酸尤为重要。本发明利用简单、易得的红薯叶为主要材料用以发酵可以产绿原酸的内生细菌使其合成绿原酸的能力大量提升，发酵液中绿原酸总产量可达54.60？mg？l^-1，是RP5初始发酵（1.58？mg？l^-1）的23.90倍。总绿原酸的产量包括绿原酸及其两种同分异构体可达128.04？mg？l^-1,是初始发酵（1.74？mg？l^-1）的31.74倍，具有广阔的经济效益。

Description

枯草芽孢杆菌产绿原酸的发酵方法

技术领域

本发明涉及一种用于发酵菌株高产绿原酸的新发酵方法，具体涉及一种以已经生长4-5个月的新鲜红薯叶为发酵培养基的基础成分和所用菌株为自身有能力产绿原酸的一株内生细菌。

背景技术

绿原酸(CGA)或3-咖啡酰奎尼酸(3-caffeoylquinicacid，3-CQA)是一种缩酚酸，由咖啡酸与奎尼酸组成，通常通过莽草酸途径产生，在植物如杜仲、金银花、野菊花中存在。研究表明，绿原酸有各种药效作用包括抗氧化、抗菌、抗过敏、抗癌、降低血糖、抗乙肝B病毒等作用，以及广泛用于中国传统医药、日用化工和食品等。绿原酸可称作是一种植物黄金，可从许多药用植物中提取，但其技术复杂且得率并不高，还会对植物本身带来损害。现少有报道从其中能分离得到产绿原酸的内生真菌，相较而言，产绿原酸的内生细菌鲜有报道。

本实验室从金银花叶中分离得到一株自身可以产绿原酸的内生细菌BacillussubtilisRP5。相比从植物和其内生真菌中提取绿原酸而言，可以节约大量的成本和时间。虽然找到了一种有效而可替代的微生物来源，但其发酵产量并不高，找到一种新型发酵产绿原酸的方法尤为重要。

红薯叶含有丰富的营养物质，它不仅含有蛋白质、氨基酸、胡萝卜素、维生素和一些重要的矿物元素，而且富含许多生物活性物质如活性多糖、黄酮类化合物和绿原酸。但是这种丰富而廉价的资源并未得到大量的利用。红薯叶中含有丰富的绿原酸等酚类物质和大量的蛋白质、多糖等营养物质。本发明利用其作为发酵RP5的培养基以生产绿原酸是一种非常可取的选择。

由于绿原酸的合成是一种碳素依赖的苯丙烷代谢途径，高浓度的碳源可造成细胞的高渗透压，在这种胁迫下可产生较高浓度的刺激代谢产物。因此本发明提供了不同浓度的蔗糖对产绿原酸的影响。与此同时，由于碳源、氮源在产绿原酸的紧密联系，氨态氮的利用比硝态氮的利用更有利于绿原酸的积累。在植物和内生菌中肯定能含有类似的产绿原酸的途径，因此培养基的氮源本发明采用铵态氮。

本发明利用新鲜红薯叶为发酵培养基基础材料，进行了对培养基的组成成分及含量的优化探究，以增加RP5发酵产绿原酸的能力，发现该种发酵方法的确能够大幅度增加菌株RP5合成绿原酸的产量。进一步的实验确定了该发酵培养基的组成成分的含量及此种发酵方法下绿原酸的前体和两种异构体的变化。该发明可为绿原酸的大规模生产提供数据支持和理论依据，也加快了植物内生细菌和红薯叶资源的综合利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单，快速的新发酵方法，大幅度提高原本可以产绿原酸及其异构体的菌株合成绿原酸的产量。

本发明通过如下技术方案实现。

本发明通过前期实验分离得到一株内生细菌BacillussubtilisRP5，该菌株对人体无害且能产绿原酸，且已于2015年6月14日送交保藏。

保藏日期：2015年6月14日，并于2015年6月19日鉴定结果为存活。

保藏编号：CCTCCNO:M2015367

分类命名：BacillussubtilisRP5

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学

本发明为产绿原酸的菌株提供一种新方法的发酵培养基组成及含量，其特征是采用已经生长4-5个月的新鲜红薯叶为基础材料，结合添加碳、氮源及其它重要离子。然后利用高效液相色谱法(HPLC)对绿原酸含量进行定量测定，利用液质联用(LC-MS)对培养基和发酵液中绿原酸前体及异构体进行定性定量检测，确保本发明的可操作性。

1植物材料和发酵培养基

新鲜甘薯叶(已经生长4-5月)采摘自成都。取200克新鲜甘薯叶剪碎制成匀浆,煮沸10分钟,然后单层纱布过滤,添加蒸馏水至1L,得到甘薯叶粗提液。一部分溶液通过微型过滤器(0.45μm)过滤除菌备用。但此种方法发酵得到绿原酸的产量比高压蒸汽灭菌得到的产量要低,因此本发明采取高压蒸汽灭菌115℃,20min。基础液体培养基(L^-1)确定为蔗糖(40),大豆蛋白胨(10)，氯化铵(5),硫酸铜(0.04)以及新鲜红薯叶(200)。

2菌株和培养条件

在我们先前的研究中,BacillussubtilisRP5分离来源于金银花叶。斜面保存于-4℃土豆培养基(PDA)以及-40℃，40％甘油管中。液体发酵实验采用250ml三角瓶中加入100ml液体培养基，接种量2％并在37℃，200revmin^-1的转速下旋转培养28h。

3绿原酸提取方法

将菌株RP5活化后接种于100ml红薯叶液体发酵培养基中，摇床培养28h(37℃，200revmin^-1)。离心(5000g，20min)，取上清液，调节发酵液的pH至4，以保持绿原酸的稳定性，加入等体积70％乙醇超声波处理(40℃，10min)以加快液质转化从而加快提取效率，然后静止过夜。再用旋转蒸发仪真空浓缩至20ml，浓盐酸调节调节PH至2-3，接着加入等体积乙酸乙酯萃取三次，每次1h，取乙酸乙酯层真空浓缩至几乎干，加入5ml色谱甲醇完全溶解，用有机滤膜过滤，除去样品中的不溶物制备成待测样品溶液。

4高效液相色谱HPLC分析

HPLC同时测定初始发酵(PDB)和红薯叶作为新的发酵培养基时发酵液中绿原酸含量。发酵液中绿原酸总产量可达54.60mgl^-1，是RP5初始发酵(1.58mgl^-1)的23.90倍。

5液质联用LC-MS分析绿原酸前体和异构体

应用液质联用方法,根据它们的裂解规律和信号强度以及报道的文献为基础，能分离绿原酸的四种前体标品肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸和奎尼酸以及两种异构体新绿原酸-4-咖啡酰奎尼酸(4-CQA)，隐绿原酸5-咖啡酰奎尼酸(5-CQA)。在四种前体中,肉桂酸酸转化率最高,可达100％,对香豆酸酸、咖啡酸、奎尼酸分别为72.4％,78.4％，33.3％。两种同分异构体可达128.04mgl^-1是初始发酵(1.74mgl^-1)的31.74倍。

本发明与现有技术相比具有以下优点。

1、本发明中新的发酵方法所运用的发酵培养基可以大幅度提高RP5产绿原酸的能力。其发酵液中绿原酸总产量可达54.60mgl^-1，是RP5初始发酵(1.58mgl^-1)的23.90倍。总绿原酸的产量包括绿原酸及其两种同分异构体可达128.04mgl^-1是初始发酵(1.74mgl^-1)的31.74倍。其效果极其显著。

2、本发明中利用的红薯叶来源广泛，价格非常低廉，容易获取。此外培养基的组成成分如蔗糖，大豆蛋白胨，氯化铵，硫酸铜也非常低廉易获得。本实验绿原酸的提取方法也相对简单。

3、本发明可以应用与其它植物和菌株，把微生物资源和植物资源综合利用起来，真正做到资源的合理开发。为大规模产绿原酸提供可靠的前景。

附图说明

图1高效液相色谱HPLC分析。图1HPLC色谱图：绿原酸(杜仲提取)标品保留时间和吸收光谱(A)；红薯叶培养基本底(B)；RP5发酵液(PDB)保留时间(C)；RP5红薯叶发酵液保留时间(D)

图2液质联用LC-MS分析绿原酸前体。图2绿原酸前体标品的MRM色谱图(A),a,b,c,d分别为肉桂酸、香豆酸、咖啡酸和奎尼酸；红薯叶中绿原酸前体的MRM色谱图(B)和其RP5发酵液前体MRM色谱图(C)；

图3，图4液质联用LC-MS分析绿原酸异构体。图3绿原酸及其异构体标品色谱图3-CQA(retentiontime:29.78),4-CQA(retentiontime:32.52),5-CQA(retentiontime:15.35)图4绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸混合标品MRM色谱图(平行三次进样)

具体实施方式

下文将通过实施实例对本发明做进一步说明，但实施实例不以任何方式限制本发明。

实施例1

菌株活化及接种：活化菌株RP5，采用PDB培养基，37℃,200revmin^-1,摇瓶20h。接种：取200克已生长4-5月的新鲜甘薯叶剪碎制成匀浆,煮沸10分钟,然后单层纱布过滤,添加蒸馏水至1L,得到甘薯叶粗提液。再向其中加入(g):蔗糖(40),大豆蛋白胨(10)，氯化铵(5),硫酸铜(0.04)。高压蒸汽灭菌115℃,20min。接种(2％)已活化好的菌液至装有100ml培养基的250ml锥形瓶，并在37℃，200revmin^-1的转速下旋转培养28h。

实施例2

提取绿原酸：摇床培养28h后。离心(5000g，20min)，取上清液，调节发酵液的pH至4，以保持绿原酸的稳定性，加入等体积70％乙醇超声波处理(40℃，10min)以加快液质转化从而加快提取效率，然后静止过夜。再用旋转蒸发仪真空浓缩至20ml，浓盐酸调节调节PH至2-3，接着加入等体积乙酸乙酯萃取三次，每次1h，取乙酸乙酯层真空浓缩至几乎干，加入5ml色谱甲醇完全溶解，用有机滤膜过滤，除去样品中的不溶物制备成待测样品溶液

实施例3

HPLC定量分析样品溶液绿原酸含量：HPLC检测条件，色谱柱为WatersC18column(75mm×4.6mm，3.5μm)，流动相为乙腈：0.5％磷酸水(13：87，v/v)，流速为1.0mlmin^-1，柱温35℃，进样量10μl，检测波长325.2nm。通过测定绿原酸的积累产量可达到54.60mgl^-1，RP5发酵产绿原酸能力提高了37.75mgl^-1，是RP5初始发酵(1.58mgl^-1)的23.90倍以及相比发酵所用的200g新鲜红薯叶中本身绿原酸含量(18.32mgl^-1)的2.06倍。HPLC保留时间和吸收波长见图1。

实施例4

LC-MS测定发酵液中绿原酸前体及异构体：绿原酸及前体物质和异构体检测的液质联用液相条件:AgilentZORBAXSB-C18柱(4.6mm×250mm，5m)流动相A-0.05％甲酸溶液，B-0.05％甲酸乙腈溶液。洗脱梯度(0～20min，2％～4％B，20～70min，4％～7％B，70～110min，7％～10％B，110～115min，10％～15％B，115～116min，15％～2％B)平衡时间10min，流速1mlmin^－1，检测波长330nm，进样量20ul，柱温25℃。质谱条件:电喷雾(ESI)离子源，负离子模式扫描，喷雾电压3.5kV，离子源温度325℃，鞘气(N2)流速9lmin^－1，毛细管温度350℃，质量扫描范围50～100m/z。该种条件下能够良好的分离绿原酸的四种前体标品肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸和奎尼酸如图2，A.所示。可以发现，利用甘薯叶培养基发酵RP5后，四种前体物质的转化如图2，B和图2，C所示。表2中给出了具体的转化率。对比发酵前后，在四种前体中,肉桂酸酸转化率最高,可达100％,对香豆酸酸、咖啡酸、奎尼酸分别为72.4％,78.4％，33.3％。具体参数见表1。说明菌株可以利用培养基中的绿原酸前体物质。图3，图4，分别为绿原酸及其异构体单标和混标液质图谱。总绿原酸的产量包括绿原酸及其两种同分异构体可达128.04mgl^-1是初始发酵(1.74mgl^-1)的31.74倍。具体参数见表2。因此,此红薯叶发酵培养基适合发酵RP5生产绿原酸及其同分异构体，并能够用于进一步研究其增强效果，如果应用到生产，具有可观的经济效益。

表1发酵液相比红薯叶培养基(对照)中绿原酸前体含量分析

注:-表示发酵液相比培养基某前体降低的相关百分含量，ND表示未达到检测下限

表2发酵前后绿原酸异构体分析

A:RP5初始发酵液中绿原酸及异构体含量(PDB为培养基)；B:红薯叶发酵培养基本底中绿原酸及异构体含量；C:RP5红薯叶发酵液中绿原酸及异构体含量；

增加倍数a:RP5红薯叶发酵液与红薯叶培养基中各物质增加的倍数；增加倍数b:RP5红薯叶发酵液与基础发酵液(PDB)中各物质的增加的倍数。

Claims (6)

1.一种细菌发酵高产绿原酸的新方法，其特征在于，所述新方法是以细菌菌株RP5发酵新鲜红薯叶为培养基基础材料。

2.权利要求1所述的发酵新方法，其特征在于细菌菌株RP5为产绿原酸或其相关异构体的植物内生菌。

3.权利要求1所述的发酵新方法，其特征在于使用了一种新的发酵培养基，其组成成分包括蔗糖,大豆蛋白胨,氯化铵,硫酸铜以及新鲜红薯叶。

4.权利要求1或2所述的发酵新方法，其特征在于，所述红薯叶为已经生长4-5个月的新鲜红薯叶。

5.一种发酵新方法，其特征在于，通过使用权利要求1-4任一项所述的培养基组成和相关菌株，以此利用菌株发酵提高绿原酸的产量。

6.权利要求5所述的方法，包括利用红薯叶或其它能产绿原酸的植物为材料，利用产绿原酸的植物内生细菌菌株RP5发酵以提高绿原酸及其相关异构体的产量。