CN101418324B

CN101418324B - 一种发酵提高玄参中哈巴俄苷提取率的方法

Info

Publication number: CN101418324B
Application number: CN2008101625809A
Authority: CN
Inventors: 陈启和; 傅明亮; 何国庆; 江芬儿; 章海锋
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2008-12-04
Filing date: 2008-12-04
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2028-12-04
Also published as: CN101418324A

Abstract

本发明公开了一种发酵提高玄参中哈巴俄苷提取率的方法，包括：(1)将酿酒酵母在麦芽汁固体培养基上培养后转接到麦芽汁液体培养基，培养得到培养液：(2)将玄参与蒸馏水混合，经灭菌处理得到玄参培养基；(3)将培养液接入玄参培养基，对玄参进行培养转化，得到转化后的玄参培养液；(4)将转化后的玄参培养液，离心去掉残渣得到上清液，再利用溶剂提取法提取上清液中的哈巴俄苷。本发明采用微生物发酵法对玄参进行生物转化，比未经转化的玄参中的哈巴俄苷的含量提高了30～50％。

Description

一种发酵提高玄参中哈巴俄苷提取率的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种采用微生物发酵法提高玄参药材中主要功效成分哈巴俄苷提取率的方法。

背景技术

我国中药历史悠久，中药资源丰富，为保证广大人民的身体健康起到巨大作用，国际上正越来越意识到中药在治疗和预防疾病中的重要作用。但近几十年来，我国在中药现代化方面进展缓慢，主要原因是中药加工技术陈旧，中药中的有效成分不清楚等。近年来现代生物技术和传统中药研究完美结合的中药微生物发酵技术正逐渐成为研究的热点，并为中药的发展开辟了新的空间。中药发酵制药技术在继承中药炮制学发酵法的基础上，吸取了微生态学研究成果，结合现代生物工程的发酵技术和目前热点益生菌研究技术而形成的高科技中药制药新技术，是从天然的中药中寻找药物的新疗效，具有很大的研究价值和市场开发意义。

中药发酵研究开始于20世纪80年代，其主要目的是为了改变药物原有性能，产生新的治疗作用(如淡豆豉、豆黄)，或增强原有疗效，扩大用药品种。中药发酵技术具有反应条件温和、高效、低毒、低残留等优点。利用微生物转化较之化学转化有以下优点：1)反应定向，副反应少，产物较单一；因为微生物的酶不仅能识别特定基团的化学性质，而且可以识别基团的特定位置；2)酶促反应条件温和；3)利用微生物转化可能完成化学方法难以进行或不能进行的化学反应。微生物转化一方面可以按照微生物中所含有的某种酶定向地转化某种药物向预先的方向，如已知某种微生物含有某种酶，而这种酶可使某种化合物的结构发生羟化或脱氢等反应，从而产生新的化合物。另一方面微生物也会形成丰富多样的次生代谢产物，它们有些本身就是功效良好的药物；或以中药中的有效成分为前体，经微生物的代谢可以形成新的化合物，或微生物的次生代谢产物和中药中的成分发生反应形成新的化合物。

玄参主要分布于我国的长江流域，现多栽培，是著名的传统浙八味中药之一。始载于《神农本草经》，列为中品，性微寒，味甘、苦、咸，具有滋阴、降火、生津、凉血、解毒等功效，用于热病阴伤、舌绛烦渴、温毒发斑、便秘、骨蒸劳嗽、夜寐不宁、目赤、咽痛、白喉、痛肿、毒疮等。玄参中含有以下几种有效成分：环烯醚萜类，如哈巴俄苷等；苯丙素类，如安格洛苷等；其它类，如肉桂酸等。已知哈巴俄苷为玄参中含量较高的成分，也是玄参中的特征有效成分，文献报道它具有抗慢性炎症、降压、镇痛、解痉、抗乙肝病毒以及免疫促进作用。玄参虽然作为开发和使用历史悠久的名贵药材，但由于开发应用程度还较低，因此玄参的研究应用大有可为，尤其是开展玄参的综合利用和纵深加工是发展玄参产业的必然之路。玄参中的主要功效成分并没有得到充分利用，因此有必要采用微生物方法改善和提高玄参中主要成分的提取率，修饰其中主要活性成分，提高其生物利用度。

从目前的研究情况看，大部分的中药发酵仍采用固体发酵或自然发酵方式，不仅菌系复杂，且转化周期较长，给中药中关键成分的定向改造带来极大困难，而且国内外并无开展玄参的固态或液体微生物转化及其生物利用度研究的报道。

发明内容

本发明提供了一种微生物发酵法转化提高玄参中主要功效成分哈巴俄苷提取率的方法。

一种发酵提高玄参中哈巴俄苷提取率的方法，包括：

(1)将酿酒酵母在麦芽汁固体培养基上培养后转接到麦芽汁液体培养基，25～30℃(优选28℃)摇床培养18～24小时得到培养液；培养液内菌种细胞的密度为1×10⁸～1×10⁹cfu/ml；

(2)按每克玄参添加20～30毫升蒸馏水，将玄参与蒸馏水混合，经灭菌处理得到玄参培养基；

(3)将步骤(1)得到的培养液无菌接入玄参培养基，在25～30℃(优选28℃)对玄参进行培养转化132～168小时左右，得到转化后的玄参培养液；

培养液无菌接入玄参培养基前，调节玄参培养基的pH至4～7，优选5.5，在玄参培养基的pH为5.5时，哈巴俄苷增值率可大大提高；

培养液与玄参培养基的用量比为：

培养液的毫升数:玄参培养基中玄参的克数＝1∶0.5～2，优选1∶1；培养转化的时间优选144小时；

(4)将转化后的玄参培养液，离心去掉残渣得到上清液，再利用溶剂提取法提取上清液中的哈巴俄苷。

所述酿酒酵母为K字酵母、酒精酵母、梅山酵母或啤酒酵母。

所述玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的根；玄参的根在使用前要经过粉碎，一般粉碎至40～60目。

经过发酵转化的玄参按照常规溶剂提取法取样进行哈巴俄苷的提取，并用反相高效液相色谱法(RP—HPLC)对其含量进行测定，以比较和监测其主要功效成分的变化。

所述哈巴俄苷提取法主要步骤为：将发酵所得的上清液减压蒸馏至近干，再用质量百分比浓度为30％的乙醇水溶液进行溶解并定容至10mL，待测定用。

所述哈巴俄苷测定方法为反相高效液相色谱法(RP—HPLC)，其主要步骤为：根据文献报道及多次实验，哈巴俄苷的色谱检测条件为：流动相：质量百分比浓度为1％的乙酸水溶液—甲醇(体积比为49∶51)，检测波长：280nm，流速：0.90mL/min，柱温：32℃，进样量10μL，跑样时间20～25min。准确称取0.5mg哈巴俄苷标准品置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成0.05mg/mL的标准溶液。依次准确取1.0mL，0.1mL上述溶液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，与储备液共同形成浓度分别为0.05mg/mL、0.005mg/mL、0.0005mg/mL的系列标准溶液。取配制好的哈巴俄苷系列标准溶液各1mL，分别于离心管中10000r/min离心5分钟，取150μL上清液于洁净干燥的进样瓶中。进样，在色谱检测条件下测定对应的峰面积值Area(A)，以峰面积值A为纵坐标，哈巴俄苷浓度C为横坐标，绘制标准曲线，经统计处理求得哈巴俄苷的线性回归方程为：线性方程为y＝2×10⁷x-6718.8(R²＝0.9999)。

本发明采用微生物发酵法对玄参进行生物转化，与未经转化的玄参相比，其主要功效成分哈巴俄苷增值率达到了30～50％。

本发明的操作流程简单，微生物细胞培养容易，生物转化易于控制，微生物转化对中药材主要功效成分的提取具有较大提高作用，本发明的研究思路和结果为开发利用中药材功能成分提供借鉴，为传统中药材的深度开发和利用提供更好的方法和平台。

附图说明

图1为本发明方法的流程示意图。

具体实施方式

实施例1～3

不同菌种对玄参的转化效果试验

参见附图1的流程，分别采用酒精酵母、梅山酵母和啤酒酵母为菌种对玄参进行转化，对未经转化和经转化后的玄参进行哈巴俄苷提取和含量测定，条件及结果如下：

各菌种分别在麦芽汁固体培养基中斜面保存，28℃活化24小时，再接种到麦芽汁液体培养基(无琼脂，pH 5.5)上。液体种子培养在250毫升的摇瓶装液为50毫升，发酵温度28℃，摇床转速为150r/min，培养24小时得到培养液。

准确称取2克经粉碎处理至20～60目的玄参，溶解于50毫升蒸馏水中，并调节pH至5.5，于121℃下灭菌处理15分钟，得到玄参培养基；按每克玄参接入1毫升培养液，将培养液无菌接入玄参培养基，在28℃下对玄参进行培养转化144小时，得到转化后的玄参培养液；将转化后的玄参培养液，离心去掉残渣得到上清液，再利用溶剂提取法提取上清液中的哈巴俄苷。

实施例1～3中得到的哈巴俄苷质量及对比例(未经发酵转化)中得到的哈巴俄苷质量见表1：

表1

表1中的对比例为未经转化的玄参，可见通过生物发酵转化可以明显提高玄参中哈巴俄苷的含量，其中以啤酒酵母的转化能力最为显著，哈巴俄苷的质量达到25.3mg/2g玄参。与对比例相比，通过生物发酵转化后玄参中哈巴俄苷的含量大大提高，哈巴俄苷增值率可达到39～47％。

实施例4～6

不同pH对玄参转化效果的试验

按照实施例1的方法，只采用啤酒酵母为菌种，对不同pH的玄参培养基进行转化，并对转化后的玄参进行哈巴俄苷提取和含量测定，结果见表2：

表2

表2中的比较分析发现采用不同pH的玄参培养基明显影响玄参中哈巴俄苷的含量，其中以pH＝5.5时，哈巴俄苷的得率最高。

实施例7～10

不同接种比例对玄参转化效果的试验

按照实施例1的方法培养获得细胞，采用啤酒酵母为转化的微生物，按照不同接种比例将培养液接入玄参培养基中进行转化，对转化后的玄参进行哈巴俄苷含量测定，结果见表3：

表3

注：每毫升培养液中含有菌种细胞1×10⁸cfu。

表3中可以看出采用1:1的接种比例对于玄参的转化极为有效，其中哈巴俄苷的得率要明显高于其它组，因此选取1:1接种比例进行转化更有利于玄参中哈巴俄苷的提取。

Claims

1.一种发酵提高玄参中哈巴俄苷提取率的方法，包括：

(1)将啤酒酵母在麦芽汁固体培养基上培养后转接到麦芽汁液体培养基，25～30℃摇床培养18～24小时得到培养液；

(3)调节玄参培养基的pH至4～7，将步骤(1)得到的培养液接入玄参培养基，在25～30℃对玄参进行培养转化132～168小时，得到转化后的玄参培养液；培养液的毫升数∶玄参培养基中玄参的克数＝1∶0.5～2；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述玄参在使用前经粉碎至40～60目。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，培养液接入玄参培养基前，调节玄参培养基的pH至5.5。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，培养液的毫升数∶玄参培养基中玄参的克数＝1∶1。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，培养转化的时间为144小时。