CN100584954C - 短乳杆菌发酵生产芍药苷代谢素-ⅰ的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化工程领域，涉及一种应用短乳杆菌发酵生产芍药苷代谢素-I的方法。将短乳杆菌L.brevis AS 1.12菌种，接入培养基，培养基的组分和含量为：西红柿汁200g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏7.5g/L，葡萄糖10g/L，吐温80为0.3ml/L，pH值7.0～8.5，于25～37℃厌氧培养12～24小时后，离心收集菌细胞，用生理盐水洗涤，再离心，将所得细胞分散于0.05M的磷酸盐缓冲液中，加入底物芍药苷或其类似物羟基芍药苷或甲基芍药苷或苯甲酰芍药苷或者芍药苷与其类似物的混合物，30～40℃转化2～24小时后，用乙酸乙酯萃取，浓缩萃取液至干得转化物浸膏，浸膏经硅胶柱层析，得芍药苷代谢素-I。本发明具有操作简单、易控制、周期短、成本低、效率高、对环境友好等特点，解决了制造镇痛解痉、抗炎、抗应激性溃疡、扩张冠脉血管、对抗急性心肌缺血以及抑制血小板聚集等药物的原料问题。
Description
技术领域
本发明属于生化工程领域，涉及一种应用乳酸杆菌发酵生产芍药苷代谢素-I的方法。
背景技术
芍药苷为芍药的主要有效成分，具有镇痛解痉、抗炎、抗应激性溃疡、扩张冠脉血管、对抗急性心肌缺血以及抑制血小板聚集等多方面的作用。近年研究表明，口服芍药苷后直接吸收很少，生物利用度低，提示芍药苷在肠道首先被肠内菌降解，其代谢物起到芍药苷的药理作用。日本的Masao Hattori等首先报道了芍药苷在人肠内菌体外培养液中转化成芍药苷代谢素-I、II、III(Paeonimatabolin-I、II、III见图1)，芍药苷代谢素-I为主要产物，芍药苷代谢素-II只在转化前期出现，芍药苷代谢素-III极少，至今未鉴定结构。药理学研究表明芍药苷代谢素-I抗中枢性痉挛作用大于芍药苷，Ola Ahmed Heikal等人用酶免疫分析法定量测定了口服芍药苷后大鼠血浆中的芍药苷和其主要代谢物芍药苷代谢素-I的血药浓度。芍药苷代谢素-I的血药浓度远大于芍药苷的血药浓度，说明口服芍药苷后，芍药苷代谢素-I是血液中的主要化合物，也是主要的活性成分，试验证明芍药苷代谢素-I的口服生物利用度几近100％。
式1芍药苷的微生物转化
平滑肌和骨骼肌痉挛是一种多发和常见的疾病，尤其是脑瘫、中风等引起的中枢性痉挛会给患者带来很大痛苦。芍药苷具有较好的解痉活性，但是它在体内很难被吸收，生物利用度极低，其药效是由于芍药苷在体内经肠道微生物转化为容易吸收且活性更好的芍药苷代谢素-I而体现出来的。由于人体肠道菌群有个体差异，特别是对于患者，由于身体状况、饮食和用了其它药物的影响，往往肠道菌群出现失调和紊乱，不能有效将芍药苷转化为药效物质芍药苷代谢素-I，从而大大降低了药效的发挥。如果直接服用芍药苷代谢素-I则不需要肠道菌的参与便可直接被吸收和利用，适合于各种情况的患者。故以芍药苷代谢素-I为活性物质研制具有自主知识产权的新药有着很好的前景。
有学者曾以藏茴香酮为原料经9步反应得到芍药苷代谢素-I，但制备路线长，总得率只有6％，没有实际应用价值。
在1985年，日本难波恒雄等报道了利用肠内菌体外发酵芍药苷转化得到芍药苷代谢素-I的制备工艺，其所用底物为芍药苷，转化时间较长，制备量很少，且未见产率报道，不适合工业化。
发明内容
本发明的目的是利用微生物发酵法生产芍药苷代谢素-I，在优化菌株及培养基和转化条件的情况下，利用芍药苷或其类似物，快速地生产出大量芍药苷代谢素-I，适合工业化生产。该法以葡萄糖等为培养基，采用短乳杆菌在合适的工艺条件下，将芍药苷或其类似物转化为芍药苷代谢素-I。
本发明所使用的菌种是发明人2004年从中国科学院微生物研究所购买的大量菌种中的短乳杆菌Lactobacillus brevis AS 1.12。
通过常规的发酵，培养菌种L.brevis AS 1.12，并利用其生产芍药苷代谢素-I，简述如下：
短乳杆菌L.brevis AS1.12的培养是以西红柿、碳源、氮源、无机盐等做培养基，碳源是葡萄糖和/或淀粉水解糖等，氮源是酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、牛骨胨等，无机盐是磷酸盐、钠盐和钾盐。
在无菌室中，从厌氧试管中取适量菌种，接入种子培养基，于25～37℃厌氧培养12～24小时；然后移入扩大培养基，接种量为5～15％V/V，即每升扩大培养基接种量10～150ml，一般采用10％，于25～37℃厌氧培养12～24小时；再将其移入发酵培养基，接种量为5～15％V/V，即每升发酵培养基接种量10～150ml，一般采用10％，于25～37℃厌氧培养12～24小时；发酵完成后，离心收集菌细胞，用生理盐水洗涤，再离心。将所得细胞分散于0.05M的磷酸盐缓冲液中，加入底物芍药苷或其类似物羟基芍药苷或甲基芍药苷或苯甲酰芍药苷或者芍药苷与其类似物的混合物，在30～40℃转化2～24小时，转化完成后，用乙酸乙酯萃取3～4次，合并萃取液，浓缩至干得转化物浸膏。浸膏经硅胶柱层析，得芍药苷代谢素-I纯品。
种子培养基、扩大培养基、发酵培养基的组分和含量均为：西红柿汁200g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏7.5g/L，葡萄糖10g/L，吐温80为0.3ml/L，用10％NaOH调pH值7.0～8.5，115℃灭菌30min。
本发明工艺流程图：
分析方法：本发明中芍药苷代谢素-I的分析方法采用薄层色谱扫描法，具体条件如下：
薄层色谱扫描仪：瑞士CAGMA-III薄层色谱扫描仪
入射波长：400nm
参比波长：560nm
展开剂：苯-氯仿-甲醇＝5∶5∶1(V/V)
显色剂：5％香草醛-浓硫酸溶液
显色温度及时间：105℃，3～5分钟
本发明的优点：底物芍药苷或其类似物是白芍或赤芍的主要成分，分离方法成熟，价廉易得；该发酵和转化方法操作简单，过程容易控制，设备费用低；且生产周期快，成本低，效率高，对环境友好，具有工业化生产的潜力。
由于以前芍药苷代谢素-I样品来源受限，文献仅有其在解痉方面的活性报道，在芍药苷其它的活性方面(比如：抗炎、抗应激性溃疡、扩张冠脉血管、对抗急性心肌缺血以及抑制血小板聚集等)还未见文献报道。因此本发明芍药苷代谢素-I的制备工艺解决了芍药苷代谢素-I样品的来源问题，推动解痉新药的开发，为芍药苷代谢素-I的其它药理活性研究提供了物质基础。
具体实施方式
实施例1
种子培养基、扩大培养基、发酵培养基的组分和含量均为：西红柿汁200g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏7.5g/L，葡萄糖10g/L，吐温80为0.3ml/L，用10％NaOH调pH值7.0～8.5，115℃灭菌30min。
将短乳杆菌L.brevis AS 1.12从厌氧管中取出10ml，接种于100ml种子培养基，于37℃厌氧培养24小时，一共培养5份。将5份培养液接种于5L扩大培养基中，扩大培养24小时，将培养液接种于45L发酵培养基中，于37℃厌氧培养24小时，离心收集细胞，并用生理盐水洗涤1次，在悬浮于0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中(浓度为40g湿细胞/L)加入芍药苷，使其浓度为1mg/ml，在37℃转化6小时。转化液用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，浓缩至干得浸膏21g。浸膏经过普通硅胶柱层析，得芍药苷代谢素-I产品4.5g。
实施例2
种子培养基、扩大培养基、发酵培养基的组分和含量同实施例1。
将短乳杆菌L.brevis AS 1.12从厌氧管中取出10ml，接种于100ml种子培养基，于37℃厌氧培养24小时。将培养液接种于1L扩大培养基中，扩大培养24小时，将培养液接种于10L发酵培养基中，于37℃厌氧培养24小时，离心收集细胞，并用生理盐水洗涤1次，在悬浮于0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中(浓度为40g湿细胞/L)加入苯甲酰芍药苷，使其浓度为1mg/ml，在37℃转化6小时。转化液用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，浓缩至干得浸膏4.5g。浸膏经过普通硅胶柱层析，得芍药苷代谢素-I产品0.1g。
实施例3
种子培养基、扩大培养基、发酵培养基的组分和含量同实施例1。
将短乳杆菌L.brevis AS 1.12从厌氧管中取出10ml，接种于100ml种子培养基，于37℃厌氧培养24小时。将培养液接种于1L扩大培养基中，扩大培养24小时，将培养液接种于10L发酵培养基中，于37℃厌氧培养24小时，离心收集细胞，并用生理盐水洗涤1次，在悬浮于0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中(浓度为40g湿细胞/L)加入氧化芍药苷，使其浓度为1mg/ml，在37℃转化6小时。转化液用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，浓缩至干得浸膏3.2g。浸膏经过普通硅胶柱层析，得芍药苷代谢素-I产品0.07g。
Claims (1)
1、一种短乳杆菌发酵生产芍药苷代谢素-I的方法，其特征是：先将短乳杆菌L.brevis AS 1.12菌种接入种子培养基，于25～37℃厌氧培养12～24小时，然后移入扩大培养基，接种量为5～15％V/V，即每升扩大培养基接种量10～150ml，于25～37℃厌氧培养12～24小时，再将其移入发酵培养基，接种量为5～15％V/V，即每升发酵培养基接种量10～150ml，于25～37℃厌氧培养12～24小时，再离心收集菌细胞，用生理盐水洗涤，再离心，将所得细胞分散于0.05M的磷酸盐缓冲液中，加入底物芍药苷或羟基芍药苷或甲基芍药苷或苯甲酰芍药苷、或者芍药苷与羟基芍药苷或甲基芍药苷或苯甲酰芍药苷的混合物，30～40℃转化2～24小时后，用乙酸乙酯萃取，浓缩萃取液至干得转化物浸膏，浸膏经硅胶柱层析，得芍药苷代谢素-I；种子培养基、扩大培养基、发酵培养基的组分和含量为：西红柿汁200g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏7.5g/L，葡萄糖10g/L，吐温80为0.3ml/L，pH值7.0～8.5。
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| Metabolism of Paeoniflorin and Related Compounds byHuman Intestinal Bacteria.. MASAO HATTORI 等.Chem.Pharm.Bull,Vol.33 No.9. 1985 |
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| 芍药科植物的研究概况. 翁小刚等.中国实验方剂学杂志，第9卷第1期. 2003 |
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