CN104498422B - 一种嗜冷产甲烷菌的驯化培养方法 - Google Patents

一种嗜冷产甲烷菌的驯化培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种嗜冷产甲烷菌的驯化培养方法，包括步骤：1)向培养装置中填充驯化培养基，充氮去氧后高温灭菌，再加入乙酸钠、甲酸钠、甲醇以及乙酸纤维素、壳聚糖、益生元各0.001g，获得驯化培养装置；2)取出淤泥菌种并打碎，加入活化淀粉，静置后得活化淀粉‑淤泥菌种；3)将步骤2)所得菌种接种到步骤1)的驯化培养装置中，在8℃的条件下培养4～5天；4)检测有气泡产生时，通过控温系统改变温度，进行变温驯化培养；5)当气泡量不再增加时，停止变温并进行补料，补料后气泡继续增加，直到12天时产气量完全稳定，嗜冷产甲烷菌群富集完成。采用本发明的驯化培养嗜冷产甲烷菌，明显加快菌落形成速度，提高富集效果。

Description

一种嗜冷产甲烷菌的驯化培养方法
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，尤其涉及一种嗜冷产甲烷菌的驯化培养方法。
背景技术
随着可利用自然资源的减少和环境污染的加剧，生物质能源成为解决人类所面临的资源问题的最有希望的能源之一。沼气发酵是以林业、农业废弃物城市垃圾为原料产生绿色、可再生资源，对社会和环境的和谐发展具有重要的意义。沼气发酵过程是一个由多种微生物联合、交替作用的复杂生化过程，发酵过程的温度、水分、原料、酸碱度以及密闭性等是保证该生化过程持续进行的必要条件，而温度是影响发酵效应的重要因素。在我国北方，冬季寒冷漫长，长期的低温条件导致沼气发酵菌群生理活性降低，进而导致发酵过程十分缓慢，甚至停止，这就造成企业损失巨大。
在沼气发酵过程中，发挥主要作用的是菌群称为产甲烷菌，它是严格厌氧菌或专性厌氧菌，对氧的敏感度极高，属于古菌域。因此，要解决北方冬季沼气发酵缓慢的问题，就是要提高产甲烷菌在冬季发酵活性，保证其正常或高效代谢。根据最适生长温度(Topt)的不同，甲烷菌可分为嗜冷(psy-chrophiles，Topt≤25℃)、嗜温(mesophiles，Topt≈35℃)、嗜热(thermophiles,Topt≈55℃)和极端嗜热(hyperthermophiles,Topt＞80℃)4个类群。由此可见，如果能够利用嗜冷甲烷菌实现低温条件下的高效厌氧生物处理过程，也就能够解决北方冬季沼气发酵所存在的问题。
然而，目前对嗜温和嗜热产甲烷菌的研究较为深入，有关嗜冷产甲烷菌的研究起步较晚，直到1992年才分离培养出第一株嗜冷产甲烷菌。近年来，随着嗜冷产甲烷菌的相关研究的迅速发展，一些嗜冷产甲烷菌的生理生化特性才得到初步认识，还需更深入的研究。
研究表明：嗜冷产甲烷菌是通过产生冷活性酶来调节它们的代谢活动，并以此来适应低温环境，而冷活性酶在低温时具有很高的活性和低稳定性。将嗜冷酶与嗜温和嗜热酶进行对比，发现嗜冷酶中性氨基酸含量较高，也就是说中性氨基酸可以提高嗜冷酶的活性，还能为嗜冷产甲烷菌提供代谢用的营养物质。
沼气发酵过程是一个持续变温的过程，也就是说在整个发酵过程中，温度不能稳定下来，这就导致嗜冷产甲烷菌的活性不能维持最高，甚至出现失活现象。研究表明，嗜冷产甲烷菌在温度变化过程中之所以失活是因为温度突变导致冷激蛋白高表达，产生冷休克反应，而该反应会延缓菌落的繁殖增长。
裴占江等人公开了题为“低温产甲烷菌群的富集效果研究”的报道，披露了一种嗜冷产甲烷菌的培养方法，该报道包括步骤：先将培养基注入血清瓶中，充氮脱氧后灭菌；加入2.5mol/L乙酸钠、25％甲酸钠和50％(v/v)甲醇；取出淤泥菌种并将菌种打碎，接种至装有培养基的血清瓶中，在8～15℃进行培养。该报道在分析与结果中表明，低温产甲烷菌群共富集5代，其中第一代发酵7天才有气泡产生，并且气量很少以至于无法测量，10天后才可以收集到少量气体，并且甲烷含量只有5％左右；其余各代需要5天才能收集到大量气体，并且分析甲烷含量仅为30％。也就是说该报道披露的嗜冷产甲烷菌的方法要富集代菌群，就需要20天左右，并且甲烷产量也仅为30％，这对企业来说，投资成本相对较高，不能规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有技术的不足，提供一种菌群富集时间短、效率高、菌群活性高，甲烷产气量高的嗜冷产甲烷菌的驯化培养方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种嗜冷产甲烷菌的驯化培养方法，控制温度锯齿式升降变化和恒温补料，克服嗜冷产甲烷菌在温度变化中的冷休克反应，具体步骤为：
1)向嗜冷产甲烷菌的培养装置中填充驯化培养基，充氮去氧后高温灭菌30～60分钟，并加入2.5mol/L乙酸钠4mL、25％甲酸钠、50％(v/v)甲醇各3mL、乙酸纤维素、壳聚糖、益生元各0.001g，获得驯化培养装置；
2)取出淤泥菌种并打碎，加入活化淀粉1～5％，静置18～24小时，得活化淀粉-淤泥菌种，所述的活化淀粉的制备方法采用冯国涛公开的题为“活化淀粉的制备及其反应性能研究”所披露的方法；
3)将步骤2)所得活化淀粉-淤泥菌种接种到步骤1)的驯化培养装置中，在8℃的条件下进行培养，培养时间为4～5天，所述的接种方法是通过无菌注射器按一定的接种比例接种到驯化培养装置中的，驯化培养装置可以是血清瓶；
4)检测有气泡产生时，通过控温系统改变温度，进行变温驯化培养，随着温度变化，气泡产量持续上升；
5)当检测到气泡产生量不再增加时，停止变温并进行补料，补料后气泡继续增加，直到12天时产气量完全稳定，嗜冷产甲烷菌群富集完成。
进一步，步骤1)所述的驯化培养基的组分为：MgCl20.1～0.3g/L、NaCl3.0～5.0g/L、NH4Cl 1.0～2.0g/L、KH2PO44.0～5.0g/L、K2HPO44.0～5.0g/L、Giemsa原液4.5～6.0ml/L、半胱氨酸0.5～0.8g/L、酵母膏5.0～8.0g/L、无机盐溶液25～28ml/L、维生素液8～10ml/L、微量元素液7～9ml/L，pH在6.8～7.2的范围内。
所述的无机盐溶液的组分为：KH2PO47.5～8.0g/L、(NH4)2SO47.5～8.0g/L、K2HPO46.5～7.0g/L、NaCl 8.0～10.0g/L、MgSO47.0～9.0g/L、CaCl27.0～9.0g/L。
所述的维生素液组分为：谷氨酸0.015g/L、抗坏血酸0.02g/L、核黄酸0.025g/L、柠檬酸0.020g/L、叶酸0.01g/L、对氨基苯甲酸0.01g/L、肌酸0.025g/L。
所述的微量元素液组分为：MnSO40.01g/L、ZnSO40.05g/L、H3BO30.01g/L、CoCl20.008g/L、Na2MoO40.008g/L、NiCl20.006g/L、FeSO40.025g/L。
在步骤4)所述的变温驯化培养过程中，变温过程采用每天升温1.2℃的锯齿式变温方法，具体做法是：在1小时内持续性地升高0.2℃，到达升温数据后迅速降低0.1℃并恒温1小时，而后在1小时内持续性地升高0.2℃，到达升温数据后迅速降低0.1℃并恒温1小时，如此循环重复，直至温度升至15℃。
在步骤5)所述的停止变温并进行补料过程中，所述的补料组分为：色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和苏氨酸各为0.1g/L、葡萄糖0.5g/L、蛋白胨2.0g/L。
与现有嗜冷产甲烷菌的培养方法相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明在将驯化培养基填充到培养装置中并充氮脱氧以及高温灭菌后，除了加入2.5mol/L乙酸钠4mL、25％甲酸钠、50％(v/v)甲醇各3mL外，还加入了乙酸纤维素、壳聚糖、益生元各0.001g。根据研究表明，嗜冷菌在低温条件下大量分泌胞外脂肪酶、蛋白酶等，这些分泌酶对嗜冷菌的代谢活动提供必要的催化动力，而胞外酶由于缺乏最优的环境条件，导致其稳定性很低，本发明加入乙酸纤维素后，提高了胞外酶的稳定性，也在一定程度上提高了嗜冷酶的稳定性，这也就为嗜冷产甲烷菌提供了丰富的营养源和催化动力，加强了代谢活动，提高发酵效率；此外，壳聚糖和益生元均为微生物代谢活动的营养源，并且益生元还有加强微生物代谢的功能，也在很大程度上了保证了嗜冷产甲烷菌高效的代谢活动。
2、本发明在淤泥嗜冷产甲烷菌加入活化淀粉并静置，这一过程使得淤泥产甲烷菌和活化淀粉混合均匀，进而将嗜冷产甲烷菌均匀地分散于淤泥与活化淀粉混合物中，而嗜冷产甲烷菌在重新分散过程中由于运动而增强代谢活动，起到了活化菌种的作用，并且淀粉为丰富的碳源，可为产甲烷菌提供营养基础。
3、由于升温时会对嗜冷酶的活性和稳定性产生影响，也会造成休克反应的出现，本发明通过控温系统使得温度在小幅范围内先升后降，呈锯齿状变化升温，在温度升高的瞬间下降，这样不会影响嗜冷酶的稳定性和活性，还会对下次升温至这一温度点时起到预适应的作用，以保证下次升温至这一温度点不会出现不良反应，这样就保证了嗜冷酶活性和稳定性呈持续性的稳定提高，也避免了冷休克反应的出现。
4、由于原有培养基营养物质的消耗而造成一定的富集停止，本发明在升温到一定温度点时，及时进行补料以满足代谢需求，并且这次补料主要以嗜冷酶的重要组成物质为主，满足嗜冷酶的合成需求，进而保证了嗜冷产甲烷菌的高效、快速富集和增长。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，旨在帮助同领域技术人员的进一步理解。
实施例1
一种嗜冷产甲烷菌的驯化培养方法，控制温度锯齿式升降变化和恒温补料，克服嗜冷产甲烷菌在温度变化中的冷休克反应，具体步骤为：
1、配制驯化培养基，其原料组分及配比为：MgCl20.1～0.3g/L、NaCl 3.0～5.0g/L、NH4Cl 1.0～2.0g/L、KH2PO44.0～5.0g/L、K2HPO44.0～5.0g/L、Giemsa原液4.5～6.0ml/L、半胱氨酸0.5～0.8g/L、酵母膏5.0～8.0g/L、无机盐溶液25～28ml/L、维生素液8～10ml/L、微量元素液7～9ml/L，pH在6.8～7.2的范围内。
所述的无机盐溶液的组分为：KH2PO47.5～8.0g/L、(NH4)2SO47.5～8.0g/L、K2HPO46.5～7.0g/L、NaCl 8.0～10.0g/L、MgSO47.0～9.0g/L、CaCl27.0～9.0g/L。
所述的维生素液组分为：谷氨酸0.015g/L、抗坏血酸0.02g/L、核黄酸0.025g/L、柠檬酸0.020g/L、叶酸0.01g/L、对氨基苯甲酸0.01g/L、肌酸0.025g/L。
所述的微量元素液组分为：MnSO40.01g/L、ZnSO40.05g/L、H3BO30.01g/L、CoCl20.008g/L、Na2MoO40.008g/L、NiCl20.006g/L、FeSO40.025g/L。
2、驯化培养方法：
1)制作驯化培养装置：向嗜冷产甲烷菌的培养装置(血清瓶)中填充步骤1所配制的驯化培养基，充氮去氧后高温灭菌30～60分钟，并加入2.5mol/L乙酸钠4mL、25％甲酸钠、50％(v/v)甲醇各3mL、乙酸纤维素、壳聚糖、益生元各0.001g，超声溶解，获得驯化培养装置；
2)取出淤泥菌种并打碎，加入活化淀粉1～5％，静置18～24小时，得活化淀粉-淤泥菌种，所述的活化淀粉的制备方法采用冯国涛公开的题为“活化淀粉的制备及其反应性能研究”所披露的方法；
3)将步骤2)所得活化淀粉-淤泥菌种接种到步骤1)的驯化培养装置中，在8℃的条件下进行培养，培养时间为4～5天，所述的接种方法是通过无菌注射器按一定的接种比例接种到驯化培养装置中的；
4)检测有气泡产生时，通过控温系统改变温度，进行变温驯化培养，随着温度变化，气泡产量持续上升，变温过程采用每天升温1.2℃的锯齿式变温方法，具体做法是：在1小时内持续性地升高0.2℃，到达升温数据后迅速降低0.1℃并恒温1小时，而后在1小时内持续性地升高0.2℃，到达升温数据后迅速降低0.1℃并恒温1小时，如此循环重复，直至温度升至15℃；
5)当检测到气泡产生量不再增加时，停止变温并进行补料，补料后气泡继续增加，直到12天时产气量完全稳定，嗜冷产甲烷菌群富集完成，所述的补料组分为：色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和苏氨酸各为0.1g/L、葡萄糖0.5g/L、蛋白胨2.0g/L。
3、菌落富集：在产气量平稳后，继续集气15天左右，集气方法一般采用排水法，然后将上述步骤中的接种有嗜冷产甲烷菌的培养液接种到相同的培养基中，采用同样的方法富集下一代。
为了与现有技术形成对比，本发明也富集5代。
结果分析：
第一代发酵4天即有气泡产生，但气泡形成非常缓慢，几乎无法测量，以后每天的气泡形成逐渐加快，7天时气泡量形成明显增加，此时将收集的气体通过气相色谱检测，甲烷含量为10％。
从补料结束到12天第一代富集结束，将收集的气体通过气相色谱检测，甲烷含量为38％.
从第二代开始，3天时即有大量气泡产生，5天时即可认为富集结束，检测甲烷含量为40％左右。
通过上述结果可知，采用本发明的驯化培养方法，明显加快了富集速度，而且提高了甲烷产量。

Claims (1)

1.一种嗜冷产甲烷菌的驯化培养方法，控制温度锯齿式升降变化和恒温补料，克服嗜冷产甲烷菌在温度变化中的冷休克反应，其特征在于,具体步骤为：
1)向嗜冷产甲烷菌的培养装置中填充驯化培养基，充氮去氧后高温灭菌30～60分钟，并加入2.5mol/L乙酸钠4mL、25％甲酸钠、50％(v/v)甲醇各3mL、乙酸纤维素、壳聚糖、益生元各0.001g，获得驯化培养装置；所述的驯化培养基的组分为：MgCl20.1～0.3g/L、NaCl3.0～5.0g/L、NH4Cl 1.0～2.0g/L、KH2PO4 4.0～5.0g/L、K2HPO4 4.0～5.0g/L、Giemsa原液4.5～6.0ml/L、半胱氨酸0.5～0.8g/L、酵母膏5.0～8.0g/L、无机盐溶液25～28ml/L、维生素液8～10ml/L、微量元素液7～9ml/L，pH在6.8～7.2的范围内；所述的无机盐溶液的组分为：KH2PO4 7.5～8.0g/L、(NH4)2SO4 7.5～8.0g/L、K2HPO4 6.5～7.0g/L、NaCl 8.0～10.0g/L、MgSO4 7.0～9.0g/L、CaCl2 7.0～9.0g/L；
2)取出淤泥菌种并打碎，加入活化淀粉1～5％，静置18～24小时，得活化淀粉-淤泥菌种；
3)将步骤2)所得活化淀粉-淤泥菌种接种到步骤1)的驯化培养装置中，在8℃的条件下进行培养，培养时间为4～5天；
4)检测有气泡产生时，通过控温系统改变温度，进行变温驯化培养，随着温度变化，气泡产量持续上升；所述的变温驯化培养过程中，变温过程采用锯齿式变温方法；所述的锯齿式变温方法是每天升温1.2℃,具体做法是在1小时内持续性地升高0.2℃，到达升温数据后迅速降低0.1℃并恒温1小时，而后在1小时内持续性地升高0.2℃，到达升温数据后迅速降低0.1℃并恒温1小时，如此循环重复，直至温度升至15℃；
5)当检测到气泡产生量不再增加时，停止变温并进行补料，补料后气泡继续增加，直到12天时产气量完全稳定，嗜冷产甲烷菌群富集完成；所述补料的组分为：色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和苏氨酸各为0.1g/L、葡萄糖0.5g/L、蛋白胨2.0g/L。
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