CN102520184A - 检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，包括如下步骤：(1)细胞内蛋白质的测定：①细胞收集及淬灭；②提取细胞内蛋白；③蛋白浓度测定；④沉淀蛋白；⑤蛋白还原以及酶解；⑥蛋白标记；⑦溶液混合；⑧差异表达蛋白鉴定；(2)主成分分析；(3)过程分析。利用本发明的方法可以从揭示氧化葡糖杆菌受谷胱甘肽作用后细胞内蛋白变化规律，找到发酵过程中的重要蛋白，这些蛋白含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，对氧化葡糖杆菌进行分子改造提供理论基础。同时也为工业混菌发酵过程的研究提供新的思路和方法。

Description

检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及一种检测谷胱甘肽促进氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中细胞内蛋白质变化的方法。

背景技术

蛋白质是构成细胞的重要组成部分，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明细胞在不同生长条件下的变化机制。一方面可以对其上游的基因组学信息进行验证，提供后续基因改造的依据，另一方面又可以对其下游的代谢物研究提供指导。蛋白组学的发展，主要依托高效的蛋白分离和鉴定技术，主要有二维凝胶电泳和液相色谱分离两种分离方法，其中，液相色谱分离然后经质谱鉴定蛋白质，具有高度自动化，高分辨率的优势，是目前蛋白组学发展的主流。基于液相色谱分离，Q-TOF鉴定蛋白技术的使用，可以从整体水平上检测细胞在发酵过程中各种结构蛋白以及功能蛋白的变化水平。

氧化葡糖杆菌被用于维生素C的工业发酵，此发酵是氧化葡糖杆菌与巨大芽孢杆菌共同作用完成的，然而氧化葡糖杆菌单独发酵，生长缓慢，产量较低。添加谷胱甘肽后，菌体生长及2-酮-L-古龙酸产量显著提高，其作用机理尚不明确，对以后对氧化葡糖杆菌进行分子改造尚不能提供有利信息。

发明内容

本发明的目的是通过高通量的蛋白组学的手段来了解添加谷胱甘肽进行氧化葡糖杆菌发酵过程中的蛋白质变化规律，进一步揭示谷胱甘肽促进氧化葡糖杆菌生长及2-酮-L-古龙酸生产的作用机制，为对氧化葡糖杆菌进行分子生物学改造提供有利信息，从而提高其生长及生产能力，提供一种检测谷胱甘肽提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中细胞内蛋白质变化的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，包括如下步骤：

(1) 细胞内蛋白质的测定：

①细胞收集及淬灭：

取3-5份氧化葡糖杆菌以8％～16％的体积比分别接种到发酵培养基A中，另取3-5份所述氧化葡糖杆菌以8％～16％的体积比分别接种到发酵培养基B中，将两种接种后的培养基在28℃～32℃，转速为200～250rpm的条件下培养发酵，在发酵过程中选取1h、15h为取样点取出发酵液样品，在4℃下，以4000～6000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞，获得3-5份从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵15h收集淬灭的破碎细胞；

所述发酵培养基A为：80g·L^-1山梨糖，20g·L^-1玉米浆，1g·L^-1 KH₂PO₄，0.2g·L^-1MgSO₄，和12g·L^-1尿素，余量为水；

所述发酵培养基B为：80g·L^-1山梨糖，20g·L^-1玉米浆，1g·L^-1 KH₂PO₄，0.2g·L^-1MgSO₄，and 12g·L^-1尿素，0.8～1.5mg·mL^-1的谷胱甘肽，余量为水；

②提取细胞内蛋白：

取步骤①获得的破碎细胞，每份100～200mg分别置于离心管中，每管加入0.5～2ml细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20～50s；加入5～15μL的质量比为2～4∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10～30min；加入5～15μL 80～120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1～3h；15000rpm离心25～40min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为：8mol·L-1尿素，质量浓度为4％的(3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)，40mM的Tris，余量为水；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白

分别取包含50～150μg蛋白的步骤③获得的各个蛋白溶液，加入4～6倍体积的-20℃～-40℃的丙酮，沉淀12～20h；离心，弃上清，沉淀用-20℃～-40℃的体积浓度为70％-85％的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；

⑤蛋白还原以及酶解

向步骤④所得的各个干燥蛋白中，添加10～40μL 40～60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；

加入1～4μL三(2-羧乙基)膦，在50～60℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1～2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10～15min，终止还原反应；

向上述溶液中，加浓度为0.2～0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液20～30μL，37℃反应12～18小时，进行蛋白酶解；

⑥蛋白标记

在每个经步骤⑤酶解的蛋白酶解液中分别加入一管用60～80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；

⑦溶液混合

将步骤溶液⑥获得的溶液混合得3-5份混合液，使每个混合液中都包括从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白和从培养基B中发酵15h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白；于-20℃保存；

⑧差异表达蛋白鉴定

将⑦中得到的混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；

(2)主成分分析：

采用matlab对步骤(1)⑧中得到的数据进行标准化后，进行主成分分析，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(3)过程分析

将步骤(2)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现谷胱甘肽在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。

利用本发明的方法可以从揭示氧化葡糖杆菌受谷胱甘肽作用后细胞内蛋白变化规律，找到发酵过程中的重要蛋白，这些蛋白含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，对氧化葡糖杆菌进行分子改造提供理论基础。同时也为工业混菌发酵过程的研究提供新的思路和方法。

附图说明

图1为对四组样品蛋白(混合溶液)数据进行主成分分析：

A、得分图：“▲”表示来自培养基B 1h的样品/来自培养基A 1h的样品，“○”表示来自培养基A 15h的样品/来自培养基A 1h的样品，“■”表示来自培养基B 15h的样品/来自培养基A 1h的样品；

B、物质载荷图

图2为硫胺素转运蛋白及以其为辅酶的重要酶表达情况：GSH-1h/KV-1h，表示来自培养基B 1h的样品/来自培养基A 1h的样品；KV-15h/KV-1h，表示来自培养基A 15h的样品/来自培养基A 1h的样品，GSH-15h/KV-1h，表示来自培养基B 15h的样品/来自培养基A 1h的样品；

图3为三羧酸循环、磷酸戊糖途径中的关键酶表达情况：GSH-1h/KV-1h，表示来自培养基B 1h的样品/来自培养基A 1h的样品；KV-15h/KV-1h，表示来自培养基A 15h的样品/来自培养基A 1h的样品，GSH-15h/KV-1h，表示来自培养基B 15h的样品/来自培养基A 1h的样品；

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)细胞内蛋白质的测定：

①细胞收集及淬灭：

取3份氧化葡糖杆菌以8％的体积比分别接种到发酵培养基A中，另取3份所述氧化葡糖杆菌以8％的体积比分别接种到发酵培养基B中，将两种接种后的培养基在28℃，转速为200rpm条件下培养发酵，在发酵过程中选取1h、15h为取样点取出发酵液样品，在4℃下，以4000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得3份从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，3份从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞，3份从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，3份从培养基B中发酵15h收集淬灭的破碎细胞；

所述发酵培养基A为：80g·L^-1山梨糖，20g·L^-1玉米浆，1g·L^-1 KH₂PO₄，0.2g·L^-1MgSO₄，和12g·L^-1尿素，余量为水；

所述发酵培养基B为：80g·L^-1山梨糖，20g·L^-1玉米浆，1g·L^-1 KH₂PO₄，0.2g·L^-1MgSO₄，and 12g·L^-1尿素，0.8～1.5mg·mL^-1的谷胱甘肽，余量为水；

②提取细胞内蛋白：

取步骤①获得的破碎细胞，每份100mg分别置于离心管中，每管加入0.5ml细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20s；加入5μL的质量比为2∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10min；加入5μL 80mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1h；15000rpm离心25min；取上清，得到蛋白溶液。所述细胞裂解液为：8mol·L^-1尿素，质量浓度为4％的(3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)(CHAPS)，40mM的Tris，余量为水；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白

分别取包含50μg蛋白的步骤③获得的各个蛋白溶液，加入4倍体积的-20℃的丙酮，沉淀12h；离心，弃上清，沉淀用-20℃的体积浓度为70％的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；

⑤蛋白还原以及酶解

向步骤④中所得的各个干燥蛋白中，添加10μL 40mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；

加入1μL三(2-羧乙基)膦，在50℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10min，终止还原反应；

向上述溶液中，加浓度为0.2μg/μL的胰蛋白酶水溶液30μL，37℃反应12小时，进行蛋白酶解；

⑥蛋白标记

在每个经步骤⑤酶解的蛋白酶解液中分别加入一管用60～80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；

⑦溶液混合

将步骤溶液⑥获得的溶液混合得3份混合液，使每个混合液中都包括从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白和从培养基B中发酵15h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白；于-20℃保存；

⑧差异表达蛋白鉴定

将⑦中得到的混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；

(2)主成分分析：

采用matlab对步骤(1)⑧中得到的数据进行标准化后，进行主成分分析，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(3)过程分析

将步骤(2)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现谷胱甘肽在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。

添加谷胱甘肽后，氧化葡糖杆菌发酵过程中，胞内鉴定到的蛋白如表1所示。

表1  氧化葡糖杆菌胞内蛋白

如图1A所示，氧化葡糖杆菌在添加谷胱甘肽15h后，蛋白表达状况与空白对照有明显差异，通过对具体差异进行分析，得到一系列生物标志物，包括硫胺素焦磷酸/硫胺素转运蛋白(thiB)、硫胺素转运蛋白(TkoF)、寡肽转运蛋白(bacterial extracellular solute-binding protein，family 5)等。谷胱甘肽作为一种三肽，是微生物体内含量最高的硫醇类物质，可以通过寡肽转运途径进入细胞。谷胱甘肽氧化型与还原型谷胱甘肽的转化对于维持微生物的氧化还原状态有重要作用，此转化过程需要NADPH参与，磷酸戊糖途径的提高可以间接利于维持氧化葡糖杆菌的氧化还原平衡状态，使得其有较好的生长及产酸环境。硫胺素焦磷酸，是三羧酸循环中丙酮酸脱氢酶、酮戊二酸脱氢酶、磷酸戊糖途径中的转酮醇酶的重要辅酶，在中心碳代谢中发挥着重要作用。通过主成分分析，添加谷胱甘肽后，负责硫胺素转运的两个蛋白均发生较大程度上调，说明谷胱甘肽的添加，使得细胞转运硫胺素的能力提高。如图2所示，这两个硫胺素转运蛋白及丙酮酸脱氢酶、酮戊二酸脱氢酶、转酮醇酶的表达量均在添加谷胱甘肽15h后有明显提高。同时，通过对检测到的蛋白进行定量分析，发现添加谷胱甘肽15h后，氧化葡糖杆菌三羧酸循环、磷酸戊糖途径中的关键酶，表达量均有上调，如图3所示，可能与硫胺素焦磷酸转运增强有关。说明氧化葡糖杆菌可能存在硫胺素或硫胺素焦磷酸合成不足或者缺陷，这就为以后进行分子生物学改造，弥补这一缺陷，提供了依据。

综上所述，谷胱甘肽对氧化葡糖杆菌生长及2-酮-L-古龙酸生产有重要作用，结合相关蛋白变化、生长曲线及产酸情况，说明谷胱甘肽有利于促进氧化葡糖杆菌对硫胺素、硫胺素焦磷酸的转运，从而获得提高的三羧酸循环、磷酸戊糖途径，进一步获得还原力NADPH，为细胞调节胞内氧化还原状态提供能量。这一发现，为后续对氧化葡糖杆菌进行基因改造提供了依据，也为工业混菌过程研究及控制提供了基础。

实施例2

一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，包括如下步骤：

(1)细胞内的蛋白质进行测定：

①细胞收集及淬灭：

取4份氧化葡糖杆菌以10％的体积比分别接种到发酵培养基A中，另取4份所述氧化葡糖杆菌以10％的体积比分别接种到发酵培养基B中，将两种接种后的培养基在30℃，转速为220rpm条件下培养发酵，在发酵过程中选取1h、15h为取样点取出发酵液样品，在4℃下，以5000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.3的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得4份从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，4份从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞，4份从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，4份从培养基B中发酵15h收集淬灭的破碎细胞；发酵培养基A和发酵培养基B同实施例1；

②提取细胞内蛋白：

取步骤①获得的破碎细胞，每份150mg分别置于离心管中，每管加入1ml细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎40s；加入10μL的质量比为3∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应15min；加入12μL 100mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置2h；15000rpm离心30min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液同实施例1；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白

分别取包含100μg蛋白的步骤③获得的各个蛋白溶液，加入5倍体积的-30℃的丙酮，沉淀15h；离心，弃上清，沉淀用-30℃的体积浓度为80％的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；

⑤蛋白还原以及酶解

向步骤④所得的各个干燥蛋白中，添加20μL 50mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；

加入2μL三(2-羧乙基)膦，在55℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1.5μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应12min，终止还原反应；

向上述溶液中，加浓度为0.25μg/μL的胰蛋白酶水溶液25μL，37℃反应15小时，进行蛋白酶解；

⑥蛋白标记

在每个经步骤⑤酶解的蛋白酶解液中分别加入一管用70μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；

⑦溶液混合

将步骤溶液⑥获得的溶液混合得4份混合液，使每个混合液中都包括从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白和从培养基B中发酵15h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白；于-20℃保存；

⑧差异表达蛋白鉴定

将⑦中得到的混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；

(2)主成分分析：

采用matlab对步骤(1)⑧中得到的数据进行标准化后，进行主成分分析，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(3)过程分析

将步骤(2)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现谷胱甘肽在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。

通过实验证明，结果与实施例1相似。

实施例3

一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，包括如下步骤：

①细胞收集及淬灭：

取5份氧化葡糖杆菌以16％的体积比分别接种到发酵培养基A中，另取5份所述氧化葡糖杆菌以16％的体积比分别接种到发酵培养基B中，将两种接种后的培养基在32℃，转速为250rpm的条件下培养发酵，在发酵过程中选取1h、15h为取样点取出发酵液样品，在4℃下，以6000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞，获得5份从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，5份从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞，5份从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，5份从培养基B中发酵15h收集淬灭的破碎细胞；发酵培养基A和发酵培养基B同实施例1；

②提取细胞内蛋白：

取步骤①获得的破碎细胞，每份200mg分别置于离心管中，每管加入2ml细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎50s；加入15μL的质量比为4∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应30min；加入15μL 120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置3h；15000rpm离心40min；取上清，得到蛋白溶液；细胞裂解液同实施例1；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白

分别取包含150μg蛋白的步骤③获得的各个蛋白溶液，加入6倍体积的-40℃的丙酮，沉淀20h；离心，弃上清，沉淀用-40℃的体积浓度为85％的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；

⑤蛋白还原以及酶解

向步骤④所得的各个干燥蛋白中，添加40μL 60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；

加入4μL三(2-羧乙基)膦，在60℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应15min，终止还原反应；

向上述溶液中，加浓度为0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液30μL，37℃反应18小时，进行蛋白酶解；

⑥蛋白标记

在每个经步骤⑤酶解的蛋白酶解液中分别加入一管用80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；

⑦溶液混合

将步骤溶液⑥获得的溶液混合得5份混合液，使每个混合液中都包括从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白和从培养基B中发酵15h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白；于-20℃保存；

⑧差异表达蛋白鉴定

将⑦中得到的混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；

(2)主成分分析：

采用matlab对步骤(1)⑧中得到的数据进行标准化后，进行主成分分析，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(3)过程分析

将步骤(2)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现谷胱甘肽在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。

通过实验证明，结果与实施例1相似。

本发明所采用的菌株氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1.110只用于说明本发明，但并不用于限定本发明，实验证明，氧化葡糖杆菌的其它菌株也可以用于本发明。

Claims (1)

1.一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)细胞内蛋白质的测定：

①细胞收集及淬灭：

取3-5份氧化葡糖杆菌以8％～16％的体积比分别接种到发酵培养基A中，另取3-5份所述氧化葡糖杆菌以8％～16％的体积比分别接种到发酵培养基B中，将两种接种后的培养基在28℃～32℃，转速为200～250rpm的条件下培养发酵，在发酵过程中选取1h、15h为取样点取出发酵液样品，在4℃下，以4000～6000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞，获得3-5份从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵15h收集淬灭的破碎细胞；

所述发酵培养基A为：80g·L^-1山梨糖，20g·L^-1玉米浆，1g·L^-1 KH₂PO₄，0.2g·L^-1MgSO₄，和12g·L^-1尿素，余量为水；

所述发酵培养基B为：80g·L^-1山梨糖，20g·L^-1玉米浆，1g·L^-1 KH₂PO₄，0.2g·L^-1MgSO₄，and 12g·L^-1尿素，0.8～1.5mg·mL^-1的谷胱甘肽，余量为水；

②提取细胞内蛋白：

取步骤①获得的破碎细胞，每份100～200mg分别置于离心管中，每管加入0.5～2ml细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20～50s；加入5～15μL的质量比为2～4∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10～30min；加入5～15μL 80～120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1～3h；15000rpm离心25～40min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为：8mol·L^-1尿素，质量浓度为4％的(3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)，40mM的Tris，余量为水；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白

分别取包含50～150μg蛋白的步骤③获得的各个蛋白溶液，加入4～6倍体积的-20℃～-40℃的丙酮，沉淀12～20h；离心，弃上清，沉淀用-20℃～-40℃的体积浓度为70％-85％的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；

⑤蛋白还原以及酶解

向步骤④所得的各个干燥蛋白中，添加10～40μL 40～60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；

加入1～4μL三(2-羧乙基)膦，在50～60℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1～2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10～15min，终止还原反应；

向上述溶液中，加浓度为0.2～0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液20～30μL，37℃反应12～18小时，进行蛋白酶解；

⑥蛋白标记

在每个经步骤⑤酶解的蛋白酶解液中分别加入一管用60～80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；

⑦溶液混合

将步骤溶液⑥获得的溶液混合得3-5份混合液，使每个混合液中都包括从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白和从培养基B中发酵15 h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白；于-20℃保存；

⑧差异表达蛋白鉴定

将⑦中得到的混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；

(2)主成分分析：

采用matlab对步骤(1)⑧中得到的数据进行标准化后，进行主成分分析，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(3)过程分析

将步骤(2)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现谷胱甘肽在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。

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