CN103497895A - 一种维生素c混合菌的保藏方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种维生素C混合菌的保藏方法，该方法将大、小菌搭配培养的维生素C混合菌种之斜面，用体积浓度为50%的甘油制备成悬浮液，再封装于无菌冻存管中，置于-70±2℃温度下保存。采用本发明方法保藏的VC二步菌菌种，其菌种死亡率在1%以下，变异率为零，其菌种的特性和稳定性可保持五年以上，且需用时操作方法简单易行，活化后的二步菌发酵水平都基本保持在115-125mg/ml的水平，二步转化率在94%以上，生产得到了稳定，避免了因频繁传代带来的风险。

Description

一种维生素C混合菌的保藏方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种维生素C混合菌的保藏方法。

背景技术

维生素C（VitanunC，Vc）是人体营养必需的维生素，其不仅作为重要的医药产品用于治疗多种疾病，也广泛用于食品、饲料及化妆品中。随着维生素C应用范围的增加，市场需求量日益增大，使人们对VC生产技术不断地进行研究、改进。现行技术中维生素C的发酵生产通常采用的都是二步法，其中古龙酸的合成：采用巨大芽孢杆菌（俗称大菌，大菌为革兰氏阳性芽孢杆菌，可染噬菌体，较易分化，）和氧化葡萄糖酸杆菌（俗称小菌，小菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，菌体呈短杆，近呈球体）两者混合发酵，因为小菌适宜在中性条件下生长，可以氧化山梨糖成古龙酸，但小菌单独培养生长欠佳，且产酸甚微，需与大菌混合培养，其与小菌共同发酵有明显促进小菌产酸的作用，大菌为小菌的伴生菌，在整个发酵中小菌起到关键的作用，且需要掌握大小菌的合适比例。

原有古龙酸生产技术环节中，一般不进行常规的菌种保藏，其保藏方式是制备的种子液一部分进罐发酵生产，一部分经过分离制备成斜面，再制备种子液，制备的种子液一部分进罐生产，一部分经过分离制备成斜面，通过对产生菌采用反复循环、活化、传代的方式为生产提供种子液。由于频繁传代、活化，菌种很容易出现大小菌比例失调，产酸能力下降，甚至因为反复移种、传代极易造成大面积染菌现象，从而使生产的稳定性不能得到有效的控制和保障，因为发酵生产水平的波动，给后工序生产同时带来了技术难度，为产品的质量问题也埋下了隐患。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种维生素C混合菌的保藏方法，利用该方法可保证菌种的相对稳定性，防止因菌种质量的不稳定性给生产造成波动。

为实现上述发明目的所采取的技术方案为：

一种维生素C混合菌的保藏方法，其特征是：将大、小菌搭配培养的维生素C混合菌种之斜面，用体积浓度为50%的甘油制备成悬浮液，再封装于无菌冻存管中，置于-70±2℃温度下保存。

上述大、小菌搭配培养的过程为：

a.将经过摇瓶筛选，且生产性能优良的原始菌菌株的种子液分离于平板，涂布均匀，置29.5±1℃培养箱培养60～72小时；

b.在无菌条件下挑外观生长良好，半透明，分布均匀，无杂菌的小菌放入无菌水中，使小菌水呈乳白色，接种至茄形瓶斜面上，放入29.5±1℃恒温室培养22～24小时，观察无杂菌生长后，接入生长良好，大小适中，边缘齐整的大菌，在同等温度条件下继续培养46～50小时。

上述冷冻的菌体经过三代活化培养后用于大生产。

本发明将优质的菌株增殖培养，用甘油制成悬浮液后进行批量的冷冻保藏，保证每个周期的菌种质量都是一致的，且只使用一个生产周期，并且每个生产周期使用的菌种是独立包装保存的，生产过程不需常年依靠转种的方式保留菌种，有效防止染菌或种液质量退化现象，使发酵过程更趋于稳定，为提炼工序打下良好基础，产品质量得到保障。

采用本发明方法保藏的VC二步菌菌种，其菌种死亡率在1%以下，变异率为零，其菌种的特性和稳定性可保持五年以上，且需用时操作方法简单易行。

采用冻存管活化三代种液进罐生产以来，无论是从试验罐到大生产，二步菌发酵水平都基本保持在115-125mg/ml的水平，二步转化率在94%以上，生产得到了稳定，也避免了因频繁传代带来的风险。

按照此菌种保藏方法，经过近四年的保藏，维生素Ｃ混合菌菌种的性能丝毫未减，生产各项指数稳定，避免了反复传代带来的波动及染菌的风险对生产的影响。应用本发明的方法，既简化了操作工艺，又稳定了生产，且在种子制备环节，减少了人员操作，降低了人工成本。

具体实施方式

采用甘油保藏法制备的生产菌种使用流程：

生产菌株冻存管→活化一代→活化二代→活化三代→接种子罐进入生产阶段。

下述实施例中分离平板（平皿）培养基组成采用：山梨糖0.6、酵母膏0.3、牛肉膏0.3、蛋白胨1、MgSO₄0.1、琼脂1.8、PH值为60.-7.0。

斜面培养基组成采用：山梨糖0.6、酵母膏0.3、牛肉膏0.3、蛋白胨1、MgSO₄0.1、琼脂1.8、PH值为6.0-7.0。

种子培养基组成采用：山梨糖2.4、葡萄糖0.2、玉米浆0.5、尿素0.1、CaCO₃0.2、PH值为6.0-7.0。

实施例1：原始菌株冻存管的制备与保藏

1吸取出经过摇瓶筛选，且生产性能优良的原始菌菌株的种子液1ml放入9ml无菌水中，浓度为10^-1，再从10^-1中吸1ml，放入另一支9ml无菌水浓度为10^-2，以此类推，稀释到10^-8，再从10^-8中吸0.1ml放入分离平皿中，然后用三角扒涂布均匀，放入29.5±1℃恒温室培养60～72小时。

2斜面的制备：从生长好的分离平皿中，挑生长良好，半透明，分布均匀，无杂菌的小菌放入无菌水中，使小菌水呈乳白色，用接种环或接种棒接种至茄形瓶斜面上，瓶口包两层纱布，放入29.5±1℃恒温室培养22～24小时，观察无杂菌生长后，移至接种室，挑选生长良好，大小适中，边缘齐整的大菌，接大菌（如为试管，在其中心线上从下到上划一条线，每瓶接种一个独立的大菌），再放入恒温室培养46～50小时，备用。

3筛选：采用摇瓶试验对每只斜面的菌株进行各项指标的全面筛选，对生产性能好的保留，其余淘汰。

4原始菌株的保藏：上述留用试管斜面加入2ml质量浓度为50%（119-121℃、30分钟灭菌）的甘油，制备成均匀的悬浮液，封装于无菌的冻存管中，每支1ml，置于-70±2℃低温冰箱作为原始菌种进行保存。

实施例2：生产用菌种之冻存管的制备与保藏

1取原始菌株冻存管菌液0.5ml，接种于种子培养基（20ml）中，29.5±1℃摇床（转速200转/分钟）培养24小时。

2将上述培养好的种子液分离于平板，涂布均匀，在29.5±1℃下培养2-3天。

3从培养好的分离平皿中，挑选生长良好，半透明，分布均匀，无杂菌的小菌放入无菌水中，使小菌水呈乳白色，用接种环或接种棒接种至250ml茄形瓶斜面上，瓶口包两层纱布，放入29.5±1℃恒温室培养22～24小时，观察无杂菌生长后，将其再次转移至接种室内，在无菌条件下，挑选生长良好，大小适中，边缘齐整的大菌，在接有小菌的培养瓶中的培养基上均匀地接种三条竖线，再放入同等条件下的恒温室（29.5±1℃）培养46～50小时，备用。

4将上述大、小菌搭配合适，生长良好的斜面加入5ml的50%（119-121℃、30分钟灭菌）的甘油，制备成均匀的悬浮液，分装于无菌的冻存管中，每支0.5ml，置于-70±2℃低温冰箱保存。

实施例3：供生产用种子液的制备

1活化一代：取生产用菌种冻存管1支，用1ml吸管将冷冻液全部转入一装有20ml种子培养基的三角瓶中29.5±1℃，培养20-24小时，为一代种子液。

2活化二代：吸取5ml的一代种子液接种于另一种子培养基（20ml）三角瓶中，29.5±1℃，震荡培养20±4小时，即为二代种子液。

3活化三代：吸取5ml的二代种子液接种于另一种子培养基（20ml）的三角瓶中，29.5±1℃，震荡培养20±4小时。此时，检测产酸在5mg/ml以上且无杂菌时，即可供生产使用。

Claims (3)

1.一种维生素C混合菌的保藏方法，其特征是：将大、小菌搭配培养的维生素C混合菌种之斜面，用体积浓度为50%的甘油制备成悬浮液，再封装于无菌冻存管中，置于-70±2℃温度下保存。

2.按照权利要求1所述的维生素C混合菌的保藏方法，其特征在于上述大、小菌搭配培养的过程为：

a.将经过摇瓶筛选，且生产性能优良的原始菌菌株的种子液分离于平板，涂布均匀，置29.5±1℃培养箱培养48～72小时；

b.在无菌条件下挑外观生长良好，半透明，分布均匀，无杂菌的小菌放入无菌水中，使小菌水呈乳白色，接种至茄形瓶斜面上，放入29.5±1℃恒温室培养22～24小时，观察无杂菌生长后，接入生长良好，大小适中，边缘齐整的大菌，在同等温度条件下继续培养46～50小时。

3.按照权利要求1所述的维生素C混合菌的保藏方法，其特征是：冷冻的菌体经过三代活化培养后用于大生产。