CN110327455A - 一种环（l-酪氨酸-l-脯氨酸）在制备细菌群体感应系统抑制剂中的应用 - Google Patents
一种环（l-酪氨酸-l-脯氨酸）在制备细菌群体感应系统抑制剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种环(L‑酪氨酸‑L‑脯氨酸)在制备细菌群体感应系统抑制剂中的应用。本发明的目的在于提供一种新型的细菌QS抑制剂环(L‑酪氨酸‑L‑脯氨酸)，环(L‑酪氨酸‑L‑脯氨酸)在海洋真菌代谢产物中含量相对较高，可以大规模提取，也可以通过人工合成方式获得。因此，本发明具有分离方法简单、无耐药性，并适合大规模制备的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，一种环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)在制备细菌群体感应系统抑制剂中的应用。
背景技术
世界卫生组织(WHO)在2014年发表的报告书中指出，具有强力耐药性的“超级细菌”的发病感染正不断蔓延并呈逐年严重化的趋势，人类的生存受到巨大威胁，解决日益严重的细菌耐药性问题已成为全球关注的重大难题。因此，通过寻找新的作用靶点是生物医学领域开发新型抗菌药物的新战略。群体感应(Quorum sensing,QS)是细菌细胞之间进行通讯的系统，它能够调控细菌的生存与致病性，这引起了药学家的密切关注，已成为药学界研制新型抗菌药物的重要靶点。以细菌QS系统为目标进行筛选得到的抗菌药物，在不破坏细菌细胞生长的情况下，仅抑制细菌毒力因子、生物被膜的产生，从而使细菌的感染能力降低或丧失。由于对细菌没有生存压力，理论上不易诱导细菌耐药性突变。因此，以抑制QS系统为目的的药物研究能有效地治疗细菌感染，有望成为解决耐药细菌感染的新型策略。
海洋真菌独特的生活环境使其生物合成机制的复杂程度和代谢产物种类的多样性远超其他来源的细菌、真菌，从中发现结构新颖、有特殊生物活性的新型化合物的机率将远远高于普通微生物。环二肽类化合物是多产于海洋真菌代谢产物中的一类活性短肽类化合物。采用有机溶剂萃取法获得的产黄青霉代谢产物具有显著地抑制紫色杆菌QS系统的活性。经过详细研究其活性成分，发现，环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)能够强烈抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌的QS系统。目前尚未见该种化合物具有抑制细菌QS活性的报道，在市场上也尚未见到与此相关的药物。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)在制备细菌群体感应系统抑制剂中的应用，可用于治疗铜绿假单胞菌引起的感染。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)在抑制细菌群体感应系统活性中的应用。
其中，环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)的化学结构式如下：
进一步地，细菌为铜绿假单胞菌。
进一步地，细菌为铜绿假单胞菌PA01。
进一步地，环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)抑制细菌群体感应系统活性是通过以下方式实现的：
环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)与天然信号分子C6HSL处在受体蛋白3QP1的同一个活性口袋中，并竞争性结合受体蛋白的同一活性位点，使蛋白构像发生改变，进而阻断群体感应调控的致病行为。
进一步地，环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)与受体蛋白3QP1形成氢键的关键氨基酸为Ser155，Leu100，Tyr88，与Phe126，Met135，Trp111，Arg55，Ile99，Leu57，Leu56存在疏水作用，并且与Leu100及Tyr88形成的氢键改变了受体蛋白的活性构像，进而阻断了群体感应调控的与致病性相关的生理行为。
进一步地，环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)能抑制铜绿假单胞菌群体感应系统调控的毒力因子的合成；所述毒力因子为绿脓菌素、弹性蛋白酶、水解蛋白酶以及生物被膜。
进一步地，环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)还可抑制由铜绿假单胞菌群体感应系统调控的群集运动。
进一步地，环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)为人工合成物或天然海洋真菌代谢产物。
进一步地，天然海洋真菌为保藏编号为CCTCC NO：M 2018731的产黄青霉DXY-1(Penicillium chrysogenum DXY-1)。
一种用于治疗铜绿假单胞菌引起的感染的药物，包括上述的环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)，以及辅助成分，该辅助成分为药学上环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)可接受的成分。
本发明的有益效果为：
1、本发明中细菌QS抑制剂环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)能显著地降低由铜绿假单胞菌QS系统介导的绿脓菌素合成、群集运动及生物被膜形成，可用于治疗铜绿假单胞菌引起的感染。
2、本发明的目的在于提供一种新型的细菌QS抑制剂环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)，环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)在海洋真菌代谢产物中含量相对较高，可以大规模提取，也可以通过人工合成方式获得。因此，本发明具有分离方法简单、无耐药性，并适合大规模制备的优点。
附图说明
图1为不同浓度环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)对铜绿假单胞菌菌体、绿脓菌素、弹性蛋白酶及蛋白水解酶产量的影响；
图2为不同浓度环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响；
图3为环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)淬灭细菌QS的分子机制。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)的分离纯化及结构鉴定
1、提取发酵产物
将产黄青霉DXY-1(Penicillium chrysogenum DXY-1；其保藏编号为：CCTCC NO：M2018731；保藏时间为：2018年10月31日；保藏地址为：中国典型培养物保藏中心，该菌株已在专利号为201910398145.4的申请中公开)平板活化后，刮取适量菌丝接种于培养液中，28℃、150r/min震荡培养72h，得到种子培养液。然后将种子液以5％的接种量转接到装有400mL真菌5号培养基的1000mL锥形瓶中，同样条件震荡培养7d，得到发酵液。用匀浆机破碎发酵液中的菌丝球，再加入等体积的乙酸乙酯萃取，萃取三次，取上清液旋干得到提取物。
2、化合物的分离纯化
(1)用少量甲醇溶解粗提物，转移至旋蒸瓶中，加入少量100-200目的硅胶，晃匀后用旋转蒸发仪旋干样品中的甲醇。根据样品质量选择合适尺寸的层析柱，将层析柱垂直固定在铁架台上，向层析柱中加入适量300-400目的硅胶，边加入硅胶边轻微拍打柱身两侧使硅胶界面下降，然后再填入硅胶至合适高度，敲打两侧使硅胶表层均匀水平，最后将下面出口与真空泵相连，减压抽真空1h，使硅胶柱紧实，关闭真空泵。在硅胶柱上面加入拌好的样品，轻轻敲打使样品硅胶表面平整，再接上真空泵抽紧实。为避免洗脱液冲散样品硅胶，应在上层加一层棉花。
(2)用梯度洗脱法进行洗脱，洗脱剂分别为二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇混合液(体积比20:1、10:1、5:1、2:1、1:1)、甲醇。每个组分洗脱3～4次，每次一个柱体积。收集到的每个组分用旋转蒸发仪浓缩，并用毛细管吸取少量组分用薄层层析板展开，香草醛显色剂显色。
(3)根据TLC结果，将相似组分合并，并用紫色杆菌CV026筛选模型进行活性检测，余下样品旋干，称重保存。接下来，用高效液相将得到的活性组分进行纯度分析，并将含有化合物少的组分进行分离制备，用不同配比的甲醇-水为流动相对活性组分进行纯化，得到单体化合物。
3、化合物的结构鉴定
综合利用紫外和核磁共振技术对化合物进行结构鉴定。根据紫外吸收光谱可知，在275nm左右出现苯的特征吸收峰，因此该化合物结构可能含有苯环。在200nm左右出现酰胺键的特征吸收峰，因此该化合物可能含有酰胺基团。该化合物的氢谱中，在低场区给出2个活泼氢信号(δH 9.17，s，4’-OH；δH 7.85，s，8-NH)，芳香区给出4个苯环氢信号(δH 7.04，d，H-2’；δH 6.62，d，H-3’；δH 6.62，d，H-5’；δH 7.04，d，H-6’)，两两重叠，裂分为d峰，提示结构中含有一个1，4-二取代的苯环结构。在高场区给出4组脂肪氢信号(δH 2.92，2.00，1.71，1.40)，4组连杂原子的脂肪氢信号(δH 4.23，4.03，3.40，3.25)。特别是4.23(1H，t，J＝4.6Hz)、4.03(1H，t，J＝9.2Hz)两个氢信号为典型的环二肽类化合物的结构特征。该化合物的碳谱共给出14个碳原子，分别为两个酰胺碳信号(δC165.54；169.35)，6个苯环碳信号(δC127.51；131.25；115.22；156.34；115.22；131.25)，3个连杂原子的碳信号(δC44.99；58.84；56.46)以及3个饱和脂肪碳信号(δC22.30；28.28；35.16)。结合氢谱和碳谱数据推测该化合物为环二肽类化合物环(酪氨酸-脯氨酸)，分子式为C14H16N2O3。通过对比核磁数据，确定该化合物为环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)，结构如下图所示：
实施例2环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)抑制铜绿假单胞菌PA01毒力因子合成的分析
1、绿脓菌素产量检测
将铜绿假单胞菌PA01活化至对数期，稀释至OD600≈0.05，分装4组，3组为平行实验，每组加入不同浓度的化合物，空白对照为甲醇，阳性对照为0.2mg/mL的阿奇霉素，37℃，震荡培养12h。离心除去菌体，取5mL上清加入3mL氯仿抽提，氯仿相转入新离心管并加入1mL0.2mol/L的盐酸，充分混匀萃取后，离心收集上层水相，用酶标仪测波长520nm处的OD值，其结果见图1。
2、蛋白酶产量检测
过夜活化铜绿假单胞菌PA01，在液体LB培养基中接种1％PA01，并加入不同浓度环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)，加入甲醇的为空白对照，加入0.2mg/mL的阿奇霉素的为阳性对照，37℃、150r/min培养12h。取菌液离心，将上清用0.22μm尼龙膜过滤，取100μL上清加入400μL含0.8％偶氮酪蛋白的50mmol/L K2HPO4(pH7.0)溶液，混匀后30℃培养3h。然后加入1.5mol/L HCl并置于冰上反应10min，离心后，上清加入0.5mol/L NaOH；再离心后，取上清在440nm处测吸光度，其结果见图1。
3、弹性蛋白酶产量测定
过夜活化铜绿假单胞菌PA01，在液体LB培养基中接种1％PA01，并加入不同浓度环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)，加入甲醇为空白对照，加入0.2mg/mL的阿奇霉素为阳性对照，37℃、150r/min培养12h。取菌液离心，将上清用0.22μm尼龙膜过滤，取100μL上清加入10mg弹性蛋白-刚果红和900μL Na2HPO4(pH7.0)，混匀后37℃震荡培养2h。10000r/min离心10min，取上清在495nm处测吸光度，其结果见图1，图1中每组检测包括四条柱状图，每组柱状图从左至右分别表示图中记载的Absorbance at 600nm(％)、Pyocyanin(％)、Elastase activity(％)、Proteolytic activity(％)。
由图1可知在浓度低于0.5mg/mL范围内，环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)对菌体的生长影响不大，而阳性对照阿奇霉素(AZM)有明显的抑菌作用。
在不抑制菌体生长的浓度范围内，以甲醇为空白对照，随着环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)的浓度增大，弹性蛋白酶产量降低，环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)浓度为0.1-0.5mg/mL时，PA01弹性蛋白酶产量分别降低5.19％、21.35％、24.34％、29.18％和38.98％，同时蛋白水解酶产量也逐渐降低。
环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)浓度为0.5mg/mL时，PA01蛋白水解酶产量降低12.52％。阿奇霉素虽然对PA01的毒力因子抑制效果特别明显，但它作为抗生素对细菌的生长也有明显的抑制作用，阿奇霉素的浓度仅为0.2mg/mL时，以甲醇为空白对照，它对菌体的抑制率可达42.38％。
实施例3环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成的分析
生物被膜的SEM成像：过夜活化铜绿假单胞菌PA01，在液体LB培养基中接种1％PA01，在六孔板中放入无菌玻片并加入3mL菌液，分别加入环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)、阳性对照0.2mg/mL的阿奇霉素和空白对照甲醇，37℃静置培养48h。吸走菌液，用无菌的PBS清洗玻片，在室温下用2.5％的戊二醛固定24h，然后用PBS洗三次除去多余的戊二醛。用梯度浓度(50％、70％、80％、90％)的乙醇脱水15分钟，最后用100％的乙醇脱水三次，每次10min。喷金观察，其结果见图2。
图2中CK为空白对照甲醇处理的PA01生物被膜，表面致密、细胞完整呈短棒状，包裹在膜内；
图2中AZM为阳性对照阿奇霉素处理的PA01生物被膜，可以看出细胞被阿奇霉素破坏，呈现颗粒状；
图2中cyclo(L-Tyr-L-Pro)为0.5mg/mL环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)处理的生物被膜，与对照相比，生物被膜被破坏不再完整，细菌裸露在外面，说明环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)能有效抑制PA01生物被膜的形成，同时细菌形态完整，为正常的短棒状，说明环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)对细胞没有破坏性，也就是说该短肽化合物不影响细菌的正常生长，只抑制细菌的群体感应系统。
实施例4环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)淬灭细菌QS的分子机制分析
分子模拟：以天然配体C6HSL和受体蛋白CviR的结合为模板，使用分子对接软件Autodock进行分子对接(molecular docking)，分子动力学软件gramacs模拟QSI与受体蛋白3QP1的结合，确定结合位点及关键氨基酸位点。
模拟分析结果：如图3所示，环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)与信号分子C6HSL处在同一个活性口袋里，且结合能量略小于信号分子，说明该二肽化合物更容易与受体蛋白结合。同时氢键作用和疏水作用是主要的作用力。
环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)与3QP1形成氢键的关键氨基酸为Ser155，Leu100，Tyr88，疏水作用力Phe126，Met135，Trp111，Arg55，Ile99，Leu57，Leu56。同时Leu100及Tyr88形成的氢键能够改变3QP1的活性构像，进而阻断了群体感应调控的与致病性相关的生理行为。
Claims (8)
1.一种环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)在抑制细菌群体感应系统活性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细菌为铜绿假单胞菌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)能抑制铜绿假单胞菌群体感应系统调控的毒力因子的合成；所述毒力因子为绿脓菌素、弹性蛋白酶、水解蛋白酶以及生物被膜。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)能抑制铜绿假单胞菌群体感应系统调控的群集运动。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)抑制细菌群体感应系统活性是通过以下方式实现的：
所述环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)与天然信号分子C6HSL处在受体蛋白3QP1的同一个活性口袋中，并竞争性结合受体蛋白的同一活性位点，使蛋白构像发生改变，进而阻断群体感应调控的致病行为。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)为人工合成物或天然海洋真菌代谢产物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述天然海洋真菌为保藏编号为CCTCCNO：M 2018731的产黄青霉DXY-1。
8.一种用于治疗铜绿假单胞菌引起的感染的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)，以及辅助成分；所述辅助成分为环(L-酪氨酸-L-脯氨酸)在药学上可接受的成分。
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