CN112042648B

CN112042648B - 肉桂酸甲酯作为群体感应抑制剂及其在治疗细菌病害中的应用

Info

Publication number: CN112042648B
Application number: CN202010776777.2A
Authority: CN
Inventors: 崔紫宁; 邵将; 贺露露; 古景文; 高冬倪
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-08-05
Filing date: 2020-08-05
Publication date: 2022-01-25
Anticipated expiration: 2040-08-05
Also published as: CN112042648A

Abstract

本发明公开了肉桂酸甲酯或其药学上可接受的盐作为群体感应抑制剂在治疗细菌病害中的应用。所述肉桂酸甲酯对于铜绿假单胞菌PAO1和胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种S1的群体感应系统相关致病性表型具有强烈的抑制作用，同时还不影响上述两种病原菌的正常生长，即所述化合物在不影响病原菌生长的同时，能够强烈的抑制病原菌群体感应系统，显著性地降低病原菌的致病性，达到了预防和/或治疗病原菌引发的病害；所述化合物可作为病原菌群体感应系统抑制剂，或制备成为相关药物，用于预防和/或治疗细菌病害，同时还具有降低和延缓病原菌对所述化合物抗药性的产生，在病害的预防和/或治疗方面具有较长的有效使用期限，应用前景广阔。

Description

肉桂酸甲酯作为群体感应抑制剂及其在治疗细菌病害中的应用

技术领域

本发明涉及细菌病害防治技术领域，更具体地，涉及肉桂酸甲酯作为群体感应抑制剂及其在治疗细菌病害中的应用。

背景技术

铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)属于革兰氏阴性菌，普遍存在于各种环境中，包括水、空气、土壤、植物和动物中，正常人的皮肤、肠道和呼吸道也有该菌的存在。铜绿假单胞菌侵染寄主后，会释放多种毒力因子，包括胞外酶、绿脓菌素、弹性蛋白酶和溶血素等，从而引起宿主复杂的病理变化。铜绿假单胞菌通过QS系统协调一些与致病相关的重要功能，包括形成生物膜、调节免疫反应、群集运动、胞外多糖和毒素的产生。群体感应调控铜绿假单胞菌30％左右的致病基因表达。目前已知铜绿假单胞菌有4个群体感应系统，包括AHLs类信号介导的las系统和rhl系统，喹诺酮类(PQS)信号介导的pqs系统，以及最近发现的以2-(2-羟基苯基)-噻唑基-4-甲醛(Integrated Quorum Sensing Signal，IQS)为信号分子的iqs系统。目前铜绿假单胞菌对多种抗生素均表现出一定的抗药性，因此开发铜绿假单胞菌QS系统抑制剂是一种可有效改善其抗药性，并能有效防治其引发感染的途径。

胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorumssp.carotovorum，Pcc)是革兰氏阴性菌，属于γ-变形菌纲。Pcc可以产生水解酶、植物毒素和碳青霉烯抗生素等一系列致病因子并且分泌到细胞外，在许多园艺作物上引起软腐病，在田间和储存条件下都可能造成严重经济损失。Pcc在侵染与致病过程中会产生一系列的致病因子，其主要致病决定因子是植物细胞壁降解酶(plant cell-wall-degradingenzymes，PCWDEs)。另外一些次级代谢产物(植物毒素和脂多糖)、胞外多糖等也都是Pcc的致病因素。致病因子在病原体内的表达通常受到一系列调节系统的调控，例如群体感应系统和双组份系统等。

传统抗生素通常以细菌生存的关键因素为靶标，导致细菌抗药性的产生越来越普遍和严重，已经严重威胁到人类健康和作物产量。病原细菌利用群体感应(Quorumsensing，QS)系统调控致病性，包括病原菌毒力因子的产生和生物被膜的形成等。因此，群体感应系统可以作为细菌病害防治的新靶点，群体感应抑制剂(Quorum sensing inhibitors，QSIs)作用于细菌的QS系统，在不杀死病原菌的前提下抑制毒力因子的表达，不仅可以缓解甚至防止病原菌产生抗药性，同时还能够有效的控制病原菌引发的感染和/或疾病。因此，以细菌的群体感应系统为靶标，在不影响细菌生长的条件下筛选出有效的群体感应抑制剂(QSIs)，降低毒力因子的产生，可以有效地避免细菌抗药性的产生，为抗菌药物研发提供新思路和新途径。从天然产物中筛选群体感应抑制剂，一方面能够有效的控制细菌引起的病害，另一方面对于环境友好，具有极大应用前景。但是目前有效的群体感应系统抑制剂研究较少，且作用效果有待于提升。例如CN201910684718.X公开了一类化合物在制备细菌群体感应系统抑制剂中的应用，但是其抑制作用还有极大的提升空间。因此有待于提供更多群体感应系统抑制剂的研究。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中缺乏较为有效的QS系统抑制剂的缺陷，提供肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐在预防和/或治疗细菌病害中的应用。本发明所述肉桂酸甲酯在不影响病原菌生长的同时，能够强烈的抑制病原菌的群体感应系统，从而显著地降低病原菌的致病性，即在不影响病原菌生长的同时，达到了治疗病原菌引发病害的效果。因此，所述化合物可以作为病原细菌群体感应系统抑制剂，或制备成为相关细菌病害的药物，用于预防和/或治疗细菌病害，同时还具有降低和延缓病原菌对所述化合物抗药性产生的作用，在细菌病害的预防和/或治疗方面具有较长的有效使用期限，应用前景广阔。

本发明的另一目的在于提供所述肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗细菌病害药物中的应用。

本发明的再一目的在于提供所述肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐作为病原细菌群体感应系统抑制剂的应用。

本发明的还一目的在于提供一种病原细菌群体系统感应系统抑制剂。

本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：

肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐在预防和/或治疗细菌病害中的应用。

本发明还保护肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗细菌病害药物中的应用。

本发明同时还保护肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐作为病原细菌群体感应系统抑制剂的应用。

优选地，所述肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐抑制病原细菌致病因子和/或毒力因子的产生。

优选地，所述肉桂酸甲酯化合物及其药学上可接受的盐抑制病原细菌的群集运动。

优选地，所述病原菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和/或胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)。

优选地，所述肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐抑制铜绿假单胞菌的绿脓菌素和总蛋白酶的产量、群集运动；所述肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐抑制胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的游动性以及植物细胞壁降解酶活性。

优选地，所述肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐抑制根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒接合转移效率。

一种病原细菌群体感应系统抑制剂，包含有肉桂酸甲酯或其药学上可接受的盐，也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述抑制剂的剂型可为粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、水分散粒剂、悬浮剂、乳油、微乳剂或水剂。本发明所述苯并噻唑化合物或其药学上可接受的盐或由其制备的药物还可以与其他多种药物混合使用。

优选地，所述肉桂酸甲酯或其药学上可接受的盐或由其制备的药物与一种或多种其他植物杀菌剂或植物生长调节剂的混合使用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述肉桂酸甲酯对于铜绿假单胞菌PAO1和胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种S1的群体感应系统相关致病性表型具有强烈的抑制作用，同时还不影响上述两种病原菌的正常生长，即所述化合物在不影响病原菌生长的同时，能够强烈的抑制病原菌群体感应系统，显著性地降低病原菌的致病性，即在不影响病原菌生长的同时，达到了预防和/或治疗病原菌引发的病害；所述化合物可作为病原菌群体感应系统抑制剂，或制备成为相关病害的药物，用于预防和/或治疗细菌病害，同时还具有降低和延缓病原菌对所述化合物抗药性产生的作用，在病害的预防和/或治疗方面具有较长的有效使用期限，应用前景广阔。

附图说明

图1为96孔细胞培养板高通量筛选图。

图2为肉桂酸甲酯抑制剂对β-内酰胺酶活性的影响。

图3为化合物肉桂酸甲酯对C.violaceum CV026产紫色色素定量测试。

图4种化合物肉桂酸甲酯对Ti质粒接合转移效率的影响。

图5为QSIs肉桂酸甲酯P.aeruginosa PAO1毒力因子的影响。

图6为QSIs肉桂酸甲酯对P.aeruginosa群体感应系统下游基因表达的影响。

图7为QSIs肉桂酸甲酯对PccS1的运动能力(swimming motility)的影响。

图8为QSIs肉桂酸甲酯对PccS1群体感应系统下游基因表达的影响。

图9为肉桂酸甲酯群体感应活性复筛图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

QS信号报告菌根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)N5(pBA7P)自身不合成N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones，AHLs)信号，但可感应外源AHL信号诱导表达β-内酰胺酶，水解头孢硝噻吩(Nitrocefin)显色。可利用该显色报告系统筛选细菌群体感应抑制剂。

指示菌株C.violaceum CV026是紫色色杆菌31532的Cvil基因缺失突变体，自身不能产生信号分子C6-HSL。但是加入外源信号分子后会诱导CV026产生紫色色素。当筛选样品为QSIs时，QSIs会阻断CV026的群体感应通路，进而抑制其紫色色素的产生，所以可根据这一颜色变化可以筛选群体感应抑制剂。

以下实施例为测试化合物对根癌土壤杆菌N5(pBA7P)和紫色色杆菌Cvil基因缺失突变体CV026的抑制作用。待测化合物用DMSO溶解，首先以200μg/mL的单一浓度对所有化合物进行群体感应抑制的筛选研究，对获得的具有群体感应抑制活性的化合物再对待测菌株的最小抑菌浓度(MIC)进行测定，进一步的QSI活性研究选择MIC以下浓度进行。

以下实施例为测试化合物对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum ssp.carotovorum，Pcc)群体感应的抑制作用，待测化合物用DMSO溶解，实验以DMSO作为溶剂对照。

实施例1群体感应抑制剂的筛选

方法：取保存的A.tumefaciens N5(pBA7P)菌液千分之一接入液体ABM培养基(100mL)中，28℃摇床培养；约16h后至OD₆₀₀＝0.4左右，用排枪分装至96孔细胞培养板里，每孔196μL；加入4μL 10mg/mL的待测化合物至终浓度为200μg/mL，每在微孔板振荡器上混匀，28℃摇床培养2h；向96孔板里加入10μL浓度为5μM的信号分子3OC6-HSL，在微孔板振荡器上混匀，28℃摇培2h；将硝噻吩用pH＝7.0的0.2M磷酸缓冲液稀释至250μg/mL，取10μL加至96孔细菌培养板中，1h内观察颜色变化，记录并拍照。见图1。

图1中标注的4-硝基吡啶-N-氧化物(4-nitropyridine-N-oxide，4-NPO)为阳性对照组、DMSO作为溶剂对照组，AHL^-表示未添加AHL信号分子的空白对照，其余未均为不同化合物的测试组。

根据β-内酰胺酶-硝噻吩显色反应，细胞培养板中的孔仍然保持黄色，表明孔中的化合物有群体感应抑制活性，使AHL信号分子不能诱导A.tumefaciens N5(pBA7P)产生β-内酰胺酶水解头孢硝噻吩。肉桂酸甲酯可能有群体感应抑制活性，选择这个化合物进行下一步的试验。

实施例2测试肉桂酸甲酯化合物对A.tumefaciens N5(pBA7P)的最低抑菌浓度(MIC)测定

为了排除化合物对A.tumefaciens N5(pBA7P)生长的影响，将筛选得到的化合物测定对A.tumefaciens N5(pBA7P)的MIC值。将过夜摇培的A.tumefaciens N5(pBA7P)千分之一接到LB液体培养基中，混匀；96孔细菌培养板用排枪每孔加入196μL上述混合液；加入4μL梯度稀释的化合物，使其浓度梯度为3.125、6.25、12.5、25、50、100和200μg/mL；等体积的DMSO作为对照，三个重复；28℃静置培养24h后观察结果。在肉眼可见范围内，明显抑制微生物增长，菌液未出现浑浊仍然澄清的最低药物浓度即MIC。

实验结果：肉桂酸甲酯对A.tumefaciens N5(pBA7P)的MIC>200μg/mL。

因此，选择化合物肉桂酸甲酯进行后续的试验研究。

实施例3化合物肉桂酸甲酯对β-内酰胺酶活性的影响以及复筛

为了排除肉桂酸甲酯为β-内酰胺酶抑制剂，对化合物肉桂酸甲酯进行β-内酰胺酶活性的测试。

取A.tumefaciens N5(pBA7P)菌液千分之一接入液体ABM培养基(100mL)中，28℃摇培；约16h后至OD₆₀₀＝0.4左右，用排枪分装至96孔细菌培养板里，每孔196μL；向96孔板里加入10μL浓度为5μM的信号分子3OC6-HSL，在微孔板振荡器上混匀，28℃摇培2h；加入4μL10000μg/mL的待测化合物至终浓度为200μg/mL，28℃摇培2h；将硝噻吩用pH＝7.0的0.2M磷酸缓冲液稀释至250μg/mL，取10μL加至96孔细菌培养板中；1h内观察颜色变化，酶标仪在490nm测定OD值。

化合物肉桂酸甲酯(TS030)对β-内酰胺酶活性的影响结果见图2。从图中可知，肉桂酸甲酯不抑制β-内酰胺酶活性。

为了对肉桂酸甲酯群体感应抑制活性进一步了解，进行了复筛，选取三个低于MIC的浓度梯浓度：25、50和100μg/mL。筛选方法同实例1。最后结果用酶标仪在490nm测定OD值。结果如图9所示，肉桂酸甲酯在25、50和100μg/mL浓度下均有群体感应抑制活性。

上述实施例1至3的结果表明，肉桂酸甲酯对β-内酰胺酶活性无明显抑制作用，同时对A.tumefaciens N5(pBA7P)的MIC都在200μg/mL及其以上，当化合物浓度均在100μg/mL以下时，化合物对于A.tumefaciens N5(pBA7P)没有抑菌作用，也不抑制β-内酰胺酶的活性，而实施例1中肉桂酸甲酯在100μg/mL浓度下(根据图9的结果可知)处理的A.tumefaciens N5(pBA7P)中并未出现显色反应，表明其能抑制AHL信号分子诱导A.tumefaciens N5(pBA7P)产生β-内酰胺酶水解头孢硝噻吩，有群体感应抑制活性。

实施例4紫色色素提取法定量检测肉桂酸甲酯的群体感应抑制(QSIs)活性

指示菌株C.violaceum CV026是紫色色杆菌31532的Cvil基因缺失突变体，自身不能产生信号分子C6-HSL。但是加入外源信号分子后会诱导CV026产生紫色色素。当筛选样品为QSIs时，会阻断CV026的群体感应通路，进而抑制其紫色色素的产生。

方法：接种紫色色杆菌CV026单菌落至LB试管28℃过夜摇培；将过夜摇培的CV026培养液OD600调至0.1，1:100稀释到5mL新鲜的LB培养基中，加入不同浓度的各待测化合物，使其浓度为25、50、75、100和200μg/mL，等体积的DMSO作为对照，加入标准信号分子C6-HSL，终浓度为1μM；28℃、150rpm培养16h，取1mL菌液于离心管中，12000rpm离心2min沉淀出紫色色素和细胞；弃掉上清，加入1mL DMSO强力涡旋溶解紫色色素，12000rpm离心2min沉淀菌体；取200μL上清液于96孔板中，酶标仪在585nm测定OD值；将菌体重新加入1mL无菌水悬浮起来，取200μL上清液于96孔板中，酶标仪在600nm测定OD值。

为了排除所使用浓度对CV026生长的影响，首先测定了肉桂酸甲酯对CV026的MIC，化合物的MIC在200ppm及其以上。实验均采用MIC以下浓度。如图3所示，肉桂酸甲酯(TS030)在所测定的最大浓度下，抑制率为35.5％，表明肉桂酸甲酯对CV026产生紫色色素有一定的抑制作用。

实施例5肉桂酸甲酯对Ti质粒接合转移的影响

A.Tumefaciens NT1可以引起植物肿瘤，其利用LuxR/LuxI类型的群体感应系统来调节其肿瘤诱导质粒的接合转移(Tumor-inducing,Ti)。该系统由转录激活因子TraR和酰基高丝氨酸内酯合酶TraI组成。TraR结合信号分子3-oxo-C8-HSL，激活负责Ti质粒偶联的三个操纵子的表达，该系统中的负调控因子TraM，在AHL信号水平低时能够结合TraR，降低Ti质粒的接合转移效率。

方法：实验中所用的供体菌是A.tumefaciens NT1，受体菌是A.tumefaciens N5。分别将受体菌和供体菌接于ABM液体培养基，28℃，170rpm摇培48h左右；取上述菌液5μL转接到新的5mL ABM培养基中，并在含有供体菌的培养基中加入待测的肉桂酸甲酯(终浓度250μM)，相同体积的DMSO作为对照，28℃，170rpm摇培；48h后，至菌浓度OD₆₀₀为1.0左右，将上述菌液梯度稀释至10^–7；取10μL稀释为10^–1浓度的受体菌接到含有卡那霉素和庆大霉素抗性的ABM平板上，待菌液晾干后，在对应的位置接种10μL稀释梯度为10^–1、10^–2、10^–3和10^–4浓度的供体菌；取梯度稀释好的供体菌和受体菌进行平板计数，每组三个重复；晾干后，28℃倒置培养。约48h后，选择菌落数合适的浓度进行平板计数。接合转移效率＝转化子数目/供体菌数目

首先，测定了肉桂醛甲酯对供体菌A.tumefaciens NT1的MIC值在500μM以上。如图4中所示，(A)为转化子在抗性平板上的计数；(B)菌浓度计数平板；(C)Ti质粒接合转移的效率。非抑菌浓度(250μM)条件下，肉桂酸甲酯显著的抑制了Ti质粒的接合转移，与空白对照组和溶剂对照组相比，抑制率为64.9％。

实施例6肉桂酸甲酯对P.aeruginosa PAO1毒力因子的影响

为了检测肉桂酸甲酯对铜绿假单胞菌PAO1群体感应系统的影响，检测了受rhl系统和pqs系统调控的绿脓菌素(pyocyanin)以及受las系统调控的总蛋白酶(protease)含量。绿脓菌素和总蛋白酶都是铜绿假单胞菌重要的毒力因子。首先测定了肉桂酸甲酯对铜绿假单胞菌的MIC，结果表明MIC大于2mM。以下试验均采用不影响菌生长的MIC以下浓度100μM。

绿脓菌素(pyocyanin)产量的测定

接种铜绿假单胞菌PAO1单菌落至LB培养基，37℃、150rpm过夜摇培；取5μL上述菌液千分之一稀释到装有5mL的King’s A培养基的试管中，同时加入肉桂酸甲酯，使其终浓度为100μM，等体积的DMSO作为对照，摇匀后放入摇床，37℃、150rpm培养14-16h，每组重复三次；取1mL上述菌液到2mL离心管中，10000g离心5min；取上清液至另一新的2mL离心管中，加入400μL三氯甲烷，充分振荡混匀，10000g离心2min；去掉水相，加入200μL 0.2N HCl，充分混匀，10000g离心2min；取出上层粉红色溶液，用酶标仪检测在520nm处的吸光值，并对数据进行统计学分析。

总蛋白酶(protease)产量的测定

接种铜绿假单胞菌PAO1单菌落至LB培养基，37℃、150rpm过夜摇培；取5μL上述菌液千分之一稀释到装有5mL的LB培养基的试管中，同时加入肉桂酸甲酯，使其终浓度为100μM，等体积的DMSO作为对照，摇匀后放入摇床，37℃、150rpm培养14-16h，每组重复三次；取1mL上述菌液到2mL离心管中，10000g离心2min，将上清用0.22μm滤膜过滤，除尽上清中的细菌；取100μL上清，加入200μL 1.3％w/v脱脂牛奶溶液(pH＝7.0的50mmol/L K₂HPO₄配制)，37℃反应2h，用酶标仪检测其在600nm处的吸光值，并对数据进行统计学分析。

结果表明(图5)：肉桂酸甲酯可以显著抑制绿脓菌素(pyocyanin)和总蛋白酶(protease)的活性。肉桂酸甲酯对绿脓菌素活性的抑制效果达到了36.2％，PAO1中总蛋白酶的抑制效果为35％。因此，肉桂酸甲酯对于铜绿假单胞菌的rhl系统、pqs系统和las系统表现出一定的抑制效果，进而抑制毒力因子的产生。

实施例7肉桂酸甲酯对P.aeruginosa PAO1群体感应系统下游基因表达的影响

为了进一步明确肉桂醛甲酯对铜绿假单胞菌PAO1群体感应系统抑制的机制，采用qRT-PCR检测其对PAO1群体感应系统相关基因表达的影响，lasA、lasB、lasI、lasR、pqsA、pqsR、rhlI及rhlR基因在铜绿假单胞菌QS系统中起着重要作用，其本身的表达也受到QS系统的调控。其中lasA编码LasA蛋白酶(LasAprotease)，lasB编码弹性蛋白酶(elastase)，成熟后的蛋白酶分泌到胞外，降解寄主细胞外基质，并且分解免疫分子，在铜绿假单胞菌的感染过程中起着很重要的作用；LasI/LasR系统调节参与急性感染发病机制的多种毒力因子的表达，包括外毒素A和碱性蛋白酶等，同时还影响鞭毛和菌毛的形成，进而影响铜绿假单胞菌的运动能力。rhl系统负责调控鼠李糖脂的表达，参与释放铜绿假单胞菌毒素蛋白进入宿主细胞的细胞质；pqs系统诱导产生鼠李糖脂和其他参与铜绿假单胞菌生物膜形成的分子。使用转录因子ropD作为内参基因量化这目的基因的相对表达量，处理组和对照组之间的表达倍数变化用2^-△△Ct方法来计算。

结果如图6所示，肉桂酸甲酯处理后造成lasA、pqsA和pqsR基因的表达显著下降，其中肉桂酸甲酯处理后pqsA与lasA基因的表达量分别下调了7倍和3倍。说明肉桂酸甲酯抑制群体感应相关基因的表达。

实施例8肉桂酸甲酯对PccS1植物细胞壁降解酶(PCWDEs)的测定

胡萝卜软腐果胶杆菌主要通过分泌植物细胞壁降解酶，包括果胶裂解酶(PeL)，多聚半乳糖醛酸酶(Peh)，纤维素酶(Cel)和蛋白酶(Prt)等，瓦解植物细胞壁，从中吸收营养进而侵染寄主植物造成植物发病。PccS1中产生PCWDEs需要QS信号分子3-oxo-C6-HSL的调控，其中CarI/CarR系统是其主要的QS系统，carI基因合成3-oxo-C6-HSL。我们利用由PccS1群体感应系统调控的PCWDEs作为指标，检测肉桂酸甲酯对PccS1群体感应系统的影响。首先测定了肉桂酸甲酯对PccS1的MIC值，化合物的MIC大于1mM。以下实验均采用不影响菌生长的MIC以下浓度。

表1 肉桂酸甲酯对细胞壁降解酶活性的测试

如表1所示，对PeL、Pch和Cel 3种酶的检测结果表明：肉桂酸甲酯对这三种酶均有一定的抑制作用。

实施例9肉桂酸甲酯对PccS1的运动能力(swimming motility)的影响

胡萝卜软腐果胶杆菌的周生鞭毛对于病原菌靠近和入侵宿主植物以及逃避有害环境有积极作用，AHL通过负调控rsmA进而影响Pcc的运动性。

方法：接种PccS1单菌落至LB培养基，28℃、170rpm过夜摇培；制备集群培养基50mL，待培养基冷却至50℃左右时，加入肉桂酸甲酯(终浓度为500μM)，轻轻混匀后迅速倒入3个无菌培养皿中，同体积的DMSO作为阴性对照，待平板冷凝后，取2μL上述菌液接种至琼脂板的中央，28℃培养8h后观察结果。

结果如图7所示，表明肉桂酸甲酯(500μM)对PccS1的游动性有明显抑制作用。

实施例10肉桂酸甲酯对PccS1群体感应系统下游基因表达的影响

为了进一步验证肉桂酸甲酯对PccS1群体感应的抑制活性，采用qRT-PCR实验来研究其对PccS1群体感应系统部分下游基因表达的影响。pel、celC、prtW、nip和carC基因在果胶杆菌中分别编码果胶裂解酶(Pel，果胶酶中最重要的酶)、纤维素酶(Cel)、蛋白酶(Prt)、坏死诱导蛋白(necrosis-inducing protein，Nip)和碳青霉烯类抗生素等致病相关因子。

结果如图8所示，在测试浓度为500μM时，肉桂酸甲酯可以抑制carC、nip、celC和prtW等基因的表达，其中对于carC基因的相对表达量下降了4倍，对于celC基因的相对表达量下降了7倍。

综上，上述实施例均说明本发明所述化合物肉桂酸甲酯对预防和/或治疗由病原细菌引发的病害起作用，表明肉桂酸甲酯对绿假单胞菌和胡萝卜软腐果胶杆菌的群体感应系统有抑制活性。肉桂酸甲酯可以用来抑制铜绿假单胞菌和胡萝卜软腐果胶杆菌的QS系统，降低其毒力因子的产生，同时降低病原菌抗药性的产生。从而延长了药物的使用期限。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐在预防和/或治疗细菌病害中的应用；所述引起细菌病害的病原菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)；所述应用体现在肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐抑制病原细菌致病因子和/或毒力因子的产生，制病原细菌的群集运动；抑制铜绿假单胞菌的绿脓菌素和总蛋白酶的产量、群集运动；抑制胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的游动性以及植物细胞壁降解酶活性。

2.肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗细菌病害药物中的应用；所述引起细菌病害的病原菌为铜绿假单胞菌和胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种；所述应用体现在肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐抑制病原细菌致病因子和/或毒力因子的产生；制病原细菌的群集运动；抑制铜绿假单胞菌的绿脓菌素和总蛋白酶的产量、群集运动；抑制胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的游动性以及植物细胞壁降解酶活性。

3.肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐作为病原细菌群体感应系统抑制剂的应用；所述引起细菌病害的病原菌为铜绿假单胞菌和胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种；所述应用体现在肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐抑制病原细菌致病因子和/或毒力因子的产生；制病原细菌的群集运动；抑制铜绿假单胞菌的绿脓菌素和总蛋白酶的产量、群集运动；抑制胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的游动性以及植物细胞壁降解酶活性。

4.根据权利要求1至3任一所述应用，其特征在于，所述肉桂酸甲酯及其药学上可接受的盐抑制根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒接合转移效率。