CN112043697B - 苯并噻唑化合物作为群体感应抑制剂在治疗细菌病害中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了苯并噻唑化合物作为群体感应抑制剂在治疗细菌病害中的应用，所述苯并噻唑化合物的结构如下所示，所述化合物对于铜绿假单胞菌PAO1和胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种S1的群体感应系统相关致病性表型具有强烈的抑制作用，同时还不影响上述两种病原菌的正常生长，即所述化合物在不影响病原菌生长的同时，能够强烈的抑制病原菌群体感应系统，显著性地降低病原菌的致病性，达到了预防和/或治疗病原菌引发的病害；所述化合物可作为病原菌群体感应系统抑制剂，或制备成为相关药物，用于预防和/或治疗细菌病害，同时还具有降低和延缓病原菌对所述化合物抗药性的产生，在病害的预防和/或治疗方面具有较长的有效使用期限，应用前景广阔。
Figure DDA0002618613650000011

Description

苯并噻唑化合物作为群体感应抑制剂在治疗细菌病害中的 应用
技术领域
本发明涉及细菌病害防治技术领域，更具体地，涉及苯并噻唑化合物作为群体感应抑制剂在治疗细菌病害中的应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)属于革兰氏阴性菌，普遍存在于各种环境中，包括水、空气、土壤、植物和动物中，正常人的皮肤、肠道和呼吸道也有该菌的存在。铜绿假单胞菌侵染寄主后，会释放多种毒力因子，包括胞外酶、绿脓菌素、弹性蛋白酶和溶血素等，从而引起宿主复杂的病理变化。铜绿假单胞菌通过QS系统协调一些与致病相关的重要功能，包括形成生物膜、调节免疫反应、群集运动、胞外多糖和毒素的产生。群体感应调控铜绿假单胞菌30％左右的致病基因表达。目前已知铜绿假单胞菌有4个群体感应系统，包括AHLs类信号介导的las系统和rhl系统，喹诺酮类(PQS)信号介导的pqs系统，以及最近发现的以2-(2-羟基苯基)-噻唑基-4-甲醛(Integrated Quorum Sensing Signal，IQS)为信号分子的iqs系统。目前铜绿假单胞菌对多种抗生素均表现出一定的抗药性，因此开发铜绿假单胞菌QS系统抑制剂是一种可有效改善其抗药性，并能有效防治其引发感染的途径。
胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorumssp.carotovorum，Pcc)是革兰氏阴性菌，属于γ-变形菌纲。Pcc可以产生水解酶、植物毒素和碳青霉烯抗生素等一系列致病因子并且分泌到细胞外，在许多园艺作物上引起软腐病，在田间和储存条件下都可能造成严重经济损失。Pcc在侵染与致病过程中会产生一系列的致病因子，其主要致病决定因子是植物细胞壁降解酶(plant cell-wall-degradingenzymes，PCWDEs)。另外一些次级代谢产物(植物毒素和脂多糖)、胞外多糖等也都是Pcc的致病因素。致病因子在病原体内的表达通常受到一系列调节系统的调控，例如群体感应系统和双组份系统等。
抗生素的广泛使用导致细菌耐药性的不断提高，已经严重威胁到人类健康和作物产量。病原细菌利用群体感应(Quorum sensing，QS)系统调控致病性，包括病原菌毒力因子的产生和生物被膜的形成等。因此，群体感应系统可以作为细菌病害防治的新靶点，群体感应抑制剂(Quorum sensing inhibitors，QSIs)作用于细菌的QS系统，在不杀死病原菌的前提下抑制毒力因子的表达，不仅可以缓解甚至防止病原菌产生抗药性，同时还能够有效的控制病原菌引发的感染和/或疾病；筛选群体感应系统抑制剂可为细菌病害防治提供新的手段和材料。但是目前有效的群体感应系统抑制剂研究较少，且作用效果有待于提升。例如CN201910684718.X公开了一类化合物在制备细菌群体感应系统抑制剂中的应用，但是其抑制作用还有极大的提升空间。因此有待于提供更多群体感应系统抑制剂的研究。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中缺乏较为有效的QS系统抑制剂的缺陷，提供苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐在预防和/或治疗细菌病害中的应用。本发明所述化合物在不影响病原菌生长的同时，能够强烈的抑制病原菌的群体感应系统，从而显著地降低病原菌的致病性，即在不影响病原菌生长的同时，达到了治疗病原菌引发病害的效果。因此，所述化合物可以作为病原细菌群体感应系统抑制剂，或制备成为相关细菌病害的药物，用于预防和/或治疗细菌病害，同时还具有降低和延缓病原菌对所述化合物抗药性产生的作用，在细菌病害的预防和/或治疗方面具有较长的有效使用期限，应用前景广阔。
本发明的另一目的在于提供所述苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗细菌病害药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供所述苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐作为病原细菌群体感应系统抑制剂的应用。
本发明的还一目的在于提供一种病原细菌群体系统感应系统抑制剂。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐在预防和/或治疗细菌病害中的应用，所述苯并噻唑化合物的结构如下所示：
Figure BDA0002618613630000021
本发明还保护苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗细菌病害药物中的应用，所述苯并噻唑化合物的结构如下所示：
Figure BDA0002618613630000031
本发明还保护苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐作为病原细菌群体感应系统抑制剂的应用，所述苯并噻唑化合物的结构如下所示：
Figure BDA0002618613630000032
优选地，所述苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐抑制病原细菌致病因子和/或毒力因子的产生。
优选地，所述苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐抑制病原细菌的群集运动。
优选地，所述病原菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和/或胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)。
优选地，所述苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐抑制铜绿假单胞菌的绿脓菌素和总蛋白酶的产量、群集运动；所述苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐抑制胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的游动性以及植物细胞壁降解酶活性。
优选地，所述苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐抑制根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒接合转移效率。
本发明同时还保护一种病原细菌群体感应系统抑制剂，包含有苯并噻唑或其药学上可接受的盐。
优选地，所述抑制剂还可以包含药学上可接受的载体和/或辅料。
优选地，所述抑制剂的剂型可为粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、水分散粒剂、悬浮剂、乳油、微乳剂或水剂。
本发明所述苯并噻唑化合物或其药学上可接受的盐或由其制备的药物还可以与其他多种药物混合使用。
优选地，所述苯并噻唑化合物或其药学上可接受的盐或由其制备的药物与一种或多种其他植物杀菌剂或植物生长调节剂的混合使用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述苯并噻唑化合物对于铜绿假单胞菌PAO1和胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种S1的群体感应系统相关致病性表型具有强烈的抑制作用，同时还不影响上述两种病原菌的正常生长，即所述化合物在不影响病原菌生长的同时，能够强烈的抑制病原菌群体感应系统，显著性地降低病原菌的致病性，即在不影响病原菌生长的同时，达到了预防和/或治疗病原菌引发的病害；所述化合物可作为病原菌群体感应系统抑制剂，或制备成为相关病害的药物，用于预防和/或治疗细菌病害，同时还具有降低和延缓病原菌对所述化合物抗药性产生的作用，在病害的预防和/或治疗方面具有较长的有效使用期限，应用前景广阔。
附图说明
图1为96孔板细胞培养板筛选QSIs。
图2为96孔细胞培养板复筛QSIs。
图3化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对β-内酰胺酶抑制活性的测定。
图4化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对C.violaceum CV026产紫色色素的影响。
图5化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对C.violaceum CV026产色素能力的定量检测。
图6化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对Ti质粒接合转移的影响。
图7化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对绿脓菌素和总蛋白酶活性的抑制。
图8化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对菌株PAO1群集运动的影响。
图9化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对P.aeruginosa PAO1群体感应系统下游基因表达的影响。
图10化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对PCWDEs活性定量测定。
图11化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对菌株PccS1运动能力的影响。
图12化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对菌株PccS1群体感应系统下游基因表达的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
QS信号报告菌根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)N5(pBA7P)自身不合成N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones，AHLs)信号，但可感应外源AHL信号诱导表达β-内酰胺酶，水解头孢硝噻吩(Nitrocefin)显色。可利用该显色报告系统筛选细菌群体感应抑制剂。
指示菌株C.violaceum CV026是紫色色杆菌31532的Cvil基因缺失突变体，自身不能产生信号分子C6-HSL。但是加入外源信号分子后会诱导CV026产生紫色色素。当筛选样品为QSIs时，QSIs会阻断CV026的群体感应通路，进而抑制其紫色色素的产生，所以可根据这一颜色变化可以筛选群体感应抑制剂。
以下实施例为测试化合物对根癌土壤杆菌N5(pBA7P)和紫色色杆菌Cvil基因缺失突变体CV026的抑制作用。待测化合物用DMSO溶解，首先以200μg/mL的单一浓度对所有化合物进行群体感应抑制的筛选研究，对获得的具有群体感应抑制活性的化合物再对待测菌株的最小抑菌浓度(MIC)进行测定，进一步的QSI活性研究选择MIC以下浓度进行。
以下实验采用的待测化合物为，2-氨基-5-溴苯并噻唑(TAO16123)、2-氨基-6-溴苯并噻唑(TAO16129)和2-(甲硫基)苯并噻唑(TAO16132)，其结构如下所述：
Figure BDA0002618613630000051
以下实施例中，化合物均以代号进行指代。
实施例1群体感应抑制剂的筛选
供试化合物由华南农业大学崔紫宁教授提供，共计900个，均为人工合成化合物，化合物编号为自主编号。肉桂酸甲酯、2-氨基-5-溴苯并噻唑、2-氨基-6-溴苯并噻唑和2-(甲硫基)苯并噻唑标准品购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，样品用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解并稀释至特定浓度，4℃冷藏备用。
取保存的A.tumefaciens N5(pBA7P)菌液千分之一接入液体ABM培养基(100mL)中，28℃摇培；约16h后至OD600＝0.4左右，用排枪分装至96孔细胞培养板里，每孔196μL；加入4μL 10000μg/mL的待测化合物至终浓度为200μg/mL，每块96孔板筛选88个化合物，剩余孔板作为溶剂对照和空白对照等，在微孔板振荡器上混匀，28℃摇培2h；向96孔板里加入10μL浓度为5μM的信号分子3OC6-HSL，在微孔板振荡器上混匀，28℃摇培2h；将硝噻吩用pH＝7.0的0.2M磷酸缓冲液稀释至250μg/mL，取10μL加至96孔细菌培养板中，1h内观察颜色变化，记录并拍照。
图1中标注的4-硝基吡啶-N-氧化物(4-nitropyridine-N-oxide，4-NPO)为阳性对照组、DMSO作为溶剂对照组，AHL-为未添加AHL信号(3OC6-HSL)，其余均为不同化合物的测试组。
根据β-内酰胺酶-硝噻吩显色反应，细胞培养板中的部分孔仍然保持黄色，表明孔中的化合物有群体感应抑制活性，使AHL信号分子不能诱导A.tumefaciens N5(pBA7P)产生β-内酰胺酶水解头孢硝噻吩，通过对900余个化合物在200μg/mL浓度的筛选，共筛选出69个可能具有群体感应抑制活性的化合物，具体结果见图1。
实施例2具有QSIs活性的69种化合物对A.tumefaciens N5(pBA7P)的最低抑菌浓度(MIC)测定
为了排除化合物对A.tumefaciens N5(pBA7P)生长的影响，将筛选得到的化合物测定对A.tumefaciens N5(pBA7P)的MIC值。
试验过程为：将过夜摇培的A.tumefaciens N5(pBA7P)千分之一接到LB液体培养基中，混匀；96孔细菌培养板用排枪每孔加入196μL上述混合液；加入4μL梯度稀释的化合物，使其浓度梯度为3.125、6.25、12.5、25、50、100和200μg/mL；等体积的DMSO作为对照，三个重复；28℃静置培养24h后观察结果。在肉眼可见范围内，明显抑制微生物增长，菌液未出现浑浊仍然澄清的最低药物浓度即MIC。
实验结果显示69个具有QSIs活性的化合物MIC都在100μg/mL及其以上，具体结果见表1。
表1 化合物对A.tumefaciens N5(pBA7P)的最小抑菌浓度(MIC)
Figure BDA0002618613630000061
实施例3初筛化合物的QSIs活性的复筛
对初筛得到的化合物进行复筛，筛选方法同实施例1。化合物所用浓度为25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL。最后结果用酶标仪在490nm测定OD值。
通过对初筛得到的69种QSIs进行复筛，选取三个低于MIC的浓度梯度：25、50和100μg/mL。随着化合物浓度升高溶液颜色逐渐与阳性对照4-NPO相同趋于黄褐色，并且测试浓度为25μg/mL时在490nm处的吸光值明显低于阴性对照，这些化合物可以作为潜在QSIs。编号分别为TAO16123、th16116、th16128、th16129、TAO16129、i-OA-Bn-6、TSO30、TAO16132、TAO16115(图2)。即3个苯丙噻唑化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132都可以作为潜在的QSIs。
实施例4测试化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对β-内酰胺酶活性的影响
本实验采用的筛选方法是通过AHL信号诱导β-内酰胺酶表达，水解头孢硝噻吩后的颜色变化来判断化合物是否具有群体感应抑制活性，如果某种化合物只是抑制了β-内酰胺酶的活性，而不是群体感应抑制剂，同样会导致溶液颜色保持黄色，造成假阳性。
试验过程为：为了排除筛选中存在β-内酰胺酶抑制剂，对筛选到的化合物进行对β-内酰胺酶活性的测试。取A.tumefaciens N5(pBA7P)菌液千分之一接入液体ABM培养基(100mL)中，28℃摇培；约16h后至OD600＝0.4左右，用排枪分装至96孔细菌培养板里，每孔196μL；向96孔板里加入10μL浓度为5μM的信号分子3OC6-HSL，在微孔板振荡器上混匀，28℃摇培2h；加入4μL 10000μg/mL的待测化合物至终浓度为200μg/mL，28℃摇培2h；将硝噻吩用pH＝7.0的0.2M磷酸缓冲液稀释至250μg/mL，取10μL加至96孔细菌培养板中；1h内观察颜色变化，酶标仪在490nm测定OD值。
实验结果所图3所示，TAO16123、TAO16129、TAO16132对β-内酰胺酶活性均无明显抑制作用。
上述实施例表明，TAO16123、TAO16129、TAO16132对β-内酰胺酶活性均无明显抑制作用，同时对A.tumefaciens N5(pBA7P)的MIC都在100μg/mL及其以上，当化合物浓度均在100μg/mL以下时，化合物对于A.tumefaciens N5(pBA7P)没有抑菌作用，也不抑制β-内酰胺酶的活性，而实施例1中分别添加了这3种化合物的A.tumefaciensN5(pBA7P)中并未出现显色反应，表明这3种化合物具有群体感应抑制活性。
实施例5 Chromobacterium violaceum CV026检测群体感应系统抑制剂
试验过程为：接种紫色色杆菌CV026单菌落至LB试管28℃过夜摇培；将过夜摇培的CV026培养液OD600调至0.1，取600μL加入到100mL融化的固体LB培养基(45℃左右)中；再加入标准信号分子C6-HSL(终浓度为1μM)，混合均匀倒平板；待平板冷却凝固后，用已经灭菌的打孔器打孔，在孔中加入10μL浓度为5000μg/mL的化合物，等体积的4-硝基吡啶-N-氧化物(4-nitropyridine-N-oxide，4-NPO)终浓度125μM作为阳性对照，DMSO作为阴性对照；28℃倒置培养24h后观察颜色变化。
实验结果如图4所示，其中的5、6、7和8分别为TSO30、TAO16123、TAO16129、TAO16132，DMSO为溶剂对照，4-NPO为阳性对照；从结果中可知：TAO16123抑制CV026紫色色素的产生，在紫色平板上形成特异的白色圈；TAO16129和TAO16132周围形成两种类型的抑制圈：靠近孔的周围，化合物浓度较高，紫色平板上形成明显的透明圈表现出抑菌活性；在透明圈的外围，化合物的浓度随着扩散降低，平板上形成不透明的白色圈，表现出群体感应抑制活性。
实施例6紫色色素提取法定量检测群体感应系统抑制剂活性
为了排除化合物所使用浓度对CV026生长的影响，首先测定了化合物对CV026的MIC，3种化合物的MIC都在200ppm及其以上，因此以下实验均采用MIC以下浓度。
接种紫色色杆菌CV026单菌落至LB试管28℃过夜摇培；将过夜摇培的CV026培养液OD600调至0.1，1:100稀释到5mL新鲜的LB培养基中，加入不同浓度的各待测化合物，使其浓度为25、50、75、100和200μg/mL，等体积的DMSO作为对照，加入标准信号分子C6-HSL，终浓度为1μM；28℃、150rpm培养16h，取1mL菌液于离心管中，12000rpm离心2min沉淀出紫色色素和细胞；弃掉上清，加入1mLDMSO强力涡旋溶解紫色色素，12000rpm离心2min沉淀菌体；取200μL上清液于96孔板中，酶标仪在585nm测定OD值；将菌体重新加入1mL无菌水悬浮起来，取200μL上清液于96孔板中，酶标仪在600nm测定OD值。
实验结果如图5所示，TAO16123、TAO16129、TAO16132均抑制了紫色色素产量，其中TAO16123、TAO16129对紫色色素产量的抑制效果较好。
实施例7化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对Ti质粒接合转移的影响
A.tumefaciens可以引起植物肿瘤，其利用LuxR/LuxI类型的群体感应系统来调节其肿瘤诱导(Tumor-inducing,Ti)质粒的接合转移转移。可检测化合物是否会通过抑制群体感应系统而抑制Ti质粒的接合转移。该系统由转录激活因子TraR和酰基高丝氨酸内酯合酶TraI组成。TraR结合信号分子3-oxo-C8-HSL，激活负责Ti质粒偶联的三个操纵子的表达，该系统中的负调控因子TraM，在AHL信号水平低时能够结合TraR，降低Ti质粒的接合转移效率。
本实验中供体菌A.tumefaciens NT1携带有pTiC58质粒而具有卡那霉素抗性，受体菌A.tumefaciens N5具有庆大霉素抗性，若二者混合的交配体系在含有卡那霉素和庆大霉素的ABM平板上长出菌落，则表明发生了质粒接合转移。
实验中所用的供体菌是A.tumefaciens NT1，受体菌是A.tumefaciens N5。分别将受体菌和供体菌接于ABM液体培养基，28℃，170rpm摇培48h左右；取上述菌液5μL转接到新的5mL ABM培养基中，并在含有供体菌的培养基中加入待测的化合物(终浓度250μM)，相同体积的DMSO作为对照，28℃，170rpm摇培；48h后，至菌浓度OD600为1.0左右，将上述菌液梯度稀释至10–7；取10μL稀释为10–1浓度的受体菌接到含有卡那霉素和庆大霉素抗性的ABM平板上，待菌液晾干后，在对应的位置接种10μL稀释梯度为10–1、10–2、10–3和10–4浓度的供体菌；取梯度稀释好的供体菌和受体菌进行平板计数，每组三个重复；晾干后，28℃倒置培养。约48h后，选择菌落数合适的浓度进行平板计数。
首先测定了化合物对供体菌A.tumefaciens NT1的MIC值，3种化合物对A.tumefaciens NT1的MIC都在500μM以上。非抑菌浓度(250μM)条件下，TAO16123、TAO16129、TAO16132这3种化合物都显著的抑制了Ti质粒的接合转移，抑制率分别为64.9％、51.9％和45.4％，如图6所示，表明这3种化合物可通过抑制A.tumefaciens的群体感应系统从而抑制Ti质粒的接合转移。
实施例8化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对铜绿假单胞菌PAO1群体感应系统的影响
为了检测这三种化合物对铜绿假单胞菌PAO1群体感应系统的影响，检测了受rhl系统和pqs系统调控的绿脓菌素以及受las系统调控的总蛋白酶含量。绿脓菌素和总蛋白酶都是铜绿假单胞菌重要的毒力因子。文献报道，儿茶酚(2-4mM)通过抑制pqs系统进而抑制绿脓菌素的产生，抑制率达到50％；顺式-2-十二碳烯酸在0.25mM的浓度下对蛋白酶的抑制率达到30％。其中绿脓菌素是铜绿假单胞菌产生的次级代谢产物，它可以自由穿过细胞膜，干扰细胞电子传递链以及正常代谢，从而导致细胞的死亡。首先测定了这3种化合物对铜绿假单胞菌的MIC，结果表明MIC都大于2mM。以下试验均采用不影响菌生长的MIC以下浓度。
(1)化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对P.aeruginosa PAO1毒力因子的影响
绿脓菌素(pyocyanin)产量的测定：接种铜绿假单胞菌PAO1单菌落至LB培养基，37℃、150rpm过夜摇培；取5μL上述菌液千分之一稀释到装有5mL的King’s A培养基的试管中，同时加入各待测化合物，使其终浓度为100μM，等体积的DMSO作为对照，摇匀后放入摇床，37℃、150rpm培养14-16h，每组重复三次；取1mL上述菌液到2mL离心管中，10000g离心5min；取上清液至另一新的2mL离心管中，加入400μL三氯甲烷，充分振荡混匀，10000g离心2min；去掉水相，加入200μL 0.2N HCl，充分混匀，10000g离心2min；取出上层粉红色溶液，用酶标仪检测在520nm处的吸光值，并对数据进行统计学分析。
总蛋白酶(protease)产量的测定：接种铜绿假单胞菌PAO1单菌落至LB培养基，37℃、150rpm过夜摇培；取5μL上述菌液千分之一稀释到装有5mL的LB培养基的试管中，同时加入各待测化合物，使其终浓度为100μM，等体积的DMSO作为对照，摇匀后放入摇床，37℃、150rpm培养14-16h，每组重复三次；取1mL上述菌液到2mL离心管中，10000g离心2min，将上清用0.22μm滤膜过滤，除尽上清中的细菌；取100μL上清，加入200μL 1.3％w/v脱脂牛奶溶液(pH＝7.0的50mmol/LK2HPO4配制)，37℃反应2h，用酶标仪检测其在600nm处的吸光值，并对数据进行统计学分析。
结果如图7所示，与溶剂对照组相比，在化合物浓度为100μM时，3种化合物都可以显著抑制绿脓菌素和总蛋白酶的活性。TAO16123、TAO16129、TAO16132对绿脓菌素活性的抑制效果分别为38.1％、13.7％和47.1％。这3种化合物对PAO1中总蛋白酶的抑制效果相似，抑制效果约为35％。由此可见，3种化合物对于rhl系统、pqs系统和las系统表现出一定的抑制效果。
(2)化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对P.aeruginosa PAO1群集运动(swarming motility)的影响
试验过程为：接种铜绿假单胞菌PAO1单菌落至LB培养基，37℃、150rpm过夜摇培；制备群集培养基50mL，待培养基冷却至50℃左右时，加入待测化合物(终浓度为500μM)，加入同体积的DMSO作为对照，轻轻混匀后迅速倒入3个无菌培养皿中；待平板冷凝后，取2μL上述菌液接种至琼脂板的中央，37℃培养10h后观察结果。
结果如图8所示，在化合物浓度为500μM时，化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132都可以显著地抑制铜绿假单胞菌的群集运动，尤其TAO16129的抑制效果最为显著，与溶剂对照相比抑制率达到40.6％，TAO16132的抑制效果稍差。
(3)化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对P.aeruginosa PAO1群体感应系统下游基因表达的影响
试验过程为：将过夜摇培的铜绿假单胞菌PAO1千分之一接到5mL LB液体培养基中，同时加入各待测化合物，使其终浓度为500μM，等体积的DMSO作为对照，摇匀后放入摇床，37℃、150rpm培养6h。按照TransZol Up Pluse RNA Kit(TransGen Biotech，Beijing)试剂盒介绍的方法提取RNA；按照FastQuant RT Kit(TransGen Biotech，Beijing)试剂盒介绍的方法进行RNA逆转录；根据文献报道，使用Hassan等人设计的lasA、lasB、lasI、lasR、pqsA、pqsR、rhlI、rhlR和内参ropD引物，根据
Figure BDA0002618613630000111
Primer Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseHPlus)(Takara，Dalian)建立qRT-PCR反应体系。
为了进一步明确3种苯并噻唑化合物对铜绿假单胞菌PAO1群体感应系统抑制的机制，采用qRT-PCR检测3种化合物对PAO1群体感应系统相关基因表达的影响，lasA、lasB、lasI、lasR、pqsA、pqsR、rhlI及rhlR基因在铜绿假单胞菌QS系统中起着重要作用，其本身的表达也受到QS系统的调控。使用转录因子ropD作为内参基因量化这目的基因的相对表达量，处理组和对照组之间的表达倍数变化用2-△△Ct方法来计算。
实验结果如图9所示，TAO16123、TAO16129、TAO16132(化合物终浓度为500μM)处理都造成lasA、pqsA和pqsR基因的表达显著下降，其中3种化合物使pqsA基因的表达量分别下调了6倍、2倍和6倍，使lasA基因的相对表达量分别下降了5倍、7倍和14倍。
实施例9化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum ssp.carotovorum，Pcc)S1群体感应系统的影响
胡萝卜软腐果胶杆菌主要通过分泌PCWDEs，包括果胶酸裂解酶(Pel)，果胶裂解酶(PL)，多聚半乳糖醛酸酶(Peh)，纤维素酶(Cel)和蛋白酶(Prt)等，瓦解植物细胞壁，从中吸收营养进而侵染寄主植物造成作物发病。PccS1中产生PCWDEs需要QS信号分子3-oxo-C6-HSL的调控，其中CarI/CarR系统是其主要的QS系统，carI基因合成3-oxo-C6-HSL。我们利用由PccS1群体感应系统调控的PCWDEs作为指标，检测这3种化合物对PccS1群体感应系统的影响。首先测定了2-氨基-5-溴苯并噻唑、2-氨基-6-溴苯并噻唑和2-(甲硫基)苯并噻唑对PccS1的MIC值，4种化合物的MIC都大于1mM。以下实验均采用不影响菌生长的MIC以下浓度。
(1)化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对PccS1的植物细胞壁降解酶(PCWDEs)活性测定
平板测定：接种胡萝卜软腐果胶杆菌PccS1单菌落至LB培养基，28℃、170rpm过夜摇培；取5μL上述菌液千分之一稀释到装有5mL的LB培养基的试管中，同时加入各待测化合物，使其终浓度为500μM，等体积的DMSO作为阴性对照，ΔcarI作为阳性对照。摇匀后放入摇床，28℃、170rpm培养14-16h，每组重复三次；取1mL上述菌液到2mL离心管中，10000g离心5min，取上清至新的离心管再次10000g离心5min，除尽上清中的细菌待用；制备Pel、Cel和Peh检测培养基50mL，培养基冷却倒入3个无菌培养皿中，待培养基冷却凝固后打孔。取上述无菌上清20μL加入Pel、Cel和Peh检测平板的孔中，待风干后，30℃倒置培养16-18h。Pel和Peh检测平板加入4N HCl染色10min，Cel平板先用1％的刚果红染色1min，弃染液，用2NNaCl漂洗15min，弃溶液。观察测量平板打孔部位颜色变化与范围大小，并拍照记录。后期再对Pel、Cel和Peh进行定量检测。
表2 QSIs对PCWDEs的活性测定
Figure BDA0002618613630000121
如图10与表2所示，通过对PeL、Peh和Cel这3种酶的定量检测，在测试浓度为500μM时，TAO16123对这3种酶的活性抑制分别为：48.2％、74.3％和61.6％；TAO16129的抑制率分别为：56.8％、65.9％和67.1％；TAO16132的抑制率分别为：55.5％、55.7％和78.8％。上述结果表明这3种苯并噻唑化合物对PccS1的PCWDEs活性有显著抑制。
(2)化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对PccS1的运动能力的影响
接种PccS1单菌落至LB培养基，28℃、170rpm过夜摇培；制备集群培养基50mL，待培养基冷却至50℃左右时，加入待测化合物(终浓度为500μM)，轻轻混匀后迅速倒入3个无菌培养皿中，同体积的DMSO作为阴性对照，ΔcarI作为阳性对照，待平板冷凝后，取2μL上述菌液接种至琼脂板的中央，28℃培养8h后观察结果。
结果如图11所示，3种化合物(500μM)对PccS1的游动性都有显著抑制，其中效果最好的是TAO16123，抑制率达到56.4％。
(3)化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132对PccS1的群体感应系统下游基因表达的影响
采用qRT-PCR实验来研究3种化合物对PccS1群体感应系统部分下游基因表达的影响。pel、celC、prtW、nip和carC基因在果胶杆菌中分别编码果胶裂解酶(Pel，果胶酶中最重要的酶)、纤维素酶(Cel)、蛋白酶(Prt)、坏死诱导蛋白(necrosis-inducing protein，Nip)和碳青霉烯类抗生素等致病相关因子。
如图12所示，在测试浓度为500μM时，TAO16123和TAO16132抑制carC、nip和celC基因的表达，其中对于carC基因的下调最为显著，相对表达量分别下降了4倍、52倍和334倍；对于celC基因的相对表达量分别下降了7倍、10倍和4倍。而TAO16129(500μM)对于carC和nip基因的表达没有显著性差异，对celC和prtW基因的相对表达量下降了4倍和3倍。
综上，上述实施例均说明本发明所述化合物TAO16123、TAO16129、TAO16132在不影响病原菌的生长的同时，强烈抑制了病原菌的群体感应系统，从而明显降低了病原菌的致病性，在不影响病原菌生长的同时即可达到预防和/或治疗由病原菌引发的病害，从而避免了病原菌抗药性的产生，延长了化合物有效使用期限。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (4)

1.苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐在制备病原细菌群体感应系统抑制剂中的应用，其特征在于，所述苯并噻唑化合物的结构如下所示：
Figure FDA0003376249160000011
，
所述病原细菌为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp. carotovorum)。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐抑制病原细菌致病因子的产生。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐抑制病原细菌的群集运动。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述苯并噻唑化合物及其药学上可接受的盐抑制胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的游动性以及植物细胞壁降解酶活性。
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