CN110257454A - 胞外多糖絮凝剂及其制备方法和应用 - Google Patents

胞外多糖絮凝剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胞外多糖絮凝剂及其制备方法和应用，该胞外多糖絮凝剂为黄孢原毛平革菌产生的胞外多糖，主要由葡萄糖组成，胞外多糖絮凝剂中多糖分子量为0.0176×108Da～1.92×108Da。其制备方法为：将黄孢原毛平革菌进行培养，离心；将离心所得上清液进行透析，离心；将离心所得上清液进行过滤，真空冷冻干燥，得到胞外多糖絮凝剂。本发明胞外多糖絮凝剂，具有成本低廉、无毒、无二次污染、絮凝效果好、适用范围广、热稳定性好等优点，其制备方法具有工艺简单、操作方便、原料简单易得等优点。该胞外多糖絮凝剂能够处理污水中的悬浮物，具有去除效果好、絮凝速率快等优点，有着较高的使用价值和较好的应用前景。

Description

胞外多糖絮凝剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物絮凝剂技术领域，涉及一种胞外多糖絮凝剂及其制备方法和应用，具体涉及一种黄孢原毛平革菌产生的胞外多糖絮凝剂及其制备方法和应用。
背景技术
水资源是人类生产、生活不可或缺的重要资源，而废水处理及其循环利用是目前解决水资源缺乏的重要方法之一。众多的水处理方法中，絮凝法是一种简单、经济、高效的处理方法。该技术中絮凝剂的选择直接影响了废水的絮凝效果。絮凝剂可分为无机絮凝剂、人工合成有机高分子絮凝剂和天然高分子絮凝剂。
常规的无机低分子絮凝剂在水处理过程中使用量较大，污泥产生量大，形成的絮体含水率高，污泥脱水困难且成本高，且pH对体系的影响较大，易腐蚀设备。如，铁絮凝剂的大量使用易腐蚀设备。与无机低分子絮凝剂相比，虽然无机高分子絮凝剂电中和能力更强，吸附性能和稳定性更加出色，但它们的也存在明显的缺点，一是其相对分子量较高，速溶性差，容易导致絮凝效果不稳定；二是对于合成有机高分子絮凝剂，如目前常用的聚丙烯酰胺被降解后会生成具有神经毒性的剧毒物质丙烯酰胺单体，这制约了上述两种絮凝剂的广泛使用。因此，高效、无毒害、可生物降解的絮凝剂的开发，受到越来越多人的关注。
天然高分子絮凝剂包括壳聚糖和微生物絮凝剂等，其中壳聚糖价格昂贵。微生物絮凝剂是一类由微生物在特定培养条件下生长代谢至一定阶段产生的具有絮凝活性的产物，它是利用微生物技术，通过细菌、真菌等微生物发酵、提取、精制而得到的，具有生物可降解、安全无毒、高效、无二次污染等优点，在废水处理方面有很大的应用潜力。
在絮凝剂的推广应用中，均是使用絮凝活性成分的纯品制剂，这样方便运输和保存。因此，要推广微生物絮凝剂的使用，则首先要保证微生物絮凝剂中的絮凝活性成分实际有效。目前在微生物絮凝剂的相关研究中，有些是直接使用菌种的发酵液进行絮凝实验，得到的絮凝效果直接归为该发酵液中某物质的絮凝活性。微生物发酵液中多含有Fe3+、Ca2+、Mg2+等离子，这些无机离子本身就具有一定的絮凝活性，会对发酵液中有效絮凝成分的实际作用分析产生干扰。因此发酵液需经一定的纯化才能进行微生物絮凝剂的絮凝效果和特性的分析。
絮凝剂的有效絮凝浓度直接影响微生物絮凝剂的生产成本，目前报道的微生物絮凝剂的有效絮凝浓度范围为0.1～90mg/L。絮凝剂的絮凝活性受絮凝剂分子量的影响很大，据文献报道，分子量越大越有利于提高絮凝效果，然而，目前的微生物絮凝剂分子量多是104～106Da范围内，尚未见更大分子量的絮凝剂报道。另外，微生物絮凝剂的组成也会应絮凝剂的絮凝性能。如以蛋白质为主链的絮凝剂通常不具有热稳定性，高温可使这些高分子物质空间结构改变，导致变性，从而使絮凝活性下降。此外，现有絮凝剂的絮凝活性会受pH值的影响，如海洋甲藻胞外多糖KG03仅限在酸性条件下使用。因此，获得一种有效絮凝浓度更小、适用范围更广的微生物絮凝剂，对于有效提高污水中悬浮物的去除效果具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种成本低廉、无毒、无二次污染、絮凝效果好、适用范围广、热稳定性好的胞外多糖絮凝剂，还提供一种工艺简单、操作方便、原材料廉价易得的胞外多糖絮凝剂的制备方法，以及该胞外多糖絮凝剂在处理污水中悬浮物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种胞外多糖絮凝剂，所述胞外多糖絮凝剂为黄孢原毛平革菌产生的胞外多糖；所述胞外多糖主要由葡萄糖组成；所述胞外多糖絮凝剂中多糖分子量为0.0176×108Da～1.92×108Da。
上述的胞外多糖絮凝剂，进一步改进的，所述胞外多糖絮凝剂中，分子量为1.76×106Da的多糖占82.31％，分子量为3.95×107Da的多糖占15.77％，其余多糖的分子量为1.92×108Da。
上述的胞外多糖絮凝剂，进一步改进的，所述胞外多糖絮凝剂主要由(1，4)葡萄糖苷键形式连接。
上述的胞外多糖絮凝剂，进一步改进的，所述胞外多糖絮凝剂中总糖的质量含量为96％～98％。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的胞外多糖絮凝剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将黄孢原毛平革菌置于培养液中进行培养，离心；
S2、将步骤S1中离心所得上清液进行透析，离心；
S3、将步骤S2中离心所得上清液进行过滤，真空冷冻干燥，得到胞外多糖絮凝剂。
上述的制备方法，进一步改进的，所述步骤S1中，所述培养液包括以下组分：2g/LKH2PO4、0.1g/L CaCl2、0.5g/L MgSO4、0.115g/L FeSO4·7H2O、0.112g/L MnSO4·H2O、0.089g/L ZnSO4·7H2O、0.05g/L CuSO4·5H2O、0.001g/L维生素B1、0.206g/L C4H12N2O6、10g/L葡萄糖；所述培养液的pH值为4.5～5.0；所述培养的温度为30℃～37℃；所述培养的转速为120rpm～180rpm；所述培养的时间为5天～7天；所述离心的转速为4000rpm～6000rpm；所述离心的时间为10min～15min；
所述步骤S2中，所述透析采用的是3500Da的透析袋；所述透析的时间为4天～5天；所述离心的转速为10000rpm～12000rpm；
所述步骤S3中，所述过滤采用的是孔径为0.22μm～0.45μm的滤膜。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的胞外多糖絮凝剂或上述的制备方法制得的胞外多糖絮凝剂在处理污水中悬浮物中的应用。
上述的应用，进一步改进的，包括以下步骤：将胞外多糖絮凝剂与悬浮物污水混合，搅拌，静置，完成对污水中悬浮物的处理；所述胞外多糖絮凝剂的添加量为使悬浮物污水中多糖的浓度为0.6mg/L～2mg/L。
上述的应用，进一步改进的，所述胞外多糖絮凝剂的添加量为使悬浮物污水中多糖的浓度为0.75mg/L～1.35mg/L。
上述的应用，进一步改进的，所述悬浮物污水中的悬浮物为高岭土；所述悬浮物污水的浓度为3g/L～5g/L；所述悬浮物污水的pH值为3～9；所述搅拌是依次在转速为300rpm～400rpm的条件下搅拌40s～1min、在转速为40rpm～60rpm的条件下搅拌2min～3min；所述静置的时间为3min～5min。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种胞外多糖絮凝剂，主要由葡萄糖组成，且胞外多糖絮凝剂中葡萄糖的分子量为0.0176×108Da～1.92×108Da，具有成本低廉、无毒、无二次污染、絮凝效果好、适用范围广、热稳定性好等优点，能够广泛用于处理污水中的悬浮物，有着较高的使用价值和较好的应用前景。
(2)本发明提供了一种胞外多糖絮凝剂的制备方法，通过将黄孢原毛平革菌进行培养并对所得发酵液进行透析、过滤等处理即可制备得到胞外多糖絮凝剂，具有工艺简单、操作方便、原料简单易得等优点，可实现规模化的批量制备，有利于工业化应用。
(3)本发明胞外多糖絮凝剂可用于处理污水中悬浮物(如高岭土)，通过将胞外多糖絮凝剂与悬浮物污水混合经搅拌、静置处理即可实现对污水中悬浮物的有效去除，具有工艺简单、操作方便、絮凝剂使用量小、絮凝速率快、絮凝效果好的优点。以处理高岭土污水为例，采用本发明的胞外多糖絮凝剂处理高岭土污水时，最高效率可达到88.3％，去除效果好，絮凝速率快，且适用于处理各种不同条件的悬浮物污水。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中制得的多糖絮凝剂的GPC测定结果图。
图2为本发明实施例2中不同用量胞外多糖絮凝剂对污水中悬浮物的絮凝效果图。
图3为本发明实施例3中胞外多糖絮凝剂对不同pH值污水中悬浮物的絮凝效果图。
图4为本发明实施例4中不同温度处理后的胞外多糖絮凝剂对污水中悬浮物的絮凝效果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
一种胞外多糖絮凝剂，该胞外多糖絮凝剂为黄孢原毛平革菌产生的胞外多糖，且胞外多糖主要由葡萄糖组成；该胞外多糖絮凝剂中分子量为1.76×106Da的多糖占82.31％，分子量为3.95×107Da的多糖占15.77％，其余多糖的分子量为1.92×108Da。
本实施例中，胞外多糖絮凝剂主要由(1，4)葡萄糖苷键形式连接。
本实施例中，胞外多糖絮凝剂中总糖的质量含量为96％～98％。
一种上述本实施例中的胞外多糖絮凝剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将黄孢原毛平革菌置于培养液中，在温度为30℃、转速为180rpm的条件下培养7天，所得发酵液在转速为4000rpm下离心10min，将菌体与溶液分离，得到上清液。该步骤中，培养液包括以下组分：2g/L KH2PO4、0.1g/L CaCl2、0.5g/L MgSO4、0.115g/L FeSO4·7H2O、0.112g/L MnSO4·H2O、0.089g/L ZnSO4·7H2O、0.05g/L CuSO4·5H2O、0.001g/L维生素B1、0.206g/L C4H12N2O6、10g/L葡萄糖，且培养液的pH值为4.5。本发明中，黄孢原毛平革菌是从实验室的混合菌样中分离纯化培养得到，并经过菌种鉴定(委托生工生物工程上海股份有限公司鉴定)。
S2、采用3500Da的透析袋在去离子水中对将步骤S1中离心所得上清液进行透析5天，在转速为10000rpm的条件下进行离心10min。
S3、采用孔径为0.22μm的尼龙滤膜(市购，上海新亚，尼龙)对将步骤S2中离心所得上清液进行过滤，得到胞外多糖絮凝剂溶液。
采用蒽酮-硫酸比色法，对本发明实施例1中制得的胞外多糖絮凝剂溶液中多糖的浓度进行测定，结果显示：本发明实施例1中制得的胞外多糖絮凝剂溶液中多糖浓度为135mg/L。
经真空冷冻干燥得到多糖絮凝剂纯品，即为本发明胞外多糖絮凝剂，该纯品中总糖的质量含量占96％～98％，含有少量的蛋白质。
多糖分子量与组成分析
分子量测定
采用凝胶渗透色谱仪(GPC)对实施例1中得到的多糖絮凝剂进行分子量分布测定，以葡聚糖做标线进行分子量测算。GPC测定结果如图1所示。图1为本发明实施例1中制得的多糖絮凝剂的GPC测定结果图。同时，多糖分子量分布如下表1所示，胞外多糖絮凝剂中主要分子量为1.76×106Da，占82.31％，其次分子量为3.95×107Da，占15.77％，还含有少量的分子量为1.92×108Da。一般微生物絮凝剂的分子量多为104Da～106Da，本发明中的胞外多糖絮凝剂的分子量较普通微生物絮凝剂的分子量要大。
表1多糖分子量分布测定结果
单糖组成
将实施例1中制得的多糖絮凝剂纯品进行水解、还原、乙酰化处理，并对多糖中单糖种类进行分析。同样的，多糖絮凝剂纯品，先后经甲基化、水解、还原、乙酰化处理，并对多糖中单糖苷链接方式进行分析。分析使用气相色谱质谱联用仪(GC-MS，PerkinElmer，clarus600)，检测条件：色谱柱为Elite-5MS石英毛细柱(30m×0.25mm)；载气为氦气，流速1mL/min；进样口温度为250℃，进样量1μL，分流比20∶1；柱箱起始温度140℃，以8℃/min升至250℃，保留15min。色谱与质谱接口温度为250℃，EI离子源，电子轰击能量70eV，扫描质量范围为40～550amu，延迟时间设置为5min。
测得多糖絮凝剂纯品主要由葡萄糖的组成，葡萄糖苷的链接方式为(1，4)葡萄糖苷键。
实施例2：
利用胞外多糖絮凝剂在处理污水中悬浮物中的应用，具体为利用实施例1中制得的胞外多糖絮凝剂处理污水中的高岭土，包括以下步骤：
将不同体积的实施例1中制得的胞外多糖絮凝剂加入到200mL高岭土溶液(该溶液中高岭土的浓度为5g/L，且该溶液中高岭土的粒径为2.5μm，溶液pH值为7.0，温度为20℃)中，使得高岭土溶液中多糖浓度分别达到0.6mg/L、0.75mg/L、0.9mg/L、1.05mg/L、1.2mg/L、1.35mg/L、1.5mg/L、1.8mg/L、2mg/L，在400rpm搅拌1min，然后在40rpm搅拌3min，静置5min，完成对污水中高岭土的处理。
完成处理后，取液面以下6cm处的溶液，测定溶液在550nm波长下的吸光度OD550。以不加胞外多糖絮凝剂的体系作为对照组，且实验组和对照组均添加CaCl2作为助凝剂。
絮凝效率计算公式如下：
絮凝效率＝(A0-Ai)/A0×100％
其中A0表示对照组所取溶液的OD550，Ai表示加入培养液絮凝之后所取溶液的OD550值。
图2为本发明实施例2中不同用量胞外多糖絮凝剂对污水中悬浮物的絮凝效果图。结果如图2所示，添加的多糖浓度为0.75mg/L～1.35mg/L时絮凝效果较好，最高絮凝效率可达到80.10％。
实施例3：
利用胞外多糖絮凝剂在处理污水中悬浮物中的应用，具体为利用实施例1中制得的胞外多糖絮凝剂处理污水中的高岭土，包括以下步骤：
取pH值分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的高岭土溶液(该溶液中高岭土的浓度为5g/L，且该溶液中高岭土的粒径为2.5μm，溶液温度为20℃)，体积均为200mL，分别加入实施例1中制得的胞外多糖絮凝剂，使得各个高岭土溶液中多糖浓度均1mg/L，在400rpm搅拌1min，然后在40rpm搅拌3min，静置5min，完成对污水中高岭土的处理。
完成处理后，取液面以下6cm处的溶液，测定溶液在550nm波长下的吸光度OD550。以不加胞外多糖絮凝剂的体系作为对照组，且实验组和对照组均添加CaCl2作为助凝剂。
图3为本发明实施例3中胞外多糖絮凝剂对不同pH值污水中悬浮物的絮凝效果图。如图3所示，当水体的pH值处于3～9范围内时，胞外多糖絮凝剂的絮凝效果较好，最高絮凝效率可达88.3％。
实施例4：
考察不同温度处理后的胞外多糖絮凝剂对高岭土溶液的絮凝效果，包括以下步骤：
将实施例1中制得的胞外多糖絮凝剂分别在温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下进行水浴加热处理3h。取加热处理后的胞外多糖絮凝剂分别加入到200mL高岭土溶液(该溶液中高岭土的浓度为5g/L，且该溶液中高岭土的粒径为2.5μm，溶液pH为7.0，温度为20℃)中，使得各个高岭土溶液中多糖浓度均为1.0mg/L，常温下在400rpm搅拌1min，然后在40rpm搅拌3min，静置5min，完成对污水中高岭土的处理。
完成处理后，取液面以下6cm处的溶液，测定溶液在550nm波长下的吸光度OD550。以不加胞外多糖絮凝剂的体系作为对照组，且实验组和对照组均添加CaCl2作为助凝剂。
图4为本发明实施例4中不同温度处理后的胞外多糖絮凝剂对污水中悬浮物的絮凝效果图。如图4所示，经过20～100℃加热处理后冷却至20℃，胞外多糖絮凝剂的絮凝效率持续保持稳定的状态，说明黄孢原毛平革菌产生的多糖絮凝剂的絮凝活性热失活后仍可通过降温恢复活性，具有较好的热稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种胞外多糖絮凝剂，其特征在于，所述胞外多糖絮凝剂为黄孢原毛平革菌产生的胞外多糖；所述胞外多糖主要由葡萄糖组成；所述胞外多糖絮凝剂中多糖分子量为0.0176×108Da～1.92×108Da。
2.根据权利要求1所述的胞外多糖絮凝剂，其特征在于，所述胞外多糖絮凝剂中，分子量为1.76×106Da的多糖占82.31％，分子量为3.95×107Da的多糖占15.77％，其余多糖的分子量为1.92×108Da。
3.根据权利要求1或2所述的胞外多糖絮凝剂，其特征在于，所述胞外多糖絮凝剂主要由(1，4)葡萄糖苷键形式连接。
4.根据权利要求1或2所述的胞外多糖絮凝剂，其特征在于，所述胞外多糖絮凝剂中总糖的质量含量为96％～98％。
5.一种如权利要求1～4中任一项所述的胞外多糖絮凝剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将黄孢原毛平革菌置于培养液中进行培养，离心；
S2、将步骤S1中离心所得上清液进行透析，离心；
S3、将步骤S2中离心所得上清液进行过滤，真空冷冻干燥，得到胞外多糖絮凝剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述培养液包括以下组分：2g/L KH2PO4、0.1g/L CaCl2、0.5g/L MgSO4、0.115g/L FeSO4·7H2O、0.112g/LMnSO4·H2O、0.089g/L ZnSO4·7H2O、0.05g/L CuSO4·5H2O、0.001g/L维生素B1、0.206g/LC4H12N2O6、10g/L葡萄糖；所述培养液的pH值为4.5～5.0；所述培养的温度为30℃～37℃；所述培养的转速为120rpm～180rpm；所述培养的时间为5天～7天；所述离心的转速为4000rpm～6000rpm；所述离心的时间为10min～15min；
所述步骤S2中，所述透析采用的是3500Da的透析袋；所述透析的时间为4天～5天；所述离心的转速为10000rpm～12000rpm；
所述步骤S3中，所述过滤采用的是孔径为0.22μm～0.45μm的滤膜。
7.一种如权利要求1～4中任意一项所述的胞外多糖絮凝剂或权利要求5或6中所述的制备方法制得的胞外多糖絮凝剂在处理污水中悬浮物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将胞外多糖絮凝剂与悬浮物污水混合，搅拌，静置，完成对污水中悬浮物的处理；所述胞外多糖絮凝剂的添加量为使悬浮物污水中多糖的浓度为0.6mg/L～2mg/L。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述胞外多糖絮凝剂的添加量为使悬浮物污水中多糖的浓度为0.75mg/L～1.35mg/L。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述悬浮物污水中的悬浮物为高岭土；所述悬浮物污水的浓度为3g/L～5g/L；所述悬浮物污水的pH值为3～9；所述搅拌是依次在转速为300rpm～400rpm的条件下搅拌40s～1min、在转速为40rpm～60rpm的条件下搅拌2min～3min；所述静置的时间为3min～5min。
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