CN102191191A

CN102191191A - 一株对重金属具有耐受性的菌株及其应用

Info

Publication number: CN102191191A
Application number: CN 201010596726
Authority: CN
Inventors: 柴立元; 杨志辉; 苏艳蓉; 陈跃辉; 闵小波
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2010-12-20
Filing date: 2010-12-20
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2030-12-20
Also published as: CN102191191B

Abstract

本发明公开了一株对重金属具有耐受性的菌株Enterobacter sp.T2及其应用。菌株Enterobacter sp.T2保藏号CGMCCNo.4281。该细菌能够耐受Pb²⁺、Cr⁶⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Ag⁺、Hg²⁺等多种重金属，特别对Pb²⁺和Mn²⁺的耐受浓度分别达到2000mg/L和1000mg/L以上。将菌种活化、培养、收集、洗涤、烘干制得去除重金属的吸附剂，对重金属Pb²⁺的最大吸附量可达81.22mg/g。

Description

一株对重金属具有耐受性的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种耐受多种重金属的菌株以及利用该菌株制备生物吸附剂的应用方法。

背景技术

工业化发展带来严峻的重金属污染，由于其不可降解和生物累积特性，对生态环境和人类健康构成了巨大威胁。传统的废水处理方法主要有沉淀，吸附，电解，膜分离等。但这些方法普遍存在投资成本高，存在二次污染，对痕量重金属处理效果差等缺点。生物吸附因其成本低廉，材料来源广泛等优点逐渐成为研究热点。

从受重金属污染的土壤中分离筛选出的微生物，因受生存环境中重金属的胁迫，既能对重金属有一定耐受性，又能对重金属具有高效吸附能力，因此具有成为高效重金属吸附剂的潜力。但是，目前国内外学者在生物吸附方面开展的研究工作主要集中在真菌、藻类、酵母等，而以细菌作为生物吸附剂材料的国内外报道较少。细菌是近地表环境中分布最广、生物量最大的生物类型。细菌细胞表面通常都有多种带负电荷的功能基团，如羧基、磷酰基、羟基等，因此表现出显著的亲金属特性，且以细菌作为吸附剂具有效率高、选择性强和吸附容量大等特点，是理想的吸附材料之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的重金属耐受细菌，该菌株具有重金属高耐受性，并可利用其制备高效重金属吸附剂，将其用于重金属污染治理，操作简单，价格低廉，环境友好。

一株对重金属具有高耐受性的菌株Enterobacter sp.T2的保藏号为CGMCCNo.4281。

该菌适合培养条件为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，单一重金属，自然pH。所述的单一重金属分别是Pb²⁺、Mn²⁺、Cr⁶⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Ag⁺、Hg²⁺，浓度为0.1g/L。

所述的菌株应用于去除水中重金属；具体用于制备去除水中重金属的生物吸附剂；特别是制备去除水中重金属铅的生物吸附剂。

将所述的菌株活化、培养、收集、洗涤、烘干、研磨，制成粉末状生物吸附剂。具体如下：

(1)将所述的菌株划线接种至新鲜的固体培养基上，30℃培养48h，进行活化；

(2)挑取生长出的单克隆菌落接种到液体培养基中，在30℃、120r/min振荡培养24h，获得对数生长期菌液；

(3)再以体积分数为2％的接种量将菌液接入液体培养基中，振荡培养12h；

(4)经5000r/min离心20min收集菌体，并用去离子水洗涤3次，收集湿菌体80℃烘干至恒重，磨细即可。

所述的固体培养基组分为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g，pH7.0；所述的液体培养基组分为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0。

本发明采集湖南某厂铬污染土壤，经过筛选和分离得到一株细菌，经鉴定，其16s rRNA基因序列于Enterobacter sp.16S rRNA有99％的相似性，命名为肠杆菌Enterobacter sp.T2。该细菌已于2010年10月29日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提交生物保藏，保藏号为CGMCC No.4281。利用菌株可制得生物吸附剂，用于含铅废水处理。

本发明中，分离、纯化细菌的过程为：

1、取采自湖南某铬污染土壤，磨细过筛，按比例溶于含无菌蒸馏水的三角瓶中，30℃恒温振荡箱(130r/min)培养30min，取出三角瓶置于水平桌面静置30min；

2、取上清液涂布于含Cr⁶⁺固体培养基上，30℃恒温培养箱培养；

3、48h后挑取已生长的菌落分别接种至不同重金属固体培养基中，30℃恒温培养箱培养；

4、48h后挑取在不同重金属培养基中均生长的单菌落培养。

所述的土样与无菌水的比例为1∶100。

所述的含Cr⁶⁺固体培养基为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，Cr⁶⁺0.1g/L，琼脂15g/L，自然pH。

所述的重金属固体培养基为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，单一重金属，琼脂15g/L，自然pH。

所述的单一重金属分别是Pb²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Ag⁺、Hg²⁺，浓度为0.1g/L。

本发明具有如下优点：

1.本发明所述的细菌只需提供C源、N源和无机盐即可在不同重金属培养环境中存活并生长，生命力强，生长速度快，生物量大，对多种重金属均有较高的耐受性，耐受金属种类多、耐受浓度高。

2.本发明所述的的生物吸附剂在制备时只需将保藏菌种活化、培养、收集、洗涤、烘干、研磨即可制得所述的吸附剂，操作简单，成本低廉。

3.本发明所述的吸附剂对铅离子的最大吸附量大于80mg/g，吸附容量高于目前常见的细菌类吸附剂。基于死体细菌，相比活体生物吸附剂，无需外加营养源，且不存在重金属毒害作用，更易保存和运输，适应范围广泛。

4.本发明所述的吸附剂吸附完成后可通过焚烧以生物矿砂的形式加以回收。在整个培养、制备过程中不加入任何有机溶剂，以菌体为生物吸附剂，无二次污染，生态风险小。

附图说明

图1：本发明的菌株的菌落形态图；

图2：本发明的菌株的系统发育分析树；

图3：本发明的吸附剂吸附铅的效果图。

具体实施方式：

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：菌株形态特征及及生物学鉴定

1.形态特征

将单克隆菌落划线接种至LB固体培养基中，将平板倒置于恒温培养箱，30℃培养1～3天，观察其菌落形态。Enterobacter sp.T2圆斑，土黄色，表面湿润，无扩散，见图1。

2.生理生化特性

革兰氏染色、氧化酶试验、接触酶试验、细菌的运动性试验、糖醇类的氧化发酵试验(包括葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇)、利用糖醇的产气试验、甲基红试验、V-P试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、H₂S产生试验、精氨酸双水解酶试验、柠檬酸盐利用试验、脲酶试验、淀粉水解、石蕊牛奶试验、明胶液化试验，结果见表1。

表1本发明的菌株生理生化指标表

	Enterobacter sp.T2		Enterobacter sp.T2
				葡萄糖	+	H₂S	+
半乳糖	+	硝酸盐	+
				甘露醇	-	脲酶	+
乳糖	+	吲哚	-
				木糖	+	M.R	-
果糖	+	V.P	+
				蔗糖	+	淀粉水解	-
树胶醛糖	+	柠檬酸盐	+
				过氧化氢酶	+	明胶水解	-
氧化酶	+	石蕊牛奶	还原
				精氨酸水解	+	革兰氏染色	-
运动性	+

3.16s rRNA特性及系统发育树分析

抽提细菌总DNA并PCR，引物为细菌16S rDNA PCR通用引物(27F--5′CGGCTACCTTGTTACGACT3′，1492R-5′GAGTTTGATCCTGGCTCAG3′)，使用TIANGEN公司生产的Taq mix进行扩增。PCR系统为：10×Taq聚合酶缓冲液5μl，MgCl₂(25mmol)4μl，dNTP(5mmol)3μl，引物1μl，模板DNA 3μl，Taq酶(10000U/ml)0.5μl，重蒸水33.5μl。PCR程序为：95℃变性5min，94℃退火1min，53℃退火30s，72℃延伸90s，循环30次；72℃10min；4℃保存。PCR产物的测序由上海生物工程有限公司完成。将所得到的16S rDNA序列通过NCBI(美国国立生物技术信息中心)的Blast程序与数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)中已有的16S rDNA核酸序列进行相似性比较分析。用ClustalX进行序列比对后采用Mega4.0软件进行系统发育分析。该菌株的系统发育分析树见图2。

实施例2：细菌对重金属的最大耐受浓度

分别配制含重金属离子的固体培养基，浓度从0.1mM/L起，以0.5mM递增。划线接种到新鲜的LB固体培养基上，30℃培养48h进行活化，挑取单克隆菌落接种到LB液体培养基中，30℃、120r/min振荡培养24h，收集细菌浓度OD₆₀₀为1.5的菌液按10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5比例稀释，分别蘸取各浓度菌液点样接种至重金属固体培养基上。30℃培养，每24h观察记录细菌生长情况，120h内抑制其出现明显生长的最低重金属浓度，即该菌的最大耐受浓度，见表2。

表2本发明的菌株耐受浓度统计表

实施例3：吸附剂对铅的吸附效果

在铅浓度分别为20、50、100、150和200mg/L，pH值为6的溶液中，各加入培养12h、投加量为0.5g/L的的由本发明细菌制得的吸附剂，于30℃的条件下吸附90min，离心收集上清液，测定吸附平衡时的剩余铅离子浓度。随着Pb²⁺初始质量浓度的增加，Pb²⁺的去除率降低，而平衡吸附量增大，但吸附量的增加幅度越来越小。生物吸附剂的最大吸附量可达81.22mg/g，见图3所示。

Claims

1.一株对重金属具有耐受性的菌株Enterobacter sp.T2，其特征在于，所述菌株的保藏号为CGMCCNo.4281。

2.权利要求1所述的菌株应用于去除水中重金属。

3.权利要求1所述的菌株应用于制备去除水中重金属的生物吸附剂。

4.根据权利要求3所述的菌株的应用方法，其特征在于，所述的菌株应用于制备去除水中重金属铅的生物吸附剂。

5.根据权利要求3所述的菌株的应用方法，其特征在于，将所述的菌株活化、培养、收集、洗涤、烘干、研磨，制成粉末状生物吸附剂。

6.根据权利要求3或4或5所述的菌株的应用方法，其特征在于，所述的生物吸附剂的制备方法具体如下：

7.根据权利要求6所述的菌株的应用方法，其特征在于，所述的固体培养基组分为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g，pH7.0；所述的液体培养基组分为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0。