CN115161229A - 一株兼具硫还原和铁还原能力菌株及其筛选与菌剂制备方法 - Google Patents

一株兼具硫还原和铁还原能力菌株及其筛选与菌剂制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株兼具硫还原和铁还原能力菌株及其筛选与菌剂制备方法。从大宝山矿区选出一株硫酸盐还原能力和铁还原能力较强的菌株，利用紫外线‑等离子体复合诱变技术对该菌株进行多次复合诱变，选育出一株高效且稳定性好的菌株。同时对菌株生长所需营养物质进行优化，得到最佳的培养基方案。本发明还涉及制备液体和固体菌剂的方法及其应用。该方法工艺简便，原料来源丰富，适于工业化生产。

Description

一株兼具硫还原和铁还原能力菌株及其筛选与菌剂制备方法
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，具体是涉及一株兼具硫还原和铁还原能力菌株及其筛选与菌剂制备方法。
背景技术
广东省大宝山矿区横石河流域沉积物中检测到大量的施氏矿物和黄钾铁矾，同时伴随着多种重金属的存在(如铜、锌、镉、铬等)。在自然界中，这些次生矿物成矿后逐渐向下沉积，这个过程中氧气和氢离子被逐渐消耗，从而形成一个相对缺氧及中性的环境，此时有利于铁还原菌和硫还原菌的生长代谢。铁是一种变价金属，铁的生物氧化还原涉及多种元素的生物地球化学循环。以Fe(III)和Fe(II)为主导的铁循环过程是调控重金属迁移转化的关键因子之一，而微生物介导的异化铁还原过程能够同时实现有机污染物在厌氧条件下的氧化分解。因此，微生物导铁还原过程在生态环境及生物修复中具有重要作用。由于现代工业的决速发展，环境中有机污染物逐步的累积，导致许多被污染的环境提供了一种厌氧或缺氧的条件。而在厌氧环境下， Fe(III)成为了有机物氧化最重要的电子受体。异化铁还原细菌在污染环境修复中具有较明显优势：(1)转移重金属，除了Fe(III)外，异化铁还原细菌还可以利用其它金属如：Mn(IV)、U(VI)和Cr(VI)作为电子受体，有效还原有害重金属，降低毒性；(2)分解有机物，铁氧化物在生态系统中的含十分丰富，在无定形铁氧化物含晕更丰富的深海区域，异化铁还原对有机物分解的贡献可达75％；(3)降解有机污染物，异化铁还原细菌能够利用许多有机污染物，如苯和芳香族化合物作为电子供体。硫酸盐还原菌是厌氧土壤、湿地、沉积物中主要微生物类群，硫酸盐还原菌在厌氧环境下氧化多种有机质，以硫酸盐或其他氧化态硫化物作为电子受体，在硫循环过程中扮演着重要角色。硫酸盐还原菌(SRB)是普遍存在于自然界中的一类原核微生物，能把SO4 2-、SO3 2-、S2O3 2-等硫氧化物以及单质S还原成H2S的一类细菌的统称，据不完全统计，已分离研究的SRB有18个属近40多个种。 SRB在实现S6+到S2-的转化过、程中不形成有机硫化物的中间物，对硫元素循环有着重要作用。
目前，微生物的改性主要有诱变和基因工程的方法，但是对于微生物肥料，因为是将活的菌体直接施入土壤和环境中，因此在我国的菌肥标准中明确限制基因工程菌的应用。射线、核辐射和化学诱变是目前普遍使用的诱变育种手段，但长期使用一种诱变剂往往会使菌株产生抗性，要想获得更大的变异就必需采用新的诱变源。等离子体辐射是直接在生物分子上沉积能量，引起基因突变，从而达到诱变育种的目的。采用该方法诱变具有突变频率高、突变谱广、生理损伤小等优点。另外，采用等离子体和紫外线两种诱变剂的交替和复合使用, 可以有效避免使用单一诱变剂产生的诱变饱和效应。矿山废水、水稻土等厌氧体系中，铁硫循环对污染物的固定有重要作用，还原类微生物可以直接或者间接影响污染土壤和水体中的铁硫循环，因此对污染物的固定具有重要作用。在铁硫元素较多的水稻土以及矿山土壤和地下水中，有效地将土著铁还原以及硫还原微生物利用起来，与其他修复方法相比，对环境更为友好。生物法不会产生二次污染，操作简单，经济，并且微生物种类繁多，繁殖迅速，能够快速适应并修复环境污染。该类菌株的富集和应用研究具有很重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供种筛选一种兼具铁还原能力和硫酸盐能力细菌的方法，该筛选方法具有简便、快速且成本低的特点，通过该筛选方法能够快速筛选到铁硫还原细菌，为利用微生物异化铁硫还原过程治理重金属污染提供种质资源；
本发明的目的之二是通过紫外线-等离子体复合诱变获得一株可用于土壤重金属污染环境治理的具有高效铁硫还原能力。该菌株还具有一定的解钾能力，具有ACC脱胺酶活性，能够产生一定量的吲哚乙酸，促进植物生长；
本发明的目的之三是提供上述微生物生长所需硫源和铁源的天然替代物，对菌株的培养基进行优化，得到适合的矿物与微生物复合材料，具有一定环境意义的产品；
本发明的目的之四提供含有上述的微生物菌剂及其固体菌剂制备方法。
本发明技术方案如下：
一种具有硫还原和铁还原和硫还原能力的筛选，本发明的技术方案中兼具铁还原硫还原细菌的筛选方法包括如下步骤：
第一步 铁还原菌的富集与分离纯化
从广东省大宝山矿区采取植物根际土，横石水底泥、矿区周边农田水稻土等用于菌株筛选。将采集得到的根系(含土壤)缓慢抖落，称取根际土样品8-10g置于100m L容量瓶中，加入0.5-1 mLFe(OH)3悬液(含Fe量为7.8-15.4mg/mL)及40-50mL无菌去离子水，在25-30℃下静置暗光培养5-7d。将培养后的土壤悬液于 500-700r/min离心8-10min，取上清液作为微生物接种液。将上述接种液稀释10、100及1000倍，分别取80-100μL在固体培养基A平板上涂布，培养皿用封口膜密封，使得培养基达到厌氧条件，置30℃培养箱中避光培养2d。选择菌落分布均匀的平板，全部挑取单菌落，分别接入柠檬酸铁液体培养基中培养。培养瓶采用10ml的试管，每瓶加柠檬酸铁液体培养基4-5ml，加入液体石蜡液封。如果在培养过程中液体培养基B由黄绿色逐渐变为白色，表明柠檬酸铁已被还原，此菌株具有还原Fe(III)的功能。吸取此培养液80-100μL，在固体培养基A平板上涂布，培养皿用封口膜密封，于25-30℃避光培养2d。最大量挑取单菌落，转接于装满LB液体培养基的12-15mL带盖菌种管中，液体石蜡密封，30℃厌氧培养1-2d。吸取1ml稀释103～104倍的接种液，在柠檬酸铁固体培养基C斜面上均匀涂布，厌氧条件下于25-30℃避光培养3～4d。当铁还原微生物开始生长时，培养基中的柠檬酸铁会逐渐被还原，培养基的颜色由黄绿色逐渐变为白色。将斜面上生长的能够还原柠檬酸铁的单菌落分别挑入液体培养基B中继续培养，进一步筛选具有铁还原功能的目的菌株。挑选具有还原柠檬酸铁能力的培养瓶作为接种液，在柠檬酸铁固体培养基上再次涂布，分离纯化目标菌株。最大量挑取单菌落，转接于装满液体培养基中D 扩繁，制得菌液，重复此步骤三次，得到具有Fe(III)还原功能的菌株若干。
其中所述固体培养基A的组成为蛋白胨0.2-0.25g，胰蛋白胨 0.2-0.25，酵母膏0.3-0.5g，葡萄糖0.3-0.5g，MgSO4·7H2O 0.4-0.6g， CaCl2 0.5-0.7g，琼脂粉0.8％-1％，蒸馏水0.8-1L，pH值6.5-7.0。液体培养基B的组成为柠檬酸铁3.0-3.4g，NH4Cl 0.5-1g，CaCl2 0.05-0.07g，MgSO4·7H2O 0.5-0.6g，K2HPO4·3H2O 0.6-0.722g，KH2PO4 0.2-0.25g，碳源为0.8％-1％葡萄糖，蒸馏水0.8-1L，pH值6.5-7.0。固体培养基C的组成为柠檬酸铁3.0-3.4g，NH4Cl 0.5-1g，CaCl2 0.05-0.07g，MgSO4·7H2O 0.5-0.6g，K2HPO4·3H2O 0.6-0.722g，KH2PO4 0.2-0.25g，碳源为0.8％-1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值6.5-7.0。液体培养基D的组成为：胰蛋白胨5-10g，酵母粉3-5g，NaCl 5-10 g，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.5。
第二步硫酸盐还原菌的富集与分离纯化
称取第一步所得根际土8-10g，分别溶解到装有70-90ml无菌水及玻璃珠的三角瓶中，密封后置于恒温摇床上室温振荡25-30min，吸取0.8-1ml土壤悬浮液加入到装有70-90ml无菌液体培养基A的三角锥瓶中，摇匀，轻轻加入无菌液体石蜡封住液面，液体石蜡层的厚度约为2-3cm，塞紧塞子，30-35℃恒温静置培养，4-5d后观察到三角瓶中的液体呈现浓厚的墨色。采用双皿叠加法进行菌株的分离纯化。首先做梯度稀释，将稀释10-5-10-7倍的土壤悬液加到外皿中，倒入准备好的呈液态的固体培养基B，立即将菌液与培养基混合均匀，快速将内皿与外皿同向叠加，若有气泡应慢慢挤压排出，使内外两皿之间呈无氧状态。每个梯度做三个平行。最后，将平板倒置于生化培养箱中进行培养，温度设定为30-35℃，培养3-4d，观察平板上长出黑色的菌落。挑选较大、生长较快的菌落，分别接入到装有8-10ml SRB液体富集培养基中，培养至对数期，再按照前述方法进一步做梯度稀释，同样选取梯度为10-3、10-5、10-7涂布，再培养。重复以上的操作3次，直至固体培养基上长出的为纯菌落，得到具有硫还原能力的菌株若干。
其中所述液体培养基A的组成为K2HPO4 0.4-0.5g，(NH4)2SO4 2.0-2.5g， NaHCO30.4-0.5g，CaCl2 0.1-0.2g，MgSO4 0.8-1.0g，酵母膏1.2-1.5g，乳酸钠1.5-2.0mL中，0.3-0.5g(NH3)2Fe(SO4)2，半胱胺酸盐0.3-0.5g，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.2。
其中所述液体培养基B的组成为K2HPO4 0.4-0.5g，(NH4)2SO4 2.0-2.5g， NaHCO30.4-0.5g，CaCl2 0.1-0.2g，MgSO4 0.8-1.0g，酵母膏1.2-1.5g，乳酸钠1.5-2.0mL中，0.3-0.5g(NH3)2Fe(SO4)2，半胱胺酸盐0.3-0.5g，琼脂粉0.8％-1％，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.2。
第三步 兼具硫酸盐还原能力与铁还原能力菌株的筛选
将第一步和第二步中筛选的菌株分别进行硫酸盐还原能力和铁还原能力的测定。选取铁、硫还原能力最强的菌株各5株。将具有硫酸盐还原能力的菌株置于液体培养基A培养5d，具有铁还原能力的菌株置于培养基B，对两类菌株的硫酸盐还原能力和铁还原能力分别进行检测，得到硫铁还原能力均比较强的菌株。
其中所述液体培养基A的组成为柠檬酸铁3.0-3.4g，NH4Cl 0.5-1g， CaCl2 0.05-0.07g，MgSO4·7H2O 0.5-0.6g，K2HPO4·3H2O 0.6-0.722g， KH2PO4 0.2-0.25g，碳源为0.8％-1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值 6.5-7.0。
液体培养基B的组成为K2HPO4 0.4-0.5g，(NH4)2SO4 2.0-2.5g，NaHCO3 0.4-0.5g，CaCl2 0.1-0.2g，MgSO4 0.8-1.0g，酵母膏1.2-1.5g，乳酸钠 1.5-2.0mL中，半胱胺酸盐0.3-0.5g，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.2。第四步菌株重金属耐受能力的驯化
2、将第三步得到的菌株分别接种于含40，80，120mg/LCd2+和100， 300，500mg/LCr6+的液体培养基A中培养，在第60、120、240、360、 480、600、720和1440min时测量菌液上清液的OD600值。得到一株对重金属Cd和Cr具有耐受能力的菌株。其特征在于该菌株具有以下特性：在固体培养基B上菌落颜色呈乳白色，圆形凸起，边缘整齐；在固体培养基C上出现较为分散的黑色菌落，有整齐的边缘，圆形菌落的直径约长1.8mm；在固体培养基D中为白色菌落，边缘整齐，菌落直径大约2mm。扫描电镜图为图菌体清晰，聚在一起，细菌呈杆状。G-，好氧或兼性厌氧，呈长杆状；其最适的生长温度31～35℃，最适的pH值为6.8～7.5；在液体培养基E中硫还原能力为84.5±0.5％；在液体培养基F中铁还原能力为73.6±0.5％；在固体培养基A能够耐受120mg/L的Cd2+生长，在含Cr6+的液体培养基A中能够耐受500mg/L的Cr6+生长；在重金属污染环境中具有一定的生长优势。
其中所述液体培养基A组成为：胰蛋白胨5-10g，酵母粉3-5g，NaCl 5-10g，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.5。
其中所述固体培养基B的组成为：胰蛋白胨5-10g，酵母粉3-5g， NaCl 5-10g，琼脂粉0.8％-1％，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.5。
固体培养基C的组成为K2HPO4 0.4-0.5g，(NH4)2SO4 2.0-2.5g，NaHCO3 0.4-0.5g，CaCl2 0.1-0.2g，MgSO4 0.8-1.0g，酵母膏1.2-1.5g，乳酸钠 1.5-2.0mL中，0.3-0.5g(NH3)2Fe(SO4)2，半胱胺酸盐0.3-0.5g，琼脂粉 0.8％-1％，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.2。
固体培养基D的组成为柠檬酸铁3.0-3.4g，NH4Cl 0.5-1g，CaCl2 0.05-0.07g，MgSO4·7H2O 0.5-0.6g，K2HPO4·3H2O 0.6-0.722g，KH2PO4 0.2-0.25g，碳源为0.8％-1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值6.5-7.0。液体培养基E的组成为K2HPO4 0.4-0.5g，(NH4)2SO4 2.0-2.5g，NaHCO3 0.4-0.5g，CaCl2 0.1-0.2g，MgSO4 0.8-1.0g，酵母膏1.2-1.5g，乳酸钠 1.5-2.0mL中，0.3-0.5g(NH3)2Fe(SO4)2，半胱胺酸盐0.3-0.5g，蒸馏水 0.8-1L，pH值6.8-7.2。
固体培养基F的组成为：柠檬酸铁3.0-3.4g，NH4Cl 0.5-1g，CaCl2 0.05-0.07g，MgSO4·7H2O 0.5-0.6g，K2HPO4·3H2O 0.6-0.722g，KH2PO4 0.2-0.25g，碳源为0.8％-1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值6.5-7.0。
第五步
将第四步所得到的作为出发菌株将挑选的好的菌株加入培养基中的得到在矿物提供的铁和硫源体系中对重金属抗性的菌株进行诱变。
诱变选育过程如下：
(1)制备出发菌株的单细胞悬液
将出发菌株接种于液体培养基A中，28-32℃，150-180rpm培养8-12hrs，离心，用无菌生理盐水洗涤，置于装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞的菌悬液；
所述的液体培养基A组成为：胰蛋白胨5-10g，酵母粉3-5g，NaCl 5-10g，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.5。
(2)紫外线诱变
将步骤(1)所得的菌悬液分别调节浓度至105-107CFU/ml，取0.1-0.2ml 涂布于含固体培养基B上，进行紫外诱变，紫外诱变的频率为10-18W，照射距离为25-50cm，照射时间5-10min；28-30℃静置培养5-7d，挑选单菌落，进行摇瓶复筛，测得硫酸盐和铁还原能力较强的菌株，再分别作摇瓶复筛；
所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：首先对上述分离得到菌株接种到 100ml上述的液体培养基A中，培养8-12hrs。取5ml菌液接种到装有100ml液体培养基B的250ml的锥形瓶中，28-32℃，150rpm摇床振荡培养5-7d；
所述的固体培养基B组成为：胰蛋白胨5-10g，酵母粉3-5g，NaCl 5-10g，琼脂粉0.8％-1％，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.5。
(3)等离子体诱变
将步骤(2)所得的菌株，制成105-107CFU/ml的菌悬液，取0.1-0.2ml 均匀涂布于无菌培养皿中，将培养皿放到等离子下面的电极上，调节上电极的位置，使得上下电极之间的距离控制在3-8mm左右，调节电压为3-5V，电流为0.5-0.8A，使空气或氩气放电，得到均匀的空气或氩气介质阻挡放电等离子体，放电时间为2-7min。诱变后立即用无菌生理盐水或磷酸盐洗脱，涂布于固体培养基B上，再进行摇瓶复筛，挑出一株硫酸盐还原能力与铁还原能力最高的一株菌，制成菌悬液用于下一步的诱变；所述的摇瓶复筛的方法同步骤(2)；
(4)将步骤(3)所得的菌悬液活菌数调至105-107CFU/ml，循环重复紫外线诱变→等离子体诱变1-2次，最后得到一株耐受重金属且铁硫还原能力均比较强的菌株。
第六步
第五步筛选出具有较高硫酸盐还原和铁的菌株，加入带有不同配比的施氏矿物、石膏、针铁矿的培养基中培养7天，分别选用离子色谱法和ICP-MS检测培养过程中SO4 2-和Fe3+的变化情况。
一株兼具硫还原和铁还原能力菌株，所述菌株Enterobacter chengduensisSFRB19-1，由广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC NO：62448，保藏日期为2022年04月29日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明的优点与有益效果：
1)采用等紫外线和离子体诱变多次循环处理的方法，保证了突变菌株的稳定性；
2)本发明的矿物替代硫源以及铁源可以作为一种缓冲剂，具有良好地通透性，使重金属离子容易渗入载体内部。
3)提供的菌株具有高的铁硫还原能力，能够抗较高浓度的Cd、Cr 生长，能够分泌吲哚乙酸、ACC脱氨酶活性较高，在修复过程中具有菌肥潜质。
4)本发明的菌剂营养要求简单、易培养、生长周期短、能够进行规模化的大生产；
5)本发明的菌剂具有重金属污染土壤改良潜力，环境友好且成本低廉。
附图说明
图1为实施案例筛选出菌株的SEM图；
图2为实施案例筛选出菌株的在LB培养基上的形态图；
图3为实施案例筛选出菌株在SRB培养基上的形态图；
图4位实施案例筛选出菌株在柠檬酸铁培养基上的形态图；
图5为重金属驯化菌株对重金属镉的抗性曲线图；
图6为重金属驯化菌株对重金属铬的抗性曲线图。
具体实施方式
实施例1
强硫酸盐还原能力菌株的筛选方法，具体步骤如下：
(1)将采集得到的根系(含土壤)缓慢抖落，称取根际土样品10.00 g于100m L容量瓶中，加入1mLFe(OH)3悬液(含Fe量为7.8-15.4 mg/mL)及50mL无菌去离子水，在30℃下静置暗光培养5-7d。
(2)将步骤(1)中培养后的土壤悬液于700r/min离心10min，取上清液作为微生物接种液。将上述接种液稀释10、100及1000倍，分别取100μL在固体培养基A平板上涂布，培养皿用封口膜密封，使得培养基达到厌氧条件，置30℃培养箱中避光培养2d。选择菌落分布均匀的平板，全部挑取单菌落，分别接入柠檬酸铁液体培养基中培养。培养瓶采用10ml的试管，每瓶加柠檬酸铁液体培养基4-5ml，加入液体石蜡液封。如果在培养过程中液体培养基B由黄绿色逐渐变为白色，表明柠檬酸铁已被还原，此菌株具有还原Fe(III)的功能。
(3)吸取步骤(2)得到的培养液100μL，在固体培养基A平板上涂布，培养皿用封口膜密封，于30℃避光培养2d。最大量挑取单菌落，转接于装满液体培养基D的15mL带盖菌种管中，液体石蜡密封， 30℃厌氧培养2d。
(4)吸取步骤(3)中的培养液1ml稀释103～104倍的接种液，在柠檬酸铁固体培养基C斜面上均匀涂布，厌氧条件下于30℃避光培养 4d。当铁还原微生物开始生长时，培养基中的柠檬酸铁会逐渐被还原，培养基的颜色由黄绿色逐渐变为白色。将斜面上生长的能够还原柠檬酸铁的单菌落分别挑入液体培养基B中继续培养，进一步筛选具有铁还原功能的目的菌株。挑选具有还原柠檬酸铁能力的培养瓶作为接种液，在柠檬酸铁固体培养基上再次涂布，分离纯化目标菌株。最大量挑取单菌落，转接于装满液体培养基中D扩繁，制得菌液，重复此步骤三次，得到具有Fe(III)还原功能的菌株若干。
其中所述固体培养基A的组成为蛋白胨0.25g，胰蛋白胨0.25g，酵母膏0.5g，葡萄糖0.5g，MgSO4·7H2O 0.6g，CaCl2 0.7g，琼脂粉1％，蒸馏水1L，pH值7.0。
液体培养基B的组成为柠檬酸铁3.4g，NH4Cl 1g，CaCl2 0.07g， MgSO4·7H2O0.6g，K2HPO4·3H2O 0.722g，KH2PO4 0.25g，碳源为1％葡萄糖，蒸馏水1L，pH值7.0。
固体培养基C的组成为柠檬酸铁3.4g，NH4Cl 1g，CaCl2 0.07g， MgSO4·7H2O0.6g，K2HPO4·3H2O 0.722g，KH2PO4 0.25g，碳源为1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值7.0。
液体培养基D的组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1L，pH值7.5。
实施例2
强硫酸盐还原能力菌株的筛选方法，具体步骤如下：
(1)取10g根际土壤，分别溶解到装有90ml无菌水及玻璃珠的三角瓶中，密封后置于恒温摇床上室温振荡30min，吸取1ml土壤悬浮液加入到装有90ml无菌液体培养基A的三角锥瓶中，摇匀，轻轻加入无菌液体石蜡封住液面，液体石蜡层的厚度约为3cm，塞紧塞子，30℃恒温静置培养，5d后观察到三角瓶中的液体呈现浓厚的墨色。
(2)采用双皿叠加法进行菌株的分离纯化。首先做梯度稀释，将稀释10-5-10-7倍的土壤悬液加到外皿中，倒入准备好的呈液态的固体培养基B，立即将菌液与培养基混合均匀，快速将内皿与外皿同向叠加，若有气泡应慢慢挤压排出，使内外两皿之间呈无氧状态。每个梯度做三个平行。最后，将平板倒置于生化培养箱中进行培养，温度设定为 30℃，培养3d，观察平板上长出黑色的菌落附图2所示。挑选较大、生长较快的菌落，分别接入到装有10ml SRB液体富集培养基中，培养至对数期，再按照前述方法进一步做梯度稀释，同样选取梯度为 10-3、10-5、10-7涂布，再培养。重复以上的操作3次，直至固体培养基上长出的为纯菌落，得到具有硫还原能力的菌株若干。
其中所述液体培养基A的组成为K2HPO4 0.5g，(NH4)2SO4 2.5g， NaHCO3 0.5g，CaCl2 0.2g，MgSO4 1.0g，酵母膏1.5g，乳酸钠2.0mL， 0.5g(NH3)2Fe(SO4)2，半胱胺酸盐0.5g，蒸馏水1L，pH值6.8。
其中所述液体培养基B的组成为K2HPO4 0.5g，(NH4)2SO4 2.5g， NaHCO3 0.5g，CaCl2 0.2g，MgSO4 1.0g，酵母膏1.5g，乳酸钠2.0mL 中，0.5g(NH3)2Fe(SO4)2，半胱胺酸盐0.5g，琼脂粉1％，蒸馏水1L， pH值6.8。
实施例3
一株兼具硫酸盐还原和铁还原能力菌株筛选以及重金属抗性驯化
(1)将两类菌株分别进行硫酸盐还原能力和铁还原能力的测定。选取铁、硫还原能力最强的菌株各5株。将具有硫酸盐还原能力的菌株置于液体培养基A培养5d，具有铁还原能力的菌株置于培养基B，对两类菌株的硫酸盐还原能力和铁还原能力分别进行检测，得到硫铁还原能力均比较强的菌株。
其中所述液体培养基A的组成为柠檬酸铁3.4g，NH4Cl 1g，CaCl2 0.07g，MgSO4·7H2O 0.6g，K2HPO4·3H2O 0.722g，KH2PO4 0.25g，碳源为1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值7.0。
液体培养基B的组成为K2HPO4 0.5g，(NH4)2SO4 2.5g，NaHCO3 0.5g， CaCl2 0.2g，MgSO4 1.0g，酵母膏1.5g，乳酸钠2.0mL中，半胱胺酸盐0.5g，蒸馏水1L，pH值7.2。
(2)将(1)中所得菌株分别接种于含40，80，120mg/LCd2+和100， 300，500mg/L Cr6+的液体培养基A中培养，在第60、120、240、360、480、600、720和1440min时测量菌液上清液的OD600值。得到一株对重金属Cd和Cr具有耐受能力的菌株。其特征在于该菌株具有以下特性：在固体培养基B上如附图3所示菌落颜色呈乳白色，圆形凸起，边缘整齐；在固体培养基C上如附图2所示出现较为分散的黑色菌落，有整齐的边缘，圆形菌落的直径约长1.8mm；在固体培养基D中为白色菌落，边缘整齐，菌落直径大约2mm。扫描电镜图为附图1,所示，菌体清晰，聚在一起，细菌呈杆状。G-，好氧或兼性厌氧，呈长杆状；其最适的生长温度31～35℃，最适的pH值为6.8～7.5；在液体培养基E中硫还原能力为84.5±0.5％；在液体培养基F中铁还原能力为73.6±0.5％；在固体培养基A能够耐受 120mg/L的Cd2+生长，在含Cr6+的液体培养基A中能够耐受500mg/L 的Cr6+生长；在重金属污染环境中具有一定的生长优势，如附图4所示。
其中所述液体培养基A组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10 g，蒸馏水1L，pH值7.5。
其中所述固体培养基B的组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉1％，蒸馏水1L，pH值7.5。
固体培养基C的组成为K2HPO4 0.5g，(NH4)2SO4 2.5g，NaHCO3 0.5g， CaCl2 0.2g，MgSO4 1.0g，酵母膏1.5g，乳酸钠2.0mL中，0.5g (NH3)2Fe(SO4)2，半胱胺酸盐0.5g，琼脂粉1％，蒸馏水1L，pH值6.8。固体培养基D的组成为柠檬酸铁3.4g，NH4Cl1g，CaCl2 0.07g，MgSO4·7H2O 0.6g，K2HPO4·3H2O 0.722g，KH2PO4 0.25g，碳源为1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值7.0。
液体培养基E的组成为K2HPO4 0.4-0.5g，(NH4)2SO4 2.0-2.5g，NaHCO3 0.5g，CaCl20.2g，MgSO4 1.0g，酵母膏1.5g，乳酸钠2.0mL中， 0.5g(NH3)2Fe(SO4)2，半胱胺酸盐0.5g，蒸馏水1L，pH值6.8。
固体培养基F的组成为：柠檬酸铁3.4g，NH4Cl1g，CaCl2 0.07g， MgSO4·7H2O0.6g，K2HPO4·3H2O 0.722g，KH2PO4 0.25g，碳源为1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值7.0。
实施例4
按照本发明提供的具有解磷能力的成团肠杆菌的诱变选育方法，诱变筛选能够耐受重金属铅的解磷能力强的诱变菌株，包括以下步骤：
((1)制备出发菌株的单细胞悬液
将出发菌株接种于液体培养基A中，28℃，180rpm培养12hrs，离心，用无菌生理盐水洗涤，置于装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞的菌悬液；
所述的液体培养基A组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1L，pH值7.5。
(2)紫外线诱变
将步骤(1)所得的菌悬液分别调节浓度至105-107CFU/ml，取0.2ml 涂布于含固体培养基B上，进行紫外诱变，紫外诱变的频率为10-18W，照射距离为50cm，照射时间10min；28℃静置培养5-7d，挑选单菌落，进行摇瓶复筛，测得硫酸盐和铁还原能力较强的菌株，再分别作摇瓶复筛；
所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：首先对上述分离得到菌株接种到100ml上述的液体培养基A中，培养12hrs。取5ml菌液接种到装有 100ml液体培养基B的250ml的锥形瓶中，28℃，150rpm摇床振荡培养5-7d；
所述的固体培养基B组成为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉1％，蒸馏水1L，pH值6.8。
(3)等离子体诱变
将步骤(2)所得的菌株，制成105-107CFU/ml的菌悬液，取0.2ml 均匀涂布于无菌培养皿中，将培养皿放到等离子下面的电极上，调节上电极的位置，使得上下电极之间的距离控制在8mm左右，调节电压为5V，电流为0.8A，使空气或氩气放电，得到均匀的空气或氩气介质阻挡放电等离子体，放电时间为5min。诱变后立即用无菌生理盐水或磷酸盐洗脱，涂布于固体培养基B上，再进行摇瓶复筛，挑出一株硫酸盐还原能力与铁还原能力最高的一株菌，制成菌悬液用于下一步的诱变；所述的摇瓶复筛的方法同步骤(2)；
(4)将步骤(3)所得的菌悬液活菌数调至105-107CFU/ml，循环重复紫外线诱变→等离子体诱变1-2次，最后得到一株耐受重金属且铁硫还原能力均比较强的菌株。
实施例5
加入带有不同配比的石膏、针铁矿的液体培养基A中培养7天，分别选用离子色谱和ICP-MS检测培养过程中SO4 2-和Fe3+的变化情况，分别得到最优添加量石膏为10g，针铁矿为0.5g。
所述的液体培养基A组成为：K2HPO4 0.5g，NaHCO3 0.5g，CaCl2 0.2g， MgSO4 1.0g，酵母膏1.5g，乳酸钠2.0mL中，蒸馏水1L，pH值7.2。

Claims (10)

1.一株兼具硫还原和铁还原能力菌株，其特征在于，所述菌株Enterobacterchengduensis SFRB19-1，由广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC NO：62448，保藏日期为2022年04月29日。
2.权利要求1所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)具有Fe(III)还原功能的菌株筛选；
(2)具有硫还原能力的菌株筛选；
(3)将步骤(1)和步骤(2)所得的菌株互换培养基培养，具有硫酸盐还原能力的菌株置于液体培养基A培养4-5d，具有铁还原能力的菌株置于液体培养基B，对两类菌株的硫酸盐还原能力和铁还原能力分别进行检测，得到硫铁还原能力均比较强的菌株；
(4)将步骤(3)所得的菌株进行重金属抗性驯化，具体为：将其分别接种于含40，80，120mg/LCd2+和100，300，500mg/LCr6+的液体培养基A中培养，在第60、120、240、360、480、600、720和1440min时测量菌液上清液的OD600值，挑选长势较好的作为目标菌株，得到一株具有重金属抗性的菌株；
(5)将具有重金属抗性的菌株进行诱变，得到一株耐受重金属且铁硫还原能力较高的菌株；
(6)将所述耐受重金属且铁硫还原能力较高的菌株，加入带有不同配比的石膏、针铁矿的液体培养基A中培养6-7天，分别选用离子色谱和ICP-MS检测培养过程中SO4 2-和Fe3+的变化情况，分别得到最优添加量石膏为8-10g，针铁矿为0.3-0.5g。
3.根据权利要求2所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤如下：
(1)取从大宝山矿区所采的根际土样品8-10.00g于100mL容量瓶中，加入0.5-1mLFe(OH)3悬液及40-50mL无菌去离子水，在25-30℃下静置暗光培养5-7d；将其离心后稀释10-1000倍，分别取80-100μL在固体培养基A平板上涂布；选择菌落分布均匀的平板，全部挑取单菌落，分别接入柠檬酸铁液体培养基培养基B中培养；在培养过程中培养基由黄绿色逐渐变为白色，表明柠檬酸铁已被还原；进行分离纯化，吸取此培养液80-100μL，在固体培养基A平板上涂布，培养皿用封口膜密封，于25-30℃避光培养1-2d；最大量挑取单菌落，挑选具有还原柠檬酸铁能力的培养瓶作为接种液，在柠檬酸铁固体培养基上再次涂布，最大量挑取单菌落，转接于液体培养基C中扩繁，制得菌液，重复此步骤三次，得到具有Fe(III)还原功能的菌株若干；
其中所述固体培养基A其中所述固体培养基A的组成为蛋白胨0.2-0.25g，胰蛋白胨0.2-0.25，酵母膏0.3-0.5g，葡萄糖0.3-0.5g，MgSO4·7H2O 0.4-0.6g，CaCl2 0.5-0.7g，琼脂粉0.8％-1％，蒸馏水0.8-1L，pH值6.5-7.0；
液体培养基B的组成为柠檬酸铁3.0-3.4g，NH4Cl 0.5-1g，CaCl20.05-0.07g，MgSO4·7H2O 0.5-0.6g，K2HPO4·3H2O 0.6-0.722g，KH2PO40.2-0.25g，碳源为0.8％-1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值6.5-7.0；液体培养基C的组成为：胰蛋白胨5-10g，酵母粉3-5g，NaCl 5-10g，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.5。
4.根据权利要求2所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤如下：
取根际土8-10g分别溶解到装有70-90ml无菌水及玻璃珠的三角瓶中，密封后置于恒温摇床上室温振荡25-30min，吸取0.8-1ml土壤悬浮液加入到装有70-90ml无菌液体培养基A的三角锥瓶中，摇匀，轻轻加入无菌液体石蜡封住液面，液体石蜡层的厚度约为2-3cm，塞紧塞子，30-35℃恒温静置培养，4-5d后观察到三角瓶中的液体呈现浓厚的墨色；采用双皿叠加法进行菌株的分离纯化；首先做梯度稀释，将稀释10-5-10-7倍的土壤悬液加到外皿中，倒入事先准备好的呈液态的固体富集培养基B，立即将菌液与培养基混合均匀，快速将内皿与外皿同向叠加，若有气泡应慢慢挤压排出，使内外两皿之间呈无氧状态；最后，将平板倒置于生化培养箱中进行培养，温度设定为30-35℃，培养3-4d，观察平板上长出黑色的菌落；挑选较大、生长较快的菌落，分别接入到装有8-10ml SRB液体富集培养基中，培养至对数期，再按照前述方法进一步做梯度稀释，同样选取梯度为10-3、10-5、10-7涂布，再培养；重复以上的操作3次，直至固体培养基上长出的为纯菌落，得到具有硫还原能力的菌株若干；
其中所述液体培养基A的组成为K2HPO4 0.4-0.5g，(NH4)2SO4 2.0-2.5g，NaHCO3 0.4-0.5g，CaCl2 0.1-0.2g，MgSO4 0.8-1.0g，酵母膏1.2-1.5g，乳酸钠1.5-2.0mL中，0.3-0.5g(NH3)2Fe(SO4)2，半胱胺酸盐0.3-0.5g，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.2；
其中所述液体培养基B的组成为K2HPO4 0.4-0.5g，(NH4)2SO4 2.0-2.5g，NaHCO3 0.4-0.5g，CaCl2 0.1-0.2g，MgSO4 0.8-1.0g，酵母膏1.2-1.5g，乳酸钠1.5-2.0mL中，0.3-0.5g(NH3)2Fe(SO4)2，半胱胺酸盐0.3-0.5g，琼脂粉0.8％-1％，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.2。
5.根据权利要求2所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，所述液体培养基A的组成为柠檬酸铁3.0-3.4g，NH4Cl 0.5-1g，CaCl2 0.05-0.07g，MgSO4·7H2O 0.5-0.6g，K2HPO4·3H2O 0.6-0.722g，KH2PO4 0.2-0.25g，碳源为0.8％-1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值6.5-7.0；
步骤(3)中，液体培养基B的组成为K2HPO4 0.4-0.5g，(NH4)2SO42.0-2.5g，NaHCO3 0.4-0.5g，CaCl2 0.1-0.2g，MgSO4 0.8-1.0g，酵母膏1.2-1.5g，乳酸钠1.5-2.0mL中，半胱胺酸盐0.3-0.5g，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.2。
6.根据权利要求2所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(4)中，所述液体培养基A组成为：胰蛋白胨5-10g，酵母粉3-5g，NaCl 5-10g，蒸馏水1000ml，pH值6.8-7.5。
7.根据权利要求3所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法，其特征在于，该菌株具有以下特性：在固体培养基A上菌落颜色呈乳白色，圆形凸起，边缘整齐；在固体培养基B上出现较为分散的黑色菌落，有整齐的边缘，圆形菌落的直径约长1.8mm；在固体培养基C中为白色菌落，边缘整齐，菌落直径大约2mm；SEM扫描电镜图菌体清晰，聚在一起，细菌呈杆状；G-，好氧或兼性厌氧，呈长杆状；其最适的生长温度31～35℃，最适的pH值为6.8～7.5；在液体培养基D中硫还原能力为84.5±0.5％；在液体培养基E中铁还原能力为73.6％±0.5；在固体培养基A能够耐受120mg/l的Cd2+生长，在含Cr6+的液体培养基A中能够耐受500mg/L的Cr6+生长；在重金属污染环境中具有一定的生长优势。
8.根据权利要求7所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法，其特征在于，其中所述固体培养基A的组成为：胰蛋白胨5-10g，酵母粉3-5g，NaCl 5-10g，琼脂粉0.8％-1％，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.5；
固体培养基B的组成为：K2HPO4 0.4-0.5g，(NH4)2SO4 2.0-2.5g，NaHCO3 0.4-0.5g，CaCl20.1-0.2g，MgSO4 0.8-1.0g，酵母膏1.2-1.5g，乳酸钠1.5-2.0mL中，0.3-0.5g(NH3)2Fe(SO4)2，半胱胺酸盐0.3-0.5g，琼脂粉0.8％-1％，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.2；
固体培养基C的组成为：柠檬酸铁3.0-3.4g，NH4Cl 0.5-1g，CaCl20.05-0.07g，MgSO4·7H2O 0.5-0.6g，K2HPO4·3H2O 0.6-0.722g，KH2PO40.2-0.25g，碳源为0.8％-1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值6.5-7.0；液体培养基D的组成为柠檬酸铁3.0-3.4g，NH4Cl 0.5-1g，CaCl20.05-0.07g，MgSO4·7H2O 0.5-0.6g，K2HPO4·3H2O 0.6-0.722g，KH2PO40.2-0.25g，碳源为0.8％-1％葡萄糖，蒸馏水1000m，pH值6.5-7.0；液体培养基E的组成为K2HPO4 0.4-0.5g，(NH4)2SO4 2.0-2.5g，NaHCO30.4-0.5g，CaCl2 0.1-0.2g，MgSO4 0.8-1.0g，酵母膏1.2-1.5g，乳酸钠1.5-2.0mL中，半胱胺酸盐0.3-0.5g，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.2。
9.根据权利要求2所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法，其特征在于，所述诱变方法为：
(1)制备出发菌株的单细胞悬液：
将具有重金属抗性的菌株作为出发菌株接种于液体培养基A中，30-35℃，150-180rpm培养8-12hrs，离心，用无菌生理盐水洗，置于装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞的菌悬液；
所述的液体培养基A组成为：胰蛋白胨5-10g，酵母粉3-5g，NaCl 5-10g，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.5；
(2)紫外线诱变
将步骤(1)所得的菌悬液分别调节浓度至105-107CFU/ml，取0.1ml涂布于含固体培养基B上，进行紫外诱变，紫外诱变的频率为10-18W，照射距离为25-50cm，照射时间5-10min；28-30℃静置培养5-7days，挑选单菌落，进行摇瓶复筛，测得硫酸盐和铁还原能力较强的菌株，再分别作摇瓶复筛；
所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：首先对上述分离得到菌株接种到100ml上述的液体培养基A中，培养8-12hrs；取5ml菌液接种到装有100ml液体培养基B的250ml的锥形瓶中，28-32℃，150rpm摇床振荡培养5-7days；
所述的固体培养基B组成为：胰蛋白胨5-10g，酵母粉3-5g，NaCl 5-10g，琼脂粉0.8％-1％，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.5；
(3)等离子体诱变
将步骤(2)所得的菌株，制成105-107CFU/ml的菌悬液，取0.1-0.2ml均匀涂布于无菌培养皿中，将培养皿放到等离子下面的电极上，调节上电极的位置，使得上下电极之间的距离控制在3-8mm左右，调节电压为3-5V，电流为0.5-0.8A，使空气或氩气放电，得到均匀的空气或氩气介质阻挡放电等离子体，放电时间为2-7min；诱变后立即用无菌生理盐水或磷酸盐洗脱，涂布于固体培养基B上，再进行摇瓶复筛，挑出一株硫酸盐还原能力与铁还原能力最高的一株菌，制成菌悬液用于下一步的诱变；所述的摇瓶复筛的方法同步骤(2)；
(4)将步骤(3)所得的菌悬液活菌数调至105-107CFU/ml，循环重复紫外线诱变→等离子体诱变1-2次，最后得到一株耐受重金属且铁硫还原能力较高的菌株。
10.根据权利要求2所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法，其特征在于，其特征在于，步骤(6)中，所述的液体培养基A组成为：K2HPO4 0.4-0.5g，NaHCO3 0.4-0.5g，CaCl20.1-0.2g，MgSO40.8-1.0g，酵母膏1.2-1.5g，乳酸钠1.5-2.0mL中，蒸馏水0.8-1L，pH值6.8-7.2。
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