CN109679861A - 一株高耐受镍菌株Bacillus sp.Z1A及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高耐受镍菌株Bacillus sp.Z1A及其应用，Bacillus sp.Z1a是申请人分离自蒙古矿山土壤，显示出较好的镍耐受性和镍吸附能力的菌种，该菌种可应用于镍去除。

Description

一株高耐受镍菌株Bacillus sp.Z1A及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，通过微生物筛选，从矿区土壤得到一种具有镍高耐受性，同时对镍有一定去除能力的菌株Bacillus sp.Z1a。
技术背景
重金属原义是指比重大于5的金属(密度大于4.5克每立方厘米的金属)，包括金、银、铜、铁、铅、镍等。重金属污染与其他有机化合物的污染不同。不少有机化合物可以通过自然界本身物理的、化学的或生物的净化，使有害性降低或解除。而重金属具有富集性，很难在环境中降解。重金属污染指由重金属或其化合物造成的环境污染。其危害程度取决于重金属在环境、食品和生物体中存在的浓度和化学形态。重金属污染主要表现在水污染中，还有一部分是在大气和固体废物中。重金属在人体内能和蛋白质及各种酶发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中富集，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒等，对人体会造成很大的危害，例如，日本发生的水俣病(汞污染)和骨痛病(镉污染)等公害病，都是由重金属污染引起的。
镍污染是由镍及其化合物所引起的环境污染。冶炼镍矿石及冶炼钢铁时，部分矿粉会随气流进入大气。在焙烧过程中也有镍及其化合物排出，主要为不溶于水的硫化镍(NiS)，氧化镍(NiO)、金属镍粉尘等，成为大气中的颗粒物。燃烧生成的镍粉尘遇到热的一氧化碳，会生成易挥发的、剧毒的致癌物羰基镍[Ni(CO)4]。精炼镍的作业工人，患鼻腔癌和肺癌的发病率较高。镀镍工业、机器制造业、金属加工业的废水中常含有镍，常用碱法处理工业废水，使其生成氢氧化镍[Ni(OH)2]沉淀而清除掉。镍可在土壤中富集，含镍的大气颗粒物沉降、含镍废水灌溉、动植物残体腐烂、岩石风化等都是土壤中镍的来源。植物生长会吸收土壤中的镍。镍含量最高的植物是绿色蔬菜和烟草，可达1.5-3ppm。镍对水稻产生毒性的临界浓度是20ppm。中国规定车间空气中羰基镍的最高容许浓度为0.001mg/m3，地面水中镍的最高容许浓度为0.5mg/L。无论水体或土壤中的Ni都需得到处理.。
目前，国内关于微生物对镍污染修复，尤其是单菌种的报道十分稀少，相关研究也并未深入展开。
发明内容
本发明的目的是提供一种对重金属镍具有高耐受性和去除效率、对环境不造成外源污染的枯草芽孢杆菌，以及将其应用于镍去除。
Bacillus sp.Z1a是申请人分离自蒙古矿山土壤，显示出较好的镍耐受性和镍吸附能力的菌种，于2018年12月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2018863。
该菌株的筛选及鉴定方法如下：
1)采集土壤样品：含重金属镍的土壤样品采自蒙古国中央省扎玛尔苏木的金矿，用无菌聚乙烯袋密封，4℃下保存。
2)重金属镍耐受菌的筛选：对于重金属镍耐受菌株的初步筛选，将5g土壤样品转移至100ml无菌蒸馏水中，并置于30℃，220rpm摇床中30分钟。使用连续稀释法将样品稀释至10-10000倍，并将其接种在高压灭菌的Luria-Bertani琼脂生长培养基上，加以1mM的Ni(II)。将接种的平板在30℃下在培养箱中倒置48小时。将存活的菌落转移至较高浓度的重金属离子修饰的培养基并孵育4-6天。使用微生物学-实验室手册2017进一步鉴定细菌菌株特征。根据Bergey手册进行鉴定菌落的表型，生长条件，染色和生化测试，例如过氧化氢酶反应，氧化酶试验，硝酸盐还原，脲酶试验，IMViC(吲哚，甲基红，Voges-Proskauer，柠檬酸盐)试验。
3)分离菌株重金属镍耐受浓度实验：将分离所得的菌种接种在添加1mM Ni(II)的Luria-Bertani琼脂生长培养基上，以未接种的添加1mM Ni(II)的Luria-Bertani琼脂生长培养基为对照，置于30℃培养箱中孵育5天。观察菌种存活情况，若与对照组相比，平板上可观察到单菌落存在，则以1mM的浓度梯度提高所添加的Ni(II)浓度。重复上述实验，直至培养基上无单菌落存在。
4)细菌分离物的16S rDNA测序：从LB肉汤过夜培养物中，按照说明书使用EasyPure Bacteria Genomic DNA试剂盒提取总基因组DNA。通过使用通用引物，正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和反向引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)(13Lane)扩增16S rDNA。对于PCR扩增混合物，2x PhantaMaster Mix(Vazyme)25μl，提取DNA1 μl，正向引物2μl，反向引物2μl和蒸馏水20μl。放大的温度设定如下：初始温度95℃3分钟，94℃变性15秒，56℃退火15秒，72℃延伸1分40秒，72℃最终伸长5分钟，最终保持在4℃。PCR产物通过切胶和纯化的序列进行测序。NCBI核苷酸碱基局部比对搜索工具(BLAST)用于分析数据。用MEGA-X构建系统发生树，使用ClusterW和邻接方法比对序列数据。
确定所得的菌株菌属后，对该菌株的镍吸附能力进行实验，实验方法如下：
1.从已有的划线平板中挑取单菌落，接入100mlLB中，37℃摇床过夜培养。
2.从上述100mlLB中取2ml菌液，转接入新的100mlLB中，37℃摇床培养至OD600＝1.0左右。
3.将菌液倒入50ml大离心管中，5000rpm×5min，多次离心。
4.收集完毕后，用5ml 0.9％NaCl溶液重悬菌体，5000rpm×5min，重复三次用以洗涤菌体。注意重悬时要均匀，不能有大块菌体。
5.洗菌结束后，用5ml 0.9％NaCl溶液重悬菌体，将重悬液倒入100ml 0.9％NaCl溶液，4℃保存14-16h，用于制备休止细胞。
6.将低温保存的细胞用50ml离心管5000rpm×5min离心收集，用5ml 0.9％NaCl溶液重悬菌体，将菌液倒入已配好的金属溶液中，37℃摇床培养24h。
7.用ICP检测重金属离子浓度。
附图说明
生物材料保藏信息：
Bacillus sp.Z1a于2018年12月6日在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号CCTCC NO：M2018863。
具体实施方式
样品来源：Bacillus sp.Z1a是申请人分离自蒙古矿山土壤，显示出较好的镍耐受性和镍吸附能力的菌种，于2018年12月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018863。
(1)Z1a生理生化实验结果：菌落形状是不规则的，波状边缘，干燥的质地，直径约4.5毫米。革兰氏染色结果呈紫色，说明是阳性。生化测试结果见下表1。
表1：Z1a相关生化测试结果
(2)16s rDNA测序结果：通过使用通用引物，正向引物27F
(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和反向引物1492R
(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)(13Lane)扩增16S rDNA。对于PCR扩增混合物，2xPhantaMaster Mix(Vazyme)25μl，提取DNA1 μl，正向引物2μl，反向引物2μl和蒸馏水20μl。放大的温度设定如下：初始温度95℃3分钟，94℃变性15秒，56℃退火15秒，72℃延伸1分40秒，72℃最终伸长5分钟，最终保持在4℃。PCR产物通过切胶和纯化的序列进行测序。测序结果如下：
(3)绘制进化树：使用邻接法推断了进化历史。显示了具有分支长度之和＝517.35434602的最佳树。树按比例绘制，分支长度与用于推断系统发育树的进化距离的分支长度相同。使用差异方法计算进化距离，并以每个序列的碱基差异数为单位。该分析涉及28个核苷酸序列。密码子职位包括第1+第2+第3+非编码。针对每个序列对(成对删除选项)移除所有模糊位置。最终数据集中共有1468个职位。进化分析在MEGA X中进行。结果如表2所示：
表2：进化树绘制结果
(4)菌株对镍的耐受性实验结果：实验室共筛得2株对镍具有耐受性的菌株，并命名为Z1a和Z2b，对其耐受极限进行实验，试验方法如上所述。最终，当Ni(II)达到7mM时，两者在LB平板上均不生长，即二者的最小抑菌浓度为7mM。
表3：不同重金属对Z1a和Z2b的最小抑菌浓度
(5)菌株对镍的吸附能力实验结果：对Z1a和Z2b进行吸附能力测试，测试方法概括为先制备二者的休止细胞，再将休止细胞转入已配置好的镍溶液中，24h后用ICP检测镍浓度。结果如表4：
表4：Z1a和Z2b对镍吸附能力实验结果
从表4可以看出，Z1a对镍的吸附能力较强。

Claims (2)

1.一株高耐受镍菌株Bacillus sp.Z1a CCTCC M 2018863。
2.如权利要求1所述的菌株应用于镍去除。
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