CN102391977A

CN102391977A - 谷氨酸棒杆菌及采用该菌发酵生产α-酮戊二酸的方法

Info

Publication number: CN102391977A
Application number: CN2011103927788A
Authority: CN
Inventors: 陈宁; 谢希贤; 徐庆阳; 刘淑云; 谢沛
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Intellectual Property Protection Center Of Wuxi Economic Development Zone
Priority date: 2011-12-01
Filing date: 2011-12-01
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2031-12-01
Also published as: CN102391977B

Abstract

一种谷氨酸棒杆菌及采用该菌发酵生产α-酮戊二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明菌株为一株谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）GKG-047，保藏编号CGMCC No.5481。该菌株是以一株谷氨酸产生菌GDK-9为亲本，通过诱变筛选出对甲氨蝶呤敏感的突变株。在氮源限量供应的情况下，该菌株能积累α-酮戊二酸。该菌株发酵为好氧发酵，菌体生长快，产酸速率快。该菌株在10L发酵罐上发酵32hα-酮戊二酸产量最高可达47.2g/L。发酵工艺简单，易于控制，α-酮戊二酸的生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。

Description

谷氨酸棒杆菌及采用该菌发酵生产α-酮戊二酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株α-酮戊二酸产生菌，特别是一种生产α-酮戊二酸的谷氨酸棒杆菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产α-酮戊二酸。

背景技术

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)，又称为α-胶酮酸，2-氧代戊二酸，α-羰基戊二酸，分子式：C₅H₆O₅，分子量146.1，外观为白色或类白色结晶粉末，易溶于水，在细胞代谢中起着重要的作用，是三羧酸循环的重要中间产物之一，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢。α-酮戊二酸广泛应用于食品、医药、有机合成、化妆品和饲料等工业中。在食品工业中，α-酮戊二酸可作为运动营养饮料的主要成分，另外作为一种营养强化剂能有效降低术后患者和病人的机体损耗主要。在医药工业中，α-酮戊二酸主要作为生化试剂和测肝功能的配套试剂。另外α-酮戊二酸还具有抗氰作用，与亚硝酸钠、硫代硫酸钠配合使用可提高抗氰能力，具有抗惊厥作用。在饲料工业中，α-酮戊二酸可以提高动物抗应激能力，增强免疫功能，促进骨骼发育，提高繁殖率。随着α-酮戊二酸应用范围不断扩大，市场需求也在不断增长。

α-酮戊二酸生产方法主要有有机合成法和微生物发酵法。目前α-酮戊二酸的生产主要采用的是有机合成法，以丁二酸二乙酯、草酸二乙酯等为原料，经缩合、水解合成α-酮戊二酸。有机合成法虽然具有收率高、原料易得、反应步骤短、反应条件温和、易于工业化放大的特点，但在多步复杂的合成反应过程中会产生大量副产物从而增加分离难度、降低生产率，同时也会产生诸如氰化物等剧毒品及重金属污染。

微生物发酵法生产α-酮戊二酸的研究最早始于1946年，Lockwook和Stodola首先对利用细菌生物合成α-酮戊二酸进行了初步的研究。上世纪60年代，Tsugawa等首次发现了解脂亚洛酵母具有过量合成α-酮戊二酸的能力。发酵法生产α-酮戊二酸取得突破是在上世纪90年代末，Finogenva等选育出一株可以利用乙醇为唯一碳源生产α-酮戊二酸的高产菌解脂亚洛酵母N1，同时研究了硫胺素浓度、氮源浓度、溶氧以及pH值等营养与环境条件对α-酮戊二酸产量的影响。通过在发酵后期补加氮源并使发酵液中氮源浓度维持在0.9～1.3g/L，溶氧维持在5％，发酵进行到144h时α-酮戊二酸产量达到49g/L，α-酮戊二酸对乙醇产率系数0.42，实现了α-酮戊二酸的过量积累。李寅等在研究光滑球拟酵母WSH-IP303丙酮酸发酵过程的代谢网络分析时发现，在WSH-IP303摇瓶发酵中有少量的α-酮戊二酸的积累，且α-酮戊二酸的产量随着CaCO₃、硫胺素、生物素浓度的增加及装液量的减少而增加。陈坚等从炼油厂附近的土壤中筛选出硫胺素营养缺陷型的解脂亚洛酵母WSH-Z06，通过对发酵培养基中组成成分进行优化，发酵6d时α-酮戊二酸产量达到39.3g/L。综上，目前发酵法生产α-酮戊二酸的研究主要集中在解脂亚洛酵母和光滑球拟酵母，从已报道的产量来看，个别菌株也具备了一定工业化生产潜力。但采用解脂亚洛酵母或光滑球拟酵母发酵生产α-酮戊二酸仍然存在如发酵周期过长(＞70h)，产量偏低，生产成本过高等问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种α-酮戊二酸产生菌和用该菌株发酵法生产α-酮戊二酸。该制备方法能显著提高α-酮戊二酸产量、缩短生产周期、降低生产成本。

本发明的技术方案：

本发明提供的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)GKG-047，已于2011年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.5481，该菌株具有酮基丙二酸、氟乙酸、磺胺胍、谷氨酰胺抗性和甲氨喋呤敏感的遗传标记；谷氨酸棒杆菌突变株GKG-047在氮源充足的情况下积累L-谷氨酸，在氮源限量供应的情况下积累α-酮戊二酸。

本发明所述采用谷氨酸棒杆菌GKG-047经发酵生产α-酮戊二酸的方法，其步骤如下：

第1、种子培养：从新鲜活化斜面挑取一环谷氨酸棒杆菌GKG-047接入装有20～30mL种子培养基的500mL三角瓶中，8层纱布封口，置于迴转式摇床上，200～300r/min，32～36℃振荡培养6～8h；

第2、发酵罐发酵：按5～15％接种量将第1步的种子液接入发酵培养基中进行发酵，发酵温度34～38℃，通风比1∶0.3～0.8，搅拌转速300～800r/min，溶氧维持在10～40％，流加质量百分比浓度为60～80％的葡萄糖维持残糖为1％～2％；0～8h，流加25％的氨水调节发酵液pH值至6.8～7.2；8h以后，流加质量百分比浓度为10～20％的NaOH调节发酵液的pH值至6.8～7.2，发酵时间30～40h。

所述种子培养基中各组分为：葡萄糖20～50g/L，玉米浆20～30mL/L，Na₂HPO₄1～4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～2g/L，尿素1～4g，余量为水，pH 6.8～7.2。

所述发酵培养基中各组分为：葡萄糖60～140g/L，糖蜜1～5g/L，玉米浆20～40mL/L，Na₂HPO₄2～4g/L，KCl 1～5g/L，MgSO₄·7H₂O 1～5g/L，MnSO₄·H₂O 2～10mg/L，FeSO₄·7H₂O2～10mg/L，VB₁2～10mg/L，余量为水，pH 6.8～7.2。

本发明的优点和积极效果：

(1)甲氨喋呤是脱氢酶系的抑制剂，在细胞中抑制丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活性。谷氨酸产生菌GDK-9为常规育种选育的谷氨酸产生菌，在氮源充足的情况下积累L-谷氨酸。以GDK-9为出发菌选育的对甲氨喋呤敏感的突变株，其α-酮戊二酸脱氢酶活性低，因此在氮源限量供应的情况下转为积累α-酮戊二酸。

(2)该菌株发酵为好氧发酵，菌体生长快，产酸速率快。与国内已申请专利描述利用解脂亚洛酵母液态发酵6d时α-酮戊二酸产量达39.3g/L相比，该菌株在10L发酵罐上发酵32hα-酮戊二酸产量最高可达47.2g/L。

(3)发酵工艺简单，易于控制，α-酮戊二酸的生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。

具体实施方式

实施例1：谷氨酸棒杆菌突变株GKG-047的获得

本发明以一株谷氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)GDK-9为出发菌【GDK-9具有酮基丙二酸、氟乙酸、磺胺胍、谷氨酰胺抗性遗传标记，它的定向育种研究发表在2008年《食品与发酵工业》第34卷第7期，现保藏于天津科技大学代谢工程研究室】，通过诱变筛选出一株对甲氨蝶呤敏感的突变株，命名为谷氨酸棒杆菌GKG-047，该菌株在氮源限量供应的情况下能积累α-酮戊二酸。

α-酮戊二酸产生菌的诱变与选育

诱变：以谷氨酸棒杆菌GDK-9为出发菌，取新鲜活化斜面菌种于完全液体培养基中。32℃，200r/min，振荡培养12h后，4000r/min离心10min收集菌体。菌体用pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤两遍后，加入终浓度为1～5mg/mL的亚硝基胍(NTG)诱变处理15～30min，4000r/min离心10min收集菌体。诱变处理菌体适当稀释后，涂布于含1～5mg/L甲氨蝶呤的基本培养基平板。32℃恒温培养4～5d，挑选200株生长微弱的小菌落转接斜面，供进一步作摇管初筛和摇瓶复筛等用。

初筛：将所得到的突变株从活化斜面取一环接种到装有6mL筛选培养基的摇管中。置巡回式摇床上，200r/min，32℃振荡培养48h。培养结束后，菌液经4000r/min离心10min后，上清用高效液相色谱测定α-酮戊二酸的含量，产量相对较高的50株突变株用摇瓶进一步复筛。

复筛：接一环初筛得到的菌体到装有30mL筛选培养基的500mL三角瓶中，200r/min，32℃振荡培养48h。菌液上清采用高效液相色谱方法比较α-酮戊二酸产量高低，获得α-酮戊二酸产量最高的突变株GKG-047。

α-酮戊二酸检测工作条件：Agilent 1200型高效液相色谱仪；色谱柱：Eclipse XDB-C18(4.5×150mm，3.5um)；紫外检测器，检测波长215nm；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相：0.05mol/L(NH₄)₂HPO₄缓冲液，pH值2.5。

所述完全液体培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 2.5g/L，pH 7.0～7.2。

所述基本培养基中各组分为：葡萄糖10g/L，(NH₄)₂SO₄10g/L，KH₂PO₄·3H₂O 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，V_H 100μg/L，V_B1 100μg/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0～7.2。

所述筛选培养基组成为：葡萄糖10～20g/L，蛋白胨0.5～2g/L，酵母膏0.5～2g/L，(NH₄)₂SO₄0.2～1g/L，KH₂PO₄·3H₂O 0.1～0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.002～0.01g/L，MnSO₄·H₂O 0.002～0.01g/L，pH 7.0～7.2。

实施例2：突变株GKG-047的5L发酵罐发酵

1)种子培养：从新鲜活化斜面挑取一环谷氨酸棒杆菌GKG-047菌苔接入装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中。种子培养基中各组分为：葡萄糖20g/L，玉米浆20mL/L，Na₂HPO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，尿素1g，余量为水，pH 7.0～7.2。8层纱布封口，置于迴转式摇床上，200r/min，32℃振荡培养8h。

2)发酵罐发酵：按5％接种量将种子液接入装有3L发酵培养基的5L全自动发酵罐中。发酵培养基中各组分为：葡萄糖60g/L，糖蜜2g/L，玉米浆20ml/L，Na₂HPO₄2g/L，KCl 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，MnSO₄·H₂O 2mg/L，FeSO₄2mg/L，VB₁2mg/L，余量为水，pH 7.0～7.2。发酵温度34℃，通风比1∶0.5～0.8，搅拌转速300～700r/min，溶氧维持在10～30％，流加质量百分比浓度为80％的葡萄糖维持残糖为1％～2％。菌体生长前期0～8h，流加25％的氨水调节发酵液pH值至7.0～7.2。8h以后，流加质量百分比浓度为20％的NaOH调节发酵液的pH值至7.0～7.2，发酵时间35h。

3)发酵液中α-酮戊二酸检测：发酵液离心后的上清液用无菌去离子水稀释5倍，用高效液相色谱测定α-酮戊二酸的含量。测定条件同实施例1。检测结果，α-酮戊二酸的产量为42.5g/L。

实施例3：突变株GKG-047的5L发酵罐发酵

利用5L全自动发酵罐进行α-酮戊二酸发酵，种子培养基、发酵培养基和种子培养方法同实施例2。按10％接种量将种子液接入装有3L发酵培养基的5L全自动发酵罐中，发酵温度36℃，通风比1∶0.5～1，搅拌转速300～700r/min，溶氧维持在10～30％，流加质量百分比浓度为80％的葡萄糖维持残糖为1％～2％。菌体生长前期0～8h，流加25％的氨水调节发酵液pH值至7.0～7.2。8h以后，流加质量百分比浓度为20％的NaOH调节发酵液的pH值至7.0～7.2，发酵时间35h。

发酵液离心后的上清液用无菌去离子水稀释5倍，用高效液相色谱测定α-酮戊二酸的含量。测定条件同实施例1。检测结果，α-酮戊二酸的产量为45.9g/L。

实施例4：突变株GKG-047的5L发酵罐发酵

利用5L全自动发酵罐进行α-酮戊二酸发酵，种子培养基、发酵培养基和种子培养方法同实施例2。按15％接种量将种子液接入装有3L发酵培养基的5L全自动发酵罐中，发酵温度38℃，通风比1∶0.5～1，搅拌转速300～700r/min，溶氧维持在10～30％，流加质量百分比浓度为80％的葡萄糖维持残糖为1％～2％。菌体生长前期0～8h，流加25％的氨水调节发酵液pH值至7.0～7.2。8h以后，流加质量百分比浓度为20％的NaOH调节发酵液的pH值至7.0～7.2，发酵时间33h。

发酵液离心后的上清液用无菌去离子水稀释5倍，用高效液相色谱测定α-酮戊二酸的含量。测定条件同实施例1。检测结果，α-酮戊二酸的产量为40.8g/L。

实施例5：突变株GKG-047的10L发酵罐发酵

利用10L全自动发酵罐进行α-酮戊二酸发酵。种子培养基中各组分为：葡萄糖30g/L，玉米浆30mL/L，Na₂HPO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，尿素1g，余量为水，pH6.8～7.2。种子培养方法同实施例2。按10％接种量将种子液接入装有6L发酵培养基的10L全自动发酵罐中。发酵培养基中各组分为：葡萄糖100g/L，糖蜜2g/L，玉米浆20mL/L，Na₂HPO₄2g/L，KCl 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，MnSO₄·H₂O 2mg/L，FeSO₄·7H₂O2mg/L，VB₁2mg/L，余量为水，pH 6.8～7.2。发酵温度36℃，通风比1∶0.5～0.8，搅拌转速300～800r/min，溶氧维持在10～40％，流加质量百分比浓度为80％的葡萄糖维持残糖为1％～2％。0～8h，流加25％的氨水调节发酵液pH值至7.0～7.2。8h以后，流加质量百分比浓度为20％的NaOH调节发酵液的pH值至7.0～7.2，发酵时间32h。

发酵液离心后的上清液用无菌去离子水稀释5倍，用高效液相色谱测定α-酮戊二酸的含量。测定条件同实施例1。检测结果，α-酮戊二酸的产量为47.2g/L。

实施例6：突变株GKG-047的10L发酵罐发酵

利用10L全自动发酵罐进行α-酮戊二酸发酵。种子培养基各组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆30mL/L，Na₂HPO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，尿素1g，余量为水，pH 6.8～7.2。种子培养方法同实施例2。按10％接种量将种子液接入装有6L发酵培养基的10L全自动发酵罐中，发酵培养基同实施例5，发酵条件和过程控制同实施例5，发酵时间32h。

发酵液离心后的上清液用无菌去离子水稀释5倍，用高效液相色谱测定α-酮戊二酸的含量。测定条件同实施例1。检测结果，α-酮戊二酸的产量为44.0g/L。

实施例7：突变株GKG-047的10L发酵罐发酵

利用10L全自动发酵罐进行α-酮戊二酸发酵。种子培养基同实施例5，种子培养方法同实施例2。按10％接种量将种子液接入装有6L发酵培养基的10L全自动发酵罐中。发酵培养基中各组分为：葡萄糖140g/L，糖蜜2g/L，玉米浆40mL/L，Na₂HPO₄2g/L，KCl 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，MnSO₄·H₂O 2mg/L，FeSO₄·7H₂O 2mg/L，VB₁2mg/L，余量为水，pH 6.8～7.2。发酵条件和过程控制同实施例5，发酵时间32h。

发酵液离心后的上清液用无菌去离子水稀释5倍，用高效液相色谱测定α-酮戊二酸的含量。测定条件同实施例1。检测结果，α-酮戊二酸的产量为40.2g/L。

Claims

1.谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)GKG-047，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.5481。

2.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于具有酮基丙二酸、氟乙酸、磺胺胍、谷氨酰胺抗性和甲氨喋呤敏感的遗传标记；谷氨酸棒杆菌突变株GKG-047在氮源充足的情况下积累L-谷氨酸，在氮源限量供应的情况下积累α-酮戊二酸。

3.一种采用权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌GKG-047经发酵生产α-酮戊二酸的方法，其特征为步骤如下：

第2、发酵罐发酵：按5～15％接种量将第1步的种子液接入发酵培养基中进行发酵，发酵温度34～38℃，通风比1∶0.5～1，搅拌转速300～800r/min，溶氧维持在10～40％，流加质量百分比浓度为60～80％的葡萄糖维持残糖为1％～2％；0～8h，流加25％的氨水调节发酵液pH值至6.8～7.2；8h以后，流加质量百分比浓度为10～20％的NaOH调节发酵液的pH值至6.8～7.2，发酵时间30～35h。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述种子培养基中各组分为：葡萄糖20～50g/L，玉米浆20～30mL/L，Na₂HPO₄1～4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～2g/L，尿素1～4g，余量为水，pH 6.8～7.2。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中各组分为：葡萄糖60～140g/L，糖蜜1～5g/L，玉米浆20～40mL/L，Na₂HPO₄2～4g/L，KCl 1～5g/L，MgSO₄·7H₂O1～5g/L，MnSO₄·H₂O 2～10mg/L，FeSO₄·7H₂O 2～10mg/L，VB₁2～10mg/L，余量为水，pH6.8～7.2。