CN113444655A - 谷氨酸棒状杆菌、高谷氨酸产量的温度敏感型菌株及其获得方法、应用以及谷氨酸发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物发酵领域，公开了一株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，该谷氨酸棒状杆菌的保藏号为CGMCC No.18784；本发明还公开了一种高谷氨酸产量的温度敏感型菌株的获得方法以及所述的方法得到的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株；另外还公开了如上所述的谷氨酸棒状杆菌或如上所述高谷氨酸产量的温度敏感型菌株在生产谷氨酸中的应用以及一种谷氨酸发酵方法。采用本发明所述的方法，获得了高谷氨酸产量的温度敏感型菌株，采用该谷氨酸发酵方法，操作简单、生产成本低、效率高，十分适于工业化生产。

Description

谷氨酸棒状杆菌、高谷氨酸产量的温度敏感型菌株及其获得 方法、应用以及谷氨酸发酵方法
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体公开了一株谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacteriumglutamicum)、一种高谷氨酸产量的温度敏感型菌株的获得方法以及所述的方法得到的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株、如上所述的谷氨酸棒状杆菌或如上所述高谷氨酸产量的温度敏感型菌株在生产谷氨酸中的应用以及一种谷氨酸发酵方法。
背景技术
谷氨酸是构成蛋白质的20种常见α氨基酸之一，在生物机体内具有重要意义。谷氨酸不仅是人类第一个应用的氨基酸，也是目前世界上应用最广、销量最大的一种氨基酸。优良高产的谷氨酸生产菌选育工作中一直是氨基酸发酵工业中重要的研究课题。谷氨酸生产菌株具有较大的自然变异能力，通常负变异频率高于正变异频率。从自然界中分离得到的野生型菌株在使用过程中，菌种的衰老和菌株活力减退明显，不能满足目前发酵生产发展的要求。
另外，在谷氨酸生产过程中，往往通过控制培养基中生物素的浓度，使菌种在发酵过程的特定阶段由生长菌型细胞转型为产酸型细胞。但由于生物素用量浓度的控制往往是随着菌种的特性、发酵工艺要求、增殖成产酸型细胞湿菌体量、碳源和氮源的种类、浓度以及供氧条件的不同而异，导致该工艺对生物素浓度非常敏感，原料和工艺过程难以控制。
而且，发酵培养基中的糖浓度对谷氨酸发酵有很大影响，在一定范围内谷氨酸产量随糖浓度增加而增加，但是糖浓度过高，由于渗透压增大，影响菌体生长，使发酵周期延长，产酸不易稳定。
因此，通过选育优良生产菌种、改良谷氨酸发酵工艺，改变谷氨酸生产行业普遍存在着产酸率水平低、糖酸转化率低、成本高、能耗高等问题，是目前谷氨酸发酵工业上的主要研究课题之一。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的谷氨酸生产行业普遍存在着产谷氨酸率水平低、糖酸转化率低、成本高、能耗高等问题，提供一株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、一种高谷氨酸产量的温度敏感型菌株的获得方法以及所述的方法得到的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株、如上所述的谷氨酸棒状杆菌或如上所述高谷氨酸产量的温度敏感型菌株在生产谷氨酸中的应用以及一种谷氨酸发酵方法，该谷氨酸棒状杆菌以及采用本发明所述的方法获得的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株结合谷氨酸发酵方法生产谷氨酸时，具有谷氨酸产量高、产酸率水平高、糖酸转化率高的优点，从而降低生产成本和能耗。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，该谷氨酸棒状杆菌的保藏号为CGMCC No.18784，所述谷氨酸棒状杆菌为高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
本发明第二方面提供一种高谷氨酸产量的温度敏感型菌株的获得方法，该方法包括：
(1)在不同温度条件下分别对待筛菌株进行培养，选择在30-32℃下能够生长，同时在38-40℃下无法生长的菌株作为一筛系列菌株；
(2)使用包含谷氨酰胺和生物素的筛选培养基培养所述一筛系列菌株，选择能够在所述筛选培养基上进行生长的菌株作为二筛系列菌株；
(3)将所述二筛系列菌株与溶菌酶接触，筛选能够被溶菌酶裂解的菌株作为三筛系列菌株；
(4)通过茚三酮特异性显色反应对所述三筛系列菌株进行优势菌株的筛选，根据OD569nm值筛选出高谷氨酸产量的温度敏感型系列菌株；
优选地，在使用筛选培养基对待筛菌株进行筛选前，该方法还包括对待筛菌株进行诱变处理；
优选地，该方法还包括对得到的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株进行遗传稳定性验证，得到遗传稳定的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
本发明第三方面提供了如上所述的方法得到的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
本发明第四方面提供了如上所述的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株或如上所述的谷氨酸棒状杆菌在生产谷氨酸中的应用。
本发明第五方面提供了一种谷氨酸发酵的方法，该方法包括：在产谷氨酸的条件下，将谷氨酸发酵菌种接种至发酵培养基中进行培养，得到谷氨酸；
其中，所述谷氨酸发酵菌种如上所述的谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacteriumglutamicum)或如上所述的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
优选地，所述发酵培养基包含玉米淀粉水解糖、玉米浆、糖蜜、甜菜碱、豆粕水解液、H3PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、KCl、苏氨酸和丁二酸。
优选地，相对于1L所述发酵培养基，玉米淀粉水解糖的含量为165-205g，玉米浆的含量为15-30g，糖蜜的含量为10-18g，甜菜碱的含量为0.5-1.5g，豆粕水解液的含量为5-10g，H3PO4的含量为3-8g，MgSO4·7H2O的含量为 1.25-1.75g，MnSO4·7H2O的含量为0.064-0.084g，FeSO4·7H2O的含量为 0.055-0.085g，KCl的含量为3-6g，苏氨酸的含量为0.08-0.15g，丁二酸的含量为0.8-1.2g。
优选地，该方法还包括：在发酵过程中，发酵液的残糖质量浓度低于1.5 重量％时，流加玉米淀粉水解糖和糖蜜。
本发明的技术方案建立了高效的高产谷氨酸菌株的筛选方法。利用茚三酮与氨基酸的显色反应，可初步比较发酵液中游离氨基酸含量，然后结合多功能酶标仪可望实现多孔板的高通量筛选。
在本发明优选的情况下，通过诱变(更优选为ARTP)处理待筛菌株，然后通过使用谷氨酰胺和生物素培养基进行筛选，然后筛选对温度和溶菌酶敏感的菌株，进一步通过茚三酮特异性反应筛选氨基酸产量高的菌株，最后确定遗传稳定的菌株，所述筛选方法提高了优良菌株筛选成功的概率，为产谷氨酸菌株的选育提供了高效的筛选方法。
本发明提供的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.18784为高谷氨酸产量的温度敏感型菌株，具有谷氨酸产量高、糖酸转化率高的优点。
本发明优选的实施方式中，通过复配糖蜜(10-18g/L)的发酵培养基，结合高浓度的玉米淀粉酶解液和糖蜜(富含果糖、生物素的混合碳源)流加发酵工艺，有效强化了菌株产酸阶段的代谢流分配，解决了初始糖浓度(如 150g/L以上)的高浓度底物抑制问题，进一步使菌株产谷氨酸浓度从124g/L 提高到210g/L。整个发酵过程操作简便，生产成本较低，十分适合于工业化生产。
生物保藏
本发明的菌株为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，于2019 年11月04日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.18784。
附图说明
图1是本发明实施例1中ARTP诱变的致死率曲线。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
谷氨酸棒杆菌细胞壁很厚，具有很强的渗透障碍功能，导致对溶菌酶具有很强的耐受性。温度敏感型菌株是指在菌体进入指数生长期时提高培养温度，强制细胞由正常细胞转型为细胞壁合成缺陷的细胞，促进谷氨酸的分泌，从而达到大量合成并积累谷氨酸的目的。
发明人发现通过利用对溶菌酶和温度敏感的谷氨酸菌株强制发酵制备谷氨酸，不需要控制培养基中生物素的亚适量，仅需通过物理方式(添加溶菌酶和变换温度)就可以改变谷氨酸棒杆菌细胞膜和细胞壁的通透性，完成由生长型细胞向产酸型细胞的转变，从而避免了因原料中生物素含量变化而造成产酸不稳定的现象，不仅可以利用生物素含量高的原料如糖蜜、薯干等直接进行发酵生产，而且可以利用淀粉质原料。
本发明第一方面提供了一株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，该谷氨酸棒状杆菌的保藏号为CGMCC No.18784，所述谷氨酸棒状杆菌为高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
在本发明中，谷氨酸含量的测定方法参见《安全标准食品中氨基酸的测定》(GB5009.124-2016)。
本发明第二方面提供一种高谷氨酸产量的温度敏感型菌株的获得方法，该方法包括：
(1)在不同温度条件下分别对待筛菌株进行培养，选择在30-32℃下能够生长，同时在38-40℃下无法生长的菌株作为一筛系列菌株；
(2)使用包含谷氨酰胺和生物素的筛选培养基培养所述一筛系列菌株，选择能够在所述筛选培养基上进行生长的菌株作为二筛系列菌株；
(3)将所述二筛系列菌株与溶菌酶接触，筛选能够被溶菌酶裂解的菌株作为三筛系列菌株；
(4)通过茚三酮特异性显色反应对所述三筛系列菌株进行优势菌株的筛选，根据OD569nm值筛选出高谷氨酸产量的温度敏感型系列菌株。
在本发明中，所述待筛菌株的种类可以不受特别的限制，可以是能够用于生产谷氨酸的菌株，比如可以为枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌等，优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
在本发明中，所述待筛菌株可以以经过培养的菌液的形式存在，比如，可以在30-37℃，100-200rpm的摇床中培养6-16h，得到的菌液作为待筛菌株样品用于高谷氨酸产量的温度敏感型菌株的筛选。培养菌液的培养基可以是本领域常规采用的培养基，比如LB培养基。
在本发明中，为了提高获得高谷氨酸产量的温度敏感型菌株的效率，优选地，在使用筛选培养基对待筛菌株进行筛选前，该方法还包括对待筛菌株进行诱变处理。
在本发明中，所述诱变处理的方法可以是本领域常规使用的方法，比如可以为化学诱变、紫外诱变、ARTP诱变等，优选为ARTP诱变。
常温常压等离子体(ARTP)诱变育种技术是由清华大学自主研发的一种微生物基因组快速突变技术。研究表明，等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络发生显著变化，最终导致微生物产生突变。该技术具有成本低、操作简便、安全性高以及等离子体产生条件温和富含大量活性粒子、突变谱广、突变率高等优点，被广泛用于细菌、真菌、微藻等微生物的生物育种。
在本发明中，ARTP诱变的操作条件可以是常规的条件，可以根据菌种的性质进行调整。优选地，当用于诱变谷氨酸棒杆菌时，所述ARTP诱变的条件包括：发射源距待筛菌株的距离为1-5mm，辐射功率为100-150W，氦气流量为8-12L/min，诱变时间为90-220s。在所述优选的条件下进行诱变，能够使菌株的致死率达到98％以上。
优选地，用于ARTP诱变的待筛菌株以菌悬液的形式存在，其中，所述菌悬液是培养得到的菌液经过离心重悬后得到。
优选地，重悬时使用的溶液可以为生理盐水或无菌水。
在本发明中，步骤(1)中，该方法优选包括：在不同温度条件下分别对诱变后的待筛菌株进行培养，选择在30-32℃下能够生长，同时在38-40℃下无法生长的菌株作为一筛系列菌株。
优选地，所述待筛菌株的培养时间为20-24h，得到的一筛系列菌株即为温度敏感型菌株。
其中，用于待筛菌株培养的培养基可以是本领域常规使用的培养基，比如可以为LB培养基。
在本发明中，步骤(2)中，该方法优选包括：将一筛系列菌株涂布到包含谷氨酰胺和生物素的筛选培养基的固体平板上，在30-37℃条件下培养 1-2d，挑选生长快速、单菌落较大的菌株，作为二筛系列菌株。应当理解的是，本领域技术人员在实际操作过程中，可以通过比较相同时间内单菌落的大小，选择单菌落较大的菌株，同时也就获得了生长快速的二筛系列菌株。
在本发明中，步骤(2)中，所述包含谷氨酰胺和生物素的筛选培养基的具体组成可以不受特别的限制，优选地，所述包含谷氨酰胺和生物素的筛选培养基包括基础培养基、谷氨酰胺和生物素。所述基础培养基的种类可以不受特别的限制，比如可以为LB培养基。所述包含谷氨酰胺和生物素的筛选培养基优选为固体培养基。
在本发明中，所述包含谷氨酰胺和生物素的筛选培养基中谷氨酰胺和生物素的含量可以在较宽的范围内选择，优选地，1L所述包含谷氨酰胺和生物素的筛选培养基中，谷氨酰胺的含量为10-50g，生物素的含量为50-150μg。
在本发明中，步骤(3)中，将所述二筛系列菌株与溶菌酶接触，筛选能够被溶菌酶裂解的菌株作为三筛系列菌株。
优选地，步骤(3)中，筛选能够被溶菌酶裂解的菌株的方法包括：在不含溶菌酶的培养基中接种所述二筛系列菌株，并培养3-5h，然后加入溶菌酶继续培养，测定培养过程中培养液的OD值，选择OD值低于对照组的 OD值的菌株作为三筛系列菌株；其中，所述对照组为在完全不含溶菌酶的培养基中对所述二筛系列菌株进行培养的培养液。能够理解的是，所述对照组的培养条件与加入溶菌酶的实验组的培养条件相同。
在本发明中，所述不含溶菌酶的培养基可以是本领域常规用于培养待筛菌株的培养基，比如可以为LB培养基。
在本发明中，LB培养基的组成为葡萄糖5-10g/L，蛋白胨1-5g/L，氯化钠1-5g/L，牛肉浸粉1-3g/L，磷酸氢二钠0.03-1g/L。
优选地，所述溶菌酶的添加量使得培养液中溶菌酶的含量为 100-300μg/L。
应当理解的是，在对照组中，二筛系列菌株在完全不含溶菌酶的培养基中生长，其OD在15-17h后的一段时间内是呈现上升趋势的，直至到达稳定期后才无明显增长或者呈下降趋势。而添加溶菌酶的培养基中，能够被溶菌酶裂解的二筛系列菌株在溶菌酶的存在下被裂解，其OD与对照组的OD值相比是降低的。
在本发明中，优选地，添加溶菌酶后，每隔2-3h检测一次菌体的OD600nm。检测的总时间可以不受特别的限制，比如可以为12-24h。
在本发明中，步骤(4)中，通过茚三酮特异性显色反应对所述三筛系列菌株进行优势菌株的筛选，根据OD569nm值筛选出高谷氨酸产量的温度敏感型系列菌株。
在本发明中，所述茚三酮特异性显色反应可以在多孔板上进行，比如可以为12孔板、24孔板、48孔板或96孔板等。
其中，所述筛选的方法可以是本领域常规采用的方法，比如可以为将得到的三筛系列菌株接种培养后，取其上清液与茚三酮试剂反应，挑选出在 OD569nm下吸光值较大的上清液对应的三筛系列菌株，即为优势菌株。
在本发明中，所述茚三酮特异性显色反应的操作方法可参见《安全标准食品中氨基酸的测定》(GB 5009.124-2016)。
在本发明中，优选地，该方法还包括对得到的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株进行遗传稳定性验证，得到遗传稳定的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
其中，遗传稳定性验证的方法可以是本领域常规采用的方法，优选为将步骤(4)得到的优势菌株接种到种子培养基中，在种子培养基上连续传代 10次，再进行发酵培养，进行氨基酸分析检测复筛后，可以得到遗传稳定的高产菌株。
在本发明中，氨基酸分析的方法可以是本领域常规采用的方法，比如薄层层析法、HPLC法等，参考《安全标准食品中氨基酸的测定》(GB 5009.124-2016)。
在本发明中，种子培养基的种类可以是本领域常规使用的种子培养基，优选地，所述种子培养基包含：葡萄糖5-10g/L，蛋白胨1-5g/L，氯化钠1-5g/L，牛肉浸粉1-3g/L，磷酸氢二钠0.03-1g/L。
在本发明的一种优选的实施方式中，使用ARTP诱变仪对谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)进行诱变处理，在不同温度条件下分别对诱变得到的系列菌株进行培养，选择在30-32℃下能够生长，同时在38-40℃下无法生长的菌株作为一筛系列菌株；使用包含谷氨酰胺和生物素的筛选培养基培养所述一筛系列菌株，选择能够在所述筛选培养基上快速生长、单菌落大的菌株作为二筛系列菌株；将所述二筛系列菌株与溶菌酶接触，筛选能够被溶菌酶裂解的菌株作为三筛系列菌株；通过茚三酮特异性显色反应对所述三筛系列菌株进行优势菌株的筛选，根据OD569nm值筛选出高谷氨酸产量的温度敏感型系列菌株；然后对得到的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株进行遗传稳定性验证，得到遗传稳定的高谷氨酸产量的温度敏感型的谷氨酸棒状杆菌。
在本发明中，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) CGMCCNo.18784通过上述高谷氨酸产量的温度敏感型菌株的获得方法制备得到。
本发明第三方面提供如上所述的方法得到的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
在本发明中，优选地，相同的条件下，所述高谷氨酸产量的温度敏感型菌株的谷氨酸产量比待筛菌株的谷氨酸产量高达69.4％。
本发明第四方面提供如上所述的谷氨酸棒状杆菌或如上所述的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株在生产谷氨酸中的应用。
本发明第五方面提供一种谷氨酸发酵方法，该方法包括：在产谷氨酸的条件下，将谷氨酸发酵菌种接种至发酵培养基中进行培养，得到谷氨酸；
其中，所述谷氨酸发酵菌种如上所述的谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacteriumglutamicum)或如上所述的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
本发明的发明人发现，可以利用糖蜜中富含的果糖和生物素系统优化谷氨酸生产发酵培养基组成，开发出复配糖蜜的发酵初始培养基，结合高浓度的玉米淀粉酶解液和糖蜜(富含果糖、生物素)混合碳源的流加发酵工艺，可以有效强化菌株产酸阶段的代谢流分配，解决发酵初始高浓度底物抑制问题，提高菌株产酸能力。
在本发明中，所述产谷氨酸的条件可以为本领域常规采用的条件，只要能够实现如上所述的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或如上所述的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株在该条件下产谷氨酸即可。优选地，所述产谷氨酸的条件包括：温度为30-40℃，pH为6.5-7.5，时间为24-28h。
若所述发酵是在发酵罐中进行，还需要控制发酵过程的通气量，本领域技术人员可以根据发酵罐大小调整通气量。
优选地，该方法还包括：在发酵过程中补充氨水，在发酵过程中控制pH 在6.5-7.5的范围内。控制pH的方法可以是本领域常规采用的方法，比如可以通过补充酸和碱中的至少一种实现。
其中，所述酸可以为盐酸、硫酸或硝酸；所述碱可以为氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。
在本发明中，优选地，所述谷氨酸发酵菌种为种子液。
其中，所述种子液的OD可以在较宽的范围内选择，优选地，所述种子液的OD600nm值为10-20，更优选为12-15。
在本发明中，优选地，相比于100体积份的所述发酵培养基，所述种子液的接种量为10-15体积份。
在本发明中，所述种子液的制备方法可以为本领域常规的制备方法，比如可以包括：将活化后的菌种接种至种子培养基中，在31-33℃下培养12-18h。
在本发明中，所述活化的方法可以为本领域常规的方法，比如可以包括：取斜面保藏菌种接种于装有种子培养基的斜面试管中，31-33℃恒温静置培养24-36h。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述种子液的制备方法包括：取斜面保藏菌种接种于装有种子培养基的斜面试管中，31-33℃恒温静置培养 26-34h；向装有种子培养基的三角瓶内接入活化菌种，31-33℃振荡培养 12-18h，得OD值为12-15的种子液。
应当理解的是，本领域人员可以根据需要选择进行扩大培养，以适应生产规模的变化。
在本发明中，所述发酵培养基的种类可以是本领域常规使用的发酵培养基，优选地，所述发酵培养基包含玉米淀粉水解糖、玉米浆、糖蜜、甜菜碱、豆粕水解液、H3PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、KCl、苏氨酸和丁二酸。
其中，优选地，相对于1L所述发酵培养基，玉米淀粉水解糖的含量为 165-205g，玉米浆的含量为15-30g，糖蜜的含量为10-18g，甜菜碱的含量为 0.5-1.5g，豆粕水解液的含量为5-10g，H3PO4的含量为3-8g，MgSO4·7H2O 的含量为1.25-1.75g，MnSO4·7H2O的含量为0.064-0.084g，FeSO4·7H2O的含量为0.055-0.085g，KCl的含量为3-6g，苏氨酸的含量为0.08-0.15g，丁二酸的含量为0.8-1.2g。在所述优选的范围内，能够进一步提高产酸率和糖酸转化率。
优选地，所述发酵培养基的pH为6.5-7.5；更优选为6.8-7.0。
在本发明中，可以使用碱调整发酵培养基的pH，所述碱的种类可以是常用的碱，优选为氢氧化钠、碳酸钠、氨水或氢氧化钾。
在本发明中，优选地，所述发酵培养基中还含有消泡剂。所述消泡剂可以是本领域常规使用的消泡剂，比如可以为乳化硅油、高碳醇脂肪酸酯复合物、聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚、聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚、聚氧丙烯甘油醚和聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚和聚二甲基硅氧烷中的至少一种。
其中，所述消泡剂的添加量可以在较宽的范围内选择，优选地，相对于 1L所述发酵培养基，消泡剂的含量为0.1-0.3g/L。
应当理解的是，所述发酵培养基的溶剂为水。
在本发明中，所述玉米淀粉水解糖的来源可以不受特别的限制，可以自制，也可以通过商购获得。优选地，所述玉米淀粉水解糖以玉米淀粉酶解液的形式加入。其中，所述玉米淀粉酶解液的添加量使得所述发酵培养基中玉米淀粉水解糖的含量为165-205g/L。
优选地，以玉米淀粉酶解液的总体积为基准，所述玉米淀粉酶解液中玉米淀粉水解糖的浓度为350-450g/L。
在本发明中，糖浓度的测定方法参见斐林试剂法。
在本发明中，所述玉米淀粉酶解液的制备方法可以是本领域常规的制备方法，比如可以为双酶法，具体方法如下：利用α-淀粉酶将玉米淀粉液化，转化为糊精及低聚糖，接着利用糖化酶将糊精及低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖。
在本发明中，所述玉米浆的来源可以不受特别的限制，可以自制，也可以通过商购获得。优选地，所述玉米浆的浓度为18-25波美度。
在本发明中，所述糖蜜的来源可以不受特别的限制，可以通过商购获得。糖蜜固形物的测定方法参见阿贝折光仪测定法。
在本发明中，所述豆粕水解液的来源可以不受特别的限制，可以自制，也可以通过商购获得。优选地，所述豆粕水解液的总氮含量为2-5g/100mL，氨基态氮含量为1-3g/100mL。
所述总氮含量和氨基态氮的含量的测定方法参见凯式定氮法和pH计法。
在本发明中，优选地，该方法还包括：在发酵过程中当发酵液的残糖质量浓度低于1.5重量％时，流加玉米淀粉水解糖和糖蜜。
在本发明中，玉米淀粉水解糖和糖蜜可以单独流加，也可以混合后流加。优选地，所述玉米淀粉水解糖和糖蜜的流加重量比为(10-12)：1。
优选地，所述玉米淀粉水解糖以玉米淀粉酶解液的方式存在。
优选地，所述玉米淀粉水解糖和糖蜜的混合物中，糖浓度为300-500g/L。
优选地，在发酵液体积为10L时，以淀粉酶解液和糖蜜的总体积计，所述流加的速率为10-40mL/h。
本发明中所述发酵培养基中涉及的其他组分均可商购获得，在此不再一一赘述。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，氨基酸和谷氨酸含量的测定方法参见《安全标准食品中氨基酸的测定》(GB 5009.124-2016)；
糖蜜中固形物的浓度为4.45°Brix。
玉米淀粉酶解液中玉米淀粉水解糖的质量浓度为30-35％。
所述玉米浆为市售玉米浆。
包含谷氨酰胺和生物素的筛选培养基：含有35g/L谷氨酰胺和100μg/L 生物素的LB培养基。
LB培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，牛肉浸粉3g/L，磷酸氢二钠0.5g/L；
所述的种子液培养基成分配比为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠 5g/L，牛肉浸粉3g/L，磷酸氢二钠0.5g/L；
种子液的制备方法的步骤如下：(1)菌种活化：取斜面保藏菌种接种于装有种子培养基的斜面试管中，31℃恒温静置培养24h，得到活化菌种；(2)种子培养：将己灭菌的装有150mL种子培养基的三角瓶内接入活化菌种，31℃振荡培养16h，得到种子液，置于4℃冰箱冷藏备用。
实施例1
一种高谷氨酸产量的温度敏感型菌株的筛选方法
以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)为待筛菌株，在30℃，200r/min的摇床中培养16h，得到的菌液经生理盐水重悬后，得到的菌悬液用于ARTP诱变。
将ARTP的温度保持在20℃，调节功率为120W，氦气(He)流量为 10L/min。吸取10μL菌悬液于无菌金属载片上，将载片放入诱变室内，发射源距离菌液2mm，采用不同的时间(0s、60s、90s、120s、150s、180s、 210s、240s)对菌液进行诱变处理。将诱变的菌体接入1mL生理盐水中振摇1min，取100μL涂布到活化培养基平板上，37℃培养2d，计算致死率，得到图1所示的致死率曲线。从图1可看出诱变时间为180s时，菌株致死率达到98％，因此，选择180s为最佳诱变时间。在最佳诱变时间条件下对谷氨酸棒杆菌出发菌株进行ARTP诱变。
将诱变处理后的菌液转接到两只装有LB的平板上，一只放置于30℃的恒温箱中培养，另一只置于40℃的恒温箱中培养，24h后观察生长情况。筛选于30℃培养时生长、于40℃培养时不长的突变株，得到的突变株即为一筛系列菌株。
将筛选到的一筛系列菌株的单菌落转接至包含谷氨酰胺和生物素筛选培养基中，37℃培养2天，挑选生长快速、单菌落较大的菌株，得到的菌株即为二筛系列菌株。
将获得的二筛系列菌株接种至液体LB培养基中，于30℃摇瓶培养， 3h后添加溶菌酶(240μg/L)，以不添加的作对照，每隔2h测一次菌体OD600 nm，挑选OD值下降的突变株。所述突变株即为三筛系列菌株。
然后将得到的三筛系列菌株接种至种子培养基中培养，在30℃、 200r/min下培养10h；并在该种子培养基上连续传代10次。再以10％的接种量接种至发酵培养基中，在30℃、200r/min下培养24h。利用茚三酮在96 孔板上进行特异性显色反应筛选OD569nm值最高的菌株，即谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.18784，将其命名为FN-08。
实施例2
本实施例用于说明谷氨酸棒杆菌的发酵性能比较
发酵培养基的成分配比为：玉米淀粉水解糖170g/L，玉米浆21g/L，甜菜碱1g/L，豆粕水解液8g/L，H3PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L， MnSO4·7H2O 0.074g/L，FeSO4·7H2O0.07g/L，KCl 4g/L，苏氨酸1g/L，丁二酸1g/L，消泡剂0.2g/L，溶剂为水，用氢氧化钠中和调节使发酵培养基的pH为7.0。
在10L发酵罐中，按照如上所述的发酵培养基的配方配制6L发酵培养基。温度110℃、维持时间10分钟，灭菌后备用。
按照如上所述的方法制备种子液，将OD值为12种子液按V种子液：V发酵培养基为10％的比例接入发酵培养基中。发酵温度控制在32℃，补充氮源至 pH为7.0，控制通气量为6L/min，发酵28h(OD600 nm为65)。
以FN-08为实验组，待筛菌株为对照组进行上述发酵实验，发酵结束后测定发酵液中的谷氨酸含量。
经计算，FN-08的发酵液中谷氨酸含量为142g/L，待筛菌株的发酵液中谷氨酸含量为115g/L。
实施例3
本实施例用于说明谷氨酸棒杆菌FN-08在含糖蜜的发酵培养基中发酵的结果
发酵培养基的成分配比为：玉米淀粉水解糖170g/L，玉米浆21g/L，糖蜜14g/L，甜菜碱1g/L，豆粕水解液8g/L，H3PO45 g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，MnSO4·7H2O 0.074g/L，FeSO4·7H2O 0.07g/L，KCl 4g/L，苏氨酸0.1g/L，丁二酸1g/L，消泡剂0.2g/L，溶剂为水，用氢氧化钠中和调节使发酵培养基的pH为7.0。
在10L发酵罐中，按照如上所述的发酵培养基的配方配制6L发酵培养基。温度110℃、维持时间10分钟，灭菌后备用。
以FN-08为发酵菌株，按照实施例2的方法准备种子液，并进行发酵。
发酵结束后测定发酵液中的谷氨酸含量，并计算产谷氨酸含量。
得到谷氨酸含量为163g/L。
实施例4
本实施例用于说明谷氨酸棒杆菌FN-08在发酵培养基中发酵的结果-流加发酵方法
发酵培养基的成分配比为：玉米淀粉水解糖170g/L，玉米浆21g/L，糖蜜14g/L，甜菜碱1g/L，豆粕水解液8g/L，H3PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L， MnSO4·7H2O 0.074g/L，FeSO4·7H2O 0.07g/L，KCl 4g/L，苏氨酸0.1g/L，丁二酸1g/L，消泡剂0.2g/L，溶剂为水，用氢氧化钠中和调节使发酵培养基的pH为7.0。
在10L发酵罐中，按照如上所述的发酵培养基的配方配制6L发酵培养基。温度110℃、维持时间10分钟，灭菌后备用。
以FN-08为发酵菌株，按照实施例2的方法准备种子液，并进行发酵。不同的是，在发酵过程中，当发酵培养基中残糖浓度(残糖浓度是指发酵培养基中所含有的还原糖浓度，此处残糖浓度的测定采用斐林试剂法)低于1 重量％时，分别流加浓度为300g/L、400g/L、450g/L、500g/L的复合碳源(玉米淀粉水解糖和糖蜜的重量比为10：1)，流加速度分别为20mL/h。
发酵结束后测定发酵液中的谷氨酸含量，结果见表1。
对比例1
本对比例用于说明谷氨酸棒杆菌待筛菌株在发酵培养基中发酵的结果- 流加发酵方法
按照实施例5所述的方法进行发酵，不同的是，使用谷氨酸棒杆菌待筛菌株(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)替代谷氨酸棒杆菌待筛菌株FN-08，复合碳源的浓度为450g/L。
发酵结束后测定发酵液中的谷氨酸含量，结果见表1。
表1
复合碳源浓度g/L 300 400 450 500 对比例1
谷氨酸含量g/L 187 195 210 202 124
从以上数据能够看出，与初始菌株相比，经过诱变筛选得到的菌株FN-08，即本发明请求保护的谷氨酸棒杆菌待筛菌株(Corynebacterium glutamicumCGMCC 18784)，在本发明优选的发酵培养基和发酵模式下，得到发酵液的谷氨酸含量提高了69.4％。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，其特征在于，该谷氨酸棒状杆菌的保藏号为CGMCC No.18784，所述谷氨酸棒状杆菌为高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
2.一种高谷氨酸产量的温度敏感型菌株的获得方法，其特征在于，该方法包括：
(1)在不同温度条件下分别对待筛菌株进行培养，选择在30-32℃下能够生长，同时在38-40℃下无法生长的菌株作为一筛系列菌株；
(2)使用包含谷氨酰胺和生物素的筛选培养基培养所述一筛系列菌株，选择能够在所述筛选培养基上进行生长的菌株作为二筛系列菌株；
(3)将所述二筛系列菌株与溶菌酶接触，筛选能够被溶菌酶裂解的菌株作为三筛系列菌株；
(4)通过茚三酮特异性显色反应对所述三筛系列菌株进行优势菌株的筛选，根据OD569 nm值筛选出高谷氨酸产量的温度敏感型系列菌株；
优选地，在使用筛选培养基对待筛菌株进行筛选前，该方法还包括对待筛菌株进行诱变处理；
优选地，该方法还包括对得到的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株进行遗传稳定性验证，得到遗传稳定的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(3)中，筛选能够被溶菌酶裂解的菌株的方法包括：在不含溶菌酶的培养基中接种所述二筛系列菌株，并培养3-5h，然后加入溶菌酶继续培养，测定培养过程中培养液的OD值，选择OD值低于对照组的OD值的菌株作为三筛系列菌株；其中，所述对照组为在完全不含溶菌酶的培养基中对所述二筛系列菌株进行培养的培养液；
优选地，所述溶菌酶的添加量使得培养液中溶菌酶的含量为100-300μg/L。
4.权利要求2或3述的方法得到的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
5.权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌或权利要求4所述的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株在生产谷氨酸中的应用。
6.一种发酵制备谷氨酸的方法，其特征在于，该方法包括：在产谷氨酸的条件下，将谷氨酸发酵菌种接种至发酵培养基中进行培养，得到谷氨酸；
其中，所述谷氨酸发酵菌种为权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或权利要求4所述的高谷氨酸产量的温度敏感型菌株。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述发酵培养基包含玉米淀粉水解糖、玉米浆、糖蜜、甜菜碱、豆粕水解液、H3PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、KCl、苏氨酸和丁二酸；
优选地，相对于1L所述发酵培养基，玉米淀粉水解糖的含量为165-205g，玉米浆的含量为15-30g，糖蜜的含量为10-18g，甜菜碱的含量为0.5-1.5g，豆粕水解液的含量为5-10g，H3PO4的含量为3-8g，MgSO4·7H2O的含量为1.25-1.75g，MnSO4·7H2O的含量为0.064-0.084g，FeSO4·7H2O的含量为0.055-0.085g，KCl的含量为3-6g，苏氨酸的含量为0.08-0.15g，丁二酸的含量为0.8-1.2g；
优选地，所述发酵培养基的pH为6.5-7.5。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述产谷氨酸的条件包括：温度为38-40℃，pH为6.5-7.5，时间为24-28h；
优选地，该方法还包括：在发酵过程中补充氨水，并在发酵过程中控制pH在6.5-7.5的范围内；
优选地，该方法还包括：在发酵过程中，当发酵液的残糖质量浓度低于1.5重量％时，流加玉米淀粉水解糖和糖蜜。
9.根据权利要求6-8中任意一项所述的方法，其中，所述谷氨酸发酵菌种为种子液；
优选地，所述种子液的OD600nm值为10-20；
优选地，相对于100体积份的所述发酵培养基，所述种子液的接种量为10-15体积份。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述种子液的制备方法包括：将活化后的谷氨酸发酵菌种接种至种子培养基中，在31-33℃下培养12-18h。
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