JP2014212762A - イソブタノール生産酵母 - Google Patents

Abstract

【課題】イソブタノールの次世代バイオ燃料としての実用化に向けて、より生産性に優れたイソブタノール生産酵母を提供すること。
【解決手段】リンゴ酸酵素をミトコンドリア内に発現または発現増強するように形質転換された、イソブタノール生産酵母、その調製方法、ならびに該イソブタノール生産酵母を用いたイソブタノールの製造方法が提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は、イソブタノールを生産する酵母およびその調製方法ならびに該酵母を用いてイソブタノールを製造する方法に関する。

分岐鎖を有するイソブタノールは、同じ炭素数の直鎖アルコールに比べてさらに高いオクタン価を示すため、ガソリン代替燃料として注目が集まっている。イソブタノールはまた、化成品の原料としても有用である。

イソブタノールについて、バイオマスから生産する試みがこれまでなされており、次世代バイオ燃料として注目されている。次世代バイオ燃料を生産する技術は、大腸菌を生体触媒として利用する方法が先行して開発されてきた。一方、酵母は、菌体のリサイクルが可能であり、発酵時のストレスが強く、アルコール耐性に優れるなど、経済的な次世代バイオ燃料の実用化の際に必須の宿主であるとされている。

イソブタノールは、酵母の発酵の副産物として生産され得るが、極めて低い量でしかない。イソブタノール生産酵母を作出するために、酵母は、その代謝経路を改変するよう遺伝子組換えがなされている（特許文献１および２；ならびに非特許文献１〜５）。

特表２０１１−５２２５４３号公報 米国特許第８，０９７，４４０号

Chenら，Biotechnology for Biofuels，2011，4:21 Bratら，Biotechnology for Biofuels，2012，5:65 Avalosら，nature biotechnology，2013，doi:10.1038/nbt.2509 Kondoら，J. Biotechnol.，2012，159(1-2):32-37 Matsudaら，Biosci. Biotechnol. Biochem.，2012，76(11)，2139-2142

本発明は、イソブタノールの次世代バイオ燃料としての実用化に向けて、イソブタノールの生産性により優れたイソブタノール生産酵母を提供することを目的とする。

本発明は、リンゴ酸酵素をミトコンドリア内に発現または発現増強するように形質転換された、イソブタノール生産酵母を提供する。

１つの実施形態では、上記酵母は、以下の（１）から（５）の変換：
（１）ピルビン酸から２−アセト乳酸への変換；
（２）２−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換；
（３）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸への変換；
（４）２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換；および
（５）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換
を含む代謝経路を含む。

１つの実施形態では、上記酵母はさらに、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体またはそれを構成する少なくとも１つのサブユニットを欠損する。

１つの実施形態では、上記酵母はさらに、（ｉ）アセト乳酸シンターゼをミトコンドリア内に発現増強する、（ｉｉ）アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをサイトゾルに発現する、または（ｉｉｉ）該（ｉ）および（ｉｉ）の両方である。

本発明はさらに、イソブタノール生産酵母を調製する方法を提供し、この方法は、
イソブタノールを生産し、かつリンゴ酸酵素をミトコンドリア内に発現または発現増強する酵母を作出する工程を含む。

１つの実施形態では、上記リンゴ酸酵素のミトコンドリア内への発現または発現増強は、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含むリンゴ酸酵素をコードする遺伝子を導入することにより得られる。

１つの実施形態では、上記イソブタノールの生産は、以下の（１）から（５）の変換：
（１）ピルビン酸から２−アセト乳酸への変換；
（２）２−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換；
（３）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸への変換；
（４）２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換；および
（５）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換
を含む代謝経路を含むように酵母を形質転換することにより得られる。

１つの実施形態では、上記調製方法は、上記酵母からピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を欠損させる工程をさらに含む。

１つの実施形態では、上記調製方法は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）：
（Ｉ）Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含むアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を酵母に導入する工程；
（ＩＩ）それぞれＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないアセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を酵母に導入する工程；および
（ＩＩＩ）Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含むアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子、ならびに、それぞれＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないアセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を酵母に導入する工程
のいずれかの工程をさらに含む。

本発明はなおさらに、イソブタノールを製造する方法を提供し、この方法は上記イソブタノール生産酵母を、炭素基質を含む培地で培養する工程を含む。

１つの実施形態では、上記炭素基質を含む培地は、グルコースを含む。

本発明によれば、イソブタノールの生産性に優れたイソブタノール生産酵母が提供される。このようなイソブタノール生産酵母を用いることにより、イソブタノールをより効率的に製造することができる。

酵母発現用プラスミドｐＡＴＰ４２３（ａ）、ｐＡＴＰ４２５（ｂ）およびｐＡＴＰ４２６（ｃ）の構造を示す模式図である。 ｐＡＴＰ４２６−ｋｉｖｄ−ＡＤＨ６の構造を示す模式図である。 ｐＩＬＶ２Ｌの構造を示す模式図である。 ｐＡＴＰ４２６−ｋｉｖｄ−ＡＤＨ６−ＩＬＶ２の構造を示す模式図である。 ｐＩＬＶ５３２ｃｙｔＬの構造を示す模式図である。 ｐＩＬＶ５３２ｃｙｔＭの構造を示す模式図である。 ｐＡＴＰ４２３−ＭＡＥ１およびｐＡＴＰ４２３−ｓＭＡＥ１の構造を示す模式図である。 ｐＡＴＰ４２３−ＭＭおよびｐＡＴＰ４２３−ＭｓＭの構造を示す模式図である。 ｐＡＴＰ４２３−ＰＭＭおよびｐＡＴＰ４２３−ＰＭｓＭの構造を示す模式図である。 形質転換酵母ＢＳＷ１２、ＢＳＷ１３、ＢＳＷ１４、ＢＳＷ１５、ＢＳＷ１６、ＢＳＷ１７、ＢＳＷ１８、ＢＳＷ１９およびＢＳＷ２０の試験管におけるグルコースからの発酵開始４８時間後のイソブタノールの生産量を示すグラフである。 （ａ）形質転換酵母ＢＳＷ１５７、ＢＳＷ１５８、ＢＳＷ１６４、ＢＳＷ１６５、ＢＳＷ１７１、ＢＳＷ１７２、ＢＳＷ１７８およびＢＳＷ１７９；ならびに（ｂ）形質転換酵母ＢＳＷ１５９、ＢＳＷ１６０、ＢＳＷ１６６、ＢＳＷ１６７、ＢＳＷ１７３、ＢＳＷ１７４、ＢＳＷ１８０およびＢＳＷ１８１の試験管におけるグルコースからの発酵開始４８時間後のイソブタノールの生産量を示すグラフである。 形質転換酵母ＢＳＷ１９２およびＢＳＷ２０５の試験管におけるグルコースからの発酵開始４８時間後のイソブタノールの生産量を示すグラフである。 形質転換酵母ＢＳＷ２０５の発酵ビンにおけるグルコースからのイソブタノールの経時的な生産量を示すグラフである。

（イソブタノール生産酵母およびその調製方法）
本発明の酵母は、リンゴ酸酵素をミトコンドリア内で発現または発現増強するように形質転換された、イソブタノール生産酵母である。

「リンゴ酸酵素」（ＭＡＥ）は、リンゴ酸からピルビン酸への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。このリンゴ酸酵素は、ＮＡＤ依存性リンゴ酸酵素とも呼ばれ、ＥＣ．１．１．１．３８に分類され得るが、上記酵素活性を有する限り限定されない。リンゴ酸酵素としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＭＡＥ１（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ３６０１３；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ８５３８３９）、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）由来ＭＡＥ１（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ａ３ＬＶ５０；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４８３９２１０）、スキゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来ｍａｅ１（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ５０５３７；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ２５４３３３４）、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）由来ＮＡＤ−ＭＥ２（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｑ８Ｌ７Ｋ９；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ８２８２２２）などが挙げられる。１つの実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＭＡＥ１である。サッカロマイセス・セレビシエ由来ＭＡＥ１の遺伝子配列およびそのコードするアミノ酸配列を配列番号１および２に示す。

リンゴ酸酵素は、酵母においては、通常、ミトコンドリア内に局在している（Bolesら，Ｊ. Bacteriol.，1998，180(11)：2875-2882）。

本発明はさらに、イソブタノール生産酵母を調製する方法を提供し、この方法は、イソブタノールを生産し、かつリンゴ酸酵素をミトコンドリア内に発現または発現増強する酵母を作出する工程を含む。１つの実施形態では、リンゴ酸酵素のミトコンドリア内への発現または発現増強は、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含むリンゴ酸酵素をコードする遺伝子を導入することにより得られる。

リンゴ酸酵素のミトコンドリア内への発現または発現増強は、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＭＡＥ１の天然型酵素をコードする遺伝子を酵母に導入することにより行うことができる。

「導入」とは、ポリヌクレオチドまたは発現ベクター中の発現を目的とする遺伝子が宿主細胞に導入されるだけでなく、宿主細胞で発現されることも含む。遺伝子導入によるその酵素の「発現」または「発現増強」は宿主に依存し得、「発現」は、本来その遺伝子を保有していない宿主に遺伝子を導入することで、形質転換酵母が酵素活性を有するようになることをいい、「発現増強」は、その遺伝子を保有する宿主に遺伝子を（好ましくは過剰発現するように）導入することで、形質転換酵母にて酵素活性を増強させることをいうが、これらは厳密に区別される必要はない。

リンゴ酸酵素（例えばＭＡＥ１）は、酵母において、本来ミトコンドリア内に発現するが、Ｎ末端が欠失した形態（例えば、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号３の塩基配列からなる））に改変した酵素は、ミトコンドリア外（サイトゾル内）に発現される。Ｎ末端に存在し、かつミトコンドリアをターゲティングするように働く領域を「Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列」ともいう。サッカロマイセス・セレビシエ由来ＭＡＥ１においては、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列は、配列番号２のアミノ酸配列の１位〜３０位のアミノ酸配列からなる領域である。ミトコンドリア内でのリンゴ酸酵素の発現を可能とする遺伝子（「ミトコンドリア内発現遺伝子」ともいう）としては、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含むタンパク質をコードする遺伝子が用いられる。「ミトコンドリア内発現遺伝子」が含むＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列は、本来の全長領域を含むもの（この場合、「天然型酵素」をコードする遺伝子になり得る）、またはミトコンドリアへのターゲティング能力を有する限り、改変されたものであってもよい。

本発明の酵母におけるイソブタノール生産経路は、その一部または全体について、当該酵母が本来有している経路を利用してもよく、またはそのような経路を保有するまたは増強するように酵母を形質転換してもよい。

１つの実施形態では、上記酵母は、以下の（１）から（５）の変換：
（１）ピルビン酸から２−アセト乳酸への変換；
（２）２−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換；
（３）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸への変換；
（４）２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換；および
（５）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換
を含む代謝経路を含む。上記（１）から（５）の変換は、酵素の触媒によって進行する。本発明の酵母は、上記（１）から（５）の少なくとも１つの変換を触媒する酵素をコードする遺伝子を導入することにより、発現または発現増強するように形質転換されたものでもよい。上記（１）から（５）の各変換を触媒する酵素について、以下に説明する。

「アセト乳酸シンターゼ」（ＡＬＳ）は、ピルビン酸２分子から２−アセト乳酸１分子への変換（上記（１））を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アセト乳酸シンターゼは、「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」としても知られ、ＥＣ．２．２．１．６に分類され得るが、上記酵素活性を有する限り限定されない。アセト乳酸シンターゼ酵素としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ２（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ０７３４２；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ８５５１３５）；大腸菌（Escherichia coli）由来ｉｌｖＢ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ０８１４２；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １２９３３５９２）、ｉｌｖＧ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ００８９２；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ２８４７６９９）およびｉｌｖＩ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ００８９３；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １２９３０３８６）；枯草菌バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来ａｌｓＳ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｑ０４７８９；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９３６８５２）およびｉｌｖＢ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ３７２５１；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９３６７９２）；乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）由来ａｌｓ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｑ７ＤＡＶ２；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １１１４８２７）およびｉｌｖＢ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｑ０２１３７；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １１１４８７３）などが挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ２である。サッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ２の遺伝子配列およびそのコードするアミノ酸配列を配列番号５および６に示す。

「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」（ＫＡＲＩ）は、２−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換（上記（２））を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。ケトール酸レダクトイソメラーゼは、「アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ」としても知られ、ＥＣ．１．１．１．８６に分類され得るが、上記酵素活性を有する限り限定されない。ケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ５（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ０６１６８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ８５１０６９）、大腸菌由来ｉｌｖＣ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ０５７９３；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １２９３４３３７）、枯草菌バチルス・ズブチリス由来ｉｌｖＣ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ３７２５３；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９３７４７５）、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス由来ｉｌｖＣ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｑ０２１３８；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １１１４８７５）などが挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ５である。サッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ５の遺伝子配列およびそのコードするアミノ酸配列を配列番号７および８に示す。

「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」（ＤＨＡＤ）は、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸への変換（上記（３））を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、「２，３−ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」としても知られ、ＥＣ．４．２．１．９に分類され得るが、上記酵素活性を有する限り限定されない。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ酵素としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ３（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ３９５２２；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ８５３４７３）、大腸菌由来ｉｌｖＤ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ０５７９１；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １２９３４３３５）、枯草菌バチルス・ズブチリス由来ｉｌｖＤ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ５１７８５；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９３９０８４）、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス由来ｉｌｖＤ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｑ０２１３９；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １１１４８７２）などが挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ３である。サッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ３の遺伝子配列およびそのコードするアミノ酸配列を配列番号９および１０に示す。

アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをまとめてバリン生合成酵素群ともいい、それぞれ、酵母におけるピルビン酸からバリンへの生合成経路の第一、第二、および第三の工程を触媒し得る。これらの酵素は、酵母においては、通常、ミトコンドリア内に局在している（非特許文献１〜３および５）。

「ケト酸デカルボキシラーゼ」（ＫＤＣ）は、２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換（上記（４））を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。ケト酸デカルボキシラーゼは、「２−ケト酸デカルボキシラーゼ」などとも呼ばれ、上記酵素活性を有する限り限定されない。ケト酸デカルボキシラーゼ酵素としては、例えば、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス由来ｋｉｖＤ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｑ６８４Ｊ７；ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＡＪ７４６３６４）；サッカロマイセス・セレビシエ由来ＫＩＤ１（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｑ０７４７１；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ８５１４７９）およびＡＲＯ１０（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｈ８Ｘ５８６；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １４５４００４７）；枯草菌バチルス・ズブチリス由来ａｌｓＳ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｑ０４７８９；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９３６８５２）などが挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施形態では、ラクトコッカス・ラクティス由来ｋｉｖＤである。ラクトコッカス・ラクティス由来ｋｉｖＤの遺伝子配列およびそのコードするアミノ酸配列を配列番号１１および１２に示す。

「アルコールデヒドロゲナーゼ」（ＡＤＨ）は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換（上記（５））を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。このアルコールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰ依存性アルコールデヒドロゲナーゼとも呼ばれ、ＥＣ．１．１．１．２に分類され得るが、上記酵素活性を有する限り限定されない。アルコールデヒドロゲナーゼ酵素としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＡＤＨ６（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｑ０４８９４；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ８５５３６８）、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＡＤＨ７（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ２５３７７；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ８５０４６９）、大腸菌K12株（Escherichia coli(strain K-12)）由来ｆｕｃＯ（ＵＮＩＰｒｏｔ番号Ｐ０Ａ９Ｓ１；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １２９３０２２９）、およびラクトコッカス・ラクティス由来ＡＤＨＡ^ＲＥ１（イソブチルアルデヒドに対するアフィニティーを増大するように改変：Bastianら，Metabolic Engineering，2011，13：345-352）などが挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＡＤＨ６である。サッカロマイセス・セレビシエ由来ＡＤＨ６の遺伝子配列およびそのコードするアミノ酸配列を配列番号１３および１４に示す。

ケト酸デカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼは、酵母においては、通常、ミトコンドリア外（すなわちサイトゾル内）にて、バリンからイソブタノールを生成するエールリッヒ経路で働くことが知られる（非特許文献１〜３および４）。

１つの実施形態では、本発明の酵母は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体またはそれを構成する少なくとも１つのサブユニットを欠損する。

ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）複合体とは、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換（ピルビン酸脱炭酸反応と呼ばれる）する３つの酵素の複合体である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、通常、真核生物のミトコンドリアのマトリックスに位置し、全部で６０のサブユニットを含み、以下の３つの機能性タンパク質（酵素）を組織する：ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）（ＥＣ １．２．４．１）、２４のサブユニットから構成される；ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ（Ｅ２）（ＥＣ ２．３．１．１２）、２４のサブユニットから構成される；ならびにジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（Ｅ３）（ＥＣ １．８．１．４）、１２のサブユニットから構成される。

ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体またはそれを構成する少なくとも１つのサブユニットの欠損は、酵母におけるサブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制することによって行われ得る。遺伝子の発現の抑制の実施形態としては、正常タンパク質の生産量の抑制、および機能しない変異体タンパク質の生産もしくは促進が挙げられる。そのための遺伝子操作としては、トランスジェニック、遺伝子ノックアウト、ノックインなどが挙げられる。

発現を抑制するサブユニットはいずれであってもよい。好ましくは、ＰＤＡ１、ＰＤＢ１、ＬＡＴ１、ＬＰＤ１、およびＰＤＸ１の少なくともいずれか１つのサブユニットであり、より好ましくは、ＰＤＢ１およびＬＰＤ１の少なくともいずれか１つのサブユニットである。このような欠損酵母は、公知の遺伝子配列情報に基づいて適宜プライマー等を作製し、上記遺伝子操作を行うことによって作製してもよく、市販の欠損株を用いてもよい。市販の欠損株としては、例えば、ＢＹ４７４１ ｌｐｄ１Δ株（インビトロジェン株式会社；現ライフテクノロジーズ株式会社より入手）、ＢＹ４７４１ ｐｄｂ１Δ株（インビトロジェン株式会社；現ライフテクノロジーズ株式会社より入手）などが挙げられる。

１つの実施形態では、本発明の酵母は、（ｉ）アセト乳酸シンターゼをミトコンドリア内に発現増強する、（ｉｉ）アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをサイトゾルに発現する、または（ｉｉｉ）該（ｉ）および（ｉｉ）の両方である。

上述したように、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、通常、酵母においてミトコンドリア内に局在している。このように本来ミトコンドリア内に発現し局在する酵素を、ミトコンドリア外にて発現させることは、酵素タンパク質のＮ末端に存在し、かつミトコンドリアをターゲティングするように働く領域（「Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列」）を欠失させることによって行われ得る（非特許文献３および５）。よって、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないタンパク質をコードする遺伝子が設計され得る。Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないタンパク質とは、酵素のＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列全体を欠失させたもの、および酵素活性を維持しかつミトコンドリアへのターゲティング能力を喪失するようにＮ末端領域が欠失された（例えば、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列よりも１〜数個のアミノ酸長いもしくは短い領域の欠失）を包含する。

上記（ｉ）に関しては、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含む形態（例えば、天然型）のアセト乳酸シンターゼをコードするように遺伝子配列を設計し得る。例えば、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列（例えば、配列番号５に示す塩基配列）を設計し得る。１つの実施形態では、本発明の酵母の調製方法は、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含むアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を酵母に導入する工程（工程（Ｉ））を含む。

上記（ｉｉ）に関しては、これらの３つの酵素について、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないタンパク質をコードするように遺伝子配列を設計し得る。１つの実施態様では、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ２、ＩＬＶ３およびＩＬＶ５について、それぞれＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないタンパク質をコードするように遺伝子配列を設計する。ＩＬＶ２、ＩＬＶ３およびＩＬＶ５について、それぞれＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列は、配列番号５の１位〜５４位、配列番号９の１位〜４２位、配列番号７の１位〜４７位のアミノ酸配列からなる領域である。Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないサッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ２、ＩＬＶ３およびＩＬＶ５の例示の遺伝子配列およびそのコードするアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１５および１６；配列番号１７および１８；ならびに配列番号１９および２０に示す。１つの実施形態では、本発明の酵母の調製方法は、それぞれＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないアセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を酵母に導入する工程（工程（ＩＩ））を含む。

上記（ｉｉｉ）に関しては、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含むアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子、ならびに、それぞれＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないアセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子のそれぞれを設計し、これらの遺伝子を酵母に導入し得る。１つの実施形態では、本発明の酵母の調製方法は、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含むアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子、ならびに、それぞれＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないアセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を酵母に導入する工程（工程（ＩＩＩ））を含む。

各酵素をコードする遺伝子は、酵母において内因性であってもよいし、外因性であってもよい。また、公知のこれらの酵素をコードする遺伝子を適宜利用でき、上述に例示した酵素およびコードする遺伝子に限定されない。遺伝子としては、由来を問わないで利用できる。すなわち、遺伝子は、宿主となる酵母以外の他の種の酵母、他の属の酵母に由来するものであってもよいし、動物、植物、真菌（カビなど）、細菌などいずれ酵母以外の生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、当業者であれば、各種遺伝子データベース（例えば、ＵＮＩＰｒｏｔ、ＮＣＢＩなど）のホームページにアクセスすることにより適宜入手できる。

本発明で用いられる遺伝子は、各酵素活性を有する限りにおいて、データベースなどにおいて開示される配列情報と一定の関係を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。このような実施形態としては、開示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、本発明において発現または発現増強しようとする酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。開示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、すなわち、欠失、置換もしくは付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、好ましくは、１個以上１０個以下程度、より好ましくは、１個以上５個以下である。アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる：（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。

他の実施形態としては、本発明で用いられる遺伝子は、開示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ本発明において発現または発現増強しようとする酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。配列同一性は、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは、９０％以上であり、もっとも好ましくは９５％以上である。

本明細書において配列の同一性または類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。配列の「同一性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸または配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarityと称される。同一性および類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性および類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschulら, J. Mol. Biol.，1990，215:403-410；Altschylら，Nucleic Acids Res. 1997，25:3389-3402）を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。

さらに他の実施形態として、開示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、たとえば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち開示される塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましく９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。さらなる他の実施形態として、開示される塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましく９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、本発明で発現または発現増強しようとする酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。

このような遺伝子は、例えば、開示されるまたは公知の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、各種生物から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記ライブラリーなどに由来する核酸を鋳型とし、本発明で発現または発現しようとする酵素をコードする遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは遺伝子は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。

また、遺伝子は、例えば、開示されるまたは公知のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡを、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法または Gapped duplex法等の公知手法またはこれに準ずる方法が挙げられ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K（TAKARA社製）やMutant-G（TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。

酵母において、酵素またはタンパク質をコードする遺伝子の発現が増強されている形態としては特に限定されない。これら遺伝子の発現を増強する改変が行われる前に比べて、これらのタンパク質の生産量または活性の増大、あるいは、後述するようにイソブタノール生産能力の増強が確認されればよい。遺伝子の発現が増強されている実施形態としては、例えば、内因性のいずれかの遺伝子がより強力なプロモーター（例えば、構成的プロモーター）の制御下に連結された実施形態が挙げられる。また、追加的に内因性および／または外因性のいずれかの遺伝子が導入されている実施形態が挙げられる。追加的に導入されたいずれかの遺伝子は好ましくは構成的プロモーターなど強力なプロモーターで作動可能に保持されている。発現の増強について、本明細書中においては「過剰発現」ともいう。

導入される遺伝子は、誘導的プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下に連結され得る。好ましくは、構成的プロモーターの制御下に連結される。酵母における構成的プロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ３（ＴＤＨ３）、チトクロームｂｃ１コンプレックス（ＣＹＣ１）および高浸透圧応答７（ＨＯＲ７）の遺伝子のプロモーター、ならびにこれらの改変体が挙げられる。

また、これらの遺伝子のいずれかの遺伝子の発現が増強されている実施形態としては、いずれかの遺伝子の複数コピーが発現可能に保持されている実施形態が挙げられる。この場合、コピー数は特に限定しないが、２以上であることが好ましい。

酵母においていずれかの酵素またはタンパク質をコードする遺伝子が発現されているまたは発現が増強されているか、および複合体を欠損しているかは、形質転換酵母が上記各種実施形態を保持しているかどうかを検出する、あるいは形質転換酵母におけるいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現量、当該タンパク質のｍＲＮＡ発現量、形質転換酵母が産生したタンパク質の活性などのいずれかが、形質転換前と比較して増加または減少しているかどうかを調べることにより評価することができる。発現増強の場合、増加の程度は、こうした発現量などが発現増強前に比較して、好ましくは１０％以上であり、より好ましくは３０％以上であり、さらに好ましくは５０％以上であり、なおより好ましくは７０％以上である。

宿主として用いる酵母は、子のう菌酵母（Ascomycetous yeast）に属するものであればよく、特に限定されない。例えば、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）、カンジダ属（Candida）、ピチア属（Pichia）、スキゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、ハンセヌラ属（Hancenula）、クロッケラ属（Kloeckera）、シュワニオマイセス属（Schwanniomyces）、およびヤロウィア属（Yarrowia）などの酵母が挙げられる。サッカロマイセス属（Saccharomyces）であるものがより好ましい。

本発明の酵母は、上述したように、上記各種遺伝子または遺伝子を含有する発現ベクターを宿主となる酵母に導入することにより得られる。

発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、あるいは人工染色体であってもよい。酵母を宿主とする場合、ベクターの調製が容易であり、また酵母細胞の形質転換が容易である点で、プラスミドの形態が好ましい。発現ベクターは、例えば、これら遺伝子など所望の遺伝子組み換えのためのＤＮＡ断片を、適当なベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。プロモーターとしては、既に説明したほか、ＧＡＬプロモーター等の誘導的プロモーターが挙げられる。発現ベクターはさらに、ターミネーター、エンハンサー、複製開始点（ori）、マーカーなどを備えることができ、これらの要素が必要に応じて適宜選択される。発現ベクターが、遺伝子置換、遺伝子破壊などの染色体への所望のＤＮＡ断片の組み込みを意図する場合は、染色体上の所定の領域との相同領域を有している。相同領域は、所望のＤＮＡ断片を組み込む領域に応じて適宜選択される。本発明で用いる組換えベクター材料としては、商業的に入手可能な酵母発現ベクターから適宜選択して用いることができる。

ＤＮＡの取得の簡易化の点からは、酵母と大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。このようなベクターは、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）とＣｏｌＥ１の複製開始点とを有しており、酵母選択マーカー（以下に説明）および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有する。酵母選択マーカーとしては、公知の任意のマーカーが利用され得る。例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ３）をコードする遺伝子、リンゴ酸ベータ−イソプロピルデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）をコードする遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）をコードする遺伝子、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＲＧ４）をコードする遺伝子、Ｎ−（５’−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）をコードする遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）をコードする遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）をコードする遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＵＲＡ１）をコードする遺伝子、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）をコードする遺伝子、およびアルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＬＹＳ２）をコードする遺伝子など）が挙げられる。例えば、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＵＲＡ１、ＴＲＰ１欠損マーカーなど）が好ましく用いられ得る。

複数の遺伝子の導入が容易である点で、図１に示すようなｐＡＴＰ４２ｘ系ベクターが好適に用いられ得る。これらのプラスミドベクターは酵母の選択マーカーが異なること以外は共通する構成を有する。図１の（ａ）ｐＡＴＰ４２３；（ｂ）ｐＡＴＰ４２５；および（ｃ）ｐＡＴＰ４２６はそれぞれ、ｐＲＳ４０３＋２μｍ、ｐＲＳ４０５＋２μｍ、ｐＲＳ４０６＋２μｍ（Ishiiら，J. Biochem.，2009，145(6)，701-708）のマルチクローニングサイトに、ＡＤＨ１ターミネーターおよびＡＤＨ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーターおよびＴＤＨ３ターミネーター、ＰＧＫ１プロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーターを挿入して調製されたベクターであり、３つのマルチクローニング部位を有する。

酵母への遺伝子の導入方法は特に限定されず、公知の方法を採用できる。代表的には、上記のような発現ベクターを用いて酵母を形質転換する方法が挙げられる。形質転換方法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、酢酸リチウム法、プロトプラスト法などのトランスフェクション法やマイクロインジェクション法のような公知の方法を制限なく使用できる。導入された遺伝子は、プラスミドの形態で存在してもよく、または酵母の染色体に挿入された形態あるいは酵母の染色体に相同組換えにより組み込まれた形態で存在してもよい。

なお、上記のような発現ベクターの作製、組換え体宿主としての酵母などの取り扱い、形質転換などに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、例えば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982、1989、2001）などを適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。

形質転換酵母は、常法に従い、酵母選択マーカーによる形質または目的タンパク質の活性などを指標として選択することができる。

（イソブタノールを製造する方法）
本発明はさらに、イソブタノールを製造する方法を提供し、この方法は、上記イソブタノール生産酵母を、炭素基質を含む培地で培養する工程（本明細書中において、発酵工程ともいう）を含む。

炭素基質としての糖は、単糖、オリゴ糖、および多糖、ならびにこれらの混合物のいずれの形態でもよい。１つの実施形態では、培養培地は、グルコースを含む。グルコースを含有する培養培地の形態は、酵母がグルコースを用いることができる形態であれば特に限定されない。例えば、培養培地がグルコースにて構成されるオリゴ糖または多糖（例えば、デンプン、セルロース）を含む場合、これらの糖を分解可能な酵素を培地に含んでもよい。炭素基質は、例えば、バイオマス原料由来の炭素基質（例えば、リグノセルロース系バイオマスの分解に伴うもの）であってもよい。バイオマス原料由来の炭素基質またはリグノセルロース系バイオマスの分解により生成する糖としては、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトースおよびアラビノースなどが挙げられるが、少なくともグルコースを含んでいることが好ましい。

発酵工程では、酵母に一般的に適用される培養条件を適宜選択して用いることができる。典型的には、発酵のための培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下、および好気条件などから適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、例えば、２５℃〜４０℃、好ましくは、２８℃〜３５℃の範囲とすることができる。培養時間も必要に応じて設定されるが、数時間〜９６時間程度、好ましくは、１２時間〜３６時間とすることができる。ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液などを用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。

発酵工程の実施により、本発明の形質転換酵母によってイソブタノールが生産される。発酵終了後、培養液からイソブタノール含有画分を回収する工程、さらにこれを精製または濃縮する工程を実施することもでき、これらの工程は、当業者によって適宜選択される。

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

酵母発現用プラスミドｐＡＴＰ４２３、ｐＡＴＰ４２５およびｐＡＴＰ４２６は、それぞれｐＲＳ４０３＋２μｍ、ｐＲＳ４０５＋２μｍ、ｐＲＳ４０６＋２μｍ（Ishiiら，J. Biochem.，2009，145(6)，701-708）のマルチクローニングサイトに、ＡＤＨ１ターミネーターおよびＡＤＨ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーターおよびＴＤＨ３ターミネーター、ＰＧＫ１プロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーターを挿入して調製した。これらの構成を表す模式図を図１に示す（（ａ）ｐＡＴＰ４２３；（ｂ）ｐＡＴＰ４２５；および（ｃ）ｐＡＴＰ４２６）。

前培養で用いたＳＤ選択培地の組成は、Ｄ−グルコース２０ｇ／Ｌ、Yeast nitrogen base６．７ｇ／Ｌ、および適切なアミノ酸および核酸（メチオニン２０ｍｇ／Ｌ、アデニン４０ｍｇ／Ｌ、トリプトファン４０ｍｇ／Ｌ、リジン３０ｍｇ／Ｌ、ロイシン６０ｍｇ／Ｌ、ウラシル２０ｍｇ／Ｌおよびヒスチジン２０ｍｇ／Ｌ）とし、ＹＰＨ４９９株用には、上記適切なアミノ酸および核酸に関して、アデニン、トリプトファン、リジン、ロイシン、ウラシルおよびヒスチジンのうち選択圧をかけるために必要な成分のみを含まないものとし、またはＢＹ４７４１株およびＢＹ４７４１破壊株用には、メチオニン、ロイシン、ウラシルおよびヒスチジンのうち選択圧をかけるために必要な成分のみを含まないものとした。

（調製例１：ｋｉｖＤ発現およびＡｄｈ６過剰発現用プラスミドの作製）
２−ケト酸デカルボキシラーゼｋｉｖＤおよびアルコールデヒドロゲナーゼＡｄｈ６をそれぞれ酵母で発現および過剰発現させるためのプラスミドを構築した。酵母発現用プラスミドｐＡＴＰ４２６（図１（ｃ））のＴＤＨ３プロモーターおよびＴＤＨ３ターミネーターとの間にラクトコッカス・ラクティス由来のｋｉｖｄ遺伝子（配列番号１１；配列番号１２はそのコードするアミノ酸配列を示す）を挿入し、さらにＡＤＨ１プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターとの間にサッカロマイセス・セレビシエ由来ＡＤＨ６遺伝子（配列番号１３；配列番号１４はそのコードするアミノ酸配列を示す）を挿入して、プラスミドｐＡＴＰ４２６−ｋｉｖｄ−ＡＤＨ６を作製した（図２）。挿入に用いたｋｉｖｄ遺伝子は、ｐＧＫ４２４−ｋｉｖｄ（非特許文献４）を鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号２１）およびリバースプライマー（配列番号２２）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得たのち、この断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで処理することにより調製した。ＡＤＨ６遺伝子は、ｐＧＫ４２６−ＡＤＨ６（非特許文献４）を鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号２３）およびリバースプライマー（配列番号２４）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得たのち、この断片を制限酵素ＡｖｒＩＩおよびＦｓｅＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＡＴＰ４２６−ｋｉｖｄ−ＡＤＨ６は、大腸菌選択マーカーＡｍｐ^ｒ遺伝子および大腸菌ＣｏｌＥ１複製起点に加え、酵母選択マーカーＵＲＡ３遺伝子および酵母２μ複製起点を有するものであった。

（調製例２：Ｉｌｖ２過剰発現用プラスミドの作製）
アセト乳酸シンターゼＩｌｖ２を酵母で過剰発現させるためのプラスミドを構築した。酵母発現用プラスミドｐＡＴＰ４２５（図１（ｂ））のＰＧＫ１プロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーターとの間にサッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ２遺伝子（配列番号５；配列番号６はそのコードするアミノ酸配列を示す）を挿入して、プラスミドｐＩＬＶ２Ｌを作製した（図３）。挿入に用いたＩＬＶ２遺伝子は、ｐＧＫ４２５−ＩＬＶ２（非特許文献４）を鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号２５）およびリバースプライマー（配列番号２６）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得たのち、この断片を制限酵素ＸｍａＩおよびＡｓｃＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＩＬＶ２Ｌは、大腸菌選択マーカーＡｍｐ^ｒ遺伝子および大腸菌ＣｏｌＥ１複製起点に加え、酵母選択マーカーＬＥＵ２遺伝子および酵母２μ複製起点を有するものであった。

（調製例３：ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６およびＩｌｖ２過剰発現用プラスミドの作製）
２−ケト酸デカルボキシラーゼｋｉｖＤを発現させると同時に、アルコールデヒドロゲナーゼＡｄｈ６およびアセト乳酸シンターゼＩｌｖ２を酵母で過剰発現させるためのプラスミドを構築した。酵母発現用プラスミドｐＡＴＰ４２６−ｋｉｖｄ−ＡＤＨ６（図２）のＰＧＫ１プロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーターとの間にサッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ２遺伝子（配列番号５；配列番号６はそのコードするアミノ酸配列を示す）を挿入して、プラスミドｐＡＴＰ４２６−ｋｉｖｄ−ＡＤＨ６−ＩＬＶ２を作製した（図４）。挿入に用いたＩＬＶ２遺伝子は、ｐＩＬＶ２Ｌを制限酵素ＸｍａＩおよびＡｓｃＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＡＴＰ４２６−ｋｉｖｄ−ＡＤＨ６−ＩＬＶ２は、大腸菌選択マーカーＡｍｐ^ｒ遺伝子および大腸菌ＣｏｌＥ１複製起点に加え、酵母選択マーカーＵＲＡ３遺伝子および酵母２μ複製起点を有するものであった。

（調製例４：Ｉｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ発現用プラスミドの作製）
ケトール酸レダクトイソメラーゼ（Ｉｌｖ５）のＮ末端欠失変異体Ｉｌｖ５ｃ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｉｌｖ３）のＮ末端欠失変異体Ｉｌｖ３ｃおよびアセト乳酸シンターゼ（Ｉｌｖ２）のＮ末端欠失変異体Ｉｌｖ２ｃを酵母で同時に発現させるためのプラスミドを構築した。酵母発現用プラスミドｐＡＴＰ４２５（図１（ｂ））のＡＤＨ１プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターとの間にサッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ５ｃ遺伝子（配列番号１９；配列番号２０はそのコードするアミノ酸配列を示す）を挿入し、ＴＤＨ３プロモーターおよびＴＤＨ３ターミネーターとの間にサッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ３ｃ遺伝子（配列番号１７；配列番号１８はそのコードするアミノ酸配列を示す）を挿入し、さらにＰＧＫ１プロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーターとの間にサッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＬＶ２ｃ遺伝子（配列番号１５；配列番号１６はそのコードするアミノ酸配列を示す）を挿入して、プラスミドｐＩＬＶ５３２ｃｙｔＬを作製した（図５）。挿入に用いたＩＬＶ５ｃ遺伝子は、ｐＧＫ４２４−ＩＬＶ５ｃ（非特許文献５）を鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号２７）およびリバースプライマー（配列番号２８）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得たのち、この断片を制限酵素ＡｖｒＩＩおよびＦｓｅＩで処理することにより調製した。ＩＬＶ３ｃ遺伝子は、ｐＧＫ４２３−ＩＬＶ３ｃ（非特許文献５）を鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号２９）およびリバースプライマー（配列番号３０）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得たのち、この断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで処理することにより調製した。ＩＬＶ２ｃ遺伝子は、ｐＧＫ４２５−ＩＬＶ２ｃ（非特許文献５）を鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号３１）およびリバースプライマー（配列番号２６）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得たのち、この断片を制限酵素ＸｍａＩおよびＡｓｃＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＩＬＶ５３２ｃｙｔＬは、大腸菌選択マーカーＡｍｐ^ｒ遺伝子および大腸菌ＣｏｌＥ１複製起点に加え、酵母選択マーカーＬＥＵ２遺伝子および酵母２μ複製起点を有するものであった。

さらに、ＬＥＵ２遺伝子の代わりに異なる酵母選択マーカーＭＥＴ１５遺伝子を有するＩｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ過剰発現プラスミドｐＩＬＶ５３２ｃｙｔＭを作製した（図６）。ｐＩＬＶ５３２ｃｙｔＭは、酵母発現用プラスミドｐＧＫ４２１（S. Togawaら、J. Biochem.、2010年、第147巻、p. 867-873）を制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｃＩで処理することにより得られたＭＥＴ１５遺伝子を含む断片と、ｐＩＬＶ５３２ｃｙｔＬを制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｃＩで処理することにより得られたＩＬＶ５ｃ、ＩＬＶ３ｃおよびＩＬＶ２ｃを含む断片をライゲーション反応により結合することで調製した。得られたプラスミドｐＩＬＶ５３２ｃｙｔＭは、大腸菌選択マーカーＡｍｐ^ｒ遺伝子および大腸菌ＣｏｌＥ１複製起点に加え、酵母選択マーカーＭＥＴ１５遺伝子および酵母２μ複製起点を有するものであった。

（調製例５：Ｍａｅ１過剰発現およびｓＭａｅ１発現用プラスミドの作製）
リンゴ酸酵素Ｍａｅ１およびリンゴ酸酵素のＮ末端欠失変異体ｓＭａｅ１をそれぞれ酵母で過剰発現および発現させるためのプラスミドを構築した。酵母発現用プラスミドｐＡＴＰ４２３（図１（ａ））のＴＤＨ３プロモーターおよびＴＤＨ３ターミネーターとの間にサッカロマイセス・セレビシエ由来ＭＡＥ１遺伝子（配列番号１；配列番号２はそのコードするアミノ酸配列を示す）およびｓＭＡＥ１遺伝子（配列番号３；配列番号４はそのコードするアミノ酸配列を示す）をそれぞれ挿入して、プラスミドｐＡＴＰ４２３-ＭＡＥ１およびｐＡＴＰ４２３−ｓＭＡＥ１を作製した（図７）。挿入に用いたＭＡＥ１遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレビシエのＹＰＨ４９９株（RS. Sikorskiら、Genetics、1989年、第122巻、p. 19-27）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号３２）およびリバースプライマー（配列番号３３）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得たのち、この断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで処理することにより調製した。ｓＭＡＥ１遺伝子は、ＹＰＨ４９９株ゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号３４）およびリバースプライマー（配列番号３３）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得たのち、この断片を制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＡＴＰ４２３−ＭＡＥ１およびｐＡＴＰ４２３−ｓＭＡＥ１はそれぞれ、大腸菌選択マーカーＡｍｐ^ｒ遺伝子および大腸菌ＣｏｌＥ１複製起点に加え、酵母選択マーカーＨＩＳ３遺伝子および酵母２μ複製起点を有するものであった。

（調製例６：Ｍａｅ１もしくはｓＭａｅ１とＭｄｈ２共発現用プラスミドの作製）
リンゴ酸デヒドロゲナーゼＭｄｈ２をＭａｅ１もしくはｓＭａｅ１と酵母で共発現させるためのプラスミドを構築した。プラスミドｐＡＴＰ４２３−ＭＡＥ１およびｐＡＴＰ４２３−ｓＭＡＥ１（図７）のＡＤＨ１プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターとの間にサッカロマイセス・セレビシエ由来ＭＤＨ２遺伝子（配列番号３５；配列番号３６はそのコードするアミノ酸配列を示す）をそれぞれ挿入して、プラスミドｐＡＴＰ４２３−ＭＭおよびｐＡＴＰ４２３−ＭｓＭを作製した（図８）。挿入に用いたＭＤＨ２遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレビシエのＹＰＨ４９９株（RS. Sikorskiら、Genetics、1989年、第122巻、p. 19-27）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号３７）およびリバースプライマー（配列番号３８）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得たのち、この断片を制限酵素ＡｖｒＩＩおよびＦｓｅＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＡＴＰ４２３−ＭＭおよびｐＡＴＰ４２３−ＭｓＭはそれぞれ、大腸菌選択マーカーＡｍｐ^ｒ遺伝子および大腸菌ＣｏｌＥ１複製起点に加え、酵母選択マーカーＨＩＳ３遺伝子および酵母２μ複製起点を有する。

（調製例７：Ｍａｅ１もしくはｓＭａｅ１と、Ｍｄｈ２およびＰｙｃ２共発現用プラスミドの作製）
ピルビン酸カルボキシラーゼＰｙｃ２をＭｄｈ２と共に、Ｍａｅ１もしくはｓＭａｅ１と酵母で共発現させるためのプラスミドを構築した。プラスミドｐＡＴＰ４２３−ＭＭおよびｐＡＴＰ４２３−ＭｓＭ（図８）のＰＧＫ１プロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーターとの間にサッカロマイセス・セレビシエ由来ＰＹＣ２遺伝子（配列番号３９；配列番号４０はそのコードするアミノ酸配列を示す）をそれぞれ挿入して、プラスミドｐＡＴＰ４２３−ＰＭＭおよびｐＡＴＰ４２３−ＰＭｓＭを作製した（図９）。挿入に用いたＰＹＣ２遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレビシエのＹＰＨ４９９株（RS. Sikorskiら、Genetics、1989年、第122巻、p. 19-27）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号４１）およびリバースプライマー（配列番号４２）を用いて、常法のＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を得たのち、この断片を制限酵素ＸｍａＩおよびＡｓｃＩで処理することにより調製した。得られたプラスミドｐＡＴＰ４２３−ＰＭＭおよびｐＡＴＰ４２３−ＰＭｓＭはそれぞれ、大腸菌選択マーカーＡｍｐ^ｒ遺伝子および大腸菌ＣｏｌＥ１複製起点に加え、酵母選択マーカーＨＩＳ３遺伝子および酵母２μ複製起点を有するものであった。

（調製例８：酵母形質転換体の作製）
酵母サッカロマイセス・セレビシエのＹＰＨ４９９株（RS. Sikorskiら、Genetics、1989年、第122巻、p. 19-27）、ＢＹ４７４１株（CB. Brachmannら、Yeast、1998年、第14巻、p. 115-132）、ＢＹ４７４１ ｌｐｄ１Δ株（インビトロジェン株式会社；現ライフテクノロジーズ株式会社より入手）、ＢＹ４７４１ ｉｌｖ６Δ株（インビトロジェン株式会社；現ライフテクノロジーズ株式会社より入手）、ＢＹ４７４１ ｐｄｂ１Δ株（インビトロジェン株式会社；現ライフテクノロジーズ株式会社より入手）に調製例１〜７で作製したプラスミドを酢酸リチウム法により導入し、形質転換酵母を得た（表１）。得られた形質転換酵母をそれぞれ表１に示すように命名した。

（実施例１：試験管での形質転換酵母のイソブタノール生産試験１）
調製例８で得た形質転換酵母ＢＳＷ１２、ＢＳＷ１３、ＢＳＷ１４、ＢＳＷ１５、ＢＳＷ１６、ＢＳＷ１７、ＢＳＷ１８、ＢＳＷ１９およびＢＳＷ２０を用いて、グルコースからの試験管での生産試験を行い、イソブタノールの生産量を測定した。

用いた形質転換酵母は以下の通りであった：
ＢＳＷ１２、空ベクターで形質転換した酵母ＹＰＨ４９９株；
ＢＳＷ１３、ｋｉｖＤ発現およびＡｄｈ６過剰発現の形質転換酵母ＹＰＨ４９９株；
ＢＳＷ１４、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現およびＩｌｖ２過剰発現の形質転換酵母ＹＰＨ４９９株；
ＢＳＷ１５、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、およびｓＭａｅ１発現（Ｍａｅ１サイトゾル内発現）の形質転換酵母ＹＰＨ４９９株；
ＢＳＷ１６、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、ｓＭａｅ１発現（Ｍａｅ１サイトゾル内発現）およびＭｄｈ２発現の形質転換酵母ＹＰＨ４９９株；
ＢＳＷ１７、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、ｓＭａｅ１発現（Ｍａｅ１サイトゾル内発現）、Ｍｄｈ２発現およびＰｙｃ２発現の形質転換酵母ＹＰＨ４９９株；
ＢＳＷ１８、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、およびＭａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）の形質転換酵母ＹＰＨ４９９株；
ＢＳＷ１９、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、Ｍａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）およびＭｄｈ２発現の形質転換酵母ＹＰＨ４９９株；ならびに
ＢＳＷ２０、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、Ｍａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）、Ｍｄｈ２発現およびＰｙｃ２発現の形質転換酵母ＹＰＨ４９９株。

各形質転換酵母をＳＤ選択培地で前培養し、菌体を回収および洗浄後、試験管内に同様のＳＤ選択培地（初発Ｄ−グルコース濃度２０ｇ／Ｌを含む）５ｍｌおよび前培養にて回収した酵母を入れ、発酵を開始した。発酵は、１５０ｒｐｍ振盪下３０℃にて４８時間、微好気条件で行った。発酵開始４８時間後、発酵サンプル１００μＬを採取し、これにアセトン８９０μＬおよび２−ブタノール１０μＬを混合し、１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清を回収した。この上清をＧＣ−ＭＳガスクロマトフラフィー質量分析装置（ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０ Ｐｌｕｓ；株式会社島津製作所）に供し、培養液中のイソブタノール濃度（ｍｇ／Ｌ）を測定した。ＧＣ−ＭＳの分離用カラムにはＤＢ−ＦＦＡＰ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用い、キャリアガスにはヘリウムを用いた。ＧＣ温度は、４０℃にて１分保持；１０℃／分にて昇温し、１６５℃にて５分保持；１２０℃／分にて昇温し、２５０℃にて５分保持にて設定した。ＭＳ検出条件は、イソブタノール：m/z＝３２．９０、４０．９０、４１．９０である。結果を図１０に示す。

図１０から明らかなように、リンゴ酸酵素Ｍａｅ１の発現を増強した（すなわち、Ｍａｅ１をミトコンドリア内発現する）形質転換酵母ＢＳＷ１８〜２０において、増大したイソブタノール生産量が観察された。この中でも、Ｍｄｈ２またはＰｙｃ２を発現させるように形質転換した酵母ＢＳＷ１９または２０に比べて、Ｍｄｈ２またはＰｙｃ２を発現させるプラスミドを用いなかったＢＳＷ１８において、より高いイソブタノール生産量が観察された。さらに、ＢＳＷ１８は、ｓＭａｅ１発現（すなわち、Ｍａｅ１をサイトゾルで発現させた）に加えて、Ｍｄｈ２およびＰｙｃ２を発現するように形質転換した酵母ＢＳＷ１７よりも高いイソブタノール生産量を示した。

（実施例２：試験管での形質転換酵母のイソブタノール生産試験２）
調製例８で得た形質転換酵母ＢＳＷ１５７、ＢＳＷ１５８、ＢＳＷ１５９、ＢＳＷ１６０、ＢＳＷ１６４、ＢＳＷ１６５、ＢＳＷ１６６、ＢＳＷ１６７、ＢＳＷ１７１、ＢＳＷ１７２、ＢＳＷ１７３、ＢＳＷ１７４、ＢＳＷ１７８、ＢＳＷ１７９、ＢＳＷ１８０およびＢＳＷ１８１を用いたこと以外は、実施例１と同様に試験管内イソブタノール生産試験を行った。得られた結果を図１１に示す（図１１の（ａ）に、ＢＳＷ１５７、ＢＳＷ１５８、ＢＳＷ１６４、ＢＳＷ１６５、ＢＳＷ１７１、ＢＳＷ１７２、ＢＳＷ１７８およびＢＳＷ１７９の結果を示し、そして（ｂ）に、ＢＳＷ１５９、ＢＳＷ１６０、ＢＳＷ１６６、ＢＳＷ１６７、ＢＳＷ１７３、ＢＳＷ１７４、ＢＳＷ１８０およびＢＳＷ１８１の結果を示す）。

用いた形質転換酵母は以下の通りであった：
ＢＳＷ１５７、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、およびＭａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）の形質転換酵母ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１５８、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、ｓＭａｅ１発現（Ｍａｅ１サイトゾル内発現）、Ｍｄｈ２発現およびＰｙｃ２発現の形質転換酵母ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１５９、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ発現（Ｉｌｖ５、Ｉｌｖ３およびＩｌｖ２サイトゾル内発現）、およびＭａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）の形質転換酵母ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１６０、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ発現（Ｉｌｖ５、Ｉｌｖ３およびＩｌｖ２サイトゾル内発現）、ｓＭａｅ１発現（Ｍａｅ１サイトゾル内発現）、Ｍｄｈ２発現およびＰｙｃ２発現の形質転換酵母ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１６４、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、およびＭａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）の形質転換酵母ｌｐｄ１欠損ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１６５、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、ｓＭａｅ１発現（Ｍａｅ１サイトゾル内発現）、Ｍｄｈ２発現およびＰｙｃ２発現の形質転換酵母ｌｐｄ１欠損ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１６６、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ発現（Ｉｌｖ５、Ｉｌｖ３およびＩｌｖ２サイトゾル内発現）、およびＭａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）の形質転換酵母ｌｐｄ１欠損ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１６７、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ発現（Ｉｌｖ５、Ｉｌｖ３およびＩｌｖ２サイトゾル内発現）、ｓＭａｅ１発現（Ｍａｅ１サイトゾル内発現）、Ｍｄｈ２発現およびＰｙｃ２発現の形質転換酵母ｌｐｄ１欠損ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１７１、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、およびＭａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）の形質転換酵母ｉｌｖ６欠損ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１７２、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、ｓＭａｅ１発現（Ｍａｅ１サイトゾル内発現）、Ｍｄｈ２発現およびＰｙｃ２発現の形質転換酵母ｉｌｖ６欠損ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１７３、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ発現（Ｉｌｖ５、Ｉｌｖ３およびＩｌｖ２サイトゾル内発現）、およびＭａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）の形質転換酵母ｉｌｖ６欠損ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１７４、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ発現（Ｉｌｖ５、Ｉｌｖ３およびＩｌｖ２サイトゾル内発現）、ｓＭａｅ１発現（Ｍａｅ１サイトゾル内発現）、Ｍｄｈ２発現およびＰｙｃ２発現の形質転換酵母ｉｌｖ６欠損ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１７８、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、およびＭａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）の形質転換酵母ｐｄｂ１欠損ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１７９、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、ｓＭａｅ１発現（Ｍａｅ１サイトゾル内発現）、Ｍｄｈ２発現およびＰｙｃ２発現の形質転換酵母ｐｄｂ１欠損ＢＹ４７４１株；
ＢＳＷ１８０、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ発現（Ｉｌｖ５、Ｉｌｖ３およびＩｌｖ２サイトゾル内発現）、およびＭａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）の形質転換酵母ｐｄｂ１欠損ＢＹ４７４１株；ならびに
ＢＳＷ１８１、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ発現（Ｉｌｖ５、Ｉｌｖ３およびＩｌｖ２サイトゾル内発現）、ｓＭａｅ１発現（Ｍａｅ１サイトゾル内発現）、Ｍｄｈ２発現およびＰｙｃ２発現の形質転換酵母ｐｄｂ１欠損ＢＹ４７４１株。

図１１（ａ）および（ｂ）から明らかなように、ＢＳＷ１６６およびＢＳＷ１８０で、とりわけ増大したイソブタノール生産量が観察された。これらの酵母は、Ｍａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）に加え、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）複合体を欠損し、かつバリン生合成酵素群のケトール酸レダクターゼ（Ｉｌｖ５）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｉｌｖ３）およびアセト乳酸シンターゼ（Ｉｌｖ２）をサイトゾルに発現する。ＢＳＷ１６４およびＢＳＷ１７８でも、増大したイソブタノール生産量が観察された。これらの酵母は、Ｍａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）に加え、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）複合体を欠損し、かつアセト乳酸シンターゼ（Ｉｌｖ２）のミトコンドリア内の発現を増強する。ＢＳＷ１６６、ＢＳＷ１６４、ＢＳＷ１８０およびＢＳＷ１７８は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）複合体を欠損する酵母において、Ｍａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）をする点で共通している。

アセト乳酸シンターゼ（Ｉｌｖ２）の調節サブユニット（Ｉｌｖ６）を欠損させた酵母（ＢＳＷ１７１またはＢＳＷ１７３）においてもイソブタノール生産量の増大が見られたが、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）複合体を欠損する酵母に比べると増大の程度は低かった。

（実施例３：試験管での形質転換酵母のイソブタノール生産試験３）
調製例８で得た形質転換酵母ＢＳＷ１９２およびＢＳＷ２０５を用い、実施例１と同様に試験管内イソブタノール生産試験を行った。得られた結果を図１２に示す。

用いた形質転換酵母は以下の通りであった：
ＢＳＷ１９２、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、Ｉｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ発現（Ｉｌｖ５、Ｉｌｖ３およびＩｌｖ２サイトゾル内発現）、およびＭａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）の形質転換酵母ＢＹ４７４１株；ならびに
ＢＳＷ２０５、ｋｉｖＤ発現、Ａｄｈ６過剰発現、Ｉｌｖ２過剰発現、Ｉｌｖ５ｃ、Ｉｌｖ３ｃおよびＩｌｖ２ｃ発現（Ｉｌｖ５、Ｉｌｖ３およびＩｌｖ２サイトゾル内発現）、およびＭａｅ１過剰発現（Ｍａｅ１ミトコンドリア内発現増強）の形質転換酵母ｌｐｄ１欠損ＢＹ４７４１株。

図１２から明らかなように、ＢＳＷ２０５では、試験管において初発Ｄ−グルコース濃度２０ｇ／Ｌからの発酵開始４８時間後に、２３０ｍｇ／Ｌものイソブタノール生産量が得られた。ＢＳＷ２０５は、ミトコンドリア内のＭａｅ１発現増強に加え、ミトコンドリア内のアセト乳酸シンターゼ（Ｉｌｖ２）の発現を増強し、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）複合体を欠損しかつバリン生合成酵素群（Ｉｌｖ５、Ｉｌｖ３およびＩｌｖ２）をサイトゾルに発現する。

（実施例４：発酵ビンでの形質転換酵母のイソブタノール生産試験）
調製例８で得た形質転換酵母ＢＳＷ２０５を用いてグルコースからの発酵ビンでの生産試験を行い、イソブタノールの生産量を測定した。

形質転換酵母を、実施例１および３と同様にＳＤ選択培地で前培養し、菌体を回収および洗浄した。次いで、発酵ビンに、ＹＰＤ培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ペプトン２０ｇ／ＬおよびＤ−グルコース１００ｇ／Ｌを含有）５０ｍＬおよび前培養で回収した酵母を入れ、発酵を開始した。発酵条件は、酵母菌体量ＯＤ_６６０＝２０、１５０ｒｐｍ振盪下３０℃にて、微好気条件で行った。発酵開始３、６、２４および４８時間後に、発酵サンプル１００μＬを採取し、実施例１と同様にして培養液中のイソブタノール濃度（ｍｇ／Ｌ）を測定した。結果を図１３に示す。

図１３から明らかなように、ＢＳＷ２０５では、発酵ビンにおいて初発Ｄ−グルコース濃度１００ｇ／Ｌからの発酵開始６時間までにイソブタノール生産量が急上昇し、６時間後では１．２ｇ／Ｌのイソブタノール生産量が観察され、その後も増大を続け、発酵開始４８時間後には１．４ｇ／Ｌの生産量が観察された。

本発明によれば、生産性に優れたイソブタノール生産酵母が提供される。このようなイソブタノール生産酵母を用いることにより、イソブタノールをより効率的に製造することができる。ガソリン代替燃料として、かつ化成品の原料に有用なイソブタノールがバイオマスから製造できれば、二酸化炭素削減効果が期待できる。効率的な製造は、さらに経済的なコストの削減につながる。

Claims (11)

1. リンゴ酸酵素をミトコンドリア内に発現または発現増強するように形質転換された、イソブタノール生産酵母。
2. 前記酵母が、以下の（１）から（５）の変換：
   （１）ピルビン酸から２−アセト乳酸への変換；
   （２）２−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換；
   （３）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸への変換；
   （４）２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換；および
   （５）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換
   を含む代謝経路を含む、請求項１に記載の酵母。
3. 前記酵母がさらに、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体またはそれを構成する少なくとも１つのサブユニットを欠損する、請求項１または２に記載の酵母。
4. 前記酵母がさらに、（ｉ）アセト乳酸シンターゼをミトコンドリア内に発現増強する、（ｉｉ）アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをサイトゾルに発現する、または（ｉｉｉ）該（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項１から３のいずれかに記載の酵母。
5. イソブタノール生産酵母を調製する方法であって、
   イソブタノールを生産し、かつリンゴ酸酵素をミトコンドリア内に発現または発現増強する酵母を作出する工程を含む、方法。
6. 前記リンゴ酸酵素のミトコンドリア内への発現または発現増強が、Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含むリンゴ酸酵素をコードする遺伝子を導入することにより得られる、請求項５に記載の方法。
7. 前記イソブタノールの生産が、以下の（１）から（５）の変換：
   （１）ピルビン酸から２−アセト乳酸への変換；
   （２）２−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換；
   （３）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸から２−ケトイソ吉草酸への変換；
   （４）２−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換；および
   （５）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換
   を含む代謝経路を含むように酵母を形質転換することにより得られる、請求項５または６に記載の方法。
8. 前記酵母からピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体またはそれを構成する少なくとも１つのサブユニットを欠損させる工程をさらに含む、請求項５から７のいずれかに記載の方法。
9. 以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）：
   （Ｉ）Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含むアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を酵母に導入する工程；
   （ＩＩ）それぞれＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないアセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を酵母に導入する工程；および
   （ＩＩＩ）Ｎ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含むアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子、ならびに、それぞれＮ末端ミトコンドリアターゲティング配列を含まないアセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼおよびジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を酵母に導入する工程
   のいずれかの工程をさらに含む、請求項５から８のいずれかに記載の方法。
10. イソブタノールを製造する方法であって、
    請求項１から４のいずれかに記載の酵母を、炭素基質を含む培地で培養する工程を含む、方法。
11. 前記炭素基質を含む培地がグルコースを含む、請求項１０に記載の方法。

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