KR101876172B1

KR101876172B1 - 케톤의 거울상 이성질체 선택적 환원을 위한 디자이너 세포 및 거울상 이성질체 풍부한 알콜의 효율적인 생산에서의 이의 용도

Info

Publication number: KR101876172B1
Application number: KR1020157025390A
Authority: KR
Inventors: 가우탐 스리바스타바; 선닛 카우르; 라빈더 싱 졸리
Original assignee: 카운슬 오브 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2014-04-17
Publication date: 2018-07-10
Also published as: JP2016515399A; EP2986724B1; US9790524B2; EP2986724A1; CN105358687B; KR20150119347A; US20160289713A1; CN105358687A; WO2014170917A1; JP6330028B2

Abstract

본 발명은 다양한 산업적으로 중요한 거울상이성질체 부화된 알콜의 효율적인 생산에서 사용하기 위한 현저하게 향상된 카르보닐 환원효소 활성을 지니는 본원에서 "디자이너 세포"로 일컬어지는 다양한 재조합 전세포 생체촉매의 제조를 제공하는 발명이다. 더욱 특히, 알콜은 광학적으로 순수한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트이고, 이는 하이드록시메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA) 환원효소 억제제의 생산을 위한 중간체 및 키랄 빌딩 블록으로서 유용하다.

Description

케톤의 거울상 이성질체 선택적 환원을 위한 디자이너 세포 및 거울상 이성질체 풍부한 알콜의 효율적인 생산에서의 이의 용도{DESIGNER CELLS FOR ENANTIOSELECTIVE REDUCTION OF KETONES AND USE THEREOF IN EFFICIENT PRODUCTION OF ENANTIOENRICHED ALCOHOLS}

발명의 분야

본 발명은 전세포 생체촉매 및 거울상 이성질체 풍부한 알콜의 효율적인 생산에서의 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 높은 거울상이성질체 과량(enantiomeric excess)으로 다양한 케톤을 이들의 알콜로 비대칭 환원시키기 위한 현저하게 향상된 전환율을 지닌 본원에서 "디자이너 세포(designer cell)"로서 일컬어지는 전세포-생체촉매의 개발에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 하이드록시메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA) 환원효소 억제제의 생산을 위한 중간체 및 키랄 빌딩 블록(chiral building block)으로서 유용한, >99.9% 거울상이성질체 과량으로 화학식(2)으로 표현되는 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트을 생성시키기 위해서 화학식(1)으로 표현되는 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 효율적으로 전환시키기 위한 현저하게 향상된 전환율을 지니는 디자이너 세포의 개발에 관한 것이다.

화학식(1) 화학식(2)

발명의 배경

종래 기술에서, 문헌[Geotrichum candidum (Sundby, E. et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2003, 21, 63-66), Candida parapsilosis (Kaliaperumal, T. et al. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 2010, 37, 159-165), Candida magnoliae(Yasohara, Y. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 1999, 51, 847-851), Cylindrocarpon sclerotigenum (Saratani, Y. et al. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2001, 65, 1676-1679), Kluveromyces lactis (Yamamoto, H., et al. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2002, 66, 1775-1778), Kluyveromyces aestuarii (Yamamoto, H. et al. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2004, 68, 638-649), Aureobasidium pullulans (He, J. Y. et al. Process Biochemistry 2006, 41, 244-249), Pichia stipitis (Ye, Q. et al. Biotechnology Letters 2009, 31, 537-542) and Streptomyces coelicolor (Wang, L. J. et al. Bioresource Technology 2011, 102, 7023-7028)]와 같은 다양한 공급원으로부터 분리된 야생형 전세포 생체촉매의 사용에 의한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 포함한 산업상 중요한 광학적 활성 알콜의 제조를 위한 방법의 예가 기재되어 있다. 추가로, 야생형 전세포 생체촉매를 사용하여 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 생산하는 방법은 미국 특허 제99/5891685호; 미국 특허 제97/5700670호; 미국 특허 제96/5559030호; 미국 특허 제95/5413921호; 미국 특허 제90/4933282호 및 미국 특허 제87/4710468호에 개시되어 있다. 비록, 상응하는 알콜로의 카르보닐의 환원을 위한 야생형 미생물의 사용을 기재하고 있는 방법이 존재하지만, 이들은 낮은 효율, 낮은 기질 농도, 낮은 광학적 순도 등과 같은 단점이 있다. 따라서, 야생형 천연 전세포 생체촉매를 사용하여 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트을 포함한 산업적으로 중요한 광학적 활성 알콜을 합성하는 것이 비실용적이다.

에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트을 포함한 산업적으로 중요한 광학적 활성 알콜의 광학적 순도를 개선시키기 위한 추가의 공지된 방법은 칸디다 마그놀리애 (Wada, M. et al. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 1998, 62, 280-285), 스포로볼로마이세스 살모니콜라(Sporobolomyces salmonicolor) (Kita, K. et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 1999, 6, 305-313), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)(Yamamoto, H. et al. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2002, 66, 1775-1778), 클루이베로 마이세스 아에스투아리(Kluyveromyces aestuarii)(Yamamoto, H. et al. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2004, 68, 638-649), 피키아 스티피 티스(Pichia stipitis)(Ye, Q., et al. Bioresource Technology 2009, 100, 6022-6027) 및 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor)(Wang, L. J. et al. Bioresource Technology 2011, 102, 7023-7028)와 같은 본래의 공급원으로부터 정제된 효소의 사용을 포함한다.

카르보닐 환원효소 활성을 지니는 정제된 효소 또는 형질전환주가 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 포함한 케톤의 카르보닐기를 환원시키는 때에, 이는 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 포함한 산업저긍로 중요한 광학적 활성 알콜의 제조를 위한 보조효소, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드, 환원됨(NADH) 또는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)를 필요로 한다. 반응이 진행됨에 따라서, 보조효소는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH) 또는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP)로 전환된다. 보조인자(cofactor) 재생 시스템의 부재하에는, 화학양론적 양의 비싼 보조인자가 요구된다. 그러나, 반응이 보조인자 재생 시스템의 존재하에 수행되는 때에는, 비싼 보조효소의 양은 크게 감소된다. 보조인자 재생 시스템은 전형적으로는 이의 기질의 존재하에 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH) 또는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP)를 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드, 환원됨(NADH) 또는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)으로 전환시키는 효소로 이루어져 있다. 보조효소 재생 능력은 정제된 효소(Yasohara, Y. et al. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2000, 64, 1430-1436; Kaluzna, I. A. et al. Journal of the American Chemical Society 2004, 126, 12827-12832; Zhu, D. et al. The Journal of Organic Chemistry 2006, 71, 4202-4205; Ye, Q. et al. Biotechnology Letters 2009, 31, 537-542) 또는 세포질 내에 보조효소 재생 능력을 지니는 형질전환주(Xu, Z. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2006, 70, 40-46; Zhang, J. et al. Chemical Communications 2006, 398-400)의 사용에 의해서 충족될 수 있다.

유전자 셔플링 기술(gene shuffling technologies)을 이용한 시험관내 효소 진화(enzyme evolution)와 같은 방법이 이용되어, 약 13-배까지 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 비대칭적으로 환원시키는 케토환원효소 및 상응하는 야생형 효소에 비해서 약 7-배까지 글루코오즈 기질을 사용하여 보조인자 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP) 또는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)를 재생시키는 글루코오즈 탈수소효소의 활성을 개선시켰다(Steve K. Ma et al. Green Chemistry 2010, 12, 81-86; 미국 특허 제 10/0028972호; 미국 특허 제10/7816111호).

그러나, 분리된 효소의 사용은 비용을 추가시키고 광학적 활성 알콜의 생산을 위한 전체 공정을 경제적으로 주목받지 못하게 하는 추가의 단계, 예컨대, 효소의 분리, 정제 및 안정화를 필요로 한다. 추가로, 기질 및/또는 생성물에 의한 효소의 억제가 종종 발생할 수 있다. 두 효소, 즉, 카르보닐 화합물의 환원을 위한 한 효소 및 보조인자 재생을 위한 다른 효소와 함께 두 기질, 즉, 각각의 효소를 위한 각각의 기질의 사용은 반응의 복잡한 전체 역학(complex overall kinetics)을 초래한다. 합하면, 이들 인자는 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 포함한 거울상이성질체 풍부한 알콜(enantiomerically enriched alcohol)의 제조에서 전세포의 사용에 비해서 분리된 효소의 사용을 덜 주목을 끌게 한다.

야생형 균주와 관련된 낮은 효율의 문제점을 극복하기 위해서, 카르보닐 환원효소 활성을 엔코딩하는 유전자가 숙주 세포에서 추정되고 과발형될 수 있다. 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 포함한 거울상이성질체 풍부한 알콜의 생산을 위한 전세포 생체촉매의 효율에서의 추가의 개선은 동일한 숙주의 세포질에서 카르보닐 환원효소 및 보조효소 재생 능력 둘 모두를 동시발현시킴으로써 달성된다(Kizaki, N. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 55, 590-595, Kataoka, M. et al. Enzyme and Microbial Technology 2006, 38, 944-951; Ye, Q. et al. Bioresource Technology 2010, 101, 6761-6767).

그러나, 카르보닐 환원효소 능력이 존재하는 형질전환주 또는 카르보닐 환원효소 및 보조효소 재생 능력 둘 모두가 세포의 세포질에 존재하는 형질전환주를 사용하는 방법은 기질 흡수 및 생성물 유출에 대한 형질막에 의해서 부과되는 장벽, 전체 과정의 복잡한 역학 등으로 인한 낮은 효율과 같은 단점이 있다.

결국, 광학적으로 순수한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트 및 다른 광학적으로 풍부한 알콜의 생산을 위한 현재의 방법은 낮은 효율, 낮은 생산성, 등과 같은 단점이 있고, 그에 따라서, 생산 비용을 증가시킨다.

세포의 표면상에서 표소를 포함한 단백질을 발현시키는 기술은 공지되어 있으며(Lee, S. Y. et al. Trends in Biotechnology 2003, 21, 45-52), 생물전환(bioconversion)을 위한 전세포 생체촉매(Shimazu, M. et al. Protein. Biotechnology Progress 2001, 17, 76-80; Shimazu, M. et al. Biotechnology and Bioengineering 2001, 76, 318-324), 유해 화학물질 및 중금속의 제거를 위한 생체 흡착제(bioadsorbent)(Bae, W. et al. Biotechnology and Bioengineering 2000, 70, 518-524; Bae, W. et al. J Inorg Biochem 2002, 88, 223-227; Sousa, C. et al. J. Bacteriol. 1998, 180, 2280-2284; Xu, Z. et al. Appl Environ Microbiol 1999, 65, 5142-5147), 인간 항체 라이브러리의 스크리닝(Chao, G. et al. Nat. Protocols 2006, 1, 755-768), 돌연변이 검출(Aoki, T. et al. Analytical Biochemistry 2002, 300, 103-106), 효소, 리포터 또는 다른 신호-감지 성분을 고정시킴에 의한 바이오센서 개발(Dhillon, J. K. et al. Letters in Applied Microbiology 1999, 28, 350-354; Shibasaki, S. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 57, 702-707; Shibasaki, S. S. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 57, 528-533)과 같은 광범위한 범위의 생물 공학적 및 산업적 적용에서 사용되어 왔다.

더욱 최근에, 탈수소효소를 포함하지만 카르보닐 환원효소 및 글루코오즈 탈수소효소를 포함하지 않는 표적 단백질의 동시 디스플레이를 위한 방법이 미국 특허 제11/7897366에서 개시되었다. 일반적으로는, 표적 펩티드 또는 단백질(패신져 단백질(passenger protein))과 융합된 세포 표면 단백질 또는 이들의 트렁케시션된 형태(캐리어 단백질)이 사용되어 표면상에 단백질을 디스플레이시킨다. 그램 (-)(에셰리키아 콜리(Escherichia coli)), 그램 (+)(바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 균주) 박테리아 및 효모(사카로마이세 스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris))가 표면상의 이종 단백질 발현의 디스플레이를 위해서 시험되었다. 그램 (+) 박테리아의 세포 벽의 강성 구조는 그러한 박테리아를 적합한 숙주가 되게 하지만, 그램 (-) 에셰리키아 콜리가 세포 표면 디스플레이에 가장 인기 있으며 많이 시험되었다. 에셰리키아 콜리의 통합 단백질, 예컨대, 외부 막에 구조적 강성을 주는 LamB, FhuA, 및 포린(porin) OmpA, OmpC 및 OmpX가 새포외 루프 내의 짧은 아미노산 서열(최대 60 아미노산)의 삽입 및 세포 표면 상의 이의 디스플레이를 위해서 광범위하게 사용되었다. 외부 막 지질단백질은 작은 지질 개질된 아미노 말단에 의해서 막 내에 고정된다. 첫 번째 지질단백질 기반 세포 표면 디스플레이는 20 개의 아미노산 신호 서열과 성숙한 에셰리키아 콜리 지질단백질의 첫 번째 9개의 N-말단 잔기로 이루어진 Lpp-OmpA 키메라였으며, 에셰리키아 콜리 외부 막 단백질 A(OmpA)의 잔기 46-159는 패신져 단백질의 N-말단에 융합되었다.

도면의 간단한 설명

도 1은 기질로서 역할하는 화합물의 예이다.

도 2는 생성물로서 역할하는 화합물의 예이다.

도 3은 SEQ ID No: 1, 3, 5 또는 7에 상응하는 "CRS 폴리펩티드" 구성물의 개략적인 표현이다. 서열은 (i) 성숙한 에셰리키아 콜리 지질단백질(Lpp))의 첫 번째 9개의 N-말단 잔기에 연결된 N-말단 20-아미노산 신호 서열, (ii) C-말단에 융합된 패신져 단백질을 막을 가로질러 수송하는 것으로 예상되는 에셰리키아 콜리 외부 막 단백질 A(OmpA)의 잔기 46-159 및 (iii) 칸디다 마그놀리애(Candida magnoliae)의 야생형 카르보닐 환원효소 SEQ ID NO: 13 또는 몇 개의 아미노산 치환을 지님으로써 SEQ ID NO: 13과는 다른 개질된 카르보닐 환원효소 SEQ ID No: 15, 17 또는 19인 CRS의 전체 서열로 이루어져 있다. 첫 번째 29 aa 잔기 신호 + Lpp 펩티드는 Gly-Ile 링커를 통해서 114 aa OmpA 잔기에 연결되었고, 이어서, 이는 Gly-Ile-Pro-Gly를 통해서 CRS의 N-말단에 결합되었다.

도 4는 SEQ ID No: 9 또는 11에 상응하는 "GDH 폴리펩티드" 구성물의 개략적인 표현이다. 서열은 (i) 성숙한 에셰리키아 콜리 지질단백질(Lpp))의 첫 번째 9개의 N-말단 잔기에 연결된 N-말단 20-아미노산 신호 서열, (ii) C-말단에 융합된 패신져 단백질을 막을 가로질러 수송하는 것으로 예상되는 에셰리키아 콜리 외부 막 단백질 A(OmpA)의 잔기 46-159 및 (iii) 바실러스 메카테리움(Bacillus megaterium)의 글루코오즈 탈수소효소 SEQ ID NO: 21 또는 몇 개의 아미노산 치환을 지님으로써 SEQ ID NO: 21과는 다른 글루코오즈 탈수소효소 SEQ ID NO: 23인 GDH의 전체 서열로 이루어져 있다. 첫 번째 29 aa 잔기 신호 + Lpp 펩티드는 Gly-Ile 링커를 통해서 114 aa OmpA 잔기에 연결되었고, 이어서, 이는 Gly-Ile-Pro-Gly를 통해서 GDH의 N-말단에 결합되었다.

도 5는 재조합 벡터 pET23(a)-omp-CRS의 방법 및 구조이다.

도 6은 재조합 벡터 pETDuet1-omp-CRS, omp-GDH의 방법 및 구조이다.

도 7은 에셰리키아 콜리 세포의 표면 상에 CRS를 발현하는 '디자이너 전세포 생체촉매Designer whole-cell biocatalyst)'의 투과 전자 현미경 사진(Transmission electron micrograph: TEM)이다. 세포는 토끼 항-CRS 폴리클로날 항체에 이어서 나노골드 표지된 염소 항-토끼 IgG (전체 분자) 이차 항체로 프로빙(probing)되었다. 화살표는 골드 입자를 나타낸다. 도 7a는 어떠한 골드 표지화가 이루어지지 않은 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a), 즉, 음성 대조군의 TEM이다. 도 7b는 강한 골드 표지화를 나타내는 표면 상에 CRS를 발현하는 에셰리 키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-omp-CRS의 TEM을 나타낸다.

발명의 요약

본 발명은 에틸 4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트로의 환원에 대해 세포의 세포질 내에서 CRS를 발현하는 상응하는 종래의 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 250-배 내지 300-배 향상된 전환율을 지니는, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드를 발현시키는 에셰리키아 콜리 균주를 제공한다.

한 가지 구체예에서, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주는 다양한 케토 화합물의 비대칭 환원에 대해 세포의 세포질 내에서 CRS를 발현시키는 상응하는 종래의 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 250-배 내지 300-배 향상된 전환율을 지닌다.

한 가지 구체예에서, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주는 다양한 케토 화합물의 환원에 대해 세포의 세포질 내에서 CRS를 발현시키는 상응하는 종래의 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 단위 세포 질량 당 약 3-배 내지 26-배 향상된 전환율을 지닌다.

또 다른 양태로, 본 발명은 에셰리키아 콜리의 세포질에서 CRS 및 GDH를 동시에 발현시키는 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 에틸 4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 환원에 대한 250-배 내지 300-배 향상된 전환율 및 GDH 폴리펩티드의 단위 질량당 글루코네이트로의 클루코오즈의 산화에 대한 200-배 내지 250-배 향상된 활성을 지니는 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주를 제공하는 것에 관한 것이다.

한 가지 구체예에서, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주는 다양한 케톤의 환원에 대해 세포의 세포질에서 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 상응하는 종래 기술의 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 CRS 단백질의 단위 질량당 약 50-배 내지 270-배 향상된 전환율을 지닌다.

한 가지 구체예에서, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주는 다양한 케토 화합물의 환원에 대해 세포의 세포질 내에서 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 상응하는 종래 기술의 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 단위 세포 질량당 약 3-배 내지 24-배 향상된 전환율을 지닌다.

한 가지 구체예에서, 다양한 케톤은 화학식(3)으로 표현되는 지방족 화합물이고, 그러한 화학식에서, R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고, R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고, R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)m이고, X = Cl 또는 Br이고, n = 1-4이고, m = 1-8이다.

더욱 바람직한 구체예에서, R₁은 CH₂Cl이고, R₂는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 CH₃이고, R₂는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 CH₂Cl이고, R₂는 H이고, R₃은 (CH₂)₇CH₃이거나, R₁은 CH₃이고, R₂는 Cl이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 CF₃이고, R₂는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 (CH₃)₂CH이고, R₂는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이다.

또 다른 구체예에서, 다양한 케톤은 화학식(4)으로 표시되는 방향족 화합물이고, 그러한 화학식에서, R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고, R₆= 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고, n= 1 내지 5이다.

한 가지 구체예에서, 에셰리키아 콜리 균주는 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 또는 에셰리키아 콜리 C43(DE3)로부터 선택된다.

바람직한 구체예에서, 보조인자로서의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)에 의한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환율은 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 에셰리키아 콜리 균주 BL21(DE3)가 세포의 표면 상에서 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 에셰리키아 콜리 C41(DE3)로 대체되는 때보다 1.3-배 더 높다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 보조인자로서의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)에 의한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환율은, 보조인자 재생을 위한 외부 GDH의 추가를 필요로 하는, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드만을 발현시키는 에셰리키아 콜리 균주 BL21(DE3)에 비해서 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 에셰리키아 콜리 C41(DE3)의 경우에 약 1.6-배 더 높다.

특정의 구체예에서, 본 발명은 높은 생산성 및 150 g l^-1 이상의 생성물 축적율로 약 100% 거울상이성질체 과량으로 산업적으로 중요한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 생성시키는 생산 방법을 제공한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 다양한 변형 및/또는 대안적인 공정 및/또는 조성에 민감하지만, 본 발명의 특정의 구체예가 도면/도형 및 표로 예를 들어 설명되었고, 이하 상세히 기재될 것이다. 그러나, 본 발명을 개시된 특정의 공정 및/또는 조성으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 반대로, 본 발명은 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위 내에 속하는 모든 변형, 등가물 및 대안을 포괄하는 것임이 이해되어야 한다.

그래프, 도형, 표, 화학식 및 원안은, 본원의 설명의 이점을 이해하는 당업자에게는 쉽게 자명하게 될 상세사항으로 개시내용을 모호하지 않게 하기 위해서 본 발명의 구체예를 이해하기에 적절하게 단지 특정의 상세사항을 나타내고 있는, 도면으로 적절히 통상적인 표현으로 표현되었다.

이하 설명은 단지 예시적인 구체예에 관한 것이고 본 발명의 범위, 적용성 또는 형태를 어떠한 방식으로 든 제한하고자 하는 것이 아니다. 오히려, 이하 설명은 본 발명의 예시적인 구체예를 실행하기 위한 용이한 예시를 제공한다. 기재된 구체예에 대한 다양한 변화가 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 기재된 구성요소의 기능 및 배열에서 이루어질 수 있다.

용어, "포함한다", "포함하는" 또는 이의 다른 변형은 비-배타적인 포함을 포괄하는 것으로 의도되어서, "포함하다"의 앞에 오는 하나 이상의 공정 또는 조성/들 또는 시스템 또는 방법은, 추가의 제한 없이, 다른 공정, 서브-공정, 조성물, 서브-조성, 최소 또는 최대 조성 또는 다른 구성요소 또는 다른 구조 또는 추가의 공정 또는 조성 또는 추가의 구성요소 또는 추가의 특징 또는 추가의 특성 또는 추가의 속성을 배제하지 않는다.

정의

본 발명의 목적을 위해서, 하기 용어는 본원에서 정의된 바와 같은 의미를 지닐 수 있다.

"CRS 폴리펩티드"는 도 3에 개략적으로 도시된 아미노산 서열을 나타낸다.

"GDH 폴리펩티드"는 도 4에 개략적으로 도시된 서열을 나타낸다.

"카르보닐 환원효소" 및 "CRS"는 상호 교환적으로 사용되며, 케톤 및 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)를 상응하는 알콜 및 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP)로 전환시키는 폴리펩티드를 나타낸다.

"글루코오즈 탈수소효소" 및 "GDH"는 상호 교환적으로 사용되며, 글루코오즈 및 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP)를 글루코네이트 및 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)으로 전환시키는 폴리펩티드를 나타낸다.

설명 중에, 용어 "디자이너 세포"는 본원에서, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP)의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)로의 산화를 위한 외부 보조인자 재생 시스템의 추가와 함께 또는 그러한 추가 없이, 환원제로서 촉매량의 환원된 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADPH)를 사용하여 다양한 케톤의 비대칭 환원을 촉매 반응시켜 거울상이성질체 풍부한 알콜을 생성시키는 에셰리키아 콜리의 재조합 균주를 나타낸다.

추가로, 용어 "보조인자 재생 시스템"은 본원에서 반응전 상태로의 소모된 보조인자의 전환을 위한 반응에 첨가되는 반응물의 세트를 나타낸다. 예를 들어, CRS에 의한 알콜로의 케톤의 전환에서, 보조인자 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP)(소모된 보조인자)로 전환된다. 반응에의 시약 GDH 및 글루코오즈의 첨가는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP)로부터의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 재생을 발생시킬 것이다.

추가로, 용어 "CRS 폴리펩티드"는 도 3에 개략적으로 도시되고 있는 아미노산 서열을 의미하며, 여기서, CRS는 칸디다 마그놀리애 SEQ ID NO: 13의 야생형 카르보닐 환원효소 또는 몇 개의 아미노산 치환을 지님으로써 SEQ ID NO: 13과는 다른 개질된 카르보닐 환원효소 예컨대, SEQ ID NO: 15(P14A, S42N, A194V, I275V) or SEQ ID NO: 17(P14A, S42N, V147A, A194V, E234G) 또는 SEQ ID NO: 19(E9G, P14A, N20S, S42N, T190A, A194V, E234G)이다.

추가로, GDH 폴리펩티드는 도 4에 개략적으로 도시된 서열을 나타내며, 여기서, GDH는 바실러스 메카테리움 SEQ ID NO: 21의 야생형 글루코오즈 탈수소효소 또는 몇 개의 아미노산 치환을 지님으로써 SEQ ID NO: 21과는 다른 개질된 글루코오즈 탈수소효소, 예컨대, SEQ ID NO: 23(S16T, E170K, P194T, A197K, E222D, S237C)이다.

본원에서 사용되는 용어 "카르보닐 환원효소" 및 "CRS"는 상호 교환적으로 사용되며, 케톤 및 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)을 상응하는 알콜 및 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP)로 전환시키는 폴리펩티드를 나타낸다. 추가로, 용어 "글루코오즈 탈수소효소" 및 "GDH"는 상호 교환적으로 사용되며, 글루코오즈 및 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP)를 글루코네이트 및 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)로 전환시키는 폴리펩티드를 나타낸다.

본 발명은 높은 거울상이성질체 과량으로 다양한 케톤을 이들의 알콜로 거울상 이성질체 선택적으로 환원시키기 위한 현저히 향상된 전환율을 지니는 본원에서 "디자이너 세포"로 일컬어지는 전세포-생체촉매를 제공한다. 특히, 본 발명은 화학식(1)으로 표시되는 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 효율적으로 전환시켜서 하이드록시메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA) 환원효소 억제제의 생산을 위한 중간체 및 키랄 빌딩 블록으로서 유용한 화학식(2)으로 표시되는 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 >99.9% 거울상이성질체 과량으로 생성시키기 위한 현저하게 향상된 전환율을 지니는 디자이너 세포의 개발에 관한 것이다.

본 발명은 세포 표면 상에서의 카르보닐 환원효소 폴리펩티드(CRS)의 발현을 제공한다. 추가로, 본 발명은 또한 세포 표면 상에서의 카르보닐 환원효소 폴리펩티드(CRS) 및 글루코오즈 탈수소효소(GDH)의 동시발현을 제공한다. 따라서, 본 발명은 세포질에서 카르보닐 환원효소를 발현시키는 전세포 시스템의 기존의 단점을 극복하며, 여기서, 카르보닐 환원효소 폴리펩티드(CRS)는 세포의 표면에 고정되고, 산업적으로 중요한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환을 위한 동일한 숙주의 세포질에서 발현되는 카르보닐 환원효소에 비해서 CRS 폴리펩티드의 단위 질량당 예상치 못하고 놀랍게 향상된 전환율을 나타낸다. 유사하게, 본 발명은 또한 세포질에서 CRS 및 GDH 효소를 동시 발현하는 전세포 시스템의 기존의 단점을 극복하며, 여기서, CRS 및 GDH는 세포의 표면에 고정되고 동시 발현되고, 그러한 동시 발현은 예상치 못하고 놀랍게 향상된 발현을 나타낸다. 더욱이, 이러한 방식으로 발현되는 효소는 순수한 고정화 효소와 같이 거동하여 비용이 많이 드는 효소의 분리, 정제 및 안정화에 대한 필요를 없앨 것으로 예상된다. 또한, 속도론은 원형질막을 가로지른 기질 흡수 및 생성물 유출이 이러한 경에는 요구되지 않는다는 사실 때문에 훨씬 더 간단할 것으로 예상된다.

놀랍게도, 본 발명은 CRS 및 글루코오즈 탈수소효소 (GDH) 활성 둘 모두가 동일한 숙주에서 동시 발현되면 디자이너 세포의 효율이 추가로 개선될 수 있다는 가설과 부합하는데, 가능하게는, 그 이유는, 그러한 생체촉매에 의해서, 보조인자 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)/니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP)이 용액중에 완전히 자유롭게되는 것이 아니라, 그 대신에, 이것이 세포의 표면상에 매우 근접되어 편재되는 CRS과 GDH 사이로 채널화될 것이기 때문이다.

따라서, 본 발명은 세포의 표면상에서 단지 CRS만 발현하고 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 (S)-4-클로로-3-옥소부타노에이트의 전환에서 보조인자 재생을 위한 GDH의 외부 첨가를 필요로 형질전환주에 비해서 몇 배 개선된 효율을 지니며, 효소 카르보닐 환원효소 및 보조효소 재생 효소(예, 글루코오즈 탈수소효소)가 세포의 표면에서 함께 동시 발현되는 디자인된 형질전환주를 제공한다.

본 발명은 높은 생산성 및 적어도 150 g l^-1의 생성물 축적율과 함께 약 100% 거울상이성질체 과량으로 산업적으로 중요한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 생성시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP)의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)로의 산화를 위한 외부 보조인자 재생 시스템의 추가와 함께 또는 그러한 추가 없이, 환원제로서 촉매량의 환원된 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADPH)를 사용하여 다양한 케톤의 비대칭 환원을 촉매 반응시켜 거울상이성질체 풍부한 알콜을 생성시키는 에셰리키아 콜리의 재조합 균주인 "디자이너 세포"를 제공한다. 칸디다 마그 놀리애의 균주는 AKU4643이고 바실러스 메카테리움은 DSM 2894이다.

본 발명은 SEQ ID No: 1, 3, 5 또는 7에 상응하는 "CRS 폴리펩티드" 구성물을 포함하는 디자이너 세포를 제공한다. 본 발명에서 기재되는 디자이너 세포는 (a) 성숙한 에셰리키아 콜리 지질단백질(Lpp))의 첫 번째 9개의 N-말단 잔기에 연결된 N-말단 20-아미노산 신호 서열; (b) C-말단에 융합된 패신져 단백질을 막을 가로질러 수송하는 것으로 예상되는 에셰리키아 콜리 외부 막 단백질 A(OmpA)의 잔기 46-159; 및 (c) 칸디다 마그놀리애 SEQ ID NO: 13의 야생형 카르보닐 환원효소 또는 몇 개의 아미노산 치환을 지님으로써 SEQ ID NO: 13과는 다른 개질된 카르보닐 환원효소 SEQ ID No: 15, 17 또는 19인 CRS의 전체 서열을 지닌다. 첫 번째 29 aa 잔기 신호 + Lpp 펩티드는 Gly-Ile 링커를 통해서 114 aa OmpA 잔기에 연결되었고, 이어서, 이는 Gly-Ile-Pro-Gly를 통해서 CRS의 N-말단에 결합되었다(도 3). 몇 개의 아미노산 치환을 지님으로써 SEQ ID NO: 13과는 다른 개질된 카르보닐 환원효소는 예컨대, SEQ ID NO: 15(P14A, S42N, A194V, I275V) 또는 SEQ ID NO: 17 (P14A, S42N, V147A, A194V, E234G) or SEQ ID NO: 19 (E9G, P14A, N20S, S42N, T190A, A194V, E234G)이다.

본 발명은 또한 SEQ ID No: 9 또는 11에 상응하는 "GDH" 폴리펩티드 구성물을 포함하는 디자이너 세포를 제공한다. 본 발명에서 기재된 디자이너 세포는 (a) 성숙한 에셰리키아 콜리 지질단백질(Lpp))의 첫 번째 9개의 N-말단 잔기에 연결된 N-말단 20-아미노산 신호 서열; (b) C-말단에 융합된 패신져 단백질을 막을 가로질러 수송하는 것으로 예상되는 에셰리키아 콜리 외부 막 단백질 A(OmpA)의 잔기 46-159; 및 (c) 바실러스 메카테리움 SEQ ID NO: 21의 야생형 글루코오즈 탈수소효소(GDH) 또는 몇 개의 아미노산 치환을 지님으로써 SEQ ID NO: 21과는 다른 개질된 카르보닐 환원효소 SEQ ID NO: 23인 GDH의 전체 서열을 지닌다. 첫 번째 29 aa 잔기 신호 + Lpp 펩티드는 Gly-Ile 링커를 통해서 114 aa OmpA 잔기에 연결되었고, 이어서, 이는 Gly-Ile-Pro-Gly를 통해서 CRS의 N-말단에 결합되었다(도 3). 몇 개의 아미노산 치환을 지님으로써 SEQ ID NO: 21과는 다른 개질된 글루코오즈 탈수소효소는 예컨대, SEQ ID NO: 23(S16T, E170K, P194T, A197K, E222D, S237C)이다.

본 발명은 또한 반응전 상태로의 소모된 보조인자의 역 전환을 위한 반응에 첨가되는 시약의 세트로 본원에서 일컬어지는 보조인자 재생 시스템을 제공한다. 예를 들어, 디자이너 세포에 의한 알콜로의 케톤의 전환에서, 보조인자 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP)(소모된 보조인자)로 전환된다. 반응에의 시약 GDH 및 글루코오즈의 첨가는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP)로부터의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 재생을 발생시킬 것이다.

본원에서 나타낸 발명은 복수의 양태를 지닌다. 한 가지 양태에서, 본 발명은, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 흡광도의 감소에 의해서 측정되는 때에, 에틸 4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트로의 환원에 대해 세포의 세포질 내에서 CRS를 발현하는 상응하는 종래의 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 250-배 내지 300-배 향상된 전환율을 지니는, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주의 구성에 관한 것이다. CRS 폴리펩티드의 상대적인 양이 면역블로팅(immunoblotting)에 의해서 측정되었다(실시예 7).

한 가지 구체예에서, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주는, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 흡광도의 감소에 의해서 측정되는 때에, 다양한 케토 화합물의 환원을 위한 세포의 세포질에서 CRS를 발현시키는 상응하는 종래의 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 CRS 단백질의 단위 질량당 약 50-배 내지 275-배 향상된 전환율을 지닌다. 상대적인 CRS 단백질 함량은 면역블로팅에 의해서 측정되었다(실시예 7).

한 가지 양태에서, 케톤은 화학식(3)으로 표현되는 지방족 화합물이다.

화학식(3)

상기 식에서,

R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고

R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

X = Cl 또는 Br이고;

n = 1-4이고;

m = 1-8이다.

추가의 바람직한 구체예에서, R₁은 CH₂Cl이고, R₂는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 CH₃이고, R₂는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 CH₂Cl이고, R₂는 H이고, R₃은 (CH₂)₇CH₃ 이거나, R₁은 CH₃이고, R₂는 Cl이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 CF₃이고, R₂는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 (CH₃)₂CH이고, R₂는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이다.

또 다른 구체예에서, 케톤은 화학식(4)으로 표현되는 방향족 화합물이다.

화학식(4)

상기 식에서,

R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고;

R₆ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n 이고;

n= 1 내지 5이다.

본원에서 언급된 바와 같이, CRS 활성의 비교를 위해서 사용되는 종래 기술의 에셰리키아 콜리는 세포질에서 칸디다 마그놀리애 SEQ ID NO: 13의 야생형 카르보닐 환원효소 또는 개질된 카르보닐 환원효소 폴리펩티드 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 19를 발현하는 에셰리키아 콜리 균주를 나타낸다. 이들 에셰리키아 콜리 균주는 US 특허 제2010/0028972호에서 개시된 기술을 이용함으로써 구성되었다.

또 다른 양태로, 본 발명은, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 흡광도의 감소에 의해서 측정되는 때에, 에틸 4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트로의 환원에 대해 세포의 세포질 내에서 CRS를 발현하는 상응하는 종래의 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 단위 세포 질량 당 약 15-배 내지 26-배 향상된 전환율을 지니는, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주의 구성에 관한 것이다.

한 가지 구체예에서, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주는, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 흡광도의 감소에 의해서 측정되는 때에, 다양한 케토 화합물의 환원에 대해 세포의 세포질 내에서 CRS를 발현하는 상응하는 종래의 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 단위 세포 질량 당 약 3-배 내지 26-배 향상된 전환율을 지닌다.

한 가지 구체예에서, 케톤은 화학식(3)으로 표현되는 지방족 화합물로서, R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고, R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고, R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)m이고, X = Cl 또는 Br이고, n = 1-4이고, m = 1-8이인 지방족 화합물이다.

또 다른 구체예에서, 케톤은 화학식(4)으로 표시되는 방향족 화합물로서, R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고, R₆= 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고, n= 1 내지 5인 방향족 화합물이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 에셰리키아 콜리 세포의 세포질에서 CRS 및 GDH를 동시에 발현시키는 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 CRS 폴리펩티드의 단위 질량당 에틸 4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 환원에 대한 250-배 내지 300-배 향상된 전환율 및 GDH 폴리펩티드의 단위 질량 당 글루코네이트로의 글루코오즈의 산화에 대해서 200-배 내지 250-배 향상된 활성을 지니는 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주의 구성에 관한 것이다. CRS 활성은 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 흡광도의 감소에 의해서 측정되었다. CRS 폴리펩티드의 상대적인 양은 면역블로팅에 의해서 측정되었다(실시예 7). GDH 활성 및 GDH 폴리펩티드의 상대적인 양은 실시예 11에 기재된 바와 같이 측정되었다.

한 가지 구체예에서, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주는, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 흡광도의 감소에 의해서 측정되는 때에, 다양한 케토 화합물의 환원을 위한 세포의 세포질에서 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 상응하는 종래 기술 에셰리키아 콜리 균주에 비해서, CRS 단백질의 단위 질량당 에틸 약 50-배 내지 270-배 향상된 전환율을 지닌다. 상대적인 CRS 단백질 함량은 면역블로팅에 의해서 측정되었다(실시예 7).

본원에서 언급된 바와 같이, CRS 및 GDH 활성의 비교를 위해서 사용되는 종래 기술의 에셰리키아 콜리는 세포질에서 칸디다 마그놀리애 SEQ ID NO: 13의 야생형 카르보닐 환원효소 및 바실러스 메가테리움 SEQ ID NO: 21의 야생형 글루코오즈 탈수소효소를 동시에 발현하는 에셰리키아 콜리 균주를 나타낸다. 이들 에셰리키아 콜리 균주는 문헌[Kizaki, N. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 55, 590-595]에 개시된 기술을 이용함으로써 구성되었다. 추가로, 이는 세포질에서 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 19로부터 선택된 다양한 카르보닐 환원효소 및 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 23으로부터 선택된 다양한 글루코오즈 탈수소효소를 동시에 발현시키는 에셰리키아 콜리 균주를 나타낸다. 이들 에셰리키아 콜리 균주는 펩티드 서열, 이들 쳅티드 서열을 코딩하는 상응하는 뉴클레오티드 서열 및 발현 벡터와 관련하여 Applied and Microbial Technology의 Volume 55의 5590-595쪽, 2001년, 미국특허 제2010/0028972호 및 미국특허 제2010/7816111호에 개시된 지식을 기반으로 하여 구성되었다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 에셰리키아 콜리 세포의 세포질에서 CRS 및 GDH를 동시에 발현시키는 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 단위 세포 질량당 에틸 4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 환원에 대해 11-배 내지 24-배 향상된 활성 및 단위 세포 질량 당 글루코네이트로의 글루코오즈의 산화에 대해 9-배 내지 31-배 향상된 활성을 지니는, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주의 구성에 관한 것이다. CRS 활성은 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 흡수에서의 감소에 의해서 측정되었다. GDH 활성은 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP)의 흡광도의 증가에 의해서 측정되었다(실시예 11).

한 가지 구체예에서, 세포의 표면 상에 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 재조합 에셰리키아 콜리 균주는, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 흡광도의 감소에 의해서 측정되는 때에, 다양한 케토 화합물의 환원에 대해서 세포의 세포질에서 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현시키는 상응하는 종래 기술 에셰리키아 콜리 균주에 비해서 단위 세포 질량당 약 3-배 내지 24-배 향상된 전환율을 지닌다.

따라서, 본 발명의 목적은, 카르보닐 환원효소 활성을 지니는 형질전환주(들)의 표면상에서 발현되는, 서열목록의 SEQ ID NO:1, 3, 5 또는 7로부터 선택된 아미노산 서열로서, 하나 또는 몇 개의 아미노산이 서열목록의 SEQ ID NO:1, 3, 5 또는 7의 아미노산 서열에서 삭제되거나, 치환되거나 부가되는 아미노산 서열을 지니는 디자이너 세포를 제공하는 것이다.

상기 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명에 따른 DNA는 서열목록의 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 지닌다.

상기 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명에 따른 플라스미드는 pET 23(a)-omp-CRS이다.

상세한 설명에서, 아미노산 서열은 홀수로 할당되었다. 특정의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바로 다음의 짝수로 할당되었다. 예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1의 경우에, 상응하는 코팅 뉴클레오티드 서열은 서열 SEQ ID NO: 2로 할당되었다.

형질전환주를 생성시키기 위한 본 발명에 따라 사용되는 세포는 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 또는 에셰리키아 콜리 C43(DE3)로부터 선택된다.

본 발명에 따라서 사용되는 형질전환 세포는 상기 플라스미드 pET 23(a)-omp-CRS로 형질전환된 세포인 형질전환주(들)이다.

바람직한 구체예에서, 형질전환 세포는 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-omp-CRS이다.

더욱 바람직한 구체예에서, 형질전환 세포는 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pET 23(a)-omp-CRS이다.

바람직한 구체예에서, 디자이너 세포는 카르보닐 환원효소 활성을 지니는 형질전환주(들)의 표면상에서 발현되는, 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로서, 하나 또는 몇 개의 아미노산이 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에서 삭제되거나, 치환되거나, 부가되는 아미노산 서열을 지닌다.

상기 폴리펩티드를 위한 DNA는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 2이다.

형질전환주를 생성시키기 위한 본 발명에 따라 사용되는 세포는 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 또는 에셰리키아 콜리 C43(DE3)이다.

에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 포함한 산업적으로 중요한 광학적으로 순수한 알콜을 생성시키기 위해서 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 포함한 기질의 카르보닐기를 비대칭적으로 환원시키는 본 발명에 따른 형질전환주는 보조효소 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)를 필요로 한다. 반응이 진행됨에 따라서, 보조효소는 산화 유형의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP)로 전환된다. 환원 유형으로의 산화-유형의 전환은 보조효소 재생 능력을 지니는 또 다른 효소(예, 글루코오즈 탈수소효소)를 필요로 한다.

한 가지 구체예에서, 글루코오즈 탈수소효소는 바실러스 메가트리움으로부터 유래된다.

본 발명의 또 다른 목적은 두 가지의 폴리펩티드, 즉, 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 효과적으로 환원시키는 서열목록의 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7로부터 선택된 아미노산 서열로서, 하나 또는 몇 개의 아미노산이 서열목록의 SEQ ID NO:1, 3, 5 또는 7의 아미노산 서열에서 삭제되거나, 치환되거나, 부가되는 아미노산 서열을 지니는 CRS 활성을 지닌 폴리펩티드, 및 광학적으로 순수한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 생성시키는 보조효소 재생 활성을 지니는 서열목록의 SEQ ID NO: 9 또는 11로부터 선택된 아미노산 서열로서, 하나 또는 몇 개의 아미노산이 서열목록의 SEQ ID NO: 9 또는 11의 아미노산 서열에서 삭제되거나, 치환되거나, 부가되는 아미노산 서열을 지니는 GDH 활성을 지니는 폴리펩티드를 형질전환주의 표면상에서 동시 발현하는 디자이너 세포를 제공하는 것이다.

카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명에 따른 DNA는 서열목록의 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 지니고, 보조 효소 재생 효소의 경우에는 서열목록의 SEQ ID NO: 10 또는 12로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 지닌다.

카르보닐 환원효소 활성 및 보조효소 재생 능력을 지니는 둘 모두의 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명에 따른 플라스미드는 pETDuet1-omp-CRS,omp-GDH이다.

본 발명에 따라서 사용되는 형질전환 세포는 상기 플라스미드 pETDuet1-omp-CRS,omp-GDH로 형질전환된 세포인 형질전환주이다.

카르보닐 환원효소 활성 및 보조효소 재생 능력 둘 모두를 지니는 형질전환주를 생성시키기 위한 본 발명에 따라 사용되는 세포는 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 또는 에셰리키아 콜리 C43(DE3)로부터 선택된다.

바람직한 구체예에서, 형질전환 세포는 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET pETDuet1-omp-CRS,omp-GDH이다.

더욱 바람직한 구체예에서, 형질전환된 세포는 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pETDuet1-omp-CRS, omp-GDH이다.

바람직한 구체예에서, 형질전환주는 두 가지의 폴리펩티드, 즉, 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 효과적으로 환원시키는 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로서, 하나 또는 몇 개의 아미노산이 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에서 삭제되거나, 치환되거나, 부가되는 아미노산 서열을 지니는 CRS 활성을 지닌 폴리펩티드, 및 광학적으로 순수한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 생성시키는 보조효소 재생 활성을 지니는 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열로서, 하나 또는 몇 개의 아미노산이 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열에서 삭제되거나, 치환되거나, 부가되는 아미노산 서열을 지니는 GDH 활성을 지니는 폴리펩티드를 형질전환주의 표면상에서 동시 발현한다.

카르보닐 환원효소 활성을 지니는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명에 따른 DNA는 서열목록의 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열을 지니고, 보조효소 재생 효소의 경우에는 서열목록의 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오티드 서열을 지닌다.

카르보닐 환원효소 활성 및 보조효소 재생 능력을 지니는 둘 모두의 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명에 따른 플라스미드는 pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH이다.

본 발명에 따라 사용되는 형질전환된 세포는 상기 플라스미드 pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH로 형질전환된 세포인 형질전환주이다.

바람직한 구체예에서, 형질전환된 세포는 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET pETDuet1-omp-CRS,omp-GDH이다.

카르보닐 환원효소 활성 및 보조효소 재생 능력 둘 모두를 지니는 형질전환주를 생성시키기 위해 본 발명에 따라 사용되는 세포는 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 또는 에셰리키아 콜리 C43(DE3)로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 목적은 형질전환주(들)을 위한 배양 조건, 배양물을 수거하는 것, 카르보닐기를 지니는 기질을 위한 반응 조건 및 생성된 광학적 활성 알콜을 수거하는 것을 포함하여 산업적으로 중요한 광학적 활성 알콜을 생산하는 생산 방법을 제공하는 것이다.

한 가지 구체예에서, 케톤은 화학식(3)으로 표현되는 지방족 화합물이고, 생성되는 광학적 활성 알콜은 화학식(5)으로 표현된다.

화학식(5)

상기 식에서,

R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

X = Cl 또는 Br이고;

n = 1-4이고;

m = 1-8이다.

더욱 바람직한 구체예에서, R₁은 CH₂Cl이고, R2는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 CH₃이고, R₂는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 CH₂Cl이고, R₂는 H이고, R₃은 (CH₂)₇CH₃이거나, R₁은 CH₃이고, R₂는 Cl이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 CF₃이고, R₂는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이거나, R₁은 (CH₃)₂CH이고, R₂는 H이고, R₃은 CH₂CH₃이다.

또 다른 구체예에서, 케톤은 화학식(4)으로 표현되는 방향족 화합물이고, 생성되는 광학적 활성 알콜은 화학식(6)으로 표현된다.

화학식(6)

상기 식에서,

R₆ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

n= 1 내지 5이다.

디자이너 전세포 생체촉매는 원심분리 또는 여과에 의해서 발효 액체배지(fermentation broth)로부터 분리될 수 있다. 분리된 생체촉매는 그대로 사용되거나 동결건조 분말로서 사용될 수 ldT다 하이드록실 화합물로의 카르보닐 화합물의 생체내변환(biotransformation)의 경우에, 생체촉매가 pH 5.0-9.0, 그러나 최적으로는 6.5의 적합한 완충액 중에 10-45℃, 그러나 최적으로는 30℃의 온도에서 현탁될 수 있다. 임의로, 보조용매, 예컨대, 디에틸 에테르, 디-n-부틸 에테르, 메틸 n-부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트 등이 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 내용물은 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 상에서 효과적으로 혼합되거나 진탕될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 반응은 카르보닐 화합물을 30℃에서 디-n-부틸 에테르를 함유하는 pH 6.5의 포스페이트 완충액 중의 전세포 생체촉매와 접촉시킴으로써 수행된다.

특정의 구체예에서, 본 발명은 약 100% 거울상이성질체 과량으로 산업적으로 중요한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 생산하는 생산 방법으로서,

(i) 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 제공하고;

(ii) 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 세포의 표면 상에서 CRS 폴리펩티드를 발현하는 에셰리키아 콜리 균주 BL21(DE3), 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH), 글루코오즈 탈수소효소 및 완충 용액과 접촉시켜서 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로 전환시키기 위한 반응 혼합물을 형성시킴을 포함하는 생산 방법을 제공한다.

임의로, 유기 용매, 예컨대, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 메틸 n-부틸 에테르 또는 디-n-부틸 에테르가 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.

또 다른 특정의 구체예에서, 본 발명은 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 디자이너 전세포 생체촉매화된 환원을 통해서 약 100% 거울상이성질체 과량 및 고수율로 산업적으로 중요한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 생산하는 생산 방법으로서,

(i) 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 제공하고;

(ii) 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 세포의 표면 상에서 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 에셰리키아 콜리 균주 BL21(DE3), 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH), 및 완충 용액과 접촉시켜서 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로 전환시키기 위한 반응 혼합물을 형성시킴을 포함하는 생산 방법을 제공한다.

바람직한 구체예에서, 보조인자로서의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)에 의한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환율은 세포의 표면 상에서 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 에셰리키아 콜리 균주 BL21(DE3)가 세포의 표면 상에서 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 에셰리키아 콜리 C41(DE3)로 대체되는 때에 1.3-배 더 높다.

바람직한 구체예에서, 보조인자로서의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)에 의한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환율은 세포의 표면 상에서 단지 CRS 폴리펩티드만을 발현하여 보조인자 재생을 위한 외부 GDH의 첨가를 필요로 하는 에셰리 키아 콜리 균주 BL21(DE3)에 비해서 세포의 표면 상에서 CRS 폴리펩티드 및 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 에셰리키아 콜리 C41(DE3)의 경우에 1.6-배 더 높다.

특정의 구체예에서, 본 발명은 높은 생산성 및 적어도 150 g l^-1의 생성물 축적율과 함께 약 100% 거울상이성질체 과량으로 산업적으로 중요한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 생산하는 생산 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 주된 구체예는, 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13 또는 15 또는 17 또는 19의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 디자이너 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 250-배 내지 300-배 더 높은 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7로부터 선택된 서열의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 디자이너 세포를 제공한다.

화학식(1) 화학식(2)

본 발명의 또 다른 구체예는, 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 디자이너 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 약 275-배 더 높은 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록 SEQ ID NO: 1의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 본 발명에서 설명된 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13 또는 15 또는 17 또는 19의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 디자이너 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 15-배 내지 26-배 더 높은 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7로부터 선택된 서열의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 본 발명에서 설명된 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 디자이너 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 적어도 15-배 더 높은 활성을 지니는 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 본 발명에서 설명된 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 화학식(3)의 화합물의 환원에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 디자이너 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 50-배 내지 275-배 더 높은 활성을 지니는 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 본 발명에서 설명된 디자이너 세포를 제공한다.

화학식(3)

상기 식에서,

R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

X = Cl 또는 Br이고;

n = 1-4이고;

m = 1-8이다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 화학식(4)의 화합물의 환원에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 디자이너 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 50-배 내지 180-배 더 높은 활성을 지니는 세포의 표면 상에서 서열목록 SEQ ID NO: 1의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 본 발명에서 설명된 디자이너 세포를 제공한다.

화학식(4)

상기 식에서,

R₆ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

n= 1 내지 5이다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 화학식(3)의 화합물 또는 화학식(4)의 화합물의 환원에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 디자이너 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 약 3-배 내지 15-배 더 높은 활성을 지니는 세포의 표면 상에서 서열목록 SEQ ID NO: 1의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 본 발명에서 설명된 디자이너 세포를 제공한다.

화학식(3)

화학식(4)

상기 화학식(3)에서,

R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

X = Cl 또는 Br이고;

n = 1-4이고;

m = 1-8이며;

상기 화학식(4)에서,

R₆ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

n= 1 내지 5이다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13 또는 15 또는 17 또는 19의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21 또는 23의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 디자이너 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서 250-배 내지 300-배 더 높은 활성 및 GDH 폴리펩티드의 단위 질량 당 글루코네이트로의 글루코오즈의 산화에 대해서 200-배 내지 250-배 향상된 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7로부터 선택된 서열의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9 또는 11로부터 선택된 서열의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 본 발명에 기재된 디자이너 세포를 제공한다.

화학식(1) 화학식(2)

본 발명의 또 다른 구체예는, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 디자이너 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서 약 270-배 더 높은 활성 및 GDH 폴리펩티드의 단위 질량 당 글루코네이트로의 글루코오즈의 산화에 대해서 약 225-배 향상된 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 본 발명에 기재된 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13 또는 15 또는 17 또는 19의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21 또는 23의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 디자이너 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서 약 11-배 내지 24-배 더 높은 활성 및 단위 세포 질량 당 글루코네이트로의 글루코오즈의 산화에 대해서 9-배 내지 31-배 향상된 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7로부터 선택된 서열의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9, 11, 13 또는 15로부터 선택된 서열의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 본 발명에 기재된 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 디자이너 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서 약 24-배 더 높은 활성 및 단위 세포 질량 당 글루코네이트로의 글루코오즈의 산화에 대해서 31-배 향상된 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 본 발명에 기재된 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 화학식(3)의 화합물의 환원에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 디자이너 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 약 55-배 내지 270-배 더 높은 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 본 발명에 기재된 디자이너 세포를 제공한다.

화학식(3)

상기 식에서,

R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

X = Cl 또는 Br이고;

n = 1-4이고;

m = 1-8이다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 화학식(4)의 화합물의 환원에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 디자이너 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 약 40-배 내지 156-배 더 높은 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 본 발명에 기재된 디자이너 세포를 제공한다.

화학식(4)

상기 식에서,

R₆ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

n= 1 내지 5이다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 화학식(3)의 화합물 또는 화학식(4)의 화합물의 환원에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 디자이너 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 약 3-배 내지 24-배 더 높은 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 본 발명에 기재된 디자이너 세포를 제공한다.

화학식(3)

화학식(4)

상기 화학식(3)에서,

R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

X = Cl 또는 Br이고;

n = 1-4이고;

m = 1-8이며;

상기 화학식(4)에서,

R₆ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

n= 1 내지 5이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명에 기재된 디자이너 세포를 제공하는데, 그러한 디자이너 세포는 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) 또는 재조합 에셰리키 아 콜리 C41(DE3) 또는 재조합 에셰리키아 콜리 C43(DE3)이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 카르보닐 환원효소 활성을 보이는 SEQ ID NO 1 또는 3 또는 5 또는 7의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 카르보닐 환원효소 활성을 보이는 SEQ ID NO 1 또는 3 또는 5 또는 7의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드 및 GDH 활성을 보이는 SEQ ID NO 9 또는 11의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 약 100%의 거울상이성질체 과량으로 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트의 생산을 위한 본 발명에 기재된 디자이너 세포의 용도를 제공한다.

화학식(2)

본 발명의 또 다른 구체예는 약 100%의 거울상이성질체 과량으로 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트의 생산을 위한 청구항 8에 청구된 디자이너 세포의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 화학식(5)의 화합물의 생산을 위한 본 발명에 기재된 디자이너 세포의 용도를 제공한다.

화학식(5)

상기 식에서,

R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

X = Cl 또는 Br이고;

n = 1-4이고;

m = 1-8이다.

화학식(5)

상기 식에서,

R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

X = Cl 또는 Br이고;

n = 1-4이고;

m = 1-8이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 화학식(6)의 화합물의 생산을 위한 본 발명에 기재된 디자이너 세포의 용도를 제공한다.

화학식(6)

상기 식에서,

R₆ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

n= 1 내지 5이다.

화학식(6)

상기 식에서,

R₆ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

n= 1 내지 5이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 수탁번호 MTCC No.5806, MTCC No. 5807, MTCC No. 5808 및 MTCC No. 5809를 지니는 디자이너 세포로서, 디자이너 세포가 SEQ ID Nos. 2, 4, 6 및 8을 지니는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, SEQ ID Nos. 2, 4, 6 및 8을 지니는 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID Nos. 1, 3, 5 및 7을 지니는 아미노산 서열을 발현할 수 있는 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 수탁번호 MTCC No.5810, MTCC No. 5811, MTCC No. 5812, MTCC No. 5813; MTCC No. 5814. MTCC No. 5815, MTCC No. 5816 및 MTCC No. 5817을 지니는 디자이너 세포로서, MTCC No.5810가 SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO.10을 지니는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 수탁번호 MTCC No.5811를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 12를 지닌 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 수탁번호 MTCC No.5812를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 4 및 SEQ ID NO.10를 지닌 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 수탁번호 MTCC No.5813를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 4 및 SEQ ID NO. 12를 지닌 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 수탁번호 MTCC No.5814를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 6 및 SEQ ID NO. 10를 지닌 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 수탁번호 MTCC No.5815를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 6 및 SEQ ID NO. 12를 지닌 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 수탁번호 MTCC No.5816을 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 8 및 SEQ ID NO. 10을 지닌 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 수탁번호 MTCC No.5817을 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 8 및 SEQ ID NO. 12를 지닌 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 수탁번호 MTCC No.5810을 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO. 9를 지닌 아미노산 서열을 발현할 수 있고; 수탁번호 MTCC No.5811을 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO. 11을 지닌 아미노산 서열을 발현할 수 있고; 수탁번호 MTCC No.5812를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 9를 지닌 아미노산 서열을 발현할 수 있고; 수탁번호 MTCC No.5813를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 11을 지닌 아미노산 서열을 발현할 수 있고; 수탁번호 MTCC No.5814를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 5 및 SEQ ID NO. 9를 지닌 아미노산 서열을 발현할 수 있고; 수탁번호 MTCC No.5815를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 5 및 SEQ ID NO. 11을 지닌 아미노산 서열을 발현할 수 있고; 수탁번호 MTCC No.5816를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 9를 지닌 아미노산 서열을 발현할 수 있고; 수탁번호 MTCC No.5817을 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 11을 지닌 아미노산 서열을 발현할 수 있는 ㄷ디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 약 100% 거울상이성질체 과량으로 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트의 생산을 위한 방법으로서,

a. 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 제공하는 단계;

b. 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 본 발명에서 기재된 디자이너 세포 및 0.005 내지 0.02 mol%의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH) 및 100 내지 500 단위의 글루코오즈 탈수소효소 및 pH 5.0 내지 9.0의 완충용액과 접촉시키는 단계;

c. 단계(b)에서 얻은 반응 혼합물에 10:1 내지 1:1의 범위의 비율로 유기 용매, 예컨대, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 메틸 n-부틸 에테르 또는 디-n-부틸 에테르를 첨가하는 단계;

d. 20 내지 40℃의 항온에서 자성 교반기 상에서 반응 혼합물을 효과적으로 혼합하는 단계:

e. 에틸 아세테이트 중에 단계(d)에서 얻은 생성물을 추출한 다음, 생성물 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

화학식(1) 화학식(2)

본 발명의 또 다른 구체예는 pH가 바람직하게는 6.5인 본 발명에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 온도가 바람직하게는 30℃인 본 발명에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 유기 용매가 바람직하게는 디-n-부틸 에테르인 본 발명에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 디자이너 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 및 재조합 에셰리키아 콜리 C43(DE3)으로부터 선택된 재조합 에셰리키아 콜리의 균주인 본 발명에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 디자이너 세포가 바람직하게는 재조합 에셰리키 아 콜리 C41(DE3)인 본 발명에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명에 기재된 바와 같은 화학식(5)의 광학적으로 부화 (optically enriched)된 지방족 알콜의 생산을 위한 방법으로서,

a. 화학식(3)의 케톤을 제공하는 단계;

b. 단계(a)에서 제공된 화학식(3)의 케톤을 본 발명에서 기재된 디자이너 세포 및 0.005 내지 0.02 mol%의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH) 및 100 내지 500 단위의 글루코오즈 탈수소효소 및 pH 5.0 내지 9.0의 완충용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성시키는 단계;

e. 에틸 아세테이트 중에 단계(d)에서 얻은 생성물을 추출한 다음, 화학식(5)의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

화학식(3)

화학식(5)

상기 화학식(3)에서,

R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

X = Cl 또는 Br이고;

n = 1-4이고;

m = 1-8이며;

상기 화학식(5)에서

R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

R₃ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

X = Cl 또는 Br이고;

n = 1-4이고;

m = 1-8이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 디자이너 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 및 재조합 에셰리키아 콜리 C43(DE3)으로부터 선택된 재조합 에셰리키아 콜리의 균주인 본 발명에 기재된 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명에 기재된 바와 같은 화학식(6)의 광학적으로 부화된 아릴 알콜의 생산을 위한 방법으로서,

a. 화학식(4)의 케톤을 제공하는 단계;

b. 단계(a)에서 제공된 화학식(4)의 케톤을 본 발명에서 기재된 디자이너 세포 및 0.005 내지 0.02 mol%의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH) 및 100 내지 500 단위의 글루코오즈 탈수소효소 및 pH 5.0 내지 9.0의 완충용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성시키는 단계;

e. 에틸 아세테이트 중에 단계(d)에서 얻은 생성물을 추출한 다음, 화학식(6)의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

화학식(4)

화학식(6)

상기 화학식(4)에서,

R₆ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;

n= 1 내지 5이다.

상기 화학식(6)에서,

R₆ = 알킬기, 예컨대, CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m이고;

n= 1 내지 5이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 수탁번호 MTCC No.5806, MTCC No. 5807, MTCC No. 5808 및 MTCC No. 5809을 지니는 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 디자이너 세포가 SEQ ID No. 1, 3, 5 및 7을 지니는 아미노산 서열을 발현하는 수탁번호 MTCC 5806-5809을 지니는 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명에 기재된 디자이너 세포로서, SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7을 지니는 아미노산 서열이 SEQ ID No. 2, 4, 6 및 8을 지니는 뉴클레오티드 서열에 상응하는 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 SEQ ID Nos. 1-8이 카르보닐 환원효소 효소의 비-천연 서열인 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 세포 표면상에서 카르보닐 환원효소의 높은 활성을 발현시킬 수 있는 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 SEQ ID Nos. 1-8를 포함하고 이를 발현시킬 수 있는 재조합 벡터 구성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 카르보닐 환원효소 효소의 비-천연 서열을 포함하는 재조합 벡터 구성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 세포 표면상에서 카르보닐 환원효소의 높은 활성을 발현시킬 수 있는 본 발명에 기재된 재조합 벡터 구성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 수탁번호 MTCC No.5810, MTCC No. 5811, MTCC No. 5812, MTCC No. 5813; MTCC No. 5814. MTCC No. 5815, MTCC No. 5816 및 MTCC No. 5817를 지니는 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 디자이너 세포로서, 수탁번호 MTCC No.5810을 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO. 9의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5811을 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO. 11의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5812를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 9의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5813을 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 11의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5814를 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 5 및 SEQ ID NO. 9의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5815을 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 5 및 SEQ ID NO. 11의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5816을 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 9의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5817을 지니는 디자이너 세포가 SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 11의 아미노산 서열을 발현하는 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 및 11을 지니는 아미노산 서열이 SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 및 12를 지니는 뉴클레오티드 서열에 상응하는 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 세포 표면 상에서 효소 카르보닐 환원효소와 글루코나제 탈수소효소를 함께 동시에 발현시킬 수 있는 디자이너 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 및 11을 지니는 아미노산 서열 및 SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 및 12를 지니는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 이를 발현시킬 수 있는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 세포 표면 상에서 효소 카르보닐 환원효소와 글루코나제 탈수소효소를 함께 동시에 발현시킬 수 있는 본 발명에 기재된 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명에 기재된 바와 같은 화학식(5) 또는 화학식(6) 또는 화학식(2)의 화합물을 생산하는 방법으로서, (a) 본 발명에 기재된 바와 같은 화학식(3)을 지니는 케톤을 제공하는 단계; (b) 단계(a)의 화학식(3)의 케톤을 SEQ ID Nos. 1-12를 단독으로 또는 본 발명에서 기재된 것들과 함께 포함하는 본 발명에 기재된 바와 같은 디자이너 세포 및 0.005 내지 0.02 mol%의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)과 접촉시키고, 임의로, 필요한 경우에, 100 내지 500 단위의 글루코오즈 탈수소효소 및 pH 5.0 내지 9.0의 완충용액을 첨가하여 반응 혼합물을 형성시키는 단계; (c) 단계(b)에서 얻은 반응 혼합물에 10:1 내지 1:1의 범위의 비율로 유기 용매, 예컨대, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 메틸 n-부틸 에테르 또는 디-n-부틸 에테르를 첨가하는 단계; (d) 20 내지 40℃의 항온에서 자성 교반기 상에서 반응 혼합물을 효과적으로 혼합하는 단계: (e) 에틸 아세테이트 중에 단계(d)에서 얻은 생성물을 추출한 다음, 화학식(5) 또는 화학식(6) 또는 화학식(2)의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

발명의 이점

1. 본 발명은 산업적으로 중요한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서 종래 기술 생체촉매에 비해서 CRS의 단위 질량 당 적어도 250-배 개선된 전환율을 지니는 전세포 생체촉매를 제공한다.

2. 본 발명은 동일한 세포의 표면 상에서 환원효소 및 보조효소 재생 활성 둘 모두의 존재로 인해서 보조인자 부하와 관련하여 더 높은 효율을 지니는 전세포 생체촉매를 제공한다. 그러한 시스템에서, 보조인자 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)/니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP)는 세포의 표면 상에 매우 근접되어 편재되는 CRS와 GDH 사이로 채널화된다.

3. 거울상이성질체 부화된 알콜이 현저하게 더 높은 전환율로 생산된다. 더욱 특히, 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트가, 하이드록시메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA) 환원효소 억제제의 생산에 대한 중간체 및 키랄 형성 블록으로서 유용한, 적어도 150 g l^-1의 생성물 축적율과 함께 약 100% 거울상이성질체 과량으로 현저하게 더 높은 전환율로 생산된다.

플라스미드(들) 및 형질전환주 (들)

본 발명의 발현 플라스미드는 카르보닐 환원효소 활성을 보이는 SEQ ID NO 1 또는 3 또는 5 또는 7로 표현되는 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열목록의 SEQ ID NO: 2 또는 4 또는 6 또는 8로 표현되는 DNA 서열을 지닌 pET23(a)-omp-CRS를 포함한다.

본 발명의 발현 플라스미드는 카르보닐 환원효소 활성을 보이는 SEQ ID NO 1 또는 3 또는 5 또는 7로 표현되는 아미노산 서열을 지니는 CRS 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열목록의 SEQ ID NO: 2 또는 4 또는 6 또는 8 및 GDH 활성을 보이는 SEQ ID NO 9 또는 11로 표현되는 아미노산 서열을 지니는 GDH 폴리펩티드를 엔코딩하는 SEQ ID NO 10 또는 12로 표현되는 DNA 서열을 지닌 pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH를 포함한다.

본 발명의 DNA를 함유하는 플라스미드는 공지된 방법에 의해서 화학적으로 경쟁하는 숙수 세포내로 도입될 수 있다. 에셰리키아 콜리 DH5α는 클로닝 숙주로서 사용되었으며, 에셰리키아 콜리 BL21(DE3); 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 및 에셰 리키아 콜리 C43(DE3)는 발현 숙주로서 사용되었다.

본 발명에 따른 형질전환주의 예로서, 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET23(a)-omp-CRS가 언급될 수 있다.

더욱 현저하게는, 본 발명에 따른 형질전환주의 예로서, 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pET23(a)-omp-CRS가 언급될 수 있다.

카르보닐 환원효소 활성을 지니는 형질전환주 (들)

카르보닐 환원효소 활성을 지니는 형질전환주가 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트 및 보조효소 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)을 포함하는 기질의 카르보닐과 반응하는 때에, 이는 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 포함한 카르보닐기를 지니는 화합물을 비대칭적으로 환원시켜서 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 포함한 광학저긍로 순수한 상응하는 알콜을 생성시킨다. 발현 플라스미드 pET23(a)-omp-CRS 및 pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH를 지니는 상기 언급된 본 발명의 형질전환주(들)는 카르보닐 환원효소 활성을 나타낸다. 더욱 정확하게는, 발현 플라스미드 pET23(a)-omp-CRS 및d pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH를 지니는 상기 언급된 본 발명의 형질전환주(들)는 세포 표면상에서 카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드를 발현시켰다.

카르보닐 환원효소 및 보조효소 재생 활성 둘 모두를 지니는 형질전환주

CRS 및 GDH 발현 플라스미드 둘 모두를 함께, 즉, pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH를 지니는 상기 언급된 본 발명의 형질전환주는 카르보닐 환원효소 및 보조효소 재생 활성 둘 모두를 나타낸다. 더욱 정확하게는, 발현 플라스미드 pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH를 지니는 상기 언급된 본 발명의 형질전환주(들)는 세포의 표면상에서 카르보닐 환원효소 및 보조효소 재생 활성 둘 모두를 지니는 폴리펩티드를 발현시켰다.

균주 지정 및 기탁에 대한 상세사항

"CRS 폴리펩티드" 및 "GDH 폴리펩티드를 발현하는 합성된 재조합 에셰리키아 콜리 균주를 인도의 Chandigarh 160036, Sector 39A에 소재하는 Institute of Microbial Technology의 The International Depository Authority, Microbial Type Culture Collection and Gene Bank (MTCC)에 기탁하였다. 균주 지정 및 할당된 수탁번호가 이하 주어진다. 균주 MTCC 5806, 5807, 5808 및 5809는 각각 "CRS 폴리펩티드" SEQ ID No. 1, 3, 5 및 7을 각각 발현한다. 균주 MTCC 5810 내지 5817은 "CRS 폴리펩티드" SEQ ID No. 1, 3, 5 및 7 및 "GDH 폴리펩티드" SEQ ID No. 9 및 11를 동시에 발현한다. 상세한 설명에서, 아미노산 서열은 홀수로 할당되었다. 특정의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바로 다음의 짝수로 할당되었다. 예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1의 경우에, 상응하는 코딩 뉴클레오티드 서열은 서열 SEQ ID NO: 2로 할당되었다.

에셰리키아 콜리 의 표면상에서의 CRS의 발현에 대한 입증

CRS를 발현하는 재조합 세포를 용해시키고, 세포 조각을 원심분리에 의해서 제거하고, 이어서, 상등액을 4℃에서 2 시간 동안 1,00,000g에서 초원심 분리하여 막 분획과 가용물 분획을 분리하였다. 막 분획을 함유하는 침강물을 완충액으로 세척하고, 막 가용화 완충액(25 mM 트리스 HCl, 20% 글리세롤 및 2% 트리톤 X100, pH 7.5)에 재현탁시켰다. 세 개의 분획, 무-세포 추출물, 막 분획 및 가용성 단백질 분획 모두를 기질로서 에틸 4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 사용하여 활성에 대해서 검정하였다. 대부분의 활성은 막 분획으로부터 회복되었다.

에셰리키아 콜리 세포의 표면상에서의 CRS의 존재가 에셰리키아 콜리의 초박 절편으로 수행된 EM 이뮤노골드 표지화 연구(EM immunogold labeling study)에 의해서 추가로 확인되었다. 항-CRS 폴리클로날 항체가 토끼의 정제된 CRS에 대해서 발생하였으며 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의해서 이들의 특이성에 대해서 검정되었다. 정제된 CRS는 환원 조건하에 SDS-PAGE 상에서 진행되었으며, 니트로셀룰로오즈 막 상으로의 전기-블로팅 후에는, 알칼리 포스파타제 컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG(전체 분자) 이차 항체로 추가로 프로빙(probing)되었다. 이어서, 블롯을 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP, 0.15 mg/ml), 니트로 블루 테트라졸륨(NBT, 0.30 mg/ml), 트리스 HCl (100 mM) 및 MgCl₂ (5 mM), pH 9.5를 함유하는 기질 용액에 이를 10 분 동안 침지시킴으로써 전개시켰다. 순수한 CRS을 특별히 표지한 폴리클로날 항체는 또한 omp-CRS를 특별히 표지할 수 있었다.

몇 번의 탈수 단계 후에, 에셰리키아 콜리 세포를 LR 화이트 수지(LR white resin)에 임베딩(embedding)시키고, 이어서, 이를 정착제로서 0.2% 글루타르알데하이드를 사용하여 몇 단계로 탈수시켰다. 초마이크로톰(ultramicrotome)을 사용한 얇은 절편 컷을 토끼 항-CRS 폴리클로날 항체와 함께 인큐베이션한 다음에, 나노골드-표지된 염소 항-토끼 IgG(전체 분자) 이차 항체와 함께 인큐베이션하고, 투과 전자 현미경하에 가시화시켰다. 상이한 필드를 관찰하였으며, 골드 입자가 세포의 표면 상에 배타적으로 존재하는 것으로 밝혀졌다(도 7). 음성 대조군으로서의 세포는 표지화가 발생하지 않았다.

형질전환주(들)의 사용

카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA를 함유하는 본 발명의 형질전환주가 사용되는 때에, 광학적으로 순수한 알콜이 생산될 수 있다. 추가로, 카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드를 발현하는 발현 플라스미드 pET23(a)-omp-CRS를 지니는 형질전환주가 사용되는 경우에, 광학적으로 순수한 알콜이 생산될 수 있다. 카르보닐 환원효소 활성 및 보조효소 재생 활성을 지니는 폴리펩티드를 발현하는 발현 벡터 pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH를 지니는 형질전환주가 사용되는 때에, 광학적으로 순수한 알콜이 생산될 수 있다. 특히, 카르보닐 환원효소 활성 및 보조효소 재생 활성을 지니는 폴리펩티드를 발현하는 발현 벡터 pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH를 지니는 형질전환주가 사용되는 때에, 광학적활성 알콜이 더욱 효과적으로 생산될 수 있다.

본 발명의 카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 및 보조효소 재생 능력을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 둘 모두를 함유하는 형질전환주는 본 발명의 카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 및 보조효소 재생 능력을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 둘 모두를 단일의 벡터내로 도입시킴으로써 얻어질 수 있다.

카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 및 보조효소 재생 능력을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 둘 모두가 도입되는 벡터의 예로서, pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH가 언급될 수 있다.

추가로, 카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 및 보조효소 재생 능력을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 둘 모두를 함유하는 전질전환주의 예로서, 에셰리키아 콜리 BL21(DE3)를 벡터로 형질전환시킴으로써 얻은 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH가 언급될 수 있다.

추가로, 카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 및 보조효소 재생 능력을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 둘 모두를 함유하는 전질전환주의 예로서, 에셰리키아 콜리 C43(DE3)를 벡터로 형질전환시킴으로써 얻은 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH가 언급될 수 있다.

카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA를 함유하는 형질전환주 및 카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 및 보조효소 재생 능력을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 둘 모두를 함유하는 전질전환주의 배양은, 이들이 증식되는 한, 일반적으로 사용되며 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기 염 및 유기 영양물 등을 함유하는 액체 영약 배지에서 수행될 수 있다.

효소 활성에 대한 검정 방법

카르보닐 환원효소를 지니는 폴리펩티드를 발현시키는 형질전환주의 활성은 통상의 방법에 의해서 측정될 수 있다. 예를 들어, 카르보닐 환원효소의 활성은 50 mM 포스페이트 완충액, pH 6.5 중의 1 ml의 반응 혼합물이 2 mM ECAA, 0.2 mM 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH) 및 5-20 μl의 전세포 생체촉매 또는 5-10 μg의 정제된 단백질 또는 10⁶ - 10⁷의 전세포 생체촉매를 함유하는 경우에 얻어질 수 있고, 반응은 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 산화에 대해서 340 nm(6.22 mM^-1cm^-1의 몰 흡광 계수)에서 15 내지 60 분 동안 분광학적으로 모니터링되었다.

보조효소 재생 활성을 지니는 폴리펩티드를 발현하는 형질전환주의 활성은 통상의 방법에 의해서 측정될 수 있다. 예를 들어, 글루코오즈 탈수소효소의 활성은 100 mM 트리스-HCl 완충액, pH 8.0 중의 1 ml의 반응 혼합물이 10 mM 글루코오즈, 0.5 mM 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP) 및 5-20 μl의 전세포 생체촉매 또는 5-10 μg의 정제된 단백질 또는 10⁶ - 10⁷의 전세포 생체촉매를 함유하는 경우에 얻어질 수 있고, 반응은 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP)의 환원에 대해서 340 nm(6.22 mM^-1cm^-1의 몰 흡광 계수)에서 15 내지 60 분 동안 분광학적으로 모니터링되었다.

광학적 활성 알콜의 생산

카르보닐 환원효소 활성을 지니는 형질전환주 및 및 상업적으로 이용 가능한 글루코오즈 탈수소효소 또는 카르보닐 환원효소 활성 및 보조효소 재생 활성 둘 모두를 지니는 형질전환주를 사용한 광학적 활성 알콜의 생산은 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 포함한 기질로서 역할하는 카르보닐기를 함유한 화합물, 보조효소 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP) 및 글루코오즈를 적절한 용매에 첨가하고, pH를 조절하면서 혼합물을 교반함으로써 수행될 수 있다.

반응은 수성 용매 중에서 또는 수성 용매와 유기 용매의 혼합물 중에서 수행될 수 있다. 유기 용매의 예는 n-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 디에틸 에테르, 메틸 n-부틸 에테르, 디-n-부틸 에테르 등을 포함한다. 바람직하게는, 반응은 30℃에서 수행될 수 있으며, 반응 용액의 pH는 5N NaOH에 의해서 6.5에서 유지된다.

기질 및 생성물

기질로서 역할하는 카르보닐기를 지니는 지방족 화합물의 예는 화학식(1)으로 표현되는 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트, 화학식(7)으로 표현되는 에틸-3-옥소부타노에이트, 화학식(8)으로 표현되는 에틸 4-메틸-3-옥소펜타노에이트, 화학식(9)으로 표현되는 옥틸 4-클로로-3-옥소부타노에이트, 화학식(10)으로 표현되는 에틸 4,4,4-트리플루오로-3-옥소부타노에이트 및 화학식(11)으로 표현되는 에틸 2-클로로-3-옥소부티레이트를 포함한다:

기질로서 역할하는 카르보닐기를 지니는 방향족 화합물의 예는 하기 화학식(12)으로 표현되는 아세토페논, 화학식(13)으로 표현되는 1-(4-플루오로페닐)에탄온, 화학식(14)으로 표현되는 1-(4-클로로페닐)에탄온, 화학식(15)으로 표현되는 1-(4-브로모페닐)에탄온, 화학식(16)으로 표현되는 1-(4-(트리플루오로메틸)페닐)에탄온, 화학식(17)으로 표현되는 1-p-톨릴에탄온, 화학식(18)으로 표현되는 1-(4-메톡시페닐)에탄온 및 화학식(19)으로 표현되는 인돌린-2,3-디온을 포함한다:

상기 언급된 반응 조건에서, 화학식(1)으로 표현되는 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트가 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(2)으로 표현되는 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트가 얻어질 수 있다.

화학식(7)으로 표현되는 에틸-3-옥소부타노에이트가 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(20)으로 표현되는 에틸 (R)-3-하이드록시부타노에이트가 얻어질 수 있다.

상기 화학식(8)으로 표현되는 에틸 4-메틸-3-옥소펜타노에이트가 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(21)으로 표현되는 에틸 (S)-3-하이드록시-4-메틸펜타노에이트가 얻어질 수 있다.

상기 화학식(9)으로 표현되는 옥틸 4-클로로-3-옥소부타노에이트가 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(22)으로 표현되는 옥틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부타노에이트가 얻어질 수 있다.

상기 화학식(10)으로 표현되는 에틸 4,4,4-트리플루오로-3-옥소부타노에이트가 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(23)으로 표현되는 옥틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부타노에이트가 얻어질 수 있다.

상기 화학식(11)으로 표현되는 에틸 2-클로로-3-옥소부타노에이트가 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(24)으로 표현되는 (2R,3R)-에틸 2-클로로-3-하이드록시부타노에이트가 얻어질 수 있다.

상기 화학식(12)으로 표현되는 아세토페논이 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(25)으로 표현되는 (R)-1-페닐에탄올이 얻어질 수 있다.

상기 화학식(13)으로 표현되는 1-(4-플루오로페닐)에탄온이 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(26)으로 표현되는 (R)-1-(4-플루오로페닐)에탄올이 얻어질 수 있다.

상기 화학식(14)으로 표현되는 1-(4-클로로페닐)에탄온이 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(27)으로 표현되는 (R)-1-(4-클로로페닐)에탄올이 얻어질 수 있다.

상기 화학식(15)으로 표현되는 1-(4-브로모페닐)에탄온이 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(28)으로 표현되는 (R)-1-(4-브로모페닐)에탄올이 얻어질 수 있다.

상기 화학식(16)으로 표현되는 1-(4-(트리플루오로메틸)페닐)에탄온이 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(29)으로 표현되는 (R)-1-(4-(트리플루오로메틸)페닐)에탄올이 얻어질 수 있다.

상기 화학식(17)으로 표현되는 1-p-톨릴에탄온이 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(30)으로 표현되는 (R)-1-p-톨릴에탄올이 얻어질 수 있다.

상기 화학식(18)으로 표현되는 1-(4-메톡시페닐)에탄온이 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(31)으로 표현되는 (R)-1-(4-메톡시페닐)에탄올이 얻어질 수 있다.

상기 화학식(19)으로 표현되는 1-(4-니트로페닐)에탄온이 기질로서 사용되는 때에, 하기 화학식(32)으로 표현되는 (R)-1-(4-니트로페닐)에탄올이 얻어질 수 있다.

정제 및 분석

반응에 의해서 생산된 광학적으로 순수한 알콜은 통상의 방법, 예를 들어, 반응에 의해서 생산된 광학적으로 순수한 알콜을 함유하는 반응 혼합물을 유기 용매, 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기 용매를 감압하에 증류에 의해서 제거하고, 생성되는 혼합물을 증류, 재결정 또는 크로마토그래피 과정에 가함으로써 정제될 수 있다.

생성물의 광학적 순도는 Daicel Chemical Industries의 Chiracel OB-H, Chiracel OD-H, Chiracel OJ 제품을 사용함으로써 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서 측정되거나 평광계에 의한 광학 회전을 측정함으로써 측정되었다.

모든 화합물의 구조를 NMR에 의해서 확인하였다. NMR은 용매로서 CDCl₃, CD₃OD 또는 CD₃SOCD₃를 사용하여 가동되었다. 키랄 이동은 내부 표준으로서 사용된 TMS로부터의 다운필드(downfield)로서 보도된다. 결합 상수 값 J는 Hz로 보고된다.

분석 데이터

케톤의 생체촉매화된 환원으로부터 얻은 알콜을 실리카겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해서 정제하였다.

화학식(2)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.28 (3H, t, J = 7.2 Hz); 2.63 (3H, m); 3.61 (2H, dd, J = 7.2, 5.4 Hz); 4.18 (2H, q, J = 7.2 Hz); 4.23 (1H, m). HPLC: Chiracel OB-H, λ₂₁₇, 헥산:이소프로판올 96:4, 1 ml/min. 채류시간 13.2 min (R) 및 14.3 min(S). [α]_D ²⁵ = -22.1 (c = 8.72, CHCl₃).

화학식(20)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.21 (3H, d, J = 6.5 Hz); 1.26 (3H, t, J = 6.8 Hz); 2.46 (2H, m); 3.00 (1H, bs); 4.16 (3H, m). HPLC: Chiracel OB-H, λ₂₁₇, 헥산:이소프로판올 96:4, 1 ml/min. 채류시간 9.4 min (S) 및 10.5 min (R). [α]_D ²⁵ = -44.2 (c = 2.03, CHCl₃).

화학식(21)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 0.90 및 0.93 (각각 3H, 각각 t, J = 6.8 Hz); 1.26 (3H, t, J = 7.2 Hz); 1.69 (1H, m); 2.38 (1H, dd, J = 9.6, 16.5 Hz); 2.52 (1H, dd, J = 2.8, 16.5 Hz); 2.94 (1H, bs); 3.75 (1H, m,); 4.14 (2H, q, J = 7.2 Hz). HPLC: Chiracel OD-H, λ₂₁₇, 헥산:이소프로판올 95:5, 1 ml/min. 채류시간 5.3 min (S) 및 7.7 min (R). [α]_D ²⁵ = -40.8 (c = 2.56, CHCl₃).

화학식(22)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 0.86 (3H, t, J = 6.9 Hz, H2 CH3); 1.27 (10H, m, 5 x CH2); 1.61 (2H, m); 2.62 (2H, m); 3.60 (2H, m); 4.11 (2H, t, J = 6.8 Hz); 4.14 (1H, m, H3). HPLC: Chiracel OB-H, λ₂₁₇, 헥산:이소프로판올 96:4, 1 ml/min. 채류시간 5.7 min (R) 및 7.6 min (S). [α]_D ²⁵ = -15.9 (c = 4.60, CHCl₃).

화학식(23)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.29 (3H, t, J = 7.2 Hz); 2.70 (2H, m); 4.21 (2H, q, J = 7.2 Hz); 4.43 (1H, m). [α]_D ²⁵ = -20.3 (c = 1.87, CHCl₃).

화학식(24)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.34 (m, 6H); 4.25 (m, 4H). de = >96% by GC: FactorfourTM (Varian, 30m x 0.25mm, 140℃, N₂ 1 kg min^-1), 채류 시간 9.98 (syn), 8.85 (anti); >99% anti. Ee. >98% GC betaDexTM (Supelco, 30m x 0.25mm, 140 oC, N₂ 1 kg min^-1), 문헌에 의한 광학적 회전의 비교를 기반으로 하여 추정적으로 할당된(2R, 3R) 형태. [α]_D ²⁵ = -3.8 (c = 1.13, CHCl₃).

화학식(25)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.49 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.10 (1H, bs); 4.87 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.35 (5H, m). HPLC: Chiracel OB-H, λ₂₁₇, 헥산:이소프로판올 96:4, 1 ml/min. 채류시간 6.2 min (R) 및 9.2 min (S). [α]_D ²⁵ = +54.8 (c = 2.74, CHCl₃).

화학식(26)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.49 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.03 (1H, bs); 4.89 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.01 및 7.03 (각각 2H, 각각 d, J = 8.6 Hz). HPLC: Chiracel OB-H, λ₂₁₇, 헥산:이소프로판올 96:4, 1 ml/min. 채류시간 7.8 min(S) 및 8.8 min(R).[α]_D ²⁵ = +48.8 (c = 1.4, CHCl₃).

화학식(27)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.47 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.1 (1H, bs, OH); 4.87 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.31 (4H, s). HPLC: Chiracel OB-H, λ₂₁₇, 헥산:이소프로판올 96:4, 1 ml/min. 채류시간 8.9 min (S) 및 10.5 min (R). [α]_D ²⁵ = +49.2 (c = 1.83, 에테르).

화학식(28)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.47 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.08 (1H, bs); 4.87 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.25 and 7.47 (각각 2H, 각각 d, J = 8.7 Hz). HPLC:Chiracel OB-H, λ₂₁₇, 헥산:이소프로판올 96:4, 1 ml/min. 채류시간 9.4 min (S) 및 11.4 min (R). [α]_D ²⁵ = +38.3 (c = 1.55, CHCl₃).

화학식(29)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.5 (3H, d, J = 6.51 Hz); 2.33 (1H, bs); 4.98 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.48 및 7.60 (각각 2H, 각각 d, J = 8.2 Hz).[α]_D ²⁵ = +27.2 (c 2.08, MeOH).

화학식(30)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.48 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.01 (1H, bs); 2.38 (1H, s); 4.87 (1H, q, J = 6.5 Hz); 7.15 및 7.26 (각각 2H, 각각 d, J = 7.9 Hz). HPLC:Chiracel OB-H, λ₂₁₇, 헥산:이소프로판올 95:5, 1 ml/min. 채류시간 10.1 min (S) 및 12.9 min (R). [α]_D ²⁵ = +52.1 (c = 1.98, CHCl₃).

화학식(31)의 화합물: ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃): 1.46 (3H, d, J = 6.5 Hz); 2.08 (1H, bs); 3.80 (3H, s); 4.84 (1H, q, J = 6.5 Hz); 6.86 및 7.28 (각각 2H, 각각 d, J = 8.2). [α]_D ²²= +51.4 (c 1.72, CHCl₃).

화학식(32)의 화합물: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 1.52 (3H, t, J = 6.5 Hz, CH3); 2.50 (1H, bs, OH); 5.02 (1H, q, J = 6.5 Hz, CH); 7.54 및 8.12 (각각 2H, 각각 d, J = 8.9 Hz, 아릴).[α]_D ²⁵ = +31.4 (c = 3.99, CHCl₃).

이하 설명은 단지 예시적인 구체예의 설명이며 어떠한 방식으로 든 본 발명의 범위, 적용성 또는 형태를 제한하고자 하는 것이 아니다. 오히려, 이하 설명은 기재된 구체예에 대한 다양한 변화가 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 기재된 구성요소의 기능 및 배열에서 이루어질 수 있는 본 발명의 예시적인 구체예를 실행하기 위한 편리한 예시를 제공한다.

실시예

이하 실시예에서 사용되는 재조합 DNA 기술에 관한 특정의 조작 방법은 이하 문헌[Sambrook, J. et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989; Vol. 2]에 기재되어 있다.

실시예 1

에셰리키아 콜리 의 표면 상에서 카르보닐 환원효소를 발현하는 발현 플라스미드 pET23 (a)- omp - CRS 의 구성

본 발명에 따른 DNA를 지니는 인공의 관행적으로 합성된 플라스미드 pUC 19-omp-CRS는 Nde1와 EcoR1에 의해서 이중 분해된 서열목록의 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드를 코딩하는 서열목록의 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열을 지니며, 생성물은 한전 겔 전기영동에 의해서 서열목록의 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열을 지니는 1.3 Kb DNA 단편이 분리되었고, 겔로부터 절제하고, Qiaquick 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 pET 23(a)을 Nde1 & EcoR1로 개별적으로 분해시킨 다음에, 송아지 장의 알칼리성 포스파타제로 탈포스포릴화시켜서 자가-결찰을 피했다. Nde1 & EcoR1 (NEB Ltd, UK) 분해된 1.3 Kb DNA 단편은 서열목록의 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열을 지니며, pET 23(a)은 T4 DNA 리가아제(NEB Ltd, UK)로 결찰되었고, 에셰리키아 콜리 DH5α에서 형질전환되었다. 생성된 클론을 암피실린(100 mg/ml)를 함유하는 LB 브로스(LB broth)에서 성장시키고, 플라스미드를 분리하고, 이어서, 이를 Nde1 및 EcoR1에 의해서 이중 분해시켰다. 서열목록의 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열를 암시하는 이중 분해 후의 3.6 Kb pET 23(a) 골격 및 1.3 Kb DNA 인서트(insert)를 생성시키는 플라스미드를 pET 23(a)의 lac 프로모터의 하류에서 클로닝시켜 4.9 Kb 플라스미드 pET 23(a)-omp-CRS를 얻었다.

플라스미드 pET 23(a)-omp-CRS의 제한 맵(restriction map)은 도 5에 예시되어 있다.

에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 또는 에셰리키아 콜리 C43(DE3)를 형질전환주의 표면 상에서 카르보닐 환원효소를 발현하는 플라스미드 pET 23(a)-omp-CRS로 형질전환시켰다.

실시예 2

형질전환주의 세포질에서 카르보닐 환원효소를 발현하는 발현 벡터 pET23(a)-CRS의 구성

이는 미국 특허 제2010/0028972호에 개시된 지식을 이용함으로써 구성되었다. 클로닝을 위한 CRSF(SEQ ID NO: 26) 및 CRSR(SEQ ID NO: 28) 프라이머는 서열목록의 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드를 코딩하는 서열목록의 SEQ ID NO:14에 의해서 표현되는 카르보닐 환원효소 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기반으로 하여 합성되었다. 관행적으로 합성된 pUC 19-omp-CRS 플라스미드를 30 사이클의 반응 동안 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 가하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분 동안 초기 변성 다음에, 95℃에서 60초, 58℃에서 50초 및 72℃에서 60초의 30회 사이클뿐만 아니라, 72℃에서 5분 동안의 최종 연장 단계였다. 정제된 PCR 생성물을 Nde1 & Xho1로 분해시키고, 1% 아가로즈 겔 상에 진행시켰다. 0.87 Kb Nde1 및 Xho1 분해된 단편을 겔로부터 절제하여 Qiaquick 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 pET 23(a)를 Nde1 & Xho1로 개별적으로 분해시킨 다음에, 송아지 장의 알칼리성 포스파타제로 탈포스포릴화시켜서 자가-결찰을 피했다. Nde1 및 Xho1 분해된 0.87 Kb는 서열목록의 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오티드 서열을 지니며, pET 23(a)은 T4 DNA 리가아제로 결찰되었고, 에셰리키아 콜리 DH5α에서 형질전환되었다. 생성된 클론을 암피실린을 함유하는 LB 브로스에서 성장시키고, 플라스미드를 분리하고, 이어서, 이를 Nde1 및 Xhol에 의해서 이중 분해시켰다. 0.87kb 유전자를 암시하는 이중 분해 후의 3.6 Kb pET 23(a) 골격 및 0.87 Kb 인서트를 생성시키는 플라스미드를 pET 23(a)의 lac 프로모터의 하류에서 클로닝시켜 4.4 Kb 플라스미드 pET 23(a)-CRS를 얻었다.

에셰리키아 콜리 BL21(DE3)를 세포질에서 카르보닐 환원효소를 발현하는 플라스미드 pET 23(a)-CRS로 형질전환시켰다.

실시예 3

형질전환주의 표면상에서 카르보닐 환원효소 및 글루코오즈 탈수소효소를 동시 발현하는 발현 벡터 pETDuet1 - omp - CRS ; omp - GDH 의 구성

두 가지의 폴리펩티드, 즉, 형질전환주(들)의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 지니는 카르보닐 환원효소 활성을 지니는 폴리펩티드 및 보조효소 재생 활성을 지니는 서열목록의 서열 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드를 동시 발현하는 발현 벡터 pETDuet1-omp-CRS;omp-GDH의 구성. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 발명자들은 두 개의 복수 클로닝 부위를 함유하는 플라스미드 pETDuet1를 선택하였으며, 이들 각각은 T7 프로모터/lac 오퍼레이터 및 리보좀 결합 부위(rbs)가 선행되고, omp-CRS 및 omp-GDH 유전자가 pETDuet1 플라스미드에서 클로닝되었으며, 이는 2-단계 과정이다.

첫 번째 단계에서, 서열목록의 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드를 코딩하는 서열목록의 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열을 지니는 본 발명에 따른 DNA가 프라이머 oc1F (SEQ ID NO:30) 및 oc1R (SEQ ID NO:32)와 함께 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 위한 주형으로서 사용되는 플라스미드 pUC19-omp-CRS로부터 증폭되었다. PCR 조건은 95℃에서 5분 동안 초기 변성 다음에, 95℃에서 60초, 55℃에서 60초 및 72℃에서 90초의 30회 사이클뿐만 아니라, 72℃에서 5분 동안의 최종 연장 단계였다. 정제된 PCR 생성물을 Nco1 및 Hind3로 분해시키고, 1% 아가로즈 겔 상에 진행시켰다. 1.3 Kb Nco1 및 Hind3 단편을 겔로부터 절제하여 Qiaquick 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 pETDuet를 Nco1 및 Hind3로 개별적으로 분해시킨 다음에, 송아지 장의 알칼리성 포스파타제로 탈포스포릴화시켜서 자가-결찰을 피했다. Nco1 및 Hind3 분해된 omp-CRS 및 pETDuet1는 T4 DNA 리가아제로 결찰되었고, 에셰리키아 콜리 DH5α에서 형질전환되었다. 생성된 클론을 암피실린(100 μg/ml)를 함유하는 LB 브로스(LB broth)에서 성장시키고, 이로부터 플라스미드를 분리하고, 이어서, 이를 Nco1 및 Hind3에 의해서 이중 분해시켰다. SEQ ID NO:2를 암시하는 이중 분해 후의 약 5.4 Kb pETDuet1 골격 및 1.3 Kb SEQ ID NO:2 인서트를 생성시키는 플라스미드를 첫 번째 클로닝 부위 내의 pETDuet1의 lac 프로모터의 하류에서 클로닝시켜 6.7 Kb 플라스미드 pETDuet1-omp-CRS를 얻었다.

두 번째 단계에서, 서열목록의 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드를 코딩하는 서열목록의 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 서열을 지닌 본 발명에 따른 DNA가 ogF (SEQ ID NO:34) 및 ogR (SEQ ID NO:36)와 함께 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 위한 주형으로서 사용되는 인공적인 관행적으로 제조된 플라스미드 pUC19-omp-GDH로부터 증폭되었다. PCR 조건은 95℃에서 5분 동안 초기 변성 다음에, 95℃에서 60초, 55℃에서 60초 및 72℃에서 90초의 30회 사이클뿐만 아니라, 72℃에서 5분 동안의 최종 연장 단계였다. 정제된 PCR 생성물을 Nde1 및 Xho1로 분해시키고, 1% 아가로즈 겔 상에 진행시켰다. 1.2 Kb Nde1 and Xho1 분해된 단편을 겔로부터 절제하여 Qiaquick 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 상기 기재된 바와 같은 6.7 Kb 플라스미드 pETDuet1-omp-CRS를 Nde1 및 Xho1로 개별적으로 분해시킨 다음에, 송아지 장의 알칼리성 포스파타제로 탈포스포릴화시켜서 자가-결찰을 피했다. Nde1 및 Xho1 분해된 SEQ ID NO:4 및 pETDuet1-omp-CRS는 T4 DNA 리가아제로 결찰되었고, 에셰리키아 콜리 DH5α에서 형질전환되었다. 생성된 클론을 암피실린을 함유하는 LB 브로스에서 성장시키고, 이로부터 플라스미드를 분리하고, 이어서, 이를 Nde1 및 Xho1에 의해서 이중 분해시켰다. omp-GDH 유전자를 암시하는 이중 분해 후의 약 6.7 Kb pETDuet1-omp-CRS 골격 및 1.2 Kb omp-GDH 인서트를 생성시키는 플라스미드를 두 번째 클로닝 부위 내의 pETDuet1-omp-CRS의 lac 프로모터의 하류에서 클로닝시켜 7.8 Kb 플라스미드d pETDuet1-omp-CRS,omp-GDH를 얻었다.

플라스미드 pETDuet1-omp-CRS,omp-GDH의 제한 맵이 도 7에 예시되어 있다.

에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 및 에셰리키아 콜리 C43(DE3)를 형질전환주(들)의 표면 상에서 카르보닐 환원효소 및 글루코오즈 탈수소효소를 동시 발현하는 플라스미드 pETDuet1-omp-CRS,omp-GDH로 형질전환시켰다.

실시예 4

형질전환주의 제조

실시예 1에서 구성된 재조합 플라스미드 pET23(a)-omp-CRS를 사용하여, 에셰 리키아 콜리 BL21(DE3), 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 및 에셰리키아 콜리 C43(DE3) 반응성 세포를 형질전환시켜 표면 상에서 카르보닐 환원효소를 발현하는 에셰리키 아 콜리 BL21 (DE3) + pET23(a)-omp-CRS, 에셰리키아 콜리 C41 (DE3) + pET23(a)-omp-CRS 및 에셰리키아 콜리 C43(DE3) + pET23(a)-omp-CRS를 얻었다.

유사하게, 실시예 3에서 구성된 재조합 플라스미드 pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH를 사용하여, 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 에셰리키아 콜리 C41(DE3), 에셰리키 아 콜리 C43(DE3) 및 에셰리키아 콜리 반응성 세포를 형질전환시켜 표면 상에서 카르보닐 환원효소 및 글루코오즈 탈수소효소 둘 모두를 발현하는 에셰리키아 콜리 BL21 (DE3) + pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH, 에셰리키아 콜리 C41 (DE3) + pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH 및 에셰리키아 콜리 C43(DE3) + pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH를 얻었다.

실시예 2에서 구성된 재조합 플라스미드 pET23(a)-CRS를 사용하여, 에셰리키 아 콜리 BL21(DE3) 반응성 세포를 형질 전환시켜 세포의 세포질에서 카르보닐 ㅎ호환원효소를 발현하는 에셰리키아 콜리 BL21 (DE3) + pET23(a)-CRS를 얻었다.

실시예 2에서 구성된 재조합 플라스미드 pET23(a)-crs 및 이하 주어진 바와 같이 구성된 pET 29(a)-GDH를 사용하여, 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) 반응성 세포를 동시 형질전환시켜 세포의 세포질에서 카르보닐 환원효소 및 글루코오즈 탈수소효소를 발현하는 에셰리키아 콜리 BL21 (DE3) + pET23(a)-CRS, pET 29(a)-GDH를 얻었다. 에셰리키아 콜리 BL21 (DE3) + pET23(a)-CRS, pET 29(a)-gdh는 문헌[Kizaki, N. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 55, 590-595]에 개시된 기술을 이용함으로써 구성되었다.

재조합 플라스미드 pET29(a)-GDH의 구성: 코딩을 위한 gdhF (SEQ ID NO 38) 및 gdhR (SEQ ID NO 40) 프라이머를 서열목록의 SEQ ID NO 25의 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드를 코딩하는 서열목록의 SEQ ID NO 26에 의해서 표현되는 클루코오즈 탈수소효소 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기반으로 하여 합성하였다. 관행적으로 합성된 pUC 19-omp-gdh 플라스미드를 30 사이클의 반응 ㄷ동안 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 가하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분 동안 초기 변성 다음에, 95℃에서 60초, 52℃에서 60초 및 72℃에서 90초의 30회 사이클뿐만 아니라, 72℃에서 5분 동안의 최종 연장 단계였다. 정제된 PCR 생성물을 Nde1 & Xho1로 분해시키고, 1% 아가로즈 겔 상에 진행시켰다. 0.81 Kb Nde1 및 Xho1 분해된 단편을 겔로부터 절제하여 Qiaquick 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 pET 29(a)를 Nde1 & Xho1로 개별적으로 분해시킨 다음에, 송아지 장의 알칼리성 포스파타제로 탈포스포릴화시켜서 자가-결찰을 피했다. Nde1 및 Xho1 분해된 0.81 Kb는 서열목록의 SEQ ID NO: 26의 뉴클레오티드 서열을 지니며, pET 29(a)는 T4 DNA 리가아제로 결찰되었고, 에셰리키아 콜리 DH5α에서 형질전환되었다. 생성된 클론을 카나마이신을 함유하는 LB 브로스에서 성장시키고, 이로부터 플라스미드를 분리하고, 이어서, 이를 Nde1 및 Xho1에 의해서 이중 분해시켰다. 0.81 Kb 유전자를 암시하는 이중 분해 후의 5.4 Kb pET 29(a) 골격 및 0.81 Kb 인서트를 생성시키는 플라스미드를 pET 29(a)의 lac 프로모터의 하류에서 클로닝시켜 6.0 Kb 플라스미드 pET 29(a)-GDH를 얻었다.

실시예 5

형질전환주내의 유전자의 발현

재조합 에셰리키아 콜리 수거 플라스미드의 새로운 배양물을 항생제(암피실린, 카나마이신, 클로르암페니콜 등, 단독으로 또는 조합으로)를 함유하는 10 ml의 Luria Bertani HiVeg Broth 배지(1% HiVeg 하이드롤라제, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨, pH-7.5)에서 37℃에서 성장시키고, 6 시간 성장 후에, 1 ml의 배양물을 항생제(암피실린, 카나마이신, 클로르암페니콜 등, 단독으로 또는 조합으로)를 함유하는 100 ml의 새로운 LB 배지에 접종하고, 200 rpm 쉐이킹 조건하에 37℃에서 성장시켰다. 600 nm에서의 OD가 0.5-0.6에 도달한 때에, 배양물을 0.2 mM IPTG의 최종 농도로 유도하고, 이를 200 rpm 쉐이킹 조건하에 20℃에서 16 시간 동안 추가로 성장시켰다..

실시예 6

재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)- omp -CRS (CRS, Sequence ID No 1)의 표면 상에서의 카르보닐 환원효소의 발현의 입증

형질전환주 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET23(a)-omp-CRS를 100 ml의 배양 배지에서 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해서 분리하고, 50 mM 포스페이트 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 이어서, 세포를 5 ml 용해 완충액(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 1mg ml^-1 리소자임, pH 8.0)에 4℃에서 30분 동안 현탁시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 4℃에서 20 분 동안 30초 펄스 온(pulse on) 및 30초 펄스 오프로 음파파쇄하였다. 세포 조각을 14,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리시킴으로써 제거하였다. 이어서, 상등액(무-세포 추출물)을 막 분획과 가용성 분획의 분리를 위해서 4℃에서 12 시간 동안 1,00,000g에서의 초원심분리에 가하였다. 막 분획을 함유하는 침강물을 동일한 완충액으로 세척하고, 막 가용화 완충액(25 mM 트리스 HCl, 20% 글리세롤 및 2% 트리톤 X100, pH 7.5)에 재현탁시켰다. 모든 세 가지 분획, 즉, 무-세포 추출물, 막 분획 및 가용성 단백질 분획을 에틸 4-클로로-3-하이드록시부티레이트으로 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 환원시키는 이들의 활성에 대해서 검정하였고, 유사하게, 0.2 mM 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH), 2.0 mM ECOB 및 1-50 μl의 샘플을 함유하는 50 mM 포스페이트 buffer pH 7.0 중의 표준 반응 혼합물(1 ml)을 30℃에서 인큐베이션하고 전체 활성을 측정하였다. 결과가 표 1에 요약되어 있다. 예상되는 바와 같이, 대부분의 활성은 막 분획에서 회복되었다. 현저하게는, 에셰리키아 콜리 BL21 (DE3) + pET23(a)(음성 대조군)의 막 분획은 어떠한 활성이 결여되었다.

표 1: 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET23(a) 및 에셰리키아 콜리 BL21 + pET 23(a)-omp-CRS (CRS, Sequence ID No 1)로부터 얻은 다양한 분획의 카르보닐 환원효소(CRS) 활성.

에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-omp-CRS의 표면 상에서의 CRS의 존재를 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-omp-cr1 세포의 초박편으로 수행된 EM 이뮤노골드 표지화 연구에 의해서 추가로 확인하였다. 항-CRS 폴리클로날 항체를 토끼의 정제된 CRS에 대해서 생성시키고, 웨스턴 블로팅에 의해서 이들의 특이성에 대해서 검정하였다. 정제된 CRS를 환원 조건 하에 SDS-PAGE 상에서 진행시키고, 니트로셀룰로오즈 막 상으로의 전자-블로팅 후에 토끼 항-CRS 폴리클로날 항체로 프로빙하고, 이를 알칼리성 포스파타제 컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG(전체 분자) 이차 항체로 추가로 프로빙하였다. 이어서, 블롯을 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP, 0.15 mg/ml), 니트로 블루 테트라졸륨(NBT, 0.30 mg/ml), 트리스 HCl (100 mM) 및 MgCl₂ (5 mM), pH 9.5를 함유하는 기질 용액에 이를 10 분 동안 침지시킴으로써 전개시켰다. 순수한 CRS을 특별히 표지한 폴리클로날 항체가 또한 omp-CRS를 특별히 표지할 수 있었다.

몇 번의 탈수 단계 후에, 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a) (음성 대조군) 및 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-omp-CRS를 LR 화이트 수지(LR white resin)에 임베딩(embedding)시키고, 이어서, 이를 정착제로서 0.2% 글루타르알데하이드를 사용하여 몇 단계로 탈수시켰다. 초마이크로톰(ultramicrotome)을 사용한 얇은 절편 컷을 토끼 항-CRS 폴리클로날 항체와 함께 인큐베이션한 다음에, 나노골드-표지된 염소 항-토끼 IgG(전체 분자) 이차 항체와 함께 인큐베이션하고, 투과 전자 현미경하에 가시화시켰다. 상이한 필드를 관찰하였으며, 골드 입자가 세포의 표면 상에 배타적으로 존재하는 것으로 밝혀졌다(도 7). 음성 대조군으로서의 세포는 표지화가 발생하지 않았다.

실시예 7

재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)- omp -CRS (CRS, Sequence ID No 1)에서 혈장 및 표면 발현된 CRS의 상대적인 발현 수준

재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-CRS (CRS, Sequence ID No 1) 및 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-omp-CRS (CRS, Sequence ID No 1)의 새로운 배양물을 성장시키고 각각의 클론의 전세포 프로테옴(whole cell proteome)을 제조하였다. 다양한 세포 농도로부터 얻은 프로테옴을 환원 조건하에 12.5% SDS-PAGE 상에서 진행시켰다. 니트로셀룰로오즈 막 상으로의 전자-블로팅 후에, 이를 토끼 항-CRS 폴리클로날 항체로 프로빙하고, 이를 알칼리성 포스파타제 컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG 항체로 추가로 프로빙하였다. 항체에 의한 프로빙 다음에, 블롯을 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP, 0.15 mg/ml), 니트로 블루 테트라졸륨(NBT, 0.30 mg/ml), 트리스 HCl (100 mM) 및 MgCl₂ (5 mM), pH 9.5를 함유하는 기질 용액에 이를 10 분 동안 침지시킴으로써 전개시켰다. CRS의 발현은 상응하는 클론의 소프트웨어 Scion Image에 의한 밴드 세기를 분석함으로써 측정하였다. 세기는 채취된 세포의 양에 대해서 플로팅하고, 세포네 발현과 표면 발현에 대한 기울기(dy/dx))를 비교하였다. omp-CRS 융합 단백질로서의 세포의 표면 상에서의 CRS의 발현은 세포질에서 발현된 CRS에 비해서 17.9-배 적은 것으로 밝혀졌다.

실시예 8

에틸 4- 클로로 -3- 옥소부티레이트의 환원에 대한 세포질 CRS에 비해서 175-배 증가된 활성을 나타낸 표면 발현된 CRS

재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-CRS (CRS Sequence ID No 1) 및 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-omp-CRS (CRS Sequence ID No 1)의 새로운 배양물을 성장시키고, 카르보닐 환원효소 활성을 측정하기 위해서 사용하였다. 이러한 검정은 기질로서의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트 및 보조인자로서의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)를 사용하여 수행되었다. 카르보닐 환원효소 활성의 초기 비율을 λ₃₄₀에서 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 흡광도의 감소를 모니터링함으로써 측정하였다. 완충액 pH 7.0중의 표준 반응 혼합물(1ml)은 0.2 mM 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH), 10⁶-10⁸ 재조합 에셰리키아 콜리 세포 및 2.0 mM 에틸 (S)-4-클로로-3-옥소부타노에이트를 함유한 50 mM 포스페이트를 함유하였다. 1 단위의 활성은 특정된 조건하에 분당 1 μmol 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 산화를 촉매작용하는 건조 세포 중량의 양으로서 정의되었다. 표면상에서 omp-CRS를 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-omp-CRS (CRS Sequence ID No 1)의 활성은 156.20 x 10³ nmol/min/gm 건조세포 중량인 것으로 측정되었다. 비교해 보면, 세포질에서 CRS를 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-CRS (CRS Sequence ID No 1)는 10.16 x 10³ nmol/min/gm 건조 세포 중량의 활성을 보였다. 따라서, 동일한 양의 세포의 경우에, 표면 발현된 CRS가 15.4-배 더 높은 활성을 보였다. 그러나, 본 발명자들은 동일한 양의 세포의 경우에, 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-CRS는 재조합 에셰리키아 콜리 BL21 + pET23(a)-omp-CRS에 비해서 17.9-배 더 많은 단백질을 발현시켰다. 따라서, 활성 per unit protein for 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET23(a)-omp-CRS에 대한 단위 단백질 당 활성은 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET23(a)-omp-CRS보다 275-배 더 높았다. 결과는 표 2에 요약되어 있다.

표 2; omp-CRS 융합 단백질로서 표면 상에서 CRS(CRS Sequence ID No 1)을 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리 및 세포질에서 CRS(CRS Sequence ID No 1)을 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리의 상대적인 활성

* DCW = 건조 세포 중량

# 음성 대조군 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET23(a)는 어떠한 활성을 나타내지 않았다.

실시예 9

다양한 케톤의 환원에 대해서 세포질 CRS에 비해서 50-배 내지 275-배 증가 된 활성을 보이는 표면 발현된 CRS

검정을 96-웰 ELISA 플레이트에서 수행하였다. 50 mM 포스페이트 완충액, pH 7.0 중의 0.2 mM 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH), 2.0 mM 기질, 50μg/ml 에셰리키아 콜리 세포(세포질량의 계산의 경우에, OD₆₀₀ = 1의 세포 현탁액이 0.25 mg/ml 건조 세포 중량과 동등한 것으로 했다)로 이루어진 반응 혼합물을 기질의 소비에 따라서 약 30 분 내지 12 시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 소비를 λ₃₄₀에서의 흡광도의 감소에 의해서 모니터링하였다. 결과를 표 3 및 표 4에 요약하였다. 예상되는 바와 같이, 표면 발현된 CRS(CRS Sequence ID no 1)는 다양한 지방족 및 방향족 케톤의 환원에서 세포내 발현된 CRS(Sequence ID no 1)보다 훨씬 더 효율적이었다. 일반적으로, 활성의 증가는 이들 조건하에 단위 CRS 단백질 당 50-배 내지 275-배의 범위에 있었다. CRS의 상대적인 농도가 실시예 7에서 기재된 바와 같이 측정되었다.

표 3: 다양한 케톤 대해서 omp-CRS 융합 단백질로서 표면상에서 CRS(Sequence ID No 1)를 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리와 세포질에서 CRS(Sequence ID No 1)를 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리의 상대적인 활성^a

a 외부 GDH가 보조인자 재생을 위한 검정 혼합물에 첨가되었다.

* DCW = 건조 세포 중량

# g DCW 당 CRS 발현은 세포질 발현된 CRS에 비해서 표면 발현된 CRS의 경우에 17.9-배 더 낮았다(실시예 7)

표 4: 다양한 케톤 대해서 omp-CRS 융합 단백질 및 omp-GDH로서 표면상에서 CRS(Sequence ID No 1) 및 GDH (Sequence ID No 9)를 동시 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리와 세포질에서 CRS(Sequence ID No 1) 및 GDH(Sequence ID No 1)를 동시 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리의 상대적인 활성

* DCW = 건조 세포 중량

# g DCW 당 CRS 발현은 세포질 발현된 CRS에 비해서 표면 발현된 CRS의 경우에 17.9-배 더 낮았다

실시예 10

형질전환주 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pETDuet1 - omp -CRS, omp - GDH (CRS, Sequence ID No 1; GDH , Sequence ID No 9)의 표면상에서의 글루코오즈 탈수소효소의 발현의 입증

형질전환주 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pETDuet1-omp-CRS; omp-GDH (CRS, Sequence ID No 1; GDH, Sequence ID No 9)를 100 ml의 배양 배지 중에서 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해서 분리하고, 50 mM 포스페이트 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 이어서, 세포를 5 ml 용해 완충액(50 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1 mg ml-1 Lysozyme, pH 8.0)에 30분 동안 4℃에서 현탁시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 4℃에서 20 분 동안 30초 펄스 온(pulse on) 및 30초 펄스 오프로 음파파쇄하였다. 세포 조각을 14,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리시킴으로써 제거하고, 상등액(무-세포 추출물)을 추가의 분석을 위해서 취하였다. 상등액(무-세포 추출물)으로부터의 막 분획과 가용성 단백질 분획을 앞서 기재된 바와 같이 분리하였다. 모든 세 가지 분획, 즉, 무-세포 추출물, 막 분획 및 가용성 단백질 분획을 글루코오즈를 글루코네이트로 산화시키는 이들의 능력에 대해서 검정하였고, 유사하게, 0.5 mM 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP) (50μl의 7.78 mg ml^-1), 5 mM 글루코오즈 (25 μl의 180 mg ml^-1) 및 1-50 μl의 샘플을 함유하는 100 mM 트리스-HCl 완충액, pH 8.0 중의 표준 반응 혼합물(1 ml)을 30℃에서 인큐베이션하고 활성을 λ₃₄₀에서의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 형성을 모니터링함으로써 측정하였다. 결과가 표 5에 요약되어 있다. 예상되는 바와 같이, 대부분의 활성은 막 분획에서 회복되었다. 현저하게는, 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pETDuet1(음성 대조군)의 막 분획은 어떠한 활성이 결여되었다.

표 5: 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pETDuet1-omp-CRS, omp-GDH (CRS, Sequence ID No 1; GDH, Sequence ID No 9) 및 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pETDuet1로부터의 다양한 분획의 글루코오즈 탈수소효소 (GDH) 활성

실시예 11

에셰리키아 콜리 C41(DE3)에서의 세포질 및 표면 발현된 GDH (Sequence ID No 9)의 상대적인 발현 수준

재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pET 29(a)-CRS + pET 29(a)-GDH (CRS, Sequence ID No 1; GDH, Sequence ID No 9) 및 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pETDuet1-omp-CRS, omp-GDH (CRS, Sequence ID No 1; GDH, Sequence ID No 9)의 글루코오즈 탈수소효소 활성을 기질로서 글루코오즈를 사용하여 340 nm 분광분석으로 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트, 환원됨(NADPH)의 흡광도의 증가를 모니터링함으로써 측정하였다. 50 mM Tris-HCl 완충액 pH 8.0 중의 반응 혼합물(1 ml)은 0.5 mM 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADP)+, 10⁶ 내지 10⁸ 세포 및 5.0 mM 글루코오즈를 함유하였다. 1 단위의 활성은 이들 조건하에 분당 1 μmol NADP의 환원을 촉매작용하는 세포의 양(건조 세포 중량)으로서 정의되었다. omp-GDH 융합 단백질로서의 세포의 표면 상에서 GDH를 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리는 683.52 x 10³ nmol/min/gm 건조 세포 중량의 활성을 보인 반면에, 세포질에서 GDH를 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리는 41.87 x 10³ nmol/min/gm 건조 세포 중량의 활성을 보였다. 표면 상에서 및 세포질에서 발현된 GDH의 상대적인 발현 수준은 SDS PAGE로부터 산정되었다. 세포질 발현은 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pETDuet1-omp-CRS의 표면 발현된 단백질에 비해서 약 13.8-배 더 높은 것으로 산정되었고, omp-GDH은 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pET 29(a)-CRS + pET 29(a)-GDH에 비해서 225-배 더 높았다. 결과가 표 6에 요약되어 있다.

표 6: omp-GDH (Sequence ID No 9) 융합 단백질로서 표면 상에서 GDH를 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리와 세포질에서 GD (Sequence ID No 9)를 발현하는 재조합 에셰리키아 콜리의 상대적인 활성

* DCW = 건조 세포 중량

# 음성 대조군 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET29(a)는 어떠한 활성을 나타내지 않았다.

실시예 12

생체촉매로서의 형질전환주 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)- omp -CRS (CRS, Sequence ID No 1) 또는 C41(DE3) + pET 23(a)- omp - CRS (CRS , Sequence ID No 1)를 사용한 에틸 (S)-4- 클로로 -3- 하이드록시부티레이트의 생산

반응을 자동적정기(718 STAT Titrino, Metrohm, Switzerland) 내에서 보조-용매로서 디부틸 에테르를 사용하여 2-상 시스템으로 수행하였다. 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET 23(a)-omp-CRS 세포 또는 C41(DE3) + pET 23(a)-omp-CRS (1.38 g; 건조 세포 중량 기준)을 20 ml 포스페이트 완충액 중에 현탁시키고, 15 ml 디부틸 에테르 중의 100 mM, pH 6.5. 글루코오즈 (9 g, 50 mmol), 글루코오즈 탈수소효소(3600 U), 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP)(18 mg, 0.02 mmol) 및 ECOB (6 g, 36.5 mmol)를 현탁액에 첨가하고, 내용물을 30℃에서 자성 교반기 상에서 가볍게 교반하였다. 반응물의 pH를 5 M NaOH로 6.5로 유지시켰다. 반응의 진행을 다음과 같이 한 시간 간격으로 모니터링하였다. 각각 0.2 ml 표본을 뽑아서 2 ml의 에틸 에세테이트로 추출하였다. 유기 상을 원심분리에 의해서 분리하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 용매를 제거하여 잔류물을 남겼으며, 이를 ¹H NMR에 의해서 분석하엿다. ¹H NMR에서, ECOB 중의 CH2Cl에 상응하는 메틸렌기가 δ 3.65에서 단일선으로 나타난 반면에, 이는 환원된 생성물 중에서의 3.60에서 dd로 나타났다. 이들 피크는 1H NMR의 잘 분리된 세그먼트로 나타나기 때문에, 두 화합물의 혼합물 중의 이들의 상대적인 농도가 δ 3.60 및 3.65에서의 상대적인 적분 공명 값을 비교함으로써 용이하게 계산될 수 있다.

반응 혼합물이 출발물질의 부재를 보이는 때에, 내용물을 에틸 아세테이트에 추출하였다. 유기 상을 원심분리에 의해서 분리하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 용매를 제거하여 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 얻었다. 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트의 광학적 순도를 Chiracel OB-H, Daicel Chemical Industries 제품; 용리제: 헥산/이소프로판올 =96/4; 유속: 1 ml/min; 검출: 217 nm; 컬럼 온도: 실온을 이용함으로써 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서 측정하였다.

실시예 13

생체촉매로서의 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3) + pET Duet1 - omp -CRS, omp-GDH (CRS, Sequence ID No 1; GDH , Sequence ID No 9) 또는 에셰리키아 콜리 C41(DE3) + pET Duet1 - omp -CRS, omp - GDH (CRS, Sequence ID No 1; GDH , Sequence ID No 9)를 사용한 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트의 생산

생산 방법은 글루코오즈 탈수소효소가 반응에 첨가되지 않음을 제외하고는 실시예 12에 기재된 바와 동일하였다.

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SEQUENCE LISTING <110> COUNCIL OF SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH Srivastava, Gautam Jolly, Ravinder Singh Kaur, Suneet <120> Designer whole cell biocatalysts and use thereof in efficient production of enantiomerically enriched alcohols. <130> xxx <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> omp-crs1 (wt) <220> <221> omp-crs1 <222> (21)..(432) <400> 1 Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gly Cys Ser Ser Asn Ala Lys Ile Asp Gln Gly Ile Asn 20 25 30 Pro Tyr Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Pro 35 40 45 Tyr Lys Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln Gly Val Gln 50 55 60 Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr Lys Ser Asn Val 85 90 95 Tyr Gly Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly 100 105 110 Val Glu Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln 115 120 125 Trp Thr Asn Asn Ile Gly Asp Ala His Thr Ile Gly Thr Arg Pro Asp 130 135 140 Asn Gly Ile Pro Gly Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Glu Tyr Pro 145 150 155 160 Ala Pro Pro Pro Ala His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp 165 170 175 Leu Phe Lys Leu Asn Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Ser Ser 180 185 190 Gly Ile Gly Tyr Ala Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp 195 200 205 Val Ala Ile Trp Tyr Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala 210 215 220 Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val 225 230 235 240 Ser Ser Ser Asp Ala Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp 245 250 255 Phe Gly His Leu Asp Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr 260 265 270 Lys Gly Ala Tyr Ile Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val 275 280 285 Val Asp Val Asp Leu Lys Gly Val Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly 290 295 300 Arg His Phe Arg Glu Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu 305 310 315 320 Val Phe Thr Ala Ser Met Ser Gly His Ile Val Asn Val Pro Gln Phe 325 330 335 Gln Ala Thr Tyr Asn Ala Ala Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys 340 345 350 Ser Leu Ala Val Glu Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser 355 360 365 Pro Gly Tyr Ile Asn Thr Glu Ile Ser Asp Phe Val Pro Gln Glu Thr 370 375 380 Gln Asn Lys Trp Trp Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu Thr 385 390 395 400 Ala Glu Leu Val Gly Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser 405 410 415 Tyr Ala Thr Gly Thr Asp Ile Ile Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu Pro 420 425 430 <210> 2 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> omp-crs1 (wt) <220> <221> omp-crs1 <222> (1)..(1296) <400> 2 atgaaagcta ctaaactggt actgggtgcc gtcatcctgg gctcaacgct gctggcgggc 60 tgctcgtcaa atgcgaaaat cgatcaaggt atcaatccgt atgtcggctt tgaaatgggc 120 tatgattggc tgggtcgtat gccgtacaaa ggcagcgttg aaaacggtgc ctataaagca 180 cagggcgtcc aactgaccgc gaaactgggt tatccgatta ccgatgacct ggatatctac 240 acgcgtctgg gcggtatggt gtggcgtgca gacaccaaaa gtaacgttta cggcaaaaat 300 catgatacgg gtgtttcccc ggtctttgcc ggcggtgtgg aatatgcaat taccccggaa 360 atcgctacgc gtctggaata ccagtggacc aacaatattg gcgacgcaca taccatcggt 420 acgcgcccgg ataatggcat tccgggtatg gcgaaaaact tctctaatgt ggaatatccg 480 gcaccgccgc cggcacacac caaaaacgaa agcctgcaag tgctggatct gtttaaactg 540 aatggcaaag ttgcgtctat tacgggtagc tctagtggca tcggttatgc gctggccgaa 600 gcattcgctc aagttggcgc tgacgtcgcg atttggtaca acagccacga tgcgaccggc 660 aaagcggaag cgctggcgaa aaaatatggt gttaaagtca aagcctacaa agcaaatgtc 720 tcctcatcgg atgccgtgaa acagaccatt gaacagcaaa tcaaagactt tggccatctg 780 gatattgtgg ttgctaacgc gggcatcccg tggacgaagg gtgcgtatat tgaccaggat 840 gacgataaac acttcgatca agtcgtggac gtggatctga aaggcgtggg ttacgttgct 900 aaacatgcgg gtcgtcactt tcgtgaacgc ttcgaaaaag aaggcaaaaa aggtgccctg 960 gtttttaccg catcaatgtc gggccatatc gtgaacgttc cgcagttcca agccacgtat 1020 aatgcggcca aagcaggtgt ccgtcacttt gctaaaagtc tggcggtgga atttgccccg 1080 ttcgcacgcg tcaacagcgt gtctccgggc tacatcaaca ccgaaatctc agatttcgtt 1140 ccgcaggaaa cgcaaaataa atggtggtcg ctggtcccgc tgggtcgcgg cggtgaaacc 1200 gctgaactgg ttggtgcgta tctgttcctg gcttcagacg caggctcgta cgcgaccggt 1260 acggacatta tcgtggatgg cggttatacg ctgccgtaa 1299 <210> 3 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> omp-crs1 (P14A, S42N, A194V, I275V) <220> <221> omp-crs1 (P14A, S42N, A194V, I275V) <222> (21)..(432) <400> 3 Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gly Cys Ser Ser Asn Ala Lys Ile Asp Gln Gly Ile Asn 20 25 30 Pro Tyr Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Pro 35 40 45 Tyr Lys Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln Gly Val Gln 50 55 60 Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr Lys Ser Asn Val 85 90 95 Tyr Gly Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly 100 105 110 Val Glu Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln 115 120 125 Trp Thr Asn Asn Ile Gly Asp Ala His Thr Ile Gly Thr Arg Pro Asp 130 135 140 Asn Gly Ile Pro Gly Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Glu Tyr Pro 145 150 155 160 Ala Pro Ala Pro Ala His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp 165 170 175 Leu Phe Lys Leu Asn Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Asn Ser 180 185 190 Gly Ile Gly Tyr Ala Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp 195 200 205 Val Ala Ile Trp Tyr Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala 210 215 220 Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val 225 230 235 240 Ser Ser Ser Asp Ala Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp 245 250 255 Phe Gly His Leu Asp Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr 260 265 270 Lys Gly Ala Tyr Ile Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val 275 280 285 Val Asp Val Asp Leu Lys Gly Val Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly 290 295 300 Arg His Phe Arg Glu Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu 305 310 315 320 Val Phe Thr Ala Ser Met Ser Gly His Ile Val Asn Val Pro Gln Phe 325 330 335 Gln Ala Thr Tyr Asn Ala Val Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys 340 345 350 Ser Leu Ala Val Glu Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser 355 360 365 Pro Gly Tyr Ile Asn Thr Glu Ile Ser Asp Phe Val Pro Gln Glu Thr 370 375 380 Gln Asn Lys Trp Trp Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu Thr 385 390 395 400 Ala Glu Leu Val Gly Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser 405 410 415 Tyr Ala Thr Gly Thr Asp Ile Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu Pro 420 425 430 <210> 4 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> omp-crs1 (P14A, S42N, A194V, I275V) <220> <221> omp-crs1 (P14A, S42N, A194V, I275V) <222> (1)..(1296) <400> 4 atgaaagcta ctaaactggt actgggtgcc gtcatcctgg gctcaacgct gctggcgggc 60 tgctcgtcaa atgcgaaaat cgatcaaggt atcaatccgt atgtcggctt tgaaatgggc 120 tatgattggc tgggtcgtat gccgtacaaa ggcagcgttg aaaacggtgc ctataaagca 180 cagggcgtcc aactgaccgc gaaactgggt tatccgatta ccgatgacct ggatatctac 240 acgcgtctgg gcggtatggt gtggcgtgca gacaccaaaa gtaacgttta cggcaaaaat 300 catgatacgg gtgtttcccc ggtctttgcc ggcggtgtgg aatatgcaat taccccggaa 360 atcgctacgc gtctggaata ccagtggacc aacaatattg gcgacgcaca taccatcggt 420 acgcgcccgg ataatggcat tccgggtatg gcgaaaaact tctctaatgt ggaatatcca 480 gcaccggcgc cggcacacac caaaaacgaa agcctgcaag tgctggatct gtttaaactg 540 aatggcaaag ttgcgtctat cacgggtagc aatagtggta tcggttatgc gctggccgaa 600 gcattcgctc aagttggcgc tgacgtcgcg atttggtaca acagccacga tgcgaccggc 660 aaagcggaag cgctggcgaa aaaatatggt gttaaagtca aagcctacaa agcaaatgtc 720 tcctcatcgg atgccgtgaa acagaccatt gaacagcaaa tcaaagactt tggccatctg 780 gatattgtgg ttgctaacgc gggcatcccg tggacgaagg gtgcgtatat tgaccaggat 840 gacgataaac acttcgatca agtcgtggac gtggatctga aaggcgtggg ttacgttgct 900 aaacatgcgg gtcgtcactt tcgtgaacgc ttcgaaaaag aaggcaaaaa aggtgccctg 960 gtttttaccg catcaatgtc gggccatatc gtgaacgttc cgcagttcca agccacgtat 1020 aacgcagtca aagcaggtgt ccgtcacttt gctaaaagtc tggcggtgga atttgccccg 1080 ttcgcacgcg tcaacagcgt gtctccgggc tacatcaaca ccgaaatctc agatttcgtt 1140 ccgcaggaaa cgcaaaataa atggtggtcg ctggtcccgc tgggtcgcgg cggtgaaacc 1200 gctgaactgg ttggtgcgta tctgttcctg gcttcagacg caggctcgta cgcgaccggt 1260 acggacattg tcgtggatgg cggttatacg ctgccgtaa 1299 <210> 5 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> omp-crs1 (P14A, S42N, V147A, A194V, K238R) <220> <221> omp-crs1 (P14A, S42N, V147A, A194V, K238R) <222> (21)..(432) <400> 5 Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gly Cys Ser Ser Asn Ala Lys Ile Asp Gln Gly Ile Asn 20 25 30 Pro Tyr Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Pro 35 40 45 Tyr Lys Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln Gly Val Gln 50 55 60 Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr Lys Ser Asn Val 85 90 95 Tyr Gly Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly 100 105 110 Val Glu Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln 115 120 125 Trp Thr Asn Asn Ile Gly Asp Ala His Thr Ile Gly Thr Arg Pro Asp 130 135 140 Asn Gly Ile Pro Gly Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Glu Tyr Pro 145 150 155 160 Ala Pro Ala Pro Ala His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp 165 170 175 Leu Phe Lys Leu Asn Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Asn Ser 180 185 190 Gly Ile Gly Tyr Ala Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp 195 200 205 Val Ala Ile Trp Tyr Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala 210 215 220 Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val 225 230 235 240 Ser Ser Ser Asp Ala Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp 245 250 255 Phe Gly His Leu Asp Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr 260 265 270 Lys Gly Ala Tyr Ile Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val 275 280 285 Val Asp Val Asp Leu Lys Gly Ala Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly 290 295 300 Arg His Phe Arg Glu Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu 305 310 315 320 Val Phe Thr Ala Ser Met Ser Gly His Ile Val Asn Val Pro Gln Phe 325 330 335 Gln Ala Thr Tyr Asn Ala Val Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys 340 345 350 Ser Leu Ala Val Glu Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser 355 360 365 Pro Gly Tyr Ile 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tccgggtatg gcgaaaaact tctctaatgt ggaatatcca 480 gcaccggcgc cggcacacac caaaaacgaa agcctgcaag tgctggatct gtttaaactg 540 aatggcaaag ttgcgtctat cacgggtagc aatagtggta tcggttatgc gctggccgaa 600 gcattcgctc aagttggcgc tgacgtcgcg atttggtaca acagccacga tgcgaccggc 660 aaagcggaag cgctggcgaa aaaatatggt gttaaagtca aagcctacaa agcaaatgtc 720 tcctcatcgg atgccgtgaa acagaccatt gaacagcaaa tcaaagactt tggccatctg 780 gatattgtgg ttgctaacgc gggcatcccg tggacgaagg gtgcgtatat tgaccaggat 840 gacgataaac acttcgatca agtcgtggac gtggatctga aaggcgcggg ttacgttgct 900 aaacatgcgg gtcgtcactt tcgtgaacgc ttcgaaaaag aaggcaaaaa aggtgccctg 960 gtttttaccg catcaatgtc gggccatatc gtgaacgttc cgcagttcca agccacgtat 1020 aacgcagtca aagcaggtgt ccgtcacttt gctaaaagtc tggcggtgga atttgccccg 1080 ttcgcacgcg tcaacagcgt gtctccgggc tacatcaaca ccgaaatctc agatttcgtt 1140 ccgcaggaaa cgcaaaatag atggtggtcg ctggtcccgc tgggtcgcgg cggtgaaacc 1200 gctgaactgg ttggtgcgta tctgttcctg gcttcagacg caggctcgta cgcgaccggt 1260 acggacatta tcgtggatgg cggttatacg 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720 tcgctggtcc cgctgggtcg cggcggtgaa accgctgaac tggttggtgc gtatctgttc 780 ctggcttcag acgcaggctc gtacgcgacc ggtacggaca ttatcgtgga tggcggttat 840 acgctgccgc tcgagcacca ccaccaccac cactga 876 <210> 15 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> crs1 (P14A, S42N, A194V, I275V) <220> <221> crs1 (P14A, S42N, A194V, I275V) <222> (1)..(283) <400> 15 Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Glu Tyr Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu Phe Lys Leu Asn 20 25 30 Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Asn Ser Gly Ile Gly Tyr Ala 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp Tyr 50 55 60 Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala Leu Ala Lys Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val Ser Ser Ser Asp Ala 85 90 95 Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp Phe Gly His Leu Asp 100 105 110 Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr Lys Gly Ala Tyr Ile 115 120 125 Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val Val 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tctgtttaaa ctgaatggca aagttgcgtc tatcacgggt 120 agcaatagtg gtatcggtta tgcgctggcc gaagcattcg ctcaagttgg cgctgacgtc 180 gcgatttggt acaacagcca cgatgcgacc ggcaaagcgg aagcgctggc gaaaaaatat 240 ggtgttaaag tcaaagccta caaagcaaat gtctcctcat cggatgccgt gaaacagacc 300 attgaacagc aaatcaaaga ctttggccat ctggatattg tggttgctaa cgcgggcatc 360 ccgtggacga agggtgcgta tattgaccag gatgacgata aacacttcga tcaagtcgtg 420 gacgtggatc tgaaaggcgt gggttacgtt gctaaacatg cgggtcgtca ctttcgtgaa 480 cgcttcgaaa aagaaggcaa aaaaggtgcc ctggttttta ccgcatcaat gtcgggccat 540 atcgtgaacg ttccgcagtt ccaagccacg tataacgcag tcaaagcagg tgtccgtcac 600 tttgctaaaa gtctggcggt ggaatttgcc ccgttcgcac gcgtcaacag cgtgtctccg 660 ggctacatca acaccgaaat ctcagatttc gttccgcagg aaacgcaaaa taaatggtgg 720 tcgctggtcc cgctgggtcg cggcggtgaa accgctgaac tggttggtgc gtatctgttc 780 ctggcttcag acgcaggctc gtacgcgacc ggtacggaca ttgtcgtgga tggcggttat 840 acgctgccgc tcgagcacca ccaccaccac cactga 876 <210> 17 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> crs1 (P14A, S42N, V147A, A194V, K238R) <220> <221> crs1 (P14A, S42N, V147A, A194V, K238R) <222> (1)..(283) <400> 17 Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Glu Tyr Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu Phe Lys Leu Asn 20 25 30 Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Asn Ser Gly Ile Gly Tyr Ala 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp Tyr 50 55 60 Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala Leu Ala Lys Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val Ser Ser Ser Asp Ala 85 90 95 Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp Phe Gly His Leu Asp 100 105 110 Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr Lys Gly Ala Tyr Ile 115 120 125 Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val Val Asp Val Asp Leu 130 135 140 Lys Gly Ala Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly Arg His Phe Arg Glu 145 150 155 160 Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu Val Phe Thr Ala Ser 165 170 175 Met Ser Gly His Ile Val Asn Val Pro Gln Phe Gln Ala Thr Tyr Asn 180 185 190 Ala Val Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys Ser Leu Ala Val Glu 195 200 205 Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser Pro Gly Tyr Ile Asn 210 215 220 Thr Glu Ile Ser Asp Phe Val Pro Gln Glu Thr Gln Asn Arg Trp Trp 225 230 235 240 Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu Thr Ala Glu Leu Val Gly 245 250 255 Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Thr Gly Thr 260 265 270 Asp Ile Ile Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu Pro Leu Glu His His His 275 280 285 His His His 290 <210> 18 <211> 876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crs1 (P14A, S42N, V147A, A194V, K238R) <220> <221> crs1 (P14A, S42N, V147A, A194V, K238R) <222> (1)..(849) <400> 18 atggcgaaaa acttctctaa tgtggaatat ccagcaccgg cgccggcaca caccaaaaac 60 gaaagcctgc aagtgctgga tctgtttaaa ctgaatggca aagttgcgtc tatcacgggt 120 agcaatagtg gtatcggtta tgcgctggcc gaagcattcg ctcaagttgg cgctgacgtc 180 gcgatttggt acaacagcca cgatgcgacc ggcaaagcgg aagcgctggc gaaaaaatat 240 ggtgttaaag tcaaagccta caaagcaaat gtctcctcat cggatgccgt gaaacagacc 300 attgaacagc aaatcaaaga ctttggccat ctggatattg tggttgctaa cgcgggcatc 360 ccgtggacga agggtgcgta tattgaccag gatgacgata aacacttcga tcaagtcgtg 420 gacgtggatc tgaaaggcgc gggttacgtt gctaaacatg cgggtcgtca ctttcgtgaa 480 cgcttcgaaa aagaaggcaa aaaaggtgcc ctggttttta ccgcatcaat gtcgggccat 540 atcgtgaacg ttccgcagtt ccaagccacg tataacgcag tcaaagcagg tgtccgtcac 600 tttgctaaaa gtctggcggt ggaatttgcc ccgttcgcac gcgtcaacag cgtgtctccg 660 ggctacatca acaccgaaat ctcagatttc gttccgcagg aaacgcaaaa tagatggtgg 720 tcgctggtcc cgctgggtcg cggcggtgaa accgctgaac tggttggtgc gtatctgttc 780 ctggcttcag acgcaggctc gtacgcgacc ggtacggaca ttatcgtgga tggcggttat 840 acgctgccgc tcgagcacca ccaccaccac cactga 876 <210> 19 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> crs1 (E9G, P14A, N20S, S42N, T190A, A194V, E234G) <220> <221> crs1 (E9G, P14A, N20S, S42N, T190A, A194V, E234G) <222> (1)..(283) <400> 19 Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Gly Tyr Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 His Thr Lys Ser Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu Phe Lys Leu Asn 20 25 30 Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Asn Ser Gly Ile Gly Tyr Ala 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp Tyr 50 55 60 Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala Leu Ala Lys Lys Tyr 65 70 75 80 Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val Ser Ser Ser Asp Ala 85 90 95 Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp Phe Gly His Leu Asp 100 105 110 Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr Lys Gly Ala Tyr Ile 115 120 125 Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val Val Asp Val Asp Leu 130 135 140 Lys Gly Val Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly Arg His Phe Arg Glu 145 150 155 160 Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu Val Phe Thr Ala Ser 165 170 175 Met Ser Gly His Ile Val Asn Val Pro Gln Phe Gln Ala Ala Tyr Asn 180 185 190 Ala Val Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys Ser Leu Ala Val Glu 195 200 205 Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser Pro Gly Tyr Ile Asn 210 215 220 Thr Glu Ile Ser Asp Phe Val Pro Gln Gly Thr Gln Asn Lys Trp Trp 225 230 235 240 Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu Thr Ala Glu Leu Val Gly 245 250 255 Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Thr Gly Thr 260 265 270 Asp Ile Ile Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu Pro Leu Glu His His His 275 280 285 His His His 290 <210> 20 <211> 876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crs1 (E9G, P14A, N20S, S42N, T190A, A194V, E234G) <220> <221> crs1 (E9G, P14A, N20S, S42N, T190A, A194V, E234G) <222> (1)..(849) <400> 20 atggctaaaa acttttccaa tgtcggatat cctgccccgg cgccagctca taccaaaagc 60 gaatcactgc aggtactgga tctgttcaaa ctgaacggca aagtcgcgtc tatcaccggt 120 agcaactcag gcattggtta cgcgctggcc gaggcttttg cgcaggttgg cgcagacgtt 180 gcgatctggt ataacagcca tgatgccacc ggtaaagcag aggccctggc taaaaaatat 240 ggcgtaaaag tcaaggctta taaagctaat gtcagttcga gtgatgcggt gaaacagact 300 attgagcagc agatcaagga ttttggccac ctggacatag ttgtggcgaa cgcaggcatc 360 ccctggacta agggtgcata catcgatcag gatgacgata aacattttga ccaggtggtt 420 gacgtcgacc tgaaaggcgt aggctatgta gcaaaacatg cgggtcgcca ttttcgtgaa 480 cgtttcgaaa aagaaggcaa aaagggcgcc ttggtcttta cggcttccat gtcgggtcac 540 atcgttaacg tgccgcaatt tcaggcggcc tacaatgcgg tcaaggcagg cgtgcgtcat 600 ttcgcaaagt ccctggccgt ggaatttgct cctttcgcac gtgttaactc tgtatctcct 660 ggctatatta ataccgagat ctctgatttc gtcccgcaag gaacacagaa taaatggtgg 720 agcttagttc cattgggccg tggcggggaa actgcggaat tagttggtgc ctacctgttc 780 ctggcaagtg atgcgggctc ctacgccacg ggcacggata tcattgtgga cggcggctac 840 acgctgccgc tcgagcacca ccaccaccac cactga 876 <210> 21 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gdh (wt) <220> <221> gdh (wt) <222> (1)..(261) <400> 21 Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ser 1 5 10 15 Thr Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala 20 25 30 Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Lys Glu Glu Glu Ala Asn Ser Val 35 40 45 Leu Glu Glu Ile Lys Lys Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys Gly 50 55 60 Asp Val Thr Val Glu Ser Asp Val Ile Asn Leu Val Gln Ser Ser Ile 65 70 75 80 Lys Glu Phe Gly Lys Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Met Glu 85 90 95 Asn Pro Val Ser Ser His Glu Met Ser Leu Ser Asp Trp Asn Lys Val 100 105 110 Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile 115 120 125 Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Thr Val Ile Asn Met Ser 130 135 140 Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala 145 150 155 160 Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr 165 170 175 Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn 180 185 190 Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp 195 200 205 Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile 210 215 220 Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr 225 230 235 240 Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe 245 250 255 Gln Ala Gly Arg Gly Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 22 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdh (wt) <220> <221> gdh (wt) <222> (1)..(783) <400> 22 atgtataaag acctggaagg caaagtggtt gtcattaccg gtagctctac gggcctgggt 60 aaagcgatgg ccatccgttt tgctaccgaa aaagcgaaag tggttgtcaa ctaccgctca 120 aaagaagaag aagcgaacag cgtgctggaa gaaatcaaaa aagttggcgg tgaagcaatc 180 gctgtcaaag gcgacgttac ggtcgaaagc gatgttatta acctggtcca gagttccatc 240 aaagaatttg gcaaactgga tgtcatgatt aacaatgcgg gtatggaaaa tccggtgtca 300 tcgcatgaaa tgtcactgtc ggactggaac aaagtgattg ataccaatct gacgggcgct 360 tttctgggtt cacgtgaagc catcaaatac ttcgttgaaa acgatatcaa aggcaccgtc 420 atcaatatga gctctgtgca tgaaaaaatc ccgtggccgc tgtttgtgca ctatgcggcc 480 agcaaaggcg gtatgaaact gatgaccgaa acgctggccc tggaatacgc accgaaaggt 540 attcgtgtga acaatatcgg cccgggtgcg attaacaccc cgatcaatgc tgaaaaattc 600 gcggacccgg aacagcgcgc cgatgttgaa agtatgattc cgatgggcta tatcggtgaa 660 ccggaagaaa ttgcagctgt tgcggcctgg ctggccagtt ccgaagcatc ctatgtcacc 720 ggcatcacgc tgtttgccga tggcggtatg acccagtacc cgagcttcca agcaggtcgc 780 ggcctcgagc accaccacca ccaccactga 810 <210> 23 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gdh (S16A, E170K, P194T, A197K, K204E, E222D, S237D) <220> <221> gdh (S16A, E170K, P194T, A197K, K204E, E222D, S237D) <222> (1)..(263) <400> 23 Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ala 1 5 10 15 Thr Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala 20 25 30 Lys Val Val Val Asn Tyr Arg Ser Lys Glu Glu Glu Ala Asn Ser Val 35 40 45 Leu Glu Glu Ile Lys Lys Val Gly Gly Glu Ala Ile Ala Val Lys Gly 50 55 60 Asp Val Thr Val Glu Ser Asp Val Ile Asn Leu Val Gln Ser Ser Ile 65 70 75 80 Lys Glu Phe Gly Lys Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Met Glu 85 90 95 Asn Pro Val Ser Ser His Glu Met Ser Leu Ser Asp Trp Asn Lys Val 100 105 110 Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile 115 120 125 Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Thr Val Ile Asn Met Ser 130 135 140 Ser Val His Glu Lys Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala 145 150 155 160 Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Lys Thr Leu Ala Leu Glu Tyr 165 170 175 Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn 180 185 190 Thr Thr Ile Asn Lys Glu Lys Phe Ala Asp Pro Glu Gln Arg Ala Asp 195 200 205 Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Asp Glu Ile 210 215 220 Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Cys Tyr Val Thr 225 230 235 240 Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe 245 250 255 Gln Ala Gly Arg Gly Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 24 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdh (S16A, E170K, P194T, A197K, K204E, E222D, S237D) <220> <221> gdh (S16A, E170K, P194T, A197K, K204E, E222D, S237D) <222> (1)..(783) <400> 24 atgtataaag acctggaagg caaagtggtt gtcattactg gtagcgctac gggcctgggt 60 aaagcgatgg ccatccgttt tgctaccgaa aaagcgaaag tggttgtcaa ctaccgctca 120 aaagaagaag aagcgaacag cgtgctggaa gaaatcaaaa aagttggcgg tgaagcaatc 180 gctgtcaaag gcgacgttac ggtcgaaagc gatgttatta acctggtcca gagttccatc 240 aaagaatttg gcaaactgga tgtcatgatt aacaatgcgg gtatggaaaa tccggtgtca 300 tcgcatgaaa tgtcactgtc ggactggaac aaagtgattg ataccaatct gacgggcgct 360 tttctgggtt cacgtgaagc catcaaatac ttcgttgaaa acgatatcaa aggcaccgtc 420 atcaatatga gctctgtgca tgaaaaaatc ccgtggccgc tgtttgtgca ctatgcggcc 480 agcaaaggcg gtatgaaact gatgaccaaa acgctggccc tggaatacgc accgaaaggt 540 attcgtgtga acaatatcgg cccgggtgcg attaacacca cgatcaataa agaaaaattc 600 gcggacccgg aacagcgcgc cgatgttgaa agtatgattc cgatgggcta tatcggtgaa 660 ccggacgaaa ttgcagctgt tgcggcctgg ctggccagtt ccgaagcatg ctatgtcacc 720 ggcatcacgc tgtttgccga tggcggtatg acccagtacc cgagcttcca agcaggtcgc 780 ggcctcgagc accaccacca ccaccactga 810 <210> 25 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crs1F <220> <221> crs1F <222> (1)..(37) <400> 25 aattgcgagc atatggcgaa aaacttctct aatgtgg 37 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crs1R <220> <221> crs1R <222> (1)..(30) <400> 26 cagtactaac tcgagcggca gcgtataacc 30 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdhF <220> <221> gdhF <222> (1)..(32) <400> 27 acgcgtgcac atatgtataa agacctggaa gg 32 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdhR <220> <221> gdhR <222> (1)..(31) <400> 28 atgtagtatc tcgaggccgc tacctgcttg g 31 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oc1F <220> <221> oc1F <222> (1)..(36) <400> 29 tatcgcattc catgggcaaa gctactaaac tggtac 36 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oc1R <220> <221> oc1R <222> (1)..(33) <400> 30 gttatgttca agcttttacg gcagggtata acc 33 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ogF <220> <221> ogF <222> (1)..(31) <400> 31 ggattgatgc atatgaaagc tacgaaactg g 31 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ogR <220> <221> ogR <222> (1)..(34) <400> 32 atattctagc tcgagttaac cgcggcctgc ttgg 34

Claims

화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13 또는 15 또는 17 또는 19의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 재조합 세포(recombinant cell)에 비해서, 카르보닐 환원효소 (CRS) 폴리펩티드의 단위 질량 당 250-배 내지 300-배 더 높은 활성을 지니는 세포의 표면 상에서 서열목록 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7로부터 선택된 서열의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포:

.
화학식(1) 화학식(2)
제 1항에 있어서, 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 재조합 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 275-배 더 높은 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포.
제 1항에 있어서, 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13 또는 15 또는 17 또는 19의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 재조합 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 15-배 내지 26-배 더 높은 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7로부터 선택된 서열의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포.
제 1항에 있어서, 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 재조합 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 적어도 15-배 더 높은 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포.
제 1항에 있어서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 재조합 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 50-배 내지 275-배 더 높은 화학식(3)의 화합물의 환원에 대한 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포:

화학식(3)
상기 식에서,
R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₃ =CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
X = Cl 또는 Br이고;
n = 1-4이고;
m = 1-8이다.
제 1항에 있어서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 재조합 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 50-배 내지 180-배 더 높은 화학식(4)의 화합물의 환원에 대한 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록 SEQ ID NO: 1의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포:

화학식(4)
상기 식에서,
R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고;
R₆ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
n= 1 내지 5이다.
제 1항에 있어서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 카르보닐 환원효소를 발현하는 재조합 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 3-배 내지 15-배 더 높은 화학식(3)의 화합물 또는 화학식(4)의 화합물의 환원에 대한 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록 SEQ ID NO: 1의 비-천연 카르보닐 환원효소 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포:

화학식(3)

화학식(4)
상기 화학식(3)에서,
R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₃ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
X = Cl 또는 Br이고;
n = 1-4이고;
m = 1-8이며;
상기 화학식(4)에서,
R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고;
R₆ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
n= 1 내지 5이다.
세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13 또는 15 또는 17 또는 19의 상응하는 카르보닐 환원효소 (CRS) 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21 또는 23의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 재조합 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서 250-배 내지 300-배 더 높은 활성 및 GDH 폴리펩티드의 단위 질량 당 글루코네이트로의 글루코오즈의 산화에 대해서 200-배 내지 250-배 향상된 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7로부터 선택된 서열의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9 또는 11로부터 선택된 서열의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 재조합 세포:

.
화학식(1) 화학식(2)
제 8항에 있어서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 재조합 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서 270-배 더 높은 활성 및 GDH 폴리펩티드의 단위 질량 당 글루코네이트로의 글루코오즈의 산화에 대해서 225-배 향상된 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 재조합 세포.
제 8항에 있어서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13 또는 15 또는 17 또는 19의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21 또는 23의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 재조합 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서 11-배 내지 24-배 더 높은 활성 및 단위 세포 질량 당 글루코네이트로의 글루코오즈의 산화에 대해서 9-배 내지 31-배 향상된 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7로부터 선택된 서열의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9, 11, 13 또는 15로부터 선택된 서열의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 재조합 세포.
제 8항에 있어서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 재조합 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트의 전환에 대해서 15-배 더 높은 활성 및 단위 세포 질량 당 글루코네이트로의 글루코오즈의 산화에 대해서 16-배 향상된 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 재조합 세포.
제 8항에 있어서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 재조합 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 55-배 내지 270-배 더 높은 화학식(3)의 화합물의 환원에 대한 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 재조합 세포:

화학식(3)
상기 식에서,
R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₃ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
X = Cl 또는 Br이고;
n = 1-4이고;
m = 1-8이다.
제 8항에 있어서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 재조합 세포에 비해서, CRS 폴리펩티드의 단위 질량 당 40-배 내지 156-배 더 높은 화학식(4)의 화합물의 환원에 대한 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 재조합 세포:

화학식(4)
상기 식에서,
R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고;
R₆ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
n= 1 내지 5이다.
제 8항에 있어서, 세포의 세포질에서 서열목록의 SEQ ID NO: 13의 상응하는 CRS 및 서열목록의 SEQ ID NO: 21의 상응하는 GDH를 동시에 발현하는 재조합 세포에 비해서, 단위 세포 질량 당 2-배 내지 15-배 더 높은 화학식(3)의 화합물 또는 화학식(4)의 화합물의 환원에 대한 활성을 지니는, 세포의 표면 상에서 서열목록의 SEQ ID NO: 1의 비-천연 CRS 폴리펩티드 및 서열목록의 SEQ ID NO: 9의 비-천연 GDH 폴리펩티드를 동시에 발현하는 재조합 세포:

화학식(3)

화학식(4)
상기 화학식(3)에서,
R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₃ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
X = Cl 또는 Br이고;
n = 1-4이고;
m = 1-8이며;
상기 화학식(4)에서,
R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고;
R₆ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
n= 1 내지 5이다.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리(Escherichia coli) BL21(DE3) 또는 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 또는 재조합 에셰리키아 콜리 C43(DE3)인 재조합 세포.
카르보닐 환원효소 활성을 보이는 SEQ ID NO 1 또는 3 또는 5 또는 7의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 재조합 발현 벡터.
카르보닐 환원효소 활성을 보이는 SEQ ID NO 1 또는 3 또는 5 또는 7의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드 및 GDH 활성을 보이는 SEQ ID NO 9 또는 11의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 재조합 발현 벡터.
제 1항에 있어서, 재조합 세포는 100%의 거울상이성질체 과량 (enantiomeric excess)으로 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트의 생산을 위한 재조합 세포:

.
화학식(2)
제 8항에 있어서, 재조합 세포는 100%의 거울상이성질체 과량 (enantiomeric excess)으로 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트의 생산을 위한 재조합 세포.
제 1항에 있어서, 제조합 세포는 화학식(5)의 화합물의 생산을 위한 재조합 세포:

화학식(5)
상기 식에서,
R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₃ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
X = Cl 또는 Br이고;
n = 1-4이고;
m = 1-8이다.
제 8항에 있어서, 재조합 세포는 화학식(5)의 화합물의 생산을 위한 재조합 세포:

화학식(5)
상기 식에서,
R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₃ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
X = Cl 또는 Br이고;
n = 1-4이고;
m = 1-8이다.
제 1항에 있어서, 화학식(6)의 화합물의 생산을 위한 재조합 세포:

화학식(6)
상기 식에서,
R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고;
R₆ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
n= 1 내지 5이다.
제 8항에 있어서, 화학식(6)의 화합물의 생산을 위한 재조합 세포:

화학식(6)
상기 식에서,
R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고;
R₆ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
n= 1 내지 5이다.
100% 거울상이성질체 과량 (enantiomeric excess)으로 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트의 생산을 위한 방법으로서,
a. 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 제공하는 단계;
b. 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 제 1항에 청구된 재조합 세포 및 0.005 내지 0.02 mol%의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADPH) 및 100 내지 500 단위의 글루코오즈 탈수소효소 및 pH 5.0 내지 9.0의 완충용액과 접촉시키는 단계;
c. 단계(b)에서 얻은 반응 혼합물에 10:1 내지 1:1의 범위의 비율로 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 메틸 n-부틸 에테르 또는 디-n-부틸 에테르로 구성된 군으로부터 선택된 유기 용매를 첨가하는 단계;
d. 20 내지 40℃의 항온에서 자성 교반기 상에서 반응 혼합물을 효과적으로 혼합하는 단계:
e. 에틸 아세테이트 중에 단계(d)에서 얻은 생성물을 추출한 다음, 생성물 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 분리하는 단계를 포함하는 방법:

.
화학식(1) 화학식(2)
제 24항에 있어서, pH가 6.5인 방법.
제 24항에 있어서, 온도가 30℃인 방법.
제 24항에 있어서, 유기 용매가 디-n-부틸 에테르인 방법.
제 24항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 및 재조합 에셰리키아 콜리 C43(DE3)으로부터 선택된 재조합 에셰리키아 콜리의 균주인 방법.
제 24항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3)인 방법.
100% 거울상이성질체 과량 (enantiomeric excess)으로 화학식(2)의 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트의 생산을 위한 방법으로서,
a. 화학식(1)의 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 제공하는 단계;
b. 에틸 4-클로로-3-옥소부티레이트를 제 8항에 청구된 재조합 세포 및 0.005 내지 0.02 mol%의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADPH) 및 pH 5.0 내지 9.0의 완충용액과 접촉시키는 단계;
c. 단계(b)에서 얻은 반응 혼합물에 10:1 내지 1:1의 범위의 비율로 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 메틸 n-부틸 에테르 또는 디-n-부틸 에테르로 구성된 군으로부터 선택된 유기 용매를 첨가하는 단계;
d. 20 내지 40℃의 항온에서 자성 교반기 상에서 반응 혼합물을 효과적으로 혼합하는 단계:
e. 에틸 아세테이트 중에 단계(d)에서 얻은 생성물을 추출한 다음, 생성물 에틸 (S)-4-클로로-3-하이드록시부티레이트를 분리하는 단계를 포함하는 방법:

.
화학식(1) 화학식(2)
제 30항에 있어서, pH가 6.5인 방법.
제 30항에 있어서, 온도가 30℃인 방법.
제 30항에 있어서, 유기 용매가 디-n-부틸 에테르인 방법.
제 30항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 및 재조합 에셰리키아 콜리 C43(DE3)으로부터 선택된 재조합 에셰리키아 콜리의 균주인 방법.
제 30항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3)인 방법.
제 30항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3)인 방법.
화학식(5)의 광학적으로 부화(optically enriched)된 지방족 알콜의 생산을 위한 방법으로서,
f. 화학식(3)의 케톤을 제공하는 단계;
g. 단계(f)에서 제공된 화학식(3)의 케톤을 제 1항에 청구된 재조합 세포 및 0.005 내지 0.02 mol%의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADPH) 및 100 내지 500 단위의 글루코오즈 탈수소효소 및 pH 5.0 내지 9.0의 완충용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성시키는 단계;
h. 단계(g)에서 얻은 반응 혼합물에 10:1 내지 1:1의 범위의 비율로 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 메틸 n-부틸 에테르 또는 디-n-부틸 에테르로 구성된 군으로부터 선택된 유기 용매를 첨가하는 단계;
i. 20 내지 40℃의 항온에서 자성 교반기 상에서 반응 혼합물을 효과적으로 혼합하는 단계:
j. 에틸 아세테이트 중에 단계(i)에서 얻은 생성물을 추출한 다음, 화학식(5)의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 방법:

화학식(3)

화학식(5)
상기 화학식(3)에서,
R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₃ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
X = Cl 또는 Br이고;
n = 1-4이고;
m = 1-8이며;
상기 화학식(5)에서
R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₃ =CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
X = Cl 또는 Br이고;
n = 1-4이고;
m = 1-8이다.
제 37항에 있어서, pH가 6.5인 방법.
제 37항에 있어서, 온도가 30℃인 방법.
제 37항에 있어서, 유기 용매가 디-n-부틸 에테르인 방법.
제 37항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 및 재조합 에셰리키아 콜리 C43(DE3)으로부터 선택된 재조합 에셰리키아 콜리의 균주인 방법.
제 37항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3)인 방법.
화학식(6)의 광학적으로 부화(optically enriched)된 아릴 알콜의 생산을 위한 방법으로서,
f. 화학식(4)의 케톤을 제공하는 단계;
g. 단계(f)에서 제공된 화학식(4)의 케톤을 제 1항에 청구된 재조합 세포 및 0.005 내지 0.02 mol%의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADPH) 및 100 내지 500 단위의 글루코오즈 탈수소효소 및 pH 5.0 내지 9.0의 완충용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성시키는 단계;
h. 단계(g)에서 얻은 반응 혼합물에 10:1 내지 1:1의 범위의 비율로 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 메틸 n-부틸 에테르 또는 디-n-부틸 에테르로 구성된 군으로부터 선택된 유기 용매를 첨가하는 단계;
i. 20 내지 40℃의 항온에서 자성 교반기 상에서 반응 혼합물을 효과적으로 혼합하는 단계:
j. 에틸 아세테이트 중에 단계(i)에서 얻은 생성물을 추출한 다음, 화학식(6)의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 방법:

화학식(4)

화학식(6)
상기 화학식(4)에서,
R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고;
R₆ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
n= 1 내지 5이고,
상기 화학식(6)에서,
R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고;
R₆ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
n= 1 내지 5이다.
제 43항에 있어서, pH가 6.5인 방법.
제 43항에 있어서, 온도가 30℃인 방법.
제 43항에 있어서, 유기 용매가 디-n-부틸 에테르인 방법.
제 43항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 및 재조합 에셰리키아 콜리 C43(DE3)으로부터 선택된 재조합 에셰리키아 콜리의 균주인 방법.
제 43항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3)인 방법.
화학식(5)의 광학적으로 부화(optically enriched)된 지방족 알콜의 생산을 위한 방법으로서,
a. 화학식(3)의 케톤을 제공하는 단계;
b. 단계(a)에서 제공된 화학식(3)의 케톤을 제 8항에 청구된 재조합 세포 및 0.005 내지 0.02 mol%의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADPH) 및 pH 5.0 내지 9.0의 완충용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성시키는 단계;
c. 단계(b)에서 얻은 반응 혼합물에 10:1 내지 1:1의 범위의 비율로 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 메틸 n-부틸 에테르 또는 디-n-부틸 에테르로 구성된 군으로부터 선택된 유기 용매를 첨가하는 단계;
d. 20 내지 40℃의 항온에서 자성 교반기 상에서 반응 혼합물을 효과적으로 혼합하는 단계:
e. 에틸 아세테이트 중에 단계(d)에서 얻은 생성물을 추출한 다음, 화학식(5)의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 방법:

화학식(3)

화학식(5)
상기 화학식(3)에서,
R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₃ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
X = Cl 또는 Br이고;
n = 1-4이고;
m = 1-8이며;
상기 화학식(5)에서
R₁ = CH₃, CH₂X, (CH₃)₂CH, CF₃ 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₂ = H, X 또는 CH₃(CH₂)_n이고;
R₃ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_m로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
X = Cl 또는 Br이고;
n = 1-4이고;
m = 1-8이다.
제 49항에 있어서, pH가 6.5인 방법.
제 49항에 있어서, 온도가 30℃인 방법.
제 49항에 있어서, 유기 용매가 디-n-부틸 에테르인 방법.
제 49항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 및 재조합 에셰리키아 콜리 C43(DE3)으로부터 선택된 재조합 에셰리키아 콜리의 균주인 방법.
제 49항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3)인 방법.
화학식(6)의 광학적으로 부화(optically enriched)된 아릴 알콜의 생산을 위한 방법으로서,
a. 화학식(4)의 케톤을 제공하는 단계;
b. 단계(a)에서 제공된 화학식(4)의 케톤을 제 8항에 청구된 재조합 세포 및 0.005 내지 0.02 mol%의 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트 (NADPH) 및 pH 5.0 내지 9.0의 완충용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성시키는 단계;
c. 단계(b)에서 얻은 반응 혼합물에 10:1 내지 1:1의 범위의 비율로 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 메틸 n-부틸 에테르 또는 디-n-부틸 에테르로 구성된 군으로부터 선택된 유기 용매를 첨가하는 단계;
d. 20 내지 40℃의 항온에서 자성 교반기 상에서 반응 혼합물을 효과적으로 혼합하는 단계:
e. 에틸 아세테이트 중에 단계(d)에서 얻은 생성물을 추출한 다음, 화학식(6)의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 방법:

화학식(4)

화학식(6)
상기 화학식(4)에서,
R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고;
R₆ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
n= 1 내지 5이고,
상기 화학식(6)에서,
R₁=R₂=R₃=R₄=R₅=H, CH₃, F, Cl, Br, I, CF₃, NO₂ 또는 OCH₃이고;
R₆ = CH₃ 또는 CH₃(CH₂)_n로 구성된 군으로부터 선택된 알킬기이고;
n= 1 내지 5이다.
제 55항에 있어서, pH가 6.5인 방법.
제 55항에 있어서, 온도가 30℃인 방법.
제 55항에 있어서, 유기 용매가 디-n-부틸 에테르인 방법.
제 55항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 BL21(DE3), 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3) 및 재조합 에셰리키아 콜리 C43(DE3)으로부터 선택된 재조합 에셰리키아 콜리의 균주인 방법.
제 55항에 있어서, 재조합 세포가 재조합 에셰리키아 콜리 C41(DE3)인 방법.
수탁번호 MTCC No.5806, MTCC No. 5807, MTCC No. 5808 또는 MTCC No. 5809을 지니는 재조합 세포.
제 61항에 있어서, 수탁번호 MTCC 5806, MTCC No. 5807, MTCC No. 5808 또는 MTCC No. 5809를 지니는 재조합 세포가 각각 SEQ ID No. 1, 3, 5 및 7로 구성된 아미노산 서열을 발현하는 재조합 세포.
제 61항 또는 제 62항에 있어서, SEQ ID Nos. 1, 3, 5 및 7로 구성된 아미노산 서열이 SEQ ID No. 2, 4, 6 및 8로 구성된 뉴클레오티드 서열에 상응하는 재조합 세포.
제 63항에 있어서, SEQ ID Nos. 1-8이 카르보닐 환원효소 효소의 비-천연 서열인 재조합 세포.
제 61항에 있어서, 세포 표면상에서 카르보닐 환원효소의 높은 활성을 발현시킬 수 있는 재조합 세포.
SEQ ID Nos. 2, 4, 6 또는 8의 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 SEQ ID Nos. 1, 3, 5 또는 7의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 재조합 벡터 구성물.
제 66항에 있어서, 카르보닐 환원효소 효소의 비-천연 서열을 포함하는 재조합 벡터 구성물.
제 66항 또는 제 67항에 있어서, 세포 표면상에서 카르보닐 환원효소의 높은 활성을 발현시킬 수 있는 재조합 벡터 구성물.
수탁번호 MTCC No.5810, MTCC No. 5811, MTCC No. 5812, MTCC No. 5813; MTCC No. 5814, MTCC No. 5815, MTCC No. 5816 또는 MTCC No. 5817를 지니는 재조합 세포.
제 69항에 있어서, 수탁번호 MTCC No.5810을 지니는 재조합 세포가 SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO. 9의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5811을 지니는 재조합 세포가 SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO. 11의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5812를 지니는 재조합 세포가 SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 9의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5813을 지니는 재조합 세포가 SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 11의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5814를 지니는 재조합 세포가 SEQ ID NO. 5 및 SEQ ID NO. 9의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5815을 지니는 재조합 세포가 SEQ ID NO. 5 및 SEQ ID NO. 11의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5816을 지니는 재조합 세포가 SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 9의 아미노산 서열을 발현하고; 수탁번호 MTCC No.5817을 지니는 재조합 세포가 SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 11의 아미노산 서열을 발현하는 재조합 세포.
제 69항 또는 제 70항에 있어서, SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9 및 11로 구성된 아미노산 서열이 SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10 및 12로 구성된 뉴클레오티드 서열에 상응하는 재조합 세포.
제 65항에 있어서, 세포 표면상에서 효소 카르보닐 환원효소와 글루코나제 탈수소효소를 함께 동시에 발현시킬 수 있는 재조합 세포.
제 71항에 청구된 서열을 포함하고 발현할 수 있는 재조합 벡터.
제 73항에 있어서, 세포 표면 상에서 효소 카르보닐 환원효소와 글루코나제 탈수소효소를 함께 동시에 발현시킬 수 있는 재조합 벡터.
제 66항에 있어서, 세포 표면상에서 효소 카르보닐 환원효소와 글루코나제 탈수소효소를 함께 동시에 발현시킬 수 있는 재조합 벡터 구성물.