CN107326049A - 重组酮还原酶在制备(r)-3,5-二（三氟甲基）苯乙醇中的应用 - Google Patents

重组酮还原酶在制备(r)-3,5-二（三氟甲基）苯乙醇中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组酮还原酶在制备(R)‑3,5‑二(三氟甲基)苯乙醇中的应用，其中重组酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2、4、6、8、10中任一项所示。将所述重组酮还原酶、3,5‑双三氟甲基苯乙酮、辅因子、缓冲液和氢供体按一定比例混合，在pH＝6～8、温度为25～35℃下进行反应得到产物。该应用使得制备(R)‑3,5‑二(三氟甲基)苯乙醇的反应条件温和，产物收率及ee值均较高，同时底物浓度高达200g/L，大大提高了(R)‑3,5‑二(三氟甲基)苯乙醇的制备效率，降低其生产成本，具有重要的工业应用价值。

Description

重组酮还原酶在制备(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇中的应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种重组酮还原酶在制备(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇中的应用。
背景技术
阿瑞匹坦(Aprepitant)是获FDA批准上市的第一个神经激肽-1(NK-1)受体阻滞剂，用于预防化疗引起的急性和延迟性恶心、呕吐等不良反应，由默克公司研发生产。该产品于2003年获美国FDA批准，2013年7月16日获中国国家食品药品监督管理局的进口注册批准。2014、2015年销售额分别高达5.53和5.35亿美元。其结构式如下所示：
福沙吡坦二甲葡胺(Fosaprepitant dimeglumine)也是一种高效止吐剂，联合阿瑞吡坦可明显提高化疗所致恶心、呕吐的控制效果。2008年2月FDA批准Merk公司的福沙匹坦二甲葡胺的上市申请；该产品2008年3月在英国上市，5月在德国上市，截止目前该品种已在欧、美、日等20多个国家上市。其结构式如下所示：
罗拉匹坦(Rolapitant)是一种高选择性P物质/神经激肽-1(NK-1)受体拮抗剂，用于治疗化疗引起的恶心呕吐，生产厂家为美国Tesaro公司，2015年9月经FDA获批，商品名为Varubi。Varubi的上市，将为预防迟发性CINV提供一种新的治疗选择，预计年销售额峰值可达4亿美元。其结构式如下所示：
其中(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇是合成阿瑞匹坦、罗拉匹坦、福沙吡坦二甲葡胺等匹坦类药物的关键中间体，国内外对其制备方法进行广泛研究，目前主要制备方法包括化学法和生物法。
化学合成法(Organic Process Research&Development,11,519-523,2007)以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，Ru等贵金属配合物为催化剂不对称合成产物(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇，该方法存在金属催化剂昂贵，产品光学纯度不高等缺点。
生物合成法主要是以酮还原酶为催化剂，将3,5-双三氟甲基苯乙酮不对称合成(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇。David Pollard等人(Tetrahedron:Asymmetry,17,554-559,2006)报道了一种来源于Lactobacillus kefir DSM 20587的酮还原酶，能将3,5-双三氟甲基苯乙酮还原为(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇，但该酶在催化过程中存在底物浓度较低(20mM)，反应产率过低(15％)等缺点，无法满足工业应用要求。
Dunming Zhu等人(Tetrahedron:Asymmetry,16,1541-1546,2005)公开了以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，酮还原酶为催化剂在葡萄糖/葡萄糖脱氢酶体系中合成产物(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇的方法，其中该文献只揭露酮还原酶购自BioCatalytics.Inc的KRED 126，并未公开其基因序列和氨基酸序列，该方法中底物浓度仅为1.25mM，转化率(21％)和产物ee值(92％)均较低，无法满足工业化生产需求。
Mirjana Gelo-Pujic等人(Tetrahedron:Asymmetry,17,2000-2005,2006)采用高加索乳杆菌(Lactobacillus kefir DSM 20587)全细胞还原3,5-双三氟甲基苯乙酮得到产物(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇，其中所用的催化剂为高加索乳杆菌野生菌，该方法最大的缺点在于底物浓度过低约1-2g/L，严重影响其工业化应用。
发明内容
为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本发明公开了一种重组酮还原酶在制备(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇中的应用。
具体生物酶催化制备(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇工艺路线如下所示：
为实现上述发明目的，本发明公开了一种重组酮还原酶在制备(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇中的应用，其中重组酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2、4、6、8、10中任一项所示。
进一步说，编码重组酮还原酶的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1、3、5、7、9中任一项所示。
进一步说，(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇由以下步骤制备得到：
将氨基酸序列如SEQ ID No.2、4、6、8、10中任一项所示的重组酮还原酶、3,5-双三氟甲基苯乙酮、辅因子、缓冲液和氢供体按一定比例混合，在pH＝6～8、温度为25～35℃下反应20～36h。反应混合液中重组酮还原酶的浓度为5～10g/L、3,5-双三氟甲基苯乙酮的浓度为100～200g/L、氢供体的体积比浓度为45％～55％、辅因子的浓度为0.05～0.1g/L和缓冲液的浓度为10～100mM。反应结束后向反应液中加入硅藻土搅拌，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取、浓缩和结晶得到收率大于95％、光学纯度大于99.9％的目标产物(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇。
进一步说，氢供体为异丙醇。
进一步说，重组酮还原酶为来源于高加索乳杆菌的酮还原酶的突变体，是通过对本公司内部的高加索乳杆菌酮还原酶的突变体文库进行筛选后得到的。来源于高加索乳杆菌的野生型酮还原酶在NCBI的登录号为AY267012.1。上述所有基因序列均可通过商业化的全基因合成服务制得。
进一步说，所述辅因子为选自NAD、NADH、NADP和NADPH的任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。
进一步说，缓冲液选自磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，其中优选为磷酸盐缓冲液。
进一步说，重组酮还原酶由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌选自重组大肠杆菌或重组毕赤酵母菌，其中优选为重组大肠杆菌。
进一步说，重组酮还原酶以酶粉形式或含酮还原酶的细胞破碎液的形式加入，优选以酶粉形式加入。
在本发明的一个具体实施例中，重组酮还原酶酶粉可采用本领域常规的分子生物学、超声破碎及真空冷冻干燥方法制得。
与现有技术相比，本发明提供了一种重组酮还原酶在制备(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇中的应用。该应用使得制备(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇的反应条件温和，产物收率及ee值均较高，同时底物浓度高达200g/L，大大提高了(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇的制备效率，降低其生产成本，具有重要的工业应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例2中HPLC检测的反应转化率；
图2为本发明实施例2中产物的ee值测定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1重组酮还原酶的制备
将含有酮还原酶编码基因(SEQ ID No.1、3、5、7或9)的基因工程菌(载体pET24a，宿主细胞E.Coli BL21(DE3))接种至5mL含卡那霉素的LB试管培养基中活化培养(37℃培养12h)，按1％接种量转接活化培养物至400mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养OD至0.6-0.8，加入IPTG(终浓度0.1mM)于25℃诱导培养16h。离心收集菌体，用40mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH 7.5)重悬菌体后，于冰水浴中超声破碎15min，离心收集上清，-20℃预冻后真空冷冻干燥48h后碾碎即得重组酮还原酶酶粉。
实施例2克级(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇的制备
于25mL反应容器中加入100mM的磷酸盐缓冲液(5mL，pH＝7.5)、异丙醇(5mL)及底物3,5-双三氟甲基苯乙酮(1.5g)，搅拌均匀后加入重组酮还原酶酶粉(60mg)及辅酶NADP(0.8mg)，30℃下磁力搅拌反应20h，取样加入两倍体积乙腈终止反应，HPLC检测转化率及产物ee值，图谱分别见图1(底物保留时间为6.5min，产物保留时间为5.0min)和图2(R型产物保留时间为5.09min，S型产物保留时间4.79min)，转化率>99.1％，R型产物ee值>99.5％。
实施例3公斤级(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇的制备
向带夹套的玻璃反应釜(25L)中加入100mM的磷酸盐缓冲液(5L，pH＝7.5)、异丙醇(5L)及3,5-双三氟甲基苯乙酮(2kg)，搅拌均匀后加入重组酮还原酶酶粉(100g)及辅酶NADP(1g)，30℃搅拌36h；向反应液中加入硅藻土搅拌15min，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得黄色油状物；粗品加入正己烷(10kg)，在0～5℃搅拌、过滤、真空烘干得产物1.92kg，纯度99.8％，光学纯度99.6％，收率96.0％。
实施例4公斤级(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇的制备
向带夹套的玻璃反应釜(25L)中加入80mM的磷酸盐缓冲液(4.5L，pH＝6)、异丙醇(5.5L)及3,5-双三氟甲基苯乙酮(1.5kg)，搅拌均匀后加入重组酮还原酶酶粉(60g)及辅酶NADP(0.7g)，25℃搅拌30h；向反应液中加入硅藻土搅拌15min，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得黄色油状物；粗品加入正己烷(10kg)，在0～5℃搅拌、过滤、真空烘干得产物1.43kg，纯度99.9％，光学纯度99.7％，收率95.3％。
实施例5公斤级(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇的制备
向带夹套的玻璃反应釜(25L)中加入10mM的磷酸盐缓冲液(5.5L，pH＝8)、异丙醇(4.5L)及3,5-双三氟甲基苯乙酮(1kg)，搅拌均匀后加入重组酮还原酶酶粉(50g)及辅酶NADP(0.5g)，35℃搅拌24h；向反应液中加入硅藻土搅拌15min，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得黄色油状物；粗品加入正己烷(10kg)，在0～5℃搅拌、过滤、真空烘干得产物0.96.4kg，纯度99.9％，光学纯度99.8％，收率96.4％。

Claims (9)

1.一种重组酮还原酶在制备(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇中的应用，所述重组酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2、4、6、8、10中任一项所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：编码所述重组酮还原酶的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1、3、5、7、9中任一项所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述(R)-3,5-二(三氟甲基)苯乙醇由以下步骤制备：将氨基酸序列如SEQ ID No.2、4、6、8、10中任一项所示的重组酮还原酶、3,5-双三氟甲基苯乙酮、辅因子、缓冲液和氢供体按一定比例混合反应得到产物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组酮还原酶的浓度为5～10g/L、所述3,5-双三氟甲基苯乙酮的浓度为100～200g/L、所述氢供体的体积比浓度为45％～55％、所述辅因子的浓度为0.05～0.1g/L和所述缓冲液的浓度为10～100mM。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述反应在pH＝6～8、温度为25～35℃下进行。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述氢供体为异丙醇。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述辅因子为选自NAD、NADH、NADP和NADPH的任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，其中优选为磷酸盐缓冲液。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述重组酮还原酶由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌选自大肠杆菌或酵母菌，其中优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
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