CN115521946A - 一种TiOx基光酶催化剂合成(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种TiOx基光酶催化剂合成(R)‑1‑[3,5‑二(三氟甲基)]苯乙醇的方法。本发明首先制备表面富钛氧层的二氧化钛纳米管和AKR‑114‑189醛酮还原酶聚集体,然后按照质量比1:0.5~2混合搅拌得到光酶催化剂TiOx/AKR‑CLEs;在反应器中加入反应溶剂、NADP+、光酶催化剂TiOX/AKR‑CLEs、3,5‑双(三氟甲基)苯乙酮,氙灯光照下反应12~24小时;取反应液上清,使用无水正己烷对上清液进行萃取,加热减压旋干,得到(R)‑1‑[3,5‑二(三氟甲基)]苯乙醇。本发明方法操作简单,成本低,催化效率高,反应条件温和,适合工业化应用。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域,尤其是NADPH再生技术领域以及抗肿瘤中的镇吐药物合成技术领域,具体涉及一种TiOx基光酶催化剂合成(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的方法。
背景技术
阿瑞吡坦(结构式如A所示)是第一个神经激肽-1(NK-1)受体阻滞剂,主要用于治疗化疗后引起的恶心、呕吐。美国FDA于2003年批准上市,阿瑞匹坦现已在多个国家和地区上市,销售额逐年快速增长。(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇((R)-3,5-BTPE,结构式如B所示),是阿瑞匹坦合成的关键前体的重要手性中间体,可以通过3,5-双(三氟甲基)苯乙酮(3,5-BTAP)直接还原所得。其中,光学活性仲醇是制药工业中许多生物活性化合物的重要组成部分。工业生产中,前手性酮的不对称氢化(AH,Asymmetric hydrogenation)是获得对映体纯的仲醇的实用且简单的方法。尽管通过AH制备光学醇的方法引起了学术和工业研究的广泛兴趣,但是由于催化剂复杂或条件恶劣,而且化学催化法不对称合成手性醇通常具有条件苛刻,催化剂昂贵,手性醇的对映体过剩量低的问题,多数研究仍处于小规模生产或难以大规模生产的情况。
近年来,酶催化的异军突起也使得生物催化逐渐成为不可忽视的一部分。酶催化反应简单、容易控制、催化效率高,反应条件温和,适合工业化应用,而且产物容易分离纯化,立体和化学选择性高,在最近几十年间已产生了指数式的增长。前期研究发现,醛酮还原酶(AKR,Aldehyde ketone reductase)因其可靠的化学选择性和立体选择性,可以用于还原3,5-BTAP合成(R)-3,5-BTPE。然而,在使用醛酮还原酶进行催化反应的过程中需要NAD(P)H作为辅助因子才能得以进行。NAD(P)H作为辅因子不仅昂贵而且不可或缺,并且用量往往较大,用量基本上等同于底物酮,这表明了该生物催化过程的经济缺陷。酶催化的NADH的再生(如醇脱氢酶和甲酸脱氢酶(FDH))在工业生物催化中已经建立,但是,此过程通常需要酶和相应底物的再生,这会受限于酶有限的稳定性以及高昂的分离费用。另外,目前关于NADPH再生的研究基本上都必须要用诸如[Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+之类的贵金属配体作为氢转移和电子转移媒介,才可以达到NADPH再生的目的,但这必然会增加高昂的成本,限制了工业化应用。因此,开发一种简单高效和低成本的NAD(P)H再生以及(R)-3,5-BTPE合成的方案,已成为业内前沿学者亟待开拓的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种TiOx基光酶催化剂合成(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的方法。
本发明方法具体是:
步骤(1)制备表面富钛氧层的二氧化钛纳米管;具体方法是:
将二氧化钛粉末P25分散到NaOH溶液中,常温下搅拌均匀,倒入反应釜中,120~150℃下反应12~36小时;反应产物用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥;干燥后产物加入盐酸溶液在常温下酸化6~12小时,然后用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥,300~600℃煅烧4~8小时;以四(乙基甲胺基)钛(IV)为钛源前驱体,以H2O为氧源前驱体进行原子层沉积,沉沉积温度为150~250℃,得到表面富钛氧层的二氧化钛纳米管。
进一步,每克二氧化钛粉末P25分散到20~50毫升浓度为5~20mol/L的NaOH溶液中。
进一步,每克干燥后产物加入100~300毫升浓度为0.005~0.02mol/L的盐酸进行酸化。
步骤(2)制备AKR-114-189醛酮还原酶聚集体;具体方法是:
将AKR-114-189醛酮还原酶突变体细胞接种到含有氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的LB培养基中,30~35℃下在振荡培养箱中培养至OD600=0.6~0.8;添加L-(+)-阿拉伯糖、脱水四环素盐酸盐aTc和对叠氮-L-苯丙氨酸,20~25℃下诱导蛋白质表达15~20小时,以8000~10000rpm离心沉淀5~10分钟,获得非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌。
进一步,LB培养基中氯霉素含量为30~40μg/mL,卡那霉素含量为80~120μg/mL,氨苄青霉素含量为40~80μg/mL。
进一步,诱导蛋白质表达时添加的L-(+)-阿拉伯糖的浓度为1.0~3.0mg/mL,脱水四环素盐酸盐aTc的浓度为50~70ng/mL,对叠氮-L-苯丙氨酸的浓度为1.0~1.5mmol/L。
进一步,所述的AKR-114-189醛酮还原酶突变体细胞是对远离源自海马栖热球菌MSB8的醛酮还原酶AKR活性位点的两个位点114Y-189Q进行突变后得到。
将非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌沉淀使用PBS缓冲液重悬,使用超声波处理,使细菌裂解;以8000~10000rpm离心10~15分钟,得到游离酶;微波辅助下,加入双叠氮交联剂和CuI溶液,参与叠氮化物-炔烃环加成点击反应使酶固定化,离心分离得到AKR-114-189醛酮还原酶聚集体。
进一步,加入的双叠氮交联剂与游离酶的摩尔比为0.5~1.5:1,加入的CuI与游离酶的摩尔比为0.2~0.6:1。
步骤(3)将表面富钛氧层的二氧化钛纳米管和AKR-114-189醛酮还原酶聚集体按照质量比1:0.5~2混合,搅拌3~6小时后得到光酶催化剂TiOx/AKR-CLEs(CLEs,cross-linked enzymes)。
步骤(4)在反应器中加入反应溶剂、NADP+、光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs、3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,在氙灯光照下反应12~24小时;
进一步,所述的反应溶剂为异丙醇、甲醇、正己烷、PBS缓冲液、氢氧化钠溶液、盐酸溶液中的一种。
进一步,反应体系中NADP+的浓度为0.5~1.5mmol/L,光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs的浓度为0.5~2.0mg/mL,3,5-双(三氟甲基)苯乙酮的浓度为30~60mmol/L。
步骤(5)取反应液上清,使用无水正己烷对上清液进行萃取,然后加热减压旋干,得到(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。
本发明利用人工光合作用再生NADPH用于光酶催化合成(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的方法,优化了反应步骤,减少环境了污染,降低了生产成本,提高了生产安全性,为产业化提供一条有竞争力的路线。本发明利用太阳光驱动TiOx纳米管分解水供氢和电子的方法,不需要额外借用其他材料作为氢转移和电子转移媒介,辅以高效温和的酶催化反应;反应过程中条件温和,操作和分离简单,易回收和循环使用,对环境污染少,极大地降低了生产成本,适合于工业上的大规模生产应用。本发明方法有益效果主要体现在:
(1)利用人工光合作用驱动NADPH再生,不额外借用其他材料作为氢转移和电子转移媒介,可以大幅降低成本,绿色环保;
(2)操作简单,催化效率高,反应条件温和,适合工业化应用;
(3)制得的光酶催化剂可循环利用进行催化反应;
(4)该方法合成出来的光酶催化剂(TiOx/AKR-CLEs),有望利用人工光合作用驱动其他反应,应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明一实施例制得的TiOx纳米管的X射线衍射图;
图2为本发明一实施例制得的TiOx纳米管的透射电镜微观形貌图;
图3为本发明一实施例催化结束后体系中(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的高效液相色谱分析图谱;
图4为本发明一实施例制得的光酶催化剂TiOx/AKR-CLEs的扫描电镜微观形貌图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。以下实施例中,若非特指,所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的,涉及的方法,如无特别说明,均为本领域的常规方法。
实施例1.制备表面富钛氧层的二氧化钛纳米管:
将1克二氧化钛粉末P25分散到20毫升浓度为20mol/L的NaOH溶液中,常温下搅拌均匀,倒入反应釜中,150℃下反应12小时;反应产物用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥;
取0.5克干燥后产物加入50毫升浓度为0.02mol/L的盐酸溶液,在常温下酸化8小时,然后用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥,400℃煅烧6小时;以四(乙基甲胺基)钛(IV)为钛源前驱体,以H2O为氧源前驱体进行原子层沉积,沉沉积温度为250℃,得到表面富钛氧层的二氧化钛纳米管。
实施例2.制备表面富钛氧层的二氧化钛纳米管:
将1克二氧化钛粉末P25分散到30毫升浓度为15mol/L的NaOH溶液中,常温下搅拌均匀,倒入反应釜中,140℃下反应20小时;反应产物用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥;
取0.5克干燥后产物加入80毫升浓度为0.015mol/L的盐酸溶液,在常温下酸化10小时,然后用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥,600℃煅烧4小时;以四(乙基甲胺基)钛(IV)为钛源前驱体,以H2O为氧源前驱体进行原子层沉积,沉沉积温度为150℃,得到表面富钛氧层的二氧化钛纳米管。
实施例3.制备表面富钛氧层的二氧化钛纳米管:
将1克二氧化钛粉末P25分散到40毫升浓度为10mol/L的NaOH溶液中,常温下搅拌均匀,倒入反应釜中,130℃下反应30小时;反应产物用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥;
取0.5克干燥后产物加入120毫升浓度为0.01mol/L的盐酸溶液,在常温下酸化12小时,然后用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥,300℃煅烧8小时;以四(乙基甲胺基)钛(IV)为钛源前驱体,以H2O为氧源前驱体进行原子层沉积,沉沉积温度为220℃,得到表面富钛氧层的二氧化钛纳米管。
实施例4.制备表面富钛氧层的二氧化钛纳米管:
将1克二氧化钛粉末P25分散到50毫升浓度为5mol/L的NaOH溶液中,常温下搅拌均匀,倒入反应釜中,120℃下反应36小时;反应产物用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥;
取0.5克干燥后产物加入150毫升浓度为0.005mol/L的盐酸溶液,在常温下酸化6小时,然后用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥,500℃煅烧5小时;以四(乙基甲胺基)钛(IV)为钛源前驱体,以H2O为氧源前驱体进行原子层沉积,沉沉积温度为180℃,得到表面富钛氧层的二氧化钛纳米管。
实施例5.制备AKR-114-189醛酮还原酶聚集体:
对远离源自海马栖热球菌MSB8的醛酮还原酶AKR活性位点的两个位点114Y-189Q进行突变后得到AKR-114-189醛酮还原酶突变体细胞;将AKR-114-189醛酮还原酶突变体细胞接种到LB培养基中,30℃下在振荡培养箱中培养至OD600=0.6;LB培养基中含有30μg/mL氯霉素、100μg/mL卡那霉素和60μg/mL氨苄青霉素;
添加浓度为2.0mg/mL的L-(+)-阿拉伯糖、浓度为50ng/mL的脱水四环素盐酸盐aTc和浓度为1.5mmol/L的对叠氮-L-苯丙氨酸,25℃下诱导蛋白质表达15小时,以8000rpm离心沉淀10分钟,获得非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌;
将非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌沉淀使用PBS缓冲液重悬,使用超声波处理,使细菌裂解;以8000rpm离心15分钟,得到游离酶;微波辅助下,加入双叠氮交联剂和CuI溶液,参与叠氮化物-炔烃环加成点击反应使酶固定化,加入的双叠氮交联剂与游离酶的摩尔比为1.5:1,加入的CuI与游离酶的摩尔比为0.6:1,离心分离得到AKR-114-189醛酮还原酶聚集体。
实施例6.制备AKR-114-189醛酮还原酶聚集体:
对远离源自海马栖热球菌MSB8的醛酮还原酶AKR活性位点的两个位点114Y-189Q进行突变后得到AKR-114-189醛酮还原酶突变体细胞;将AKR-114-189醛酮还原酶突变体细胞接种到LB培养基中,32℃下在振荡培养箱中培养至OD600=0.7;LB培养基中含有40μg/mL氯霉素、120μg/mL卡那霉素和80μg/mL氨苄青霉素;
添加浓度为3.0mg/mL的L-(+)-阿拉伯糖、浓度为60ng/mL的脱水四环素盐酸盐aTc和浓度为1.0mmol/L的对叠氮-L-苯丙氨酸,18℃下诱导蛋白质表达20小时,以9000rpm离心沉淀6分钟,获得非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌;
将非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌沉淀使用PBS缓冲液重悬,使用超声波处理,使细菌裂解;以9000rpm离心12分钟,得到游离酶;微波辅助下,加入双叠氮交联剂和CuI溶液,参与叠氮化物-炔烃环加成点击反应使酶固定化,加入的双叠氮交联剂与游离酶的摩尔比为1.0:1,加入的CuI与游离酶的摩尔比为0.2:1,离心分离得到AKR-114-189醛酮还原酶聚集体。
实施例7.制备AKR-114-189醛酮还原酶聚集体:
对远离源自海马栖热球菌MSB8的醛酮还原酶AKR活性位点的两个位点114Y-189Q进行突变后得到AKR-114-189醛酮还原酶突变体细胞;将AKR-114-189醛酮还原酶突变体细胞接种到LB培养基中,35℃下在振荡培养箱中培养至OD600=0.8;LB培养基中含有50μg/mL氯霉素、80μg/mL卡那霉素和40μg/mL氨苄青霉素;
添加浓度为1.0mg/mL的L-(+)-阿拉伯糖、浓度为70ng/mL的脱水四环素盐酸盐aTc和浓度为1.2mmol/L的对叠氮-L-苯丙氨酸,20℃下诱导蛋白质表达15小时,以10000rpm离心沉淀5分钟,获得非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌;
将非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌沉淀使用PBS缓冲液重悬,使用超声波处理,使细菌裂解;10000rpm离心10分钟,得到游离酶;微波辅助下,加入双叠氮交联剂和CuI溶液,参与叠氮化物-炔烃环加成点击反应使酶固定化,加入的双叠氮交联剂与游离酶的摩尔比为0.5:1,加入的CuI与游离酶的摩尔比为0.4:1,离心分离得到AKR-114-189醛酮还原酶聚集体。
利用实施例1~4任一方法制得的表面富钛氧层的二氧化钛纳米管以及实施例5~7任一方法制得的AKR-114-189醛酮还原酶聚集体,制备光酶催化剂TiOx/AKR-CLEs(CLEs,cross-linked enzymes)。
实施例8.制备光酶催化剂TiOx/AKR-CLEs:
将表面富钛氧层的二氧化钛纳米管和AKR-114-189醛酮还原酶聚集体按照质量比1:0.5混合,搅拌3小时后得到光酶催化剂TiOx/AKR-CLEs。
实施例9.制备光酶催化剂TiOx/AKR-CLEs:
将表面富钛氧层的二氧化钛纳米管和AKR-114-189醛酮还原酶聚集体按照质量比1:1混合,搅拌6小时后得到光酶催化剂TiOx/AKR-CLEs。
实施例10.制备光酶催化剂TiOx/AKR-CLEs:
将表面富钛氧层的二氧化钛纳米管和AKR-114-189醛酮还原酶聚集体按照质量比1:1.5混合,搅拌4小时后得到光酶催化剂TiOx/AKR-CLEs。
利用实施例1~4任一方法制得的光酶催化剂TiOx/AKR-CLEs催化合成(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。
实施例11.
在反应器中加入异丙醇溶剂、NADP+、光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs、3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,反应体系中NADP+的浓度为1.2mmol/L,光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs的浓度为0.8mg/mL,3,5-双(三氟甲基)苯乙酮的浓度为35mmol/L;在氙灯光照下反应22小时;
取反应液上清,使用无水正己烷对上清液进行萃取,加热减压旋干,得到(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。
实施例12.
在反应器中加入甲醇溶液、NADP+、光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs、3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,反应体系中NADP+的浓度为0.5mmol/L,光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs的浓度为1.2mg/mL,3,5-双(三氟甲基)苯乙酮的浓度为45mmol/L;在氙灯光照下反应12小时;
取反应液上清,使用无水正己烷对上清液进行萃取,加热减压旋干,得到(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。
实施例13.
在反应器中加入正己烷溶剂、NADP+、光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs、3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,反应体系中NADP+的浓度为0.8mmol/L,光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs浓度为0.5mg/mL,3,5-双(三氟甲基)苯乙酮的浓度为50mmol/L;在氙灯光照下反应15小时;
取反应液上清,使用无水正己烷对上清液进行萃取,加热减压旋干,得到(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。
实施例14.
在反应器中加入PBS缓冲液、NADP+、光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs、3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,反应体系中NADP+的浓度为1.0mmol/L,光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs浓度为1.5mg/mL,3,5-双(三氟甲基)苯乙酮的浓度为40mmol/L;在氙灯光照下反应18小时;
取反应液上清,使用无水正己烷对上清液进行萃取,加热减压旋干,得到(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。
实施例15.
在反应器中加入氢氧化钠溶液、NADP+、光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs、3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,反应体系中NADP+的浓度为1.2mmol/L,光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs浓度为2.0mg/mL,3,5-双(三氟甲基)苯乙酮的浓度为30mmol/L;在氙灯光照下反应20小时;
取反应液上清,使用无水正己烷对上清液进行萃取,加热减压旋干,得到(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。
实施例16.
在反应器中加入盐酸溶液、NADP+、光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs、3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,反应体系中NADP+的浓度为1.5mmol/L,光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs的浓度为1.0mg/mL,3,5-双(三氟甲基)苯乙酮的浓度为60mmol/L;在氙灯光照下反应24小时;
取反应液上清,使用无水正己烷对上清液进行萃取,加热减压旋干,得到(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。
实施例17.
将1.0g的P25粉末分散到10mol/L的NaOH溶液中,配成40mL溶液,在常温下搅拌1小时倒入反应釜中,接着放入烘箱在135℃下反应24小时。反应后的样品用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,将样品放入70℃真空烘箱中干燥12小时。取上述干燥后的样品0.5g于烧杯中,加入浓度为0.01M盐酸溶液100ml,盖上封口膜,在室温下酸化10小时。将酸化后的样品用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,将样品放入70℃真空烘箱中干燥12小时。
将上述干燥的样品放入管式炉中在500℃下煅烧5小时。以四(乙基甲胺基)钛(IV)为钛源前驱体,以H2O为氧源前驱体进行原子层沉积,沉积温度:200℃。沉积结束得到的样品即为TiOx纳米管。
通过X射线衍射(XRD)测试,得到了表面富钛氧层二氧化钛(TiOX)样品的相结构,结果如图1所示。所有样品均在2θ值为25.3、37.8、48.1、54.0、55.0、62.7和68.6处出现衍射峰,这可归因于锐钛矿型TiO2的(101)、(004)、(200)、(105)、(211)、(204)和(116)晶面(PDF卡21-1272,JCPDS)。没有任何其他的峰出现,说明没有杂质生成。
接着通过TEM测试进一步研究了材料的形貌。图2为TiOX纳米管的TEM图谱,可以清楚地看到样品具有很好的纳米管状结构。
实施例18.
常温下,将250μmol/L的TiOx纳米管,32mg/mL醛酮还原酶(AKR-114-189)聚集体通过械搅拌4小时制得光酶催化剂(TiOx/AKR-CLEs)。
将100mM的PBS缓冲液(pH=7.0),1mM的NADP+,以及10mg光酶催化剂(TiOx/AKR-CLEs),50mM底物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,总体积为10ml,并用氙灯(波长λ>800nm)距反应器15厘米处光照反应18小时。反应结束后,用高效液相色谱仪检测体系中(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的含量,如图3。高效液相色谱条件:C18柱,柱温为25℃,检测器为210nm,流动相为:甲醇:水=75:25(v/v),流速为0.4mL/min。
以从TCI(东京化成工业株式会社)采购的(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇作为标准品,与本发明方法制备的产品,进行HPLC分析,两者保留时间一致,确定产物结构。转化率通过标准样品((R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的HPLC峰面积)的标准曲线计算,标样的标准曲线为y=107x+2*106,其中x表示反应液中的产物浓度,单位为mg/mL,y表示产物的HPLC峰面积。HPLC检测得到(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的转化率为11.53%。
从图4可以看出,光催化再生NADPH促进的手性醇合成与人工添加NADPH取得一样的效果,即完全可用此法以水为氢供体再生NADPH,且醛酮还原酶保持稳定的催化性能。
实施例19.
常温下,将250μmol/L的TiOx纳米管,32mg/mL醛酮还原酶(AKR-114-189)聚集体通过械搅拌4小时制得光酶催化剂(TiOx/AKR-CLEs)。
将100mM的PBS缓冲液(pH=7.0),1mM的NADP+,以及10mg光酶催化剂(r-TiOx/AKR-CLEs),50mM底物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,总体积为10ml,并用氙灯(波长λ>800nm)距反应器15厘米处光照反应18小时;反应结束后,用高效液相色谱仪检测体系中(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的含量;高效液相色谱条件:C18柱,柱温为25℃,检测器为210nm,流动相为:甲醇:水=75:25(v/v),流速为0.4mL/min。
反应结束后过滤获取光酶催化剂(TiOx/AKR-CLEs),用去离子水洗涤干燥,以备循环使用,循环一次12小时,循环5次后,HPLC检测(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的转化率基本不变。
实施例20.
常温下,将200μmol/L的TiOx纳米管,25mg/mL醛酮还原酶(AKR-114-189)聚集体通过械搅拌3小时制得光酶催化剂(TiOx/AKR-CLEs)。
将100mM的PBS缓冲液(pH=7.0),0.5mM的NADP+,以及5mg光酶催化剂(r-TiOx/AKR-CLEs),50mM底物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,总体积为10ml,并用氙灯(波长λ>800nm)距反应器15厘米处光照反应12小时;反应结束后,用高效液相色谱仪检测体系中(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的含量;高效液相色谱条件:C18柱,柱温为25℃,检测器为210nm,流动相为:甲醇:水=75:25(v/v),流速为0.4mL/min。
实施例21.
室温下,将400μmol/L的TiOx纳米管,40mg/mL醛酮还原酶(AKR-114-189)聚集体通过械搅拌6小时制得光酶催化剂(TiOx/AKR-CLEs)。
将100mM的PBS缓冲液(pH=7.0),1.5mM的NADP+,以及15mg光酶催化剂(TiOx/AKR-CLEs),50mM底物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,总体积为10ml,并用氙灯(波长λ>800nm)距反应器15厘米处光照反应24小时;反应结束后,用高效液相色谱仪检测体系中(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的含量;高效液相色谱条件:C18柱,柱温为25℃,检测器为210nm,流动相为:甲醇:水=75:25(v/v),流速为0.4mL/min。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种TiOx基光酶催化剂合成(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇的方法,其特征在于:
步骤(1)制备表面富钛氧层的二氧化钛纳米管;具体方法是:
将二氧化钛粉末P25分散到NaOH溶液中,常温下搅拌均匀,倒入反应釜中,120~150℃下反应12~36小时;反应产物用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥;干燥后产物加入盐酸溶液在常温下酸化6~12小时,然后用去离子水和无水乙醇离心洗涤至沉淀显中性,真空干燥,300~600℃煅烧4~8小时;以四(乙基甲胺基)钛(IV)为钛源前驱体,以H2O为氧源前驱体进行原子层沉积,沉沉积温度为150~250℃,得到表面富钛氧层的二氧化钛纳米管;
步骤(2)制备AKR-114-189醛酮还原酶聚集体;具体方法是:
将AKR-114-189醛酮还原酶突变体细胞接种到含有氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的LB培养基中,30~35℃下在振荡培养箱中培养至OD600=0.6~0.8;添加L-(+)-阿拉伯糖、脱水四环素盐酸盐aTc和对叠氮-L-苯丙氨酸,20~25℃下诱导蛋白质表达15~20小时,以8000~10000rpm离心沉淀5~10分钟,获得非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌;
将非天然氨基酸修饰后的醛酮还原酶的细菌沉淀使用PBS缓冲液重悬,使用超声波处理,使细菌裂解;以8000~10000rpm离心10~15分钟,得到游离酶;微波辅助下,加入双叠氮交联剂和CuI溶液,参与叠氮化物-炔烃环加成点击反应使酶固定化,离心分离得到AKR-114-189醛酮还原酶聚集体;
步骤(3)将表面富钛氧层的二氧化钛纳米管和AKR-114-189醛酮还原酶聚集体按照质量比1:0.5~2混合,搅拌3~6小时后得到光酶催化剂TiOx/AKR-CLEs;
步骤(4)在反应器中加入反应溶剂、NADP+、光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs、3,5-双(三氟甲基)苯乙酮,在氙灯光照下反应12~24小时;
步骤(5)取反应液上清,使用无水正己烷对上清液进行萃取,之后加热减压旋干,得到(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)]苯乙醇。
2.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于:步骤(1)中,每克二氧化钛粉末P25分散到20~50毫升浓度为5~20mol/L的NaOH溶液中。
3.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于:步骤(1)中,每克干燥后产物加入100~300毫升浓度为0.005~0.02mol/L的盐酸进行酸化。
4.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于:步骤(2)中,LB培养基中氯霉素含量为30~40μg/mL,卡那霉素含量为80~120μg/mL,氨苄青霉素含量为40~80μg/mL。
5.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于:步骤(2)中,诱导蛋白质表达时添加的L-(+)-阿拉伯糖的浓度为1.0~3.0mg/mL,脱水四环素盐酸盐aTc的浓度为50~70ng/mL,对叠氮-L-苯丙氨酸的浓度为1.0~1.5mmol/L。
6.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于:步骤(2)中,所述的AKR-114-189醛酮还原酶突变体细胞是对远离源自海马栖热球菌MSB8的醛酮还原酶AKR活性位点的两个位点114Y-189Q进行突变后得到。
7.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于:步骤(2)中,加入的双叠氮交联剂与游离酶的摩尔比为0.5~1.5:1,加入的CuI与游离酶的摩尔比为0.2~0.6:1。
8.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于:步骤(4)中,所述的反应溶剂为异丙醇、甲醇、正己烷、PBS缓冲液、氢氧化钠溶液、盐酸溶液中的一种。
9.如权利要求1所述的合成方法,其特征在于:步骤(4)中,反应体系中NADP+的浓度为0.5~1.5mmol/L,光酶催化剂TiOX/AKR-CLEs的浓度为0.5~2.0mg/mL,3,5-双(三氟甲基)苯乙酮的浓度为30~60mmol/L。
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