CN115558660A - 一种双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器及其微量热辅助制备方法和应用 - Google Patents

一种双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器及其微量热辅助制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双酶共固定磁性HP‑Zr‑MOF反应器及其微量热辅助制备方法和应用，该反应器是以Zn2+或Cu2+活化后表面带正电荷的核‑壳结构HP‑Zr‑MOF@Fe3O4磁性复合材料为固相载体，在微热量计中完成磁性HP‑Zr‑MOF共固定辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。本发明制备的反应器热稳定性及重复使用性十分突出，其对模拟废水中有机毒物2,4‑二氯苯酚具有较好的降解效果，这对广泛应用于有机污染物的降解等方面具有一定的研究意义。

Description

一种双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器及其微量热辅助制备 方法和应用
技术领域
本发明属于酶的固定化技术领域，具体涉及一种磁性HP-Zr-MOF共固定辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOx)反应器，并为其提供一种微量热辅助制备方法及在催化降解有机污染物中的应用。
背景技术
游离酶作为一种高效、绿色的生物催化剂，因其具有特异性好、催化效率高、反应条件温和等优点，而被广泛应用于合成化学、食品加工、制药、废水处理等领域。然而，由于游离酶在实际应用中存在操作稳定性较差，在极端条件下容易失活，不能重复使用和回收等缺点，将游离酶固载到固相载体中构筑固定化酶反应器被认为是提升酶的稳定性的最有效途径之一。金属有机骨架(MOFs)材料具有大的比表面积、高的孔隙率、孔道可调控性、易功能化和易修饰性等优良特性，往往成为优秀固定化酶载体首选。然而，由于MOFs固定化酶反应器使用过程中离心分离导致材料发生团聚造成酶泄露，使得其重复利用性较差，而采用向MOFs材料中引入Fe3O4微球磁性纳米粒子的构筑策略赋予载体材料磁分离的性能，以磁性分离替代离心分离，被认为是提高固定化酶反应器重复使用性最有效途径之一，近年来备受研究人员的青睐。
辣根过氧化物酶(HRP)在自然界中分布广泛，且价格相对低廉，催化反应的类型多种多样，具有良好的应用前景。HRP酶催化反应是一个以H2O2为氧化剂的双底物反应，但反应体系中高浓度H2O2会导致HRP的不可逆失活。这种H2O2对酶的氧化性灭活其实是血红素过氧化物酶家族中普遍存在的问题。目前的解决策略主要有两种：一是间歇式加入以避免H2O2局部浓度过高，但这无疑会大大延长反应时间，且副产物增多，产率下降；二是以叔丁基过氧化氢(TBHP)替代H2O2，但这会在反应体系中引入有机杂质。有幸的是近年来已有研究者发现：将过氧化物酶与葡萄糖氧化酶(GOx，等电点为4.2)同时引入反应体系中，利用葡萄糖的氧化原位产生H2O2，可以和缓地、源源不断地满足HRP酶催化氧化之需。然而这一过程仅仅是两个酶促反应的耦合，需要其有效匹配、协同完成目标反应。如果能将两种游离酶同时固载到同一固相载体上，则与分散在溶液中的两种游离酶相比，两种酶催化反应体系中的成分更容易相互接触，通过载体孔道结构的精准调控使其与两种酶的分子尺寸相匹配，深入研究酶与载体及底物之间不同的相互作用力，在反应过程中将两种酶的催化特性结合起来，充分发挥每一种酶的特点甚至利用级联反应的协同作用，使酶的催化效率得以提高。此外，固相载体的刚性骨架对酶分子具有保护作用，可屏蔽或稀释反应环境中可能存在的一些致失活因素，从而提高酶分子的稳定性。
量热学是热力学大学科中的一个重要分支，是测量物理、化学和生物变化过程的热效应，并研究物理、化学和生物过程的热效应变化规律的学科。借助于微量热技术不仅可以准确测定变化过程的热效应，还可以获得热动力学参数，进而推测反应机理，预测反应的可行性和达到平衡的条件，在实际工业生产和生化过程中发挥着重要的作用。微量热技术作为一种非特异性的低频光谱技术，具有灵敏度高、重复性好、样品用量少、操作简单且检测费用低的优点，能够原位、无损地提供热力学及热动力学数据信息。微量热学可以实现实时原位跟踪，精确测量纳瓦级热量，在生化领域有很好的应用，如细菌生长曲线的测定和蛋白质与表面活性剂的相互作用研究。然而在酶固定化过程以及酶催化反应领域的研究还相对较少，目前仅有零星报道，且绝大多数都是关于酶催化反应动力学方面的报道。
工业废水因其具有水质变化大和有机污染物毒性强、种类多等性质，不仅有诱发人类癌症的可能，而且给环境保护造成了极大的威胁。传统的废水处理方法主要分为物理处理法、化学处理法和生物处理法三类。与传统的废水处理法相比，酶处理法具有催化效率高、反应条件温和、反应速度快，对温度、浓度和有毒物质适应范围广，可重复使用等特性，因而其在有毒有害的有机废水处理、环境监测和清洁生产等环境领域得到了广泛的关注和应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种催化活性高、热稳定性及重复使用性好的双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器，并为该反应器提供一种微量热辅助制备方法以及在催化降解有机污染物中的应用。
解决上述技术问题所采用的反应器是以Zn2+或Cu2+活化后表面带正电荷的核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料为固相载体，通过Zn2+或Cu2+亲和作用同时固定葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，其中葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的摩尔比为3：1～3，所述HP-Zr-MOF的介孔孔径为6～12nm。
本发明双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器中，以固相载体计，所述辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的总固载量为120～170mg/g。
本发明双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器由下述方法制备得到：
1、将柠檬酸修饰的Fe3O4磁性纳米粒子分散在DMF，然后加入ZrCl4、对苯二甲酸、牛血清蛋白(BSA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，超声20～40分钟，120℃溶剂热条件下反应40～60小时，磁性分离、洗涤、干燥，得到BSA-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料；
2、将BSA-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料置于电阻炉中，在300～350℃下煅烧1～2小时，得到核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料；
3、将核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料分散于氯化铜的乙醇溶液或硝酸锌的乙醇溶液中，室温振荡1.5～3小时，经磁性分离、洗涤、干燥后，置于微量热仪中，然后注入含辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的pH值为5～7的醋酸-醋酸钠缓冲液，在20～35℃下完成磁性HP-Zr-MOF共固定辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。
上述步骤1中，优选所述柠檬酸修饰的Fe3O4磁性纳米粒子与ZrCl4、对苯二甲酸、牛血清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1：2.4～3.6：3.0～4.5：0.1～0.4：1.8～3.6。
上述步骤2中，优选所述核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料中，柠檬酸修饰的Fe3O4磁性纳米粒子内核的粒径为250～300nm，其表面包覆的Zr-MOF壳层为多级孔结构，其厚度为30～50nm。
上述步骤3中，优选所述核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料与氯化铜或硝酸锌、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶的配比为1mg：8×10-4～8×10-3mmol：0.05～0.15mg：0.15～0.45mg。
上述步骤3中，进一步优选所述磁性HP-Zr-MOF共固定辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的固定化时间为2～10小时。
本发明双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器在催化降解有机污染物2,4-二氯苯酚中的应用，具体降解方法为：在含有2,4-二氯苯酚的模拟废水中加入固定化酶反应器和β-D-葡萄糖，在密闭条件下常温振荡15～180分钟，即可完成催化降解有机污染物2,4-二氯苯酚。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明采用向HP-Zr-MOF材料中引入Fe3O4微球磁性纳米粒子的构筑策略赋予载体材料磁分离的性能；基于生物矿化策略，以BAS为模板剂，以PVP为结构导向剂，赋予载体材料多级孔结构特征。
2、本发明利用微量热技术全程在线跟踪酶固定化过程，在微热量计中完成磁性HP-Zr-MOF共固定HRP和GOx反应器的构筑过程，解析热谱图求得载体-酶分子结合的吸附热，关联酶反应器的催化效率，根据量热结果优化磁性HP-Zr-MOF共固定HRP和GOx反应器的制备条件。
3、本发明基于金属离子亲和作用将HRP和GOx同时引入磁性HP-Zr-MOF中构筑固定化双酶级联反应器，反应体系中通过GOx氧化葡萄糖原位产生H2O2与HRP催化反应的级联来达到H2O2缓释的目的，以消除H2O2局部浓度过高导致的HRP失活的弊端。所制备的HRP和GOx反应器表现出高催化活性、高稳定性和出色的重复使用性。
4、将本发明HRP和GOx反应器用于催化降解模拟废水中有机污染物2,4-二氯苯酚，具有反应时间较短、酶用量小、反应条件温和等优点，同时表现出非常高效的催化降解环境毒物能力，更适合应用于实际降解体系中。
附图说明
图1是利用微量热仪在20～35℃温度范围内原位监测HRP和GOx在HP-Zr-MOF@Fe3O4上的固定化过程热谱图：(a)20℃；(b)25℃；(c)30℃；(d)35℃。
图2是游离HRP和GOx、HP-Zr-MOF@Fe3O4和HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP的热重分析曲线。
图3是HP-Zr-MOF@Fe3O4(a)、HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&(HRP-FITC)(b)、HP-Zr-MOF@Fe3O4-(GOx-RhB)&HRP(c)和HP-Zr-MOF@Fe3O4-(GOx-RhB)&(HRP-FITC)(d)的激光共聚焦图。
图4是实施例1制备的HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP中双酶体积比对ABTS转化率的影响。
图5是反应体系pH值(a)、反应时间(b)、β-D-葡萄糖浓度(c)对实施例1制备的HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP催化氧化ABTS转化率的影响。
图6是温度对游离HRP和实施例1制备的HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP、HP-Zr-MOF@Fe3O4-HRP催化活性的影响。
图7是实施例1制备的HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP和HP-Zr-MOF@Fe3O4-HRP的重复使用效果图。
图8是游离HRP和GOx、实施例1制备的HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP对模拟废水中2,4-二氯苯酚的降解效率(a)以及HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP对2,4-二氯苯酚的降解效率与降解时间的关系(b)、HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP对模拟废水中2,4-二氯苯酚的重复降解次数(c)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、将1.0g(4mmol)磁性Fe3O4纳米粒子、50mL超纯水加入250mL三口烧瓶中，在搅拌下超声20分钟，使磁性Fe3O4纳米粒子均匀分散于超纯水中，然后加入4.5mL 2.0mol/L柠檬酸水溶液，在N2保护下90℃搅拌90分钟，冷却至室温，磁性分离，产物用超纯水洗涤数次，60℃真空干燥5小时，得到柠檬酸修饰的Fe3O4磁性纳米粒子。将50mg柠檬酸修饰的Fe3O4磁性纳米粒子、0.18g重均分子量为8000～12000的PVP分散在10mL DMF中，超声10分钟，然后将10mg BSA、0.120g ZrCl4、0.166g对苯二甲酸分散在20mL DMF中。随后将上述溶液混合，并超声30分钟，密封后在5小时内升温至120℃，恒温48小时，然后缓慢冷却至室温，磁性分离，用DMF和乙醇洗涤数次，60℃真空干燥5小时，得到BSA-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料。
2、将BSA-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料置于电阻炉中，以每分钟2℃的速率升温至350℃并煅烧2小时，得到核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料。
3、将100mg核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料分散在8mL 60mmol/LCuCl2·2H2O的乙醇溶液中，室温振荡2小时后磁性分离，用乙醇洗涤多次，在40℃下真空干燥5小时，得到Cu2+活化处理的HP-Zr-MOF@Fe3O4复合材料。将10mg Cu2+活化处理的HP-Zr-MOF@Fe3O4复合材料置于微量热仪中，然后注入2mL含1.2mg HRP和3.6mg GOx的pH＝6的醋酸-醋酸钠缓冲液，利用微量热仪原位监测HRP和GOx在HP-Zr-MOF@Fe3O4上的固载过程，在20～35℃的范围内改变体系的温度，记录热流随时间的变化曲线，获得相应的热谱图，解析热谱图求得载体与酶分子结合的吸附热，实验结果见图1和表1。最后经磁性分离，对固体进行洗涤、干燥，得到磁性HP-Zr-MOF共固定GOx和HRP反应器，记作HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP。
为了证明游离HRP和GOx的成功固载，将游离HRP和GOx、HP-Zr-MOF@Fe3O4及其共固定HRP和GOx反应器在30～1000℃温度范围内进行热重分析测试，通过比较HP-Zr-MOF@Fe3O4载体与HP-Zr-MOF@Fe3O4共固定HRP和GOx反应器的热重分析曲线，验证游离HRP和GOx的成功固载；基于热重分析曲线在200～550℃温度范围内游离HRP和GOx、HP-Zr-MOF@Fe3O4及其共固定HRP和GOx反应器的失重率计算游离HRP和GOx在HP-Zr-MOF@Fe3O4中的固载量，并以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为模型反应来测定不同温度条件下制备的反应器的酶催化活性。具体方法如下：向1460μL pH＝5的醋酸-醋酸钠缓冲液中加入15μL10mmol/L ABTS溶液和2mg HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP或含有相等酶量的HRP和GOx，最后加入15μLβ-D-葡萄糖，摇匀待反应5分钟后磁性分离，用紫外分光光度计测定反应液在415nm处的吸光度值，由公式(1)计算ABTS的转化率。实验结果见图2和表1。
Figure BDA0003893343160000061
公式(1)中，A(实测值)：实际测得的吸光度值；ε415nm：ABTS·+在415nm处的摩尔吸光系数；b：测量时所用比色皿的宽度(cm)；CABTS：反应前ABTS底物浓度(mol/L)。
表1不同温度下酶固载过程中酶与载体表面的相互作用特征
Figure BDA0003893343160000062
从表1中数据可以看出，不同温度条件下HP-Zr-MOF@Fe3O4与游离HRP和GOx结合的吸附热值均为负值，根据本试验中对微量热仪的设定可知游离HRP和GOx在HP-Zr-MOF@Fe3O4上的固载过程为放热过程；吸附热的大小可以衡量吸附强弱的程度，吸附热越大，吸附越强。在试验温度范围内，HRP和GOx的固载量为120～170mg/g；随着温度的升高，酶分子在载体上的吸附热值和酶固载量均逐渐增大，表明载体与酶分子之间的结合力逐渐增大，但当温度达到30℃时，酶催化活性达到最大，酶固载量基本不变，表明酶在载体上的吸附基本达到饱和，因此酶固载过程的最适温度为30℃；酶固载的放热量较小，表明游离HRP和GOx在HP-Zr-MOF@Fe3O4上的固载过程是一个弱相互作用过程。
图2的热重曲线显示，游离HRP和GOx的分解温度发生在200～550℃之间，而在此温度范围内，HP-Zr-MOF@Fe3O4与HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP的TGA曲线存在明显差异，其中HP-Zr-MOF@Fe3O4的失重率为13.4％，归属于材料结构中配位水分子和部分有机配体的分解，而HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP的失重率为29.7％，归属于配位水分子和部分有机配体的分解以及酶分子的分解。以上实验结果表明，HP-Zr-MOF@Fe3O4具有良好的热稳定性，且酶固载过程对其热稳定性没有影响。此外，热重分析证实HRP和GOx已被成功固载到HP-Zr-MOF@Fe3O4中。
为了进一步证明游离HRP和GOx的成功固载，将游离HRP用异硫氰酸荧光素(FITC，绿)标记，游离GOx用罗丹明B(RhB，红)标记，结果如图3所示。图3(a)为激光共聚焦显微镜记录的裸HP-Zr-MOF@Fe3O4的图像，图3(b)表示游离HRP成功固载到HP-Zr-MOF@Fe3O4载体上，图3(c)表示游离GOx成功固载到HP-Zr-MOF@Fe3O4载体上，图3(d)为绿色和红色的叠加图，两种颜色叠加后呈现的图像(黄色)表明游离HRP和GOx成功共固定到HP-Zr-MOF@Fe3O4载体上。
在双酶催化反应体系中，HRP与GOx的物质的量比是一个很关键的影响因素。由于HRP催化氧化ABTS所需要的H2O2来自GOx对β-D-葡萄糖的氧化产生，所以HRP与GOx固载量匹配与否直接影响ABTS的转化效率。本发明通过改变HRP与GOx的体积比(其中HRP的浓度为10mg/mL，GOx的浓度为30mg/mL)，分别探讨了采用过渡金属离子Cu2+和Zn2+活化HP-Zr-MOF@Fe3O4后制备的HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP催化ABTS过氧化反应体系中HRP与GOx的最佳体积比对ABTS转化率的影响，实验结果见图4和表2。由图4和表2中实验数据对比可知，当HRP与GOx加入体积比为7μL:15μL即对应HRP与GOx物质的量比约为2:3时，ABTS的转化效率较高；且采用Cu2+活化的HP-Zr-MOF@Fe3O4具有相对较高的酶催化活性。
表2 HRP与GOx体积比对ABTS的催化氧化效果
Figure BDA0003893343160000081
HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP催化ABTS的过氧化反应，涉及到反应体系pH值、反应时间和β-D-葡萄糖浓度因素对ABTS转化率的影响。本发明采用单因素法对反应条件进行考察，实验结果见图5。由图可知，当缓冲液pH值在3～7范围考察时，ABTS转化率呈现出先增大后减小的趋势；当反应体系pH值为5和6时，ABTS转化率相对较高，但当反应体系pH值为5时，ABTS转化率最高。当在0～30分钟范围内考察反应时间时，ABTS转化效率在5分钟内就可达到较理想的效果，而5分钟后变化不大，所以最终确定反应时间为5分钟。对于HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP催化ABTS过氧化反应体系，反应开始β-D-葡萄糖浓度增大时，ABTS转化率明显增大，但当浓度达到一定值后，ABTS转化率反而下降。HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP催化ABTS过氧化反应最佳β-D-葡萄糖浓度为20mmol/L。
对实施例1制备的固定化酶反应器进行酶学性能研究，具体如下：
1、固定化酶反应器的热稳定性
以ABTS为模型反应，测定固定化酶反应器的热稳定性，在30～90℃温度下将游离酶和含有等量酶的固定化酶反应器分别温育1小时，结果见图6。由图6可见，游离HRP和固定化酶反应器催化ABTS氧化反应的催化活性随着温度的升高均有所下降，其均呈“钟罩型”变化。游离HRP和固定化酶反应器热稳定性在30～50℃差别不大，但当温度超过60℃之后，游离HRP的催化活性明显下降，而固定化酶反应器在较高温度下仍能保持较高的催化活性。游离HRP的最佳反应温度为40℃，在70℃下温育1小时仅能保持18.1％的催化活性，而相同条件下HP-Zr-MOF@Fe3O4-HRP和HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP仍能分别保持90.3％和95.1％的催化活性，甚至在80℃下温育1小时仍能分别保持50.1％和75.6％的催化活性。以上结果表明，固定化酶反应器的热稳定性较游离酶显著提高，这是由于固定化酶反应器中刚性的载体为游离酶抵御高温提供了屏障，从而降低酶活性的损失。与HP-Zr-MOF@Fe3O4-HRP相比，HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP表现出较好的热稳定性。HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP的热稳定性优于HP-Zr-MOF@Fe3O4-HRP主要基于以下两个原因：(1)H2O2的在线产生对HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP是一个优势，由于GOx和HRP共固定到HP-Zr-MOF@Fe3O4载体中，因此H2O2缓释的氧化剂在底物和HRP之间不存在传质阻力的问题；(2)载体的介孔孔径与酶分子尺寸大小匹配有关，由于GOx的分子尺寸比HRP大，HP-Zr-MOF@Fe3O4共固定GOx和HRP过程中可能出现GOx先占据大孔径(8.9nm)，而HRP不得不占据较小孔径(7.0nm)，这样势必会形成一种有序“占位”的局面，从而有利于酶活性的保持。因此，本发明固定化酶反应器可用于一些高温下进行的催化反应。
2、固定化酶反应器的重复使用性
将HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP和HP-Zr-MOF@Fe3O4-HRP分别用于ABTS过氧化反应，反应5分钟后磁性分离，测定上层反应液在415nm处的吸光度值，将下层的HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP和HP-Zr-MOF@Fe3O4-HRP分别用于催化下一次的ABTS过氧化反应，以第一次ABTS转化率为100％，将之后每一次的转化率与第一次的比较，以残余活性表征固定化酶反应器的重复使用性，结果见图7。由图7可知，两种固定化酶反应器具有十分出色的重复使用性，其中HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP重复使用10次后，能够保持100％的催化活性，甚至重复使用20次后，仍能保持75.4％的催化活性。这可能是由于作为载体的HP-Zr-MOF@Fe3O4实现了固定化酶反应器从反应液中快速分离，避免了上清液吸出时可能造成的材料损失和离心分离可能会引起的材料团聚；同时，金属离子亲和作用固定法固载的酶与载体的结合更牢固，可以实现多次重复使用。但两种固定化酶反应器中，HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP的重复使用性较HP-Zr-MOF@Fe3O4-HRP效果好。HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP重复使用性提高的主要原因可能与酶催化反应体系中H2O2的缓释有关。
实施例2
实施例1制备的HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP在催化降解2,4-二氯苯酚中的应用，具体降解方法如下：分别在10mL用铝箔裹住的离心管中加入900～2400μL人工配制模拟有机废水，然后加入10mg HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP(或10mg载体固载HRP和GOx的量)和150～1500μL 20mmol/L 2,4-二氯苯酚甲醇溶液(最终浓度为1～10mmol/L)以及600μL 100mmol/Lβ-D-葡萄糖溶液，形成总体积为3mL的降解反应体系，室温下避光反应15～180分钟后磁性分离。用移液枪移取1mL上清液，用3mL乙酸乙酯萃取3次，将萃取后的上层液移入到50mL蒸馏瓶中进行旋转蒸发，将溶剂蒸干后再向蒸馏瓶中加入1mL甲醇溶解，然后用0.22μm的有机相过滤膜进行过滤，滤液用高效液相色谱进行分析测定，根据底物的标准曲线方程以及降解后测得峰面积计算降解率，结果见图8。由图8(a)可见，HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP在降解模拟废水中2,4-二氯苯酚的过程中，表现出很高的催化效率，结果表明HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP在15分钟内可实现浓度为1mmol/L的2,4-二氯苯酚完全降解，同样还可以处理高浓度的2,4-二氯苯酚。当2,4-二氯苯酚的浓度达到10mmol/L时，降解率仍可达到66.6％。图8(b)表明当浓度为10mmol/L时，反应开始2,4-二氯苯酚的降解率明显增大，在30分钟内达到最大，而30分钟后变化不大，最大降解效率约为68.9％。从图8(c)可以看出，HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP经过5次重复使用后，其相对降解效率可保持90％以上，表明HP-Zr-MOF@Fe3O4-GOx&HRP具有良好的操作稳定性和重复使用性。

Claims (8)

1.一种双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器，其特征在于：该反应器是以Zn2+或Cu2+活化后表面带正电荷的核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料为固相载体，通过Zn2+或Cu2+亲和作用同时固定葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，其中葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的摩尔比为3：1～3，所述HP-Zr-MOF的介孔孔径为6～12nm。
2.根据权利要求1所述的双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器，其特征在于：以固相载体计，所述辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的总固载量为120～170mg/g。
3.根据权利要求1或2所述的双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器，其特征在于该固定化酶反应器由下述方法制备得到：
(1)将柠檬酸修饰的Fe3O4磁性纳米粒子分散在DMF，然后加入ZrCl4、对苯二甲酸、牛血清蛋白和聚乙烯吡咯烷酮，超声20～40分钟，120℃溶剂热条件下反应40～60小时，磁性分离、洗涤、干燥，得到BSA-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料；
(2)将BSA-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料置于电阻炉中，在300～350℃下煅烧1～2小时，得到核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料；
(3)将核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料分散于氯化铜的乙醇溶液或硝酸锌的乙醇溶液中，室温振荡1.5～3小时，经磁性分离、洗涤、干燥后，置于微量热仪中，然后注入含辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的pH值为5～7的醋酸-醋酸钠缓冲液，在20～35℃下完成磁性HP-Zr-MOF共固定辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。
4.根据权利要求3所述的双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器，其特征在于：步骤(1)中，所述柠檬酸修饰的Fe3O4磁性纳米粒子与ZrCl4、对苯二甲酸、牛血清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1：2.4～3.6：3.0～4.5：0.1～0.4：1.8～3.6。
5.根据权利要求3所述的双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器，其特征在于：步骤(2)中，所述核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料中，柠檬酸修饰的Fe3O4磁性纳米粒子内核的粒径为250～300nm，其表面包覆的Zr-MOF壳层为多级孔结构，其厚度为30～50nm。
6.根据权利要求3所述的双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器，其特征在于：步骤(3)中，所述核-壳结构HP-Zr-MOF@Fe3O4磁性复合材料与氯化铜或硝酸锌、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶的配比为1mg：8×10-4～8×10-3mmol：0.05～0.15mg：0.15～0.45mg。
7.根据权利要求3所述的双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器，其特征在于：步骤(3)中，所述磁性HP-Zr-MOF共固定辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的固定化时间为2～10小时。
8.权利要求1所述的双酶共固定磁性HP-Zr-MOF反应器在催化降解有机污染物2,4-二氯苯酚中的应用。
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