CN111139232A - 磁性铜(ii)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子及其制备方法、固定漆酶的方法 - Google Patents

磁性铜(ii)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子及其制备方法、固定漆酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子及其制备方法、固定漆酶的方法，首先采用水热法制备羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子，再配位吸附Cu2+离子制备磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子，最后利用漆酶组氨酸残基与Cu(II)间的配位作用，制备高稳定性、高活性、可重复使用的磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶。与现有技术相比，本发明制备磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶操作简单，经济环保；载酶量高，固定化漆酶的催化活性高、稳定性高，且可简便地循环再使用，能够有效降低实际生产成本，具有广泛的应用前景。

Description

磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子及其制备方法、固定 漆酶的方法
技术领域
本发明属于固定化漆酶制备方法领域，具体涉及磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子及其制备方法、固定漆酶的方法。
背景技术
漆酶是一类应用广泛含铜的多酚氧化酶，它能够催化氧化各种酚类染料、取代酚、芳香胺等易氧化的化合物，在治理含酚废水和工业造纸废水等领域重要的应用价值。尽管游离漆酶在常温常压温和条件下能够高效的进行催化作用，但是漆酶是一种由氨基酸组成的蛋白质，其本身的分子结构对于外界的环境十分的敏感，一些物理因素、化学因素的变化很容易引起酶蛋白分子结构的变化致使漆酶丧失催化活性。此外漆酶易溶于反应的溶液，在使用一次之后很难从反应体系中回收分离出来，造成浪费。
为了克服游离漆酶的上述不足，人们将游离漆酶与不溶性载体联结起来，使之成为固定化漆酶，实现了漆酶的回收再利用。因此，漆酶催化技术的工业化很大程度上取决于漆酶的固定化技术的发展。
Fe3O4纳米粒子是一种重要的磁性分离材料，在环境治理、催化材料、固定化酶、生物医药等领域具有广泛应用价值。尽管已有磁性Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@MoS2@PEI等纳米粒子固定化漆酶的文献报道(Chem.Eng.J.295(2016)201-206；ACS Appl.Mater.Interfaces3(2011)237-244；Chem.Eng.J.375(2019)121947)，但目前文献报道磁性纳米粒子固定化漆酶的固载量低，漆酶在固定化过程中损失了部分催化活性，不能满足工业化生产需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子及其制备方法，制备方法简单、温和，所制备的磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子漆酶的固载量多。
本发明的另一目的在于提供一种固定漆酶的方法，利用获得高催化活性的磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶，且活性高，酶活回收率高、稳定性好，固定化漆酶可循环再利用。
本发明具体技术方案如下：
一种磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)制备羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子；
2)吸附Cu2+离子制备磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子。
进一步的，步骤1)包括以下步骤：
1-1)在搅拌条件下、氮气气氛中，向铁源溶液加入浓氨水，加热反应，制备得到Fe3O4纳米粒子悬浮液；
1-2)向步骤1-1)制备的Fe3O4纳米粒子悬浮液中加入碳源和氢氧化钠后，加热反应，制得到羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子。
进一步的，步骤1-1)中所述加热反应是指60-70℃条件下反应1-2h；再在90-100℃条件下反应1-2h。
进一步的，步骤1-1)中，浓氨水分三次加入。
更优选的，步骤1-1)中，先加所需量一半量的浓氨水，于60℃条件下反应20min后，保持60℃温度再加入四分之一量的浓氨水，于60℃条件下反应20min，再加入剩余四分之一量浓氨水后，于60℃条件下反应20-80min，最后升温到90-100℃条件下反应1-2h。
本发明方法可以使Fe3O4纳米粒子的粒径更均匀，更小，尺寸为10-100nm。
步骤1-1)中所述的铁源为Fe(II)铁源与Fe(III)铁源混合物，Fe(II)铁源与Fe(III)铁源摩尔比为1:1-2；
所述Fe(II)铁源为硫酸亚铁或氯化亚铁；所述Fe(III)铁源为硫酸铁或氯化铁。
步骤1-1)中所述浓氨水质量百分浓度28％。
步骤1-1)中所述铁源溶液浓度为0.012mol/L-0.12mol/L；制备方法为：铁源1.2-6mmol加入到50-100mL水，即得。
步骤1-2)中所述的碳源为葡萄糖或蔗糖，铁源与碳源的摩尔比为1：2-7.5；所述的碳源与氢氧化钠的摩尔比为1：15-20。
步骤1-2)中所述加热反应为：180-260℃反应12-24h。
步骤1-2)中待反应结束后，自然冷却到室温，分离收集产物，并经洗涤、干燥处理，得到羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子。
步骤2)具体为：将步骤1)制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子加入含Cu2 +溶液中反应，得到磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子，即磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子。
进一步的，步骤2)中所述反应是指25-45℃条件下反应0.5-2h。温度高、Cu2+浓度大，吸附反应速度快，更容易达到吸附平衡，但温度不能过高，否则Cu2+发生水解，Cu2+浓度过大，物理吸附量过大，需要去除物理吸附的Cu2+。
步骤2)中所述含Cu2+溶液优选为硫酸铜溶液或氯化铜溶液。
步骤2)中所述的磁性Fe3O4@C纳米粒子与Cu2+溶液中溶质的质量比为1:0.15-0.5；所述的Cu2+溶液的浓度为1-4mmol/L；
本发明提供的一种磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子，采用上述方法制备得到。
一种固定漆酶的方法，采用上述制备的得到的磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子固定。
具体固定方法为：将制备的磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子加入到漆酶溶液中，反应后，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得所述磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶。
所述反应是指于25-35℃条件下反应0.5-2h。
所述漆酶溶液活性为20U/mL。
所述的磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子与漆酶溶液的用量比为40:2-5mg/mL。
本发明所述的磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的催化活性的测定包括以下步骤：取1mmol ABTS溶于1000mL水中，配制1mmol/L ABTS水溶液；采用氧化ABTS法测定磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的催化活性。其中，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，分子式C18H24N6O6S4，简称ABTS。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明葡萄糖或蔗糖在氢氧化钠的作用下，于高温(180℃-260℃)条件下发生碳化，在碳化过程中葡萄糖或蔗糖发生不完全碳化，会残留羟基和羧基官能团。碳化温度高(或氢氧化钠量多)，碳化速度快，需要时间短，残留官能团少，引起吸附Cu2+少，固定化漆酶量少、活性低；碳化温度低(或氢氧化钠量少)，碳化速度慢，需要时间长，残留官能团多，造成四氧化三铁外面的碳层薄且不稳定，引起吸附Cu2+少，固定化漆酶量少、活性低。因此，本发明设计180℃-260℃条件、铁源与碳源的摩尔比为1：2-7.5；碳源与氢氧化钠的摩尔比为1：15-20的用量比。
本发明首先采用水热法制备羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子，采用本发明方法制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子更小，表面官能团数量多，有利于漆酶的固定化，再配位吸附Cu2+离子制备磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子，最后利用漆酶组氨酸残基与Cu(II)间的配位作用，制备高稳定性、高活性、可重复使用的磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶。本发明制备磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶操作简单，经济环保；磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子的载酶量高，固定化漆酶的催化活性高、稳定性高，且可简便地循环再使用，能够有效降低实际生产成本，具有广泛的应用前景。
与现有技术相比，本发明有益效果如下：
1.磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子制备方法简单，产率高，经济环保；
2.磁性Fe3O4@C纳米粒子的粒径小，且表面具有丰富的羟基和羧基，可直接应用于Cu2+螯合；
3.磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子在固定化过程中能稳定漆酶的蛋白结构，固定漆酶的反应条件温和，因而所得到的磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的活性高，固定化过程中酶活回收率可达75.3％-113.4％；
4.磁性Fe3O4@C纳米粒子表面螯合的Cu2+可与漆酶残余的组氨酸配位，固定大量漆酶，其蛋白质的固载量高达273-515mg/g；
5.磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子与漆酶分子间的强配位键能够提高漆酶的稳定性，使得固定化漆酶重复使用多次后任能保持较高催化活性；
6.磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶具有磁响应性，可借助外磁场从反应体系中快速简便地富集、分离、回收磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶，可有效降低实际生产成本，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例1所制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子的透射电子显微镜检测图；有图1可知实施例1所制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子为15-25nm；
图2为实施例1所制备的产物的X-射线粉末衍射检测图；在图2中，横坐标为衍射角2θ(°)，纵坐标为强度Intensity(a.u.)；经过与标准图谱(JCPDS:77-1545)进行对照，产物衍射峰位于18.3°、30.1°、35.5°、43.1°、53.6°、57.0°、62.7°、71.0°、74.2°、79.0°，分别对应于立方相四氧化三铁的衍射峰(111)，(220)，(311)，(400)，(422)，(511)，(440)，(620)，(533)，(444)；
图3为实施例1所制备的产物的红外光谱图，在图3中，横坐标为波数Wavelength/cm-1，纵坐标为透光率％Transmittance；由红外光谱表征确定了产物表面的羟基和羧基；3340cm-1和896cm-1处两个吸收峰为羟基的伸缩和弯曲振动峰，2922cm-1和2854cm-1处吸收峰归属为-CH2伸缩振动峰，1559cm-1和1402cm-1处吸收峰为羧基中的C＝O伸缩振动峰1085cm-1和573cm-1处吸收峰为四氧化三铁特征吸收峰；
图4为实施例1制备的产物的磁滞回线图，在图4中，横坐标为磁场强度H(Oe)，纵坐标为饱和磁化强度M(emu/g)，由图可知饱和磁化强度为73.8emu/g，矫顽力为51.5Oe，得知此磁性碳材料具有磁性；
图5为实施例1所制备的磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶和游离漆酶的热稳定性对比图；在图5中，横坐标为时间Time(h)，纵坐标为相对活性Relativeactivity(％)；固定化漆酶和游离漆酶均在60℃环境中保持相同时间(1-10h)；
图6为实施例1所制备的磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶和游离漆酶的抗有机物污染性能对比图；在图6中，横坐标为有机溶剂Organic solvents，纵坐标为相对活性Relative activity(％)；固定化漆酶和游离漆酶均在有机溶剂中于25℃条件下保存2h；
图7为实施例1所制备的磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的循环使用效果图；在图7中，横坐标为循环次数Number of cycles，纵坐标为相对活性Relativeactivity(％)；
图8为实施例2所制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子的透射电子显微镜检测图，有图8可知实施例2所制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子为60-80nm；
图9为实施例3所制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子的透射电子显微镜检测图，有图9可知实施例3所制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子为13-21nm；
图10为实施例4所制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子的透射电子显微镜检测图，有图10可知实施例4所制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子为18-22nm。
具体实施方式
通过下述实施例可以进一步理解本发明，但不能限制本发明的内容。
实施例1
一种磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)制备羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子的操作过程如下：
1-1)在三颈烧瓶中，将0.4mmol氯化亚铁与0.8mmol氯化铁溶解在50mL水中，并在搅拌、氮气气氛中加入4mL浓氨水(28％质量百分浓度)，4mL浓氨水分3次添加；先加2mL浓氨水，于60℃条件下反应20min后，再在60℃温度条件下加入1mL浓氨水，于60℃条件下反应20min，再加入1mL浓氨水后，于60℃条件下反应20min，最后升温到90℃条件下反应1h，制备Fe3O4纳米粒子悬浮液，冷却至室温；
1-2)向上述Fe3O4纳米粒子悬浮液中加入9mmol葡萄糖和180mmol氢氧化钠后，再转移到热压反应釜中，旋紧热压反应釜，于200℃反应18h；待反应结束后，自然冷却到室温，磁分离收集产物，用水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，于60℃真空干燥0.5h，即可得到羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子。产品经X射线衍射、透射电子显微镜、超导量子干涉仪、傅立叶变换红外光谱仪表征，如图1-图4所示，证实产物为羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子，所制备的磁性Fe3O4@C纳米粒子更小，表面官能团数量多，有利于漆酶的固定化。
2)磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的操作过程如下：
取4mg上述方法制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子加入到4mL 2mmol/L硫酸铜溶液中，于30℃条件下反应1h，所得产品经磁分离、用水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，于60℃真空干燥0.5h，即可得到磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子；
一种固定漆酶的方法，具体为：
1)在10L全自动通风发酵罐中装7L发酵培养基，接种栓菌属真菌，接种量为10％，通过调节转速、罐压和通气量将溶氧控制在30％左右。整个发酵过程不控制pH并在发酵10d结束。发酵结束后使用4层纱布过滤去除发酵液中的菌丝体等大型固形物，过滤液在4℃、5000r/min条件下离心30min，收集上清液，制备粗漆酶溶液，活性为200U/mL，稀释10倍后再使用；
2)将实施例1制备的4mg磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子超声分散到1mL水中，再加入0.4mL稀释后的粗漆酶液，于30℃条件下反应1h，所得产品经磁分离、水洗涤3次，即可获得磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶。
测定磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的催化活性的操作过程如下：
步骤1)称取1mmol的ABTS溶解于1L水中，配制1mmol/L的ABTS水溶液，至于4℃冰箱中保存备用；
步骤2)用Bradford法测定磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定牛血清白蛋白的量，用氧化ABTS法测定磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的催化活性。将固定化漆酶(或游离漆酶)分别置于60℃保存相同时间，再用氧化ABTS法测定酶活，研究固定化漆酶的热稳定性；将固定化漆酶(或游离漆酶)分别置于不同有机溶剂中保存2h，再用氧化ABTS法测定酶活，研究固定化漆酶的抗有机物污染能力；从反应液中回收固定化漆酶并测定酶活，研究磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的循环利用情况。
检测所述漆酶在磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子上的固载量为436mg/g；所述的固定化漆酶的酶活为1646U/g；所述的固定化漆酶的酶活回收率为82.3％；在60℃条件下放置10h后，所述的固定化漆酶的活性仍能保持80％，是游离酶的1.2倍(见图5)；在甲醇或乙醇或丙酮或二甲亚砜或乙腈溶液中放置2h后，所述的固定化漆酶的活性能保持92.6％、93.7％、82.3％、94.4％、95.2％，是游离酶的1.1-1.3倍(见图6)；所述的固定化漆酶循环使用10次后，磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的活性仍能保持61％(见图7)。
实施例2
一种磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)制备羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子的操作过程如下：
1-1)在三颈烧瓶中，将3mmol氯化亚铁与3mmol氯化铁溶解在100mL水中，并在搅拌、氮气气氛中加入4mL浓氨水(28％质量百分浓度)，4mL浓氨水分3次添加；先加2mL浓氨水，于70℃条件下反应20min后，再在70℃温度条件下加入1mL浓氨水，于70℃条件下反应20min，再加入1mL浓氨水后，于70℃条件下反应80min，最后升温到100℃条件下反应2h，制备Fe3O4纳米粒子悬浮液，冷却至室温；
1-2)向上述Fe3O4纳米粒子悬浮液中加入12mmol蔗糖和180mmol氢氧化钠后，再转移到热压反应釜中，旋紧热压反应釜，于260℃反应12h；待反应结束后，自然冷却到室温，磁分离收集产物，用水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，于60℃真空干燥0.5h，即可得到羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子。
2)取4mg羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子加入到5mL 1mmol/L硫酸铜溶液中，于25℃条件下反应2h，所得产品经磁分离、用水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，于60℃真空干燥0.5h，即可得到磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子；
一种固定漆酶的方法，具体为：
1)制备粗漆酶溶液，活性为200U/mL，稀释10倍后再使用；
2)将上述磁性4mgCu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子超声分散到1mL水中，再加入0.2mL稀释后的粗漆酶液，于25℃条件下反应2h，所得产品经磁分离、水洗涤3次，即可获得所述磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶。
磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的催化活性的测定同实施例1：
检测所述漆酶在磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子上的固载量为273mg/g；所述的固定化漆酶的酶活为1134U/g；所述的固定化漆酶的酶活回收率为113.4％；在60℃条件下放置10h后，所述的固定化漆酶的活性仍能保持83％，是游离酶的1.25倍；所述的固定化漆酶循环使用10次后，磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的活性仍能保持73％。
实施例3
一种磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)制备羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子的操作过程如下：
1-1)在三颈烧瓶中，将0.4mmol氯化亚铁与0.8mmol氯化铁溶解在50mL水中，并在搅拌、氮气气氛中加入4mL浓氨水(28％质量百分浓度)，4mL浓氨水分3次添加；先加2mL浓氨水，于60℃条件下反应20min后，再在60℃温度条件下加入1mL浓氨水，于60℃条件下反应20min，再加入1mL浓氨水后，于60℃条件下反应20min，最后升温到90℃条件下反应1h，制备Fe3O4纳米粒子悬浮液，冷却至室温；
1-2)向上述Fe3O4纳米粒子悬浮液中加入9mmol葡萄糖和180mmol氢氧化钠后，再转移到热压反应釜中，旋紧热压反应釜，于180℃反应24h；待反应结束后，自然冷却到室温，磁分离收集产物，用水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，于60℃真空干燥0.5h，即可得到羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子。
2)取4mg上述制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子加入到5mL 2.5mmol/L硫酸铜溶液中，于45℃条件下反应0.5h，所得产品经磁所得产品经磁分离、用水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，于60℃真空干燥0.5h，即可得到磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子；
一种固定漆酶的方法，具体为：
1)采用摇瓶发酵法制备粗漆酶溶液(粗漆酶溶液活性为200U/mL)，稀释10倍后再使用；
2)将实施例3制备的4mg磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子超声分散到1mL水中，再加入0.5mL稀释后的粗漆酶液，于35℃条件下反应0.5h，所得产品经磁分离、水洗涤4次，即可获得所述磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶。
磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的催化活性的测定同实施例1：
检测所述漆酶在磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子上的固载量为515mg/g；所述的固定化漆酶的酶活为1883U/g；所述的固定化漆酶的酶活回收率为75.3％；在60℃条件下放置10h后，所述的固定化漆酶的活性仍能保持78％；所述的固定化漆酶循环使用10次后，磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的活性仍能保持57％。
实施例4
一种磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)制备羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子的操作过程如下：
1-1)在三颈烧瓶中，将0.4mmol氯化亚铁与0.8mmol氯化铁溶解在50mL水中，并在搅拌、氮气气氛中加入4mL浓氨水(28％质量百分浓度)，4mL浓氨水分3次添加；先加2mL浓氨水，于60℃条件下反应20min后，再在60℃温度条件下加入1mL浓氨水，于60℃条件下反应20min，再加入1mL浓氨水后，于60℃条件下反应20min，最后升温到90℃条件下反应1h，制备Fe3O4纳米粒子悬浮液，冷却至室温；
1-2)向上述Fe3O4纳米粒子悬浮液中加入9mmol葡萄糖和180mmol氢氧化钠后，再转移到热压反应釜中，旋紧热压反应釜，于240℃反应20h；待反应结束后，自然冷却到室温，磁分离收集产物，用水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，于60℃真空干燥0.5h，即可得到羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子。
2)取4mg上述制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子加入到3mL 4mmol/L硫酸铜溶液中，于35℃条件下反应1h，所得产品经磁分离、用水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，于60℃真空干燥0.5h，即可得到磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子；
一种固定漆酶的方法，具体为：
1)采用摇瓶发酵法制备粗漆酶溶液(粗漆酶溶液活性为200U/mL)，稀释10倍后再使用；
2)将上述4mg磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子超声分散到1mL水中，再加入0.3mL稀释后的粗漆酶液，于35℃条件下反应0.5h，所得产品经磁分离、水洗涤3次，即可获得所述磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶。
磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的催化活性的测定同实施例1：
检测所述漆酶在磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子上的固载量为358mg/g；所述的固定化漆酶的酶活为1534U/g；所述的固定化漆酶的酶活回收率为102.3％；在60℃条件下放置10h后，所述的固定化漆酶的活性仍能保持81％；所述的固定化漆酶循环使用10次后，磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶的活性仍能保持65％。

Claims (10)

1.一种磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)制备羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子；
2)吸附Cu2+离子制备磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)包括以下步骤：
1-1)在搅拌条件下、氮气气氛中，向铁源溶液加入浓氨水，加热反应，制备得到Fe3O4纳米粒子悬浮液；
1-2)向步骤1-1)制备的Fe3O4纳米粒子悬浮液中加入碳源和氢氧化钠后，加热反应，制得到羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1-1)中所述的铁源为Fe(II)铁源与Fe(III)铁源混合物，Fe(II)铁源与Fe(III)铁源摩尔比为1:1-2。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，铁源与碳源的摩尔比为1：2-7.5；所述的碳源与氢氧化钠的摩尔比为1：15-20。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤1-2)中所述加热反应为：180-260℃反应12-24h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：将步骤1)制备的羟基/羧基官能化磁性Fe3O4@C纳米粒子加入含Cu2+溶液中反应，得到磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的磁性Fe3O4@C纳米粒子与Cu2+溶液中溶质的质量比为1:0.15-0.5。
8.一种权利要求1-7任一项所述制备方法制备得到的磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子。
9.一种固定漆酶的方法，其特征在于，利用权利要求1-7任一项所述制备方法制备得到的磁性铜(II)螯合四氧化三铁@碳纳米粒子固定。
10.根据权利要求9所述的固定漆酶的方法，其特征在于，具体固定方法为：将制备的磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子加入到粗漆酶溶液中，反应后，所得产品经磁分离、洗涤，即可获得所述磁性Cu(II)螯合Fe3O4@C纳米粒子固定化漆酶。
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