CN113151249A - 一种高稳定磁性固定化漆酶及其制备方法、一种高效降解染料的方法 - Google Patents

一种高稳定磁性固定化漆酶及其制备方法、一种高效降解染料的方法 Download PDF

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CN113151249A CN202110534228.9A CN202110534228A CN113151249A CN 113151249 A CN113151249 A CN 113151249A CN 202110534228 A CN202110534228 A CN 202110534228A CN 113151249 A CN113151249 A CN 113151249A
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Abstract

本发明提供了一种高稳定磁性固定化漆酶及其制备方法、一种高效降解染料的方法，首先采用溶剂热法合成磁性Fe3O4纳米粒子，然后将磁性纳米粒子用氨基官能团功能化，最后通过双功能试剂戊二醛进行交联制备出高活性、高稳定性、高重复利用性的磁性固定化漆酶。与现有技术相比，本发明制备的磁性固定化漆酶操作简单、经济环保、原子利用率高、绿色无污染；磁性固定化漆酶具备持续稳定的催化能力、简便可重复利用性以及绿色可持续性，大大降低生产成本，使其在催化氧化、水体治理、环境修复等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种高稳定磁性固定化漆酶及其制备方法、一种高效降解染 料的方法
技术领域
本发明属于染料降解领域，具体涉及一种高稳定磁性固定化漆酶及其制备方法、一种高效降解染料的方法。
背景技术
漆酶(E.C.1.10.3.2)，属于多铜氧化酶。漆酶表现出低特异性，宽底物范围，例如酚类化合物、二胺、芳族胺、N-杂环、吩噻嗪、硫醇基等，均可以用作漆酶的还原底物，并且漆酶催化氧化唯一副产物是水，绿色环保，故而漆酶的研究引起科学家浓厚兴趣。但漆酶的大规模应用还存在需要克服的困难，酶蛋白的活性受环境影响较大，外部物理化学环境的改变极大程度改变漆酶活性，甚至变性失活；而漆酶回收利用的问题依然是极大的挑战。
为解决游离漆酶存在的局限性，人们将游离酶与不溶于水的物质通过物理或化学方法联结在一起，制备固定化漆酶。但固定化漆酶的环境耐受性差依然是尚未解决的难题。
磁性纳米粒子是具有良好磁响应能力的材料，通过外加磁场就能很容易的实现产品的富集分离，并且磁性纳米粒子具有良好的生物相容性，在固定化漆酶方面有广阔的应用前景。目前已报道各种磁性固定化酶如Fe3O4/SBA-15、 Fe3O4@MIL-100(Fe)、Fe3O4@SiO2(J.Oleo Sci.63,(10)1027-1034(2014)； Catalysts 2019,9,850(2019)；Microporousand Mesoporous Materials 197(2014) 1-7)，但目前报道文献中漆酶在固定过程中损失大量酶活，不能在工业生产中大规模推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种高稳定磁性固定化漆酶及其制备方法；制备方法简便，条件温和，效果明显，回收率高，稳定性好等优点，并且可在较酸环境中高效发挥作用。
本发明还有一个目的在于提供一种高效降解染料的方法，利用高稳定磁性固定化漆酶处理。
本发明具体技术方案如下：
一种高稳定磁性固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：
1)制备磁性Fe3O4纳米粒子；
2)制备氨基化磁性Fe3O4纳米粒子；
3)制备双功能化磁性Fe3O4纳米粒子；
4)高稳定磁性固定化漆酶。
步骤1)具体为：向铁源、醋酸钠中加入多元醇和聚乙二醇，高温下反应，洗涤，分离得磁性Fe3O4纳米粒子；
进一步的，步骤1)中铁源为氯化铁或硫酸铁，所述多元醇为乙二醇；所述聚乙二醇为PEG-200；
步骤1-1)中所述铁源与醋酸钠摩尔比为1：(5-12)；
所述乙二醇与聚乙二醇体积比为30-40:1-1.5；
步骤1)中所述高温下反应指在160℃-240℃下反应6-20h；
步骤1)中所述铁源浓度为0.05-0.15mol/L；
步骤2)具体为：
将磁性Fe3O4纳米粒子分散于溶剂中，加入硅烷偶联剂，高温下反应，洗涤，分离得氨基化磁性Fe3O4纳米粒子，即官能团化磁性纳米粒子Fe3O4-NH2；
步骤2)中所述磁性Fe3O4纳米粒子与硅烷偶联剂质量比为1：(2-12)。
步骤2)中所述溶剂为蒸馏水或去离子水；
步骤2)中所述硅烷偶联剂为含氨基官能团的硅烷偶联剂；优选为3-氨丙基三乙氧基硅烷；
步骤2)中所述高温下反应指在100-140℃下反应20-28h；
步骤3)具体为：将氨基化磁性Fe3O4纳米粒子分散于双功能试剂溶液中，培养，洗涤，分离得双功能化磁性Fe3O4纳米粒子；
步骤3)中所述双功能试剂为二醛类双功能试剂；优选为戊二醛；双功能试剂溶液浓度为2-3wt％；
步骤3)中所述培养方法为：在20-40℃下搅拌背光培养2-6h；
步骤3)中双功能试剂溶液中的双功能试剂与制备氨基化磁性Fe3O4纳米粒子所用的磁性Fe3O4纳米粒子的质量比为(1-8)：1。
步骤4)具体为：将双功能化磁性Fe3O4纳米粒子分散于溶剂中，加入漆酶溶液，培养，洗涤，分离得磁性Fe3O4固定酶。
进一步的，步骤4)中所述溶剂为蒸馏水或去离子水；
步骤4)中所述漆酶活性为8.8U/mL；步骤4)中所述漆酶溶液的浓度为0.07 mg/ml；
步骤4)中所述培养方法为：在20-40℃下搅拌背光培养1-4h；
步骤4)中所述漆酶溶液中所含漆酶与制备双功能化磁性Fe3O4纳米粒子所用的磁性Fe3O4纳米粒子的质量比为(0.001-0.008)：1。
本发明先用3-氨丙基三乙氧基硅烷将磁性Fe3O4纳米粒子官能团化修饰氨基 (-NH2)，再用双功能试剂戊二醛共价结合磁性Fe3O4纳米粒子，最后，通过共价结合方式将漆酶固定于氨基化磁性Fe3O4纳米粒子表面。
本发明所述磁性Fe3O4固定酶活性测试步骤包括如下：量取1mmol愈创木酚蒸馏水定容至1L，配制1mmol/L愈创木酚溶液；采用氧化愈创木酚法测定磁性 Fe3O4固定酶活性。愈创木酚分子式：C7H8O2。
本发明提供的一种高效降解染料的方法，具体为：
将高稳定磁性固定化漆酶分散于染料中；加入ABTS，反应。
所述反应优选为振荡反应；于30-70℃下反应10min-90min；振荡速度 600-900rmp。
所述染料为三苯甲烷类、蒽醌类或偶氮类；染料浓度为5mg/L～200mg/L；
所述三苯甲烷类染料为孔雀石绿；偶氮类染料为偶氮荧光桃红；蒽醌类染料为亮蓝；
优选的，上述染料浓度为：孔雀石绿200mg/L、偶氮荧光桃红50mg/L、亮蓝100mg/L；
高稳定磁性固定化漆酶质量与染料体积比例为1：(0.38～0.42)mg/mL；介体ABTS在体系中浓度为0.025mM～0.05mM。
所述的ABTS为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐。
优选的，高效降解不同染料的方法：
高效降解三苯甲烷类染料，具体过程如下：
取10mg高稳定磁性固定化漆酶，加入50℃预热的3.9mL pH 3.0三苯甲烷类染料溶液，加入100μL 1mmol/L ABTS溶液，置于50℃混匀仪中混匀反应，反应 60min后磁分离即可。
高效降解偶氮类染料，具体过程如下：
取10mg高稳定磁性固定化漆酶，加入50℃预热的3.9mL pH 3.0偶氮类染料溶液，加入100μL 1mmol/L ABTS溶液，置于50℃混匀仪中混匀反应，反应15min 后磁分离即可。
高效降解蒽醌类染料，具体过程如下：
取10mg高稳定磁性固定化漆酶，加入50℃预热的3.9mL pH 3.0蒽醌类染料溶液，加入100μL 1mmol/L ABTS溶液，置于50℃混匀仪中混匀反应，反应60min 后磁分离即可。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明采用溶剂热法一步制备出磁性Fe3O4纳米粒子，然后通过加热方式在磁性纳米粒子表面修饰氨基官能团，得到氨基化磁性Fe3O4纳米粒子。本发明制备磁性Fe3O4纳米粒子反应温度为160-240℃；磁性Fe3O4纳米粒子与硅烷偶联剂质量比为1：(2-12)。本发明制备出的氨基化磁性Fe3O4纳米粒子为空心结构，粒径约为100nm-200nm。硅烷偶联剂的用量影响后续固定酶活性，硅烷偶联剂过量导致共价结合反应空间受阻，漆酶固载量变少，活性降低。
本发明采用共价固定方式制备磁性Fe3O4固定酶：首先将磁性Fe3O4纳米粒子用双功能试剂进行交联，然后经过洗涤后与漆酶进行固定。双功能试剂用量和浓度对固定酶酶活起到决定性作用，本发明使用戊二醛为双功能试剂，戊二醛本身具有杀菌效果，所以本发明将戊二醛浓度控制在所述范围内，以免影响酶活性。
本发明首先采用溶剂热法合成磁性Fe3O4纳米粒子，然后将磁性纳米粒子用氨基官能团功能化，最后通过双功能试剂戊二醛进行交联制备出高活性、高稳定性、高重复利用性的磁性固定化漆酶。与现有技术相比，本发明制备的磁性固定化漆酶操作简单、经济环保、原子利用率高、绿色无污染；磁性固定化漆酶具备持续稳定的催化能力、简便可重复利用性以及绿色可持续性，大大降低生产成本，使其在催化氧化、水体治理、环境修复等领域具有广阔的应用前景。
与现有技术相比，本发明有益效果如下：
(一)磁性Fe3O4纳米粒子及氨基官能化制备方法简单，过程绿色环保，原料利用率高；
(二)通过溶剂热法制备表面富含羟基的磁性Fe3O4纳米粒子，增强其亲水性，提升磁性纳米粒子的分散度。
(三)采用水相中连接硅烷偶联剂，使硅烷偶联剂在磁性Fe3O4纳米粒子表面多层包覆，丰富了氨基官能团，增加漆酶固载量。
(四)磁性Fe3O4纳米粒子表面富含氨基官能团，可直接用于共价固定漆酶；
(五)氨基化磁性Fe3O4纳米粒子固定漆酶过程温和，常温常压下进行，利于酶蛋白的活性保留，固定化过程中酶活回收率可达65％-90.8％；
(六)官能化的磁性Fe3O4纳米粒子通过双功能试剂共价固定漆酶，固载量为 1-6mg/g，实现低负载量酶的高酶活表达；
(七)由于磁性Fe3O4纳米粒子的保护作用，并且磁性Fe3O4固定酶通过共价固定的方式固定化漆酶，所以漆酶与磁性载体之间是化学键链接的强相互作用，固定酶展现出极佳的稳定性、重复性、环境耐受性；
(八)本发明制备的磁性Fe3O4固定酶使漆酶耐热性提升至114％，耐酸性提升至125％，有机物抗性提升至156％，金属离子耐受性提升至184％，蛋白质抑制剂抗性提升40多倍，均高于现有技术制备的固定化漆酶。
(九)相比于目前技术，本发明制备的磁性Fe3O4固定酶降解染料效率提升至431％，并且以更少的酶使用量来实现。
(十)磁性Fe3O4固定酶具有超强的磁响应，在外加磁场下可以从水体中迅速分离富集，极大节约能源、降低生产成本，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1所制备的氨基化磁性Fe3O4纳米粒子透射电子显微镜检测图；由图1可知实施例1所制备的氨基化磁性Fe3O4纳米粒子粒径大约为114-123nm；
图2为实施例1所制备的氨基化磁性Fe3O4纳米粒子X-射线粉末衍射检测图；在图2中，横坐标为衍射角2θ(°)，纵坐标强度Intensity(a.u.)；经过与标准图谱进行对照，产物衍射峰位于18.3°、30.1°、35.5°、43.1°、53.6°、57.0°、62.7°、71.0°、 74.2°、79.0°，分别对应立方相四氧化三铁衍射峰(111)，(220)，(311)，(400)， (422)，(511)，(440)，(620)，(533)，(444)；
图3为实施例1所制备的磁性Fe3O4固定酶以及游离酶的热稳定性对比图；在图3中，横坐标为时间Time(h)，纵坐标为相对活性Relative activity(％)；固定酶和游离酶均在60℃环境中保持相同时间(1-10h)；
图4为实施例1所制备的磁性Fe3O4固定酶以及游离酶的抗有机物污染能力对比图；在图4中，横坐标为有机溶剂Organic solvents，纵坐标为相对活性Relative activity(％)；固定酶和游离酶均在有机溶剂中于25℃条件下保存2h；
图5为实施例1所制备的磁性Fe3O4固定酶循环使用效果图；在图5中，横坐标为循环次数Number of cycles，纵坐标为相对活性Relative activity(％)；
图6为实施例1所制备的磁性Fe3O4固定酶重复降解孔雀石绿、偶氮荧光桃红、亮蓝染料的效果图；在图6中，横坐标为循环降解次数Number of cycles，纵坐标为降解率Degradation(％)；
图7为实施例2所制备的磁性Fe3O4纳米粒子透射电子显微镜检测图；由图7 可知实施例2所制备的磁性Fe3O4纳米粒子粒径大约为120-135nm；
图8为实施例3所制备的磁性Fe3O4纳米粒子透射电子显微镜检测图；由图8 可知实施例3所制备的磁性Fe3O4纳米粒子粒径大约为102-118nm；
图9为实施例4所制备的磁性Fe3O4纳米粒子透射电子显微镜检测图；由图9 可知实施例4所制备的磁性Fe3O4纳米粒子粒径大约为110-160nm。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
一种高稳定磁性固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：
1)制备磁性Fe3O4纳米粒子及氨基官能化的操作过程如下：
1-1)称取1.35g FeCl3·6H2O，3.6g NaAc·3H2O置于聚四氟乙烯内衬中，加入40mL乙二醇、1mL PEG-200，搅拌均匀，得到黄色乳液，将反应釜于190℃下反应10h，冷却至室温；产品用乙醇洗涤1次，蒸馏水洗涤2次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子；
1-2)将1-1)制备Fe3O4纳米粒子分散于60mL蒸馏水中，加入3mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，通保护气氩气升温至140℃回流23h，蒸馏水洗涤1次，分离即可得氨基化磁性Fe3O4纳米粒子。
2)氨基化磁性Fe3O4纳米粒子固定化漆酶的操作过程如下：
2-1)将制得的氨基化磁性Fe3O4纳米粒子分散至50mL 2％戊二醛水溶液(w/w)中；32℃下水浴搅拌背光反应3h，结束后蒸馏水洗涤1次，分离即可得双功能试剂修饰的磁性Fe3O4纳米粒子；
2-2)将制得的双功能修饰的磁性Fe3O4纳米粒子分散至50mL蒸馏水中，加入17mL漆酶溶液，漆酶溶液的浓度为0.07mg/ml；所述漆酶活性为8.8U/mL； 34℃下水浴搅拌背光反应2h，蒸馏水洗涤一次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子固定化酶；
测定磁性Fe3O4固定酶催化活性的操作步骤如下：
1)称取1mmol的愈创木酚溶解于1L蒸馏水中，配制1mmol/L的愈创木酚水溶液，置于4℃冰箱中保存备用；
2)用Bradford法测定磁性Fe3O4纳米粒子固定漆酶的量，用氧化愈创木酚法测定磁性Fe3O4纳米粒子固定化漆酶的催化活性。将磁性固定化漆酶(或游离酶) 分别置于60℃保存相同时间，再用氧化愈创木酚法测定酶活，研究固定化漆酶 (或游离酶)的热稳定性；将固定化漆酶(或游离酶)分别置于不同有机溶剂中保存2h，再用氧化愈创木酚法测定酶活，研究固定化漆酶(或游离酶)的抗有机物污染能力；从反应液中回收固定化漆酶并用氧化愈创木酚法测定酶活，研究磁性固定化酶的循环利用情况。
测定磁性Fe3O4固定酶高效降解染料的操作步骤如下：
1)取10mg磁性Fe3O4固定酶，加入3.9mL不同类型染料(染料分别为200mg/L 孔雀石绿、50mg/L偶氮桃红、100mg/L亮蓝)，再加入0.1mL 1mmol/L ABTS，在不同时间间隔内通过紫外分光光度计测试每种染料在特定波长的吸光度，研究固定酶降解染料的动力学；
2)高效降解三苯甲烷类染料，具体过程如下：
取10mg高稳定磁性固定化漆酶，加入50℃预热的3.9mL pH 3.0三苯甲烷类孔雀石绿染料溶液，加入100μL 1mmol/L ABTS溶液，置于50℃混匀仪中混匀反应，700rmp振荡速率下反应60min后磁分离即可。
高效降解偶氮类染料，具体过程如下：
取10mg高稳定磁性固定化漆酶，加入50℃预热的3.9mL pH 3.0偶氮类荧光桃红染料溶液，加入100μL 1mmol/L ABTS溶液，置于50℃混匀仪中混匀反应，700rmp振荡速率下反应15min后磁分离即可。
高效降解蒽醌类染料，具体过程如下：
取10mg高稳定磁性固定化漆酶，加入50℃预热的3.9mL pH 3.0蒽醌类亮蓝染料溶液，加入100μL 1mmol/L ABTS溶液，置于50℃混匀仪中混匀反应，700rmp 振荡速率下反应60min后磁分离即可。
检测所述漆酶在磁性Fe3O4纳米粒子固载量为3.11mg/g；所述的磁性Fe3O4固定酶的酶活回收率为80.8％；所述的磁性Fe3O4固定酶的酶活为155.8U/g；所述磁性Fe3O4固定酶在60℃条件下放置10h后，固定酶酶活仍能保持71.3％，相比于游离酶提升至114％(如图3)；所述磁性Fe3O4固定酶混合不同pH缓冲液在30℃条件下放置2h后，固定酶在pH 2.3缓冲液中酶活仍能保持90.8％，相比于游离酶提升至125％；所述磁性Fe3O4固定酶与不同有机物1:1(w/w)混合于30℃条件下放置2h后，固定酶在丙酮中有95.7％相对活性保留，相比于游离酶提升至156％(如图4)；所述磁性Fe3O4固定酶与金属离子混合于30℃条件下放置2h后，固定酶在 Fe3+溶液中有82.0％相对活性保留，相比于游离酶提升至184％；所述磁性Fe3O4固定酶与蛋白质抑制剂混合于30℃条件下放置2h后，固定酶于乙二胺中仍有 60.4％相对活性保留，相比较于游离酶提升40余倍；所述的磁性Fe3O4固定酶循环使用10次后，仍然有59.3％相对活性保留(如图5)。
检测所述的磁性ZnFe2O4固定化漆酶5min对200mg/L孔雀石绿、50mg/L偶氮桃红、100mg/L亮蓝的降解率分别为54.6％、78.4％、53.2％，并分别于60min、15min、60min后趋于降解终点所述的磁性Fe3O4固定化漆酶分别对200mg/L孔雀石绿、50mg/L偶氮桃红、100mg/L亮蓝的降解率为98.9％、91.6％、82.4％，循环降解10次后，磁性Fe3O4固定化漆酶对孔雀石绿、偶氮桃红、亮蓝的降解率分别为86.8％、82.8％、68.7％(如图6)；
实施例2
一种高稳定磁性固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：
1)制备氨基化磁性Fe3O4纳米粒子的操作过程如下：
1-1)称取1.35g FeCl3·6H2O，3.6g NaAc·3H2O置于聚四氟乙烯内衬中，加入40mL乙二醇、1mL PEG-200，搅拌均匀，得到黄色乳液，将反应釜于220℃下反应10h，冷却至室温；产品用乙醇洗涤1次，蒸馏水洗涤2次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子；
1-2)将1-1)制备Fe3O4纳米粒子分散于60mL蒸馏水中，加入3mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，通保护气氩气升温至130℃回流20h，蒸馏水洗涤1次，分离即可得氨基化磁性Fe3O4纳米粒子。
2)固定化漆酶的操作过程如下：
2-1)将制得的氨基化磁性Fe3O4纳米粒子分散至50mL 2％戊二醛水溶液 (w/w)中，28℃下水浴搅拌背光反应4h，结束后蒸馏水洗涤1次，分离即可得双功能试剂修饰的磁性Fe3O4纳米粒子；
2-2)将制得的双功能修饰的磁性Fe3O4纳米粒子分散至50mL蒸馏水中，加入10mL漆酶，漆酶溶液的浓度为0.07mg/ml；所述漆酶活性为8.8U/mL；35℃下水浴搅拌背光反应3h，蒸馏水洗涤一次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子固定化酶；
测定磁性Fe3O4固定酶催化活性的操作步骤同实施例1；
测定磁性Fe3O4固定酶高效降解染料的操作步骤同实施例1；
检测所述漆酶在磁性Fe3O4纳米粒子固载量为2.88mg/g；所述的磁性Fe3O4固定酶的酶活回收率为71.2％；所述的磁性Fe3O4固定酶的酶活为110.2U/g；
检测所述的磁性Fe3O4固定化漆酶对孔雀石绿降解率为98.3％；所述的磁性 Fe3O4固定化漆酶循环使用10次后对孔雀石绿降解率为78.6％。
实施例3
一种高稳定磁性固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：
1)制备氨基化磁性Fe3O4纳米粒子的操作过程如下：
1-1)称取1.35g FeCl3·6H2O，3.6g NaAc·3H2O置于聚四氟乙烯内衬中，加入40mL乙二醇、1mL PEG-200，搅拌均匀，得到黄色乳液，将反应釜于160℃下反应19h，冷却至室温；产品用乙醇洗涤1次，蒸馏水洗涤2次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子；
1-2)将1-1)制备Fe3O4纳米粒子分散于60mL蒸馏水中，加入3mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，通保护气氩气升温至120℃回流26h，蒸馏水洗涤1次，分离即可得氨基化磁性Fe3O4纳米粒子。
2)固定化漆酶的操作过程如下：
2-1)将制得的氨基化磁性Fe3O4纳米粒子分散至50mL 2％戊二醛水溶液 (w/w)中，32℃下水浴搅拌5h，结束后蒸馏水洗涤1次，分离即可得双功能试剂修饰的磁性Fe3O4纳米粒子；
2-2)将制得的双功能修饰的磁性Fe3O4纳米粒子分散至50mL蒸馏水中，加入10mL漆酶，漆酶溶液的浓度为0.07mg/ml；所述漆酶活性为8.8U/mL；32℃下水浴搅拌3h，蒸馏水洗涤一次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子固定化酶；
测定磁性Fe3O4固定酶催化活性的操作步骤同实施例1：
测定磁性Fe3O4固定酶高效降解染料的操作步骤同实施例1：
检测所述漆酶在磁性Fe3O4纳米粒子固载量为1.67mg/g；所述的磁性Fe3O4固定酶的酶活回收率为65.5％；所述的磁性Fe3O4固定酶的酶活为90.3U/g；
检测所述的磁性Fe3O4固定化漆酶对孔雀石绿降解率为89.1％；所述的磁性 Fe3O4固定化漆酶循环使用10次后对孔雀石绿降解率为74.8％。
实施例4
一种高稳定磁性固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：
1)制备氨基化磁性Fe3O4纳米粒子的操作过程如下：
1-1)称取1.35g FeCl3·6H2O，3.6g NaAc·3H2O置于聚四氟乙烯内衬中，加入40mL乙二醇、1mL PEG-200，搅拌均匀，得到黄色乳液，将反应釜于240℃下反应8h，冷却至室温；产品用乙醇洗涤1次，蒸馏水洗涤2次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子；
1-2)将1-1)制备Fe3O4纳米粒子分散于60mL蒸馏水中，加入3mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，通保护气升温至140℃回流20h，蒸馏水洗涤1次，分离即可得氨基化磁性Fe3O4纳米粒子。
2)氨基化磁性Fe3O4纳米粒子固定化漆酶的操作过程如下：
2-1)将制得的氨基化磁性Fe3O4纳米粒子分散至50mL 2％戊二醛水溶液(w/w)中，32℃下水浴搅拌背光反应3.5h，结束后蒸馏水洗涤1次，分离即可得双功能试剂修饰的磁性Fe3O4纳米粒子；
2-2)将制得的双功能修饰的磁性Fe3O4纳米粒子分散至50mL蒸馏水中，加入20mL漆酶，漆酶溶液的浓度为0.07mg/ml；所述漆酶活性为8.8U/mL，38℃下水浴搅拌背光反应2h，蒸馏水洗涤一次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子固定化酶；
测定磁性Fe3O4固定酶催化活性的操作步骤同实施例1；
测定磁性Fe3O4固定酶高效降解染料的操作步骤同实施例1；
检测所述漆酶在磁性Fe3O4纳米粒子固载量为3.78mg/g；所述的磁性Fe3O4固定酶的酶活回收率为89.6％；所述的磁性Fe3O4固定酶的酶活为203.2U/g。检测所述的磁性Fe3O4固定化漆酶对孔雀石绿降解率为99.3％；所述的磁性Fe3O4固定化漆酶循环使用10次后对孔雀石绿降解率为84.6％。

Claims (10)

1.一种高稳定磁性固定化漆酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)制备磁性Fe3O4纳米粒子；
2)制备氨基化磁性Fe3O4纳米粒子；
3)制备双功能化磁性Fe3O4纳米粒子；
4)高稳定磁性固定化漆酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)具体为：向铁源、醋酸钠中加入多元醇和聚乙二醇，高温下反应，洗涤，分离得磁性Fe3O4纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述高温反应指在160℃-240℃下反应6-20h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：
将磁性Fe3O4纳米粒子分散于溶剂中，加入硅烷偶联剂，高温下反应，洗涤，分离得氨基化磁性Fe3O4纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述磁性Fe3O4纳米粒子与硅烷偶联剂质量比为1：(2-12)；步骤2)中所述高温下反应指在100-140℃下反应20-28h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为：将氨基化磁性Fe3O4纳米粒子分散于双功能试剂溶液中，培养，洗涤，分离得双功能化磁性Fe3O4纳米粒子。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中双功能试剂溶液中的双功能试剂与制备氨基化磁性Fe3O4纳米粒子所用的磁性Fe3O4纳米粒子的质量比为(1-8)：1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)具体为：将双功能化磁性Fe3O4纳米粒子分散于溶剂中，加入漆酶溶液，培养，洗涤，分离得磁性Fe3O4固定酶；步骤4)中所述漆酶溶液中所含漆酶与制备双功能化磁性Fe3O4纳米粒子所用的磁性Fe3O4纳米粒子的质量比为(0.01-0.08)：1。
9.一种权利要求1-8任一项所述制备方法制备的高稳定磁性固定化漆酶。
10.一种高效降解染料的方法，其特征在于，利用权利要求1-8任一项所述制备方法制备的高稳定磁性固定化漆酶分散于染料中；加入ABTS，反应。
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