CN112941124B - 一种全细胞催化制备依利格鲁司特中间体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药技术领域，尤其是一种全细胞催化制备依利格鲁司特中间体的方法，以化合物II为底物，在全细胞、NADP+、NADPH、氢供体、助溶剂和缓冲液的存在下，进行生物催化反应生成依利格鲁司特中间体，即化合物I；合成路线如下：本发明的制备方法简单方便，经济实用，实现了依利格鲁司特手性中间体的高效合成。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体领域为一种制备依利格鲁司特中间体的方法。
背景技术
依利格鲁司特(Eliglustat)于2014年获得FDA审批通过，为长期治疗1型戈谢病的一线用药，原研是密歇根大学，后许可给赛诺菲(Sanofi)旗下健赞(Genzyme)公司，商品名为Cerdelga。戈谢病发生在不能产生足够的一种酶被称为葡糖脑苷脂酶的人体中，该酶缺乏会导致在脾、肝和骨髓收集脂肪物质。其主要体征包括肝和脾肿大、低红细胞计数(贫血)、低血小板计数和骨问题。Cerdelga是一种明胶胶囊，口服制剂靶向葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase，GCS)，能够降低葡萄糖神经酰胺的产生。在美国估计1型戈谢病影响约6，000人。
依利格鲁司特作为罕见遗传病的治疗药物，国内研究较少。原研路线中，其中间体的合成主要通过化学法制备，化合物II中含有一个羟基和氨基，均需要进行保护后再进一步进行手性羰基还原反应，操作复杂，具体合成路线如下：
发明内容
本发明的目的在于提供一种全细胞催化制备依利格鲁司特中间体的方法，利用全细胞催化进行不对称还原反应制备手性醇。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种全细胞催化制备依利格鲁司特中间体的方法，以化合物II为底物，在全细胞、NADP+、NADPH、氢供体、助溶剂和缓冲液的存在下，进行生物催化反应生成依利格鲁司特中间体，即化合物I；合成路线如下：
其中，所述全细胞为大肠埃希氏菌全细胞、枯草芽孢杆菌全细胞或酵母菌全细胞。
优选的，所述全细胞为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。
其中，所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中的外源表达载体为pET系列质粒或pRSFDuet-1。
具体的，优选为pRSFDuet-1，所述外源表达载体的构建优选如图1所示，该质粒含有两个多克隆位点，可以同时载入羰基还原酶基因与辅酶循环酶基因共表达。该羰基还原酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(为Genbank登录号U26463.1中的CDS序列密码子优化序列)，该辅酶循环酶的基因序列如SEQ ID No.2所示(辅酶循环酶为葡糖脱氢酶，申请人自行研发，授权专利号：CN106754777)。
优选的，全细胞为肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)全细胞。
其中，所述大肠埃希氏菌全细胞的制备方法具体为：将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的羰基还原酶经过DNA序列后合成后，进行PCR扩增后导入羰基还原酶表达载体的HindⅢ和BamHI酶切位点获得重组表达载体编号pRSFDuet-1-001，随后，将SEQ ID No：2所示的辅酶循环酶基因经过DNA序列后合成后，进行PCR扩增，选择质粒pRSFDuet-1-001的NdeI和XhoI酶切位点导入辅酶循环酶基因，之后，将重组表达载体转入羰基还原酶表达细胞中，得到表达工程菌，经过抗生素抗性平板涂布筛选后，获得克隆菌株，经检验重组成功后，对获得的菌株进行活化后发酵培养，离心收集菌体，洗涤后获得大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)全细胞。
其中，所述化合物II与所述全细胞的质量比为1:0.1～2；所述助溶剂为异丙醇、DMSO或乙醇。
其中，所述的氢供体为葡萄糖、甲酸或异丙醇，优选为葡萄糖；所述化合物II与所述氢供体的质量比为1：0.1-0.5。
其中，所述化合物II与助溶剂的质量体积比为1g：5～50/mL；所述缓冲液为PBS缓冲液，其浓度为0.2mM，pH为7.5～8.0，化合物II与辅酶质量比为1g：0.1-20mg。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本申请的制备方法不需要高温高压等极端催化环境，也不需要有毒催化剂的使用，对环境友好；使用共表达的全细胞催化降低了分别产羰基还原酶与辅酶循环酶的成本，经济可靠无污染。
附图说明
图1为重组PRSFDuet质粒的构建示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)全细胞菌株构建
将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的羰基还原酶经过DNA序列合成后，进行PCR扩增，引物如下：
F：cgcggatccatggttggcacgactaccct；
R：cccaagcttttatttgattttgaccgcatttttacaag。(SEQ ID No：3-4所示)
PCR扩增条件：98℃3min，98℃30s，56℃90s、72℃90s，35个循环；
PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix 25μL；
扩增后，导入表达载体的HindⅢ和BamHI酶切位点，获得重组表达载体编号pRSFDuet-1-001。
随后，将核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的辅酶循环酶经过DNA序列合成后，进行PCR扩增，引物如下：
F2：cccatatgatggacatgtatccggatttata
R2：ccgctcgagttagcggcctgcctg。(SEQ ID No：5-6所示)
PCR扩增条件：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环；
PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix 25μL；
扩增后，选择质粒pRSFDuet-1-001的NdeI和XhoI酶切位点导入辅酶循环酶基因，之后，将重组表达载体(如图1所示)转入羰基还原酶表达细胞中，得到表达工程菌，挑取阳性转化子并测序鉴定其核苷酸序列如SEQ ID No.1(优化后羰基还原酶DNA序列)所示后，获得大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)全细胞菌株。
二、用于酶催化反应的肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)全细胞菌体制备
将获得的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)全细胞菌株，接种到含有抗生素卡那抗性的LB液体培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液。将种子培养液接种按照1-2％比例接种至到TB液体发酵培养基中。然后置于37℃下培养至OD600值为0.6～0.8，加入终浓度为0.5mol/L的IPTG，置于25℃继续培养16h后，12000rmp，5℃下离心收集菌体，采用pH值为7.5的200mmol/L的PBS缓冲液将收集后菌株进行洗涤并重悬，离心后收集，获得用于酶催化的全细胞菌体。
实施例2化合物I的制备
于250ml锥形瓶中，加入50ml PBS缓冲液(0.2mM，pH7.5)，依次溶解2g实施例1制得的全细胞菌体，10mgNADP+、10mgNADPH，0.5g葡萄糖，1g底物化合物II溶于5ml异丙醇中，加入反应器，220rpm搅拌，于33℃下反应24h，pH监控在7.5(使用0.1％NaOH进行pH调整)得到化合物I。反应结果经HPLC检测，转化率为92％，纯度99.53％，ee值98.7％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏阿尔法药业有限公司
<120> 一种全细胞催化制备依利格鲁司特中间体的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 972
<212> DNA
<213> 羰基还原酶(Artificial Sequence)
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gaagcgggtg ttaagcgtga agatctgttc atcaccagca aactgtggaa taacagccac 240
cgcccggaac aggttgaacc agctctggat gacactctga aagaactggg cctggaatac 300
ctggatctgt atctgattca ctggccggtt gcctttccgc cggaaggtga tatcacccag 360
aatctgttcc cgaaagctaa cgataaagaa gttaaactgg acctggaagt aagcctggta 420
gacacttgga aagcaatggt aaaactgctg gataccggta aagtgaaagc gatcggcgta 480
tctaacttcg atgcgaaaat ggtcgacgca atcatcgaag ccaccggtgt caccccgtct 540
gtgaaccaga tcgagcgcca tccgctgctg ctgcaaccgg aactgatcgc gcaccacaag 600
gcaaaaaaca tccacatcac tgcgtattcc ccgctgggta acaacaccgt gggtgcacca 660
ctgctggtgc aacacccgga aattaaacgc attgctgaaa aaaacggttg caccccggcg 720
caggttctga tcgcatgggc aattgtgggt ggccactctg ttatcccgaa atctgtaacc 780
ccgtcccgta tcggtgaaaa cttcaaacag gttagcctgt cccaggagga cgtagatgcg 840
gtgtctaaac tgggtgaggg ctctggtcgc cgtcgttaca acatcccgtg cacctactcc 900
ccgaaatggg atatcaacgt attcggtgaa gaagacgaaa agtcttgtaa aaatgcggtc 960
aaaatcaaat aa 972
<210> 2
<211> 792
<212> DNA
<213> 辅酶循环酶(Artificial Sequence)
<400> 2
atggacatgt atccggattt atataaagga aaagtcgtcg ctattacagg agctgctaca 60
gggctcggaa aggcgatggc cattcgcttc ggcaaggagc aggcaaaagt ggttatcaac 120
tattatagta ataaacaaga tccgaacgag gtaaaagaag aggtcatcaa ggcgggcggt 180
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acggcaatta aggagttcgg cacactcgat attatgatta ataatgccgg tcttgaaaat 300
cctgtgccat ctcacgaaat gccgctcaag gattgggata aagtcatcgg cacgaactta 360
acgggtgcct ttttaggaag ccgtgaagcg attaaatatt tcgtagaaaa cgatatcaag 420
ggaaatgtca ttaacatgtc cagtgtgcac gaagtgattc cttggccgtt atttgtccac 480
tatgcggcaa gtaaaggcgg gataaagaaa atgacagaaa cattagcgtt ggaatacgcg 540
ccgaagggca ttcgcgtcaa taatattggg ccaggtgcga tcaacacgcc aatcaatgct 600
gaaaaattcg ctgaccctaa acagaaagct gatgtagaaa gcatgattcc aatgggatat 660
atcggcgaac cggaggagat cgccgcagta gcagcctggc ttgagtcgaa ggaagccagc 720
tacgtcacag gcatcacgtt attcgcggac ggcttaatga cacaatatcc ttcattccag 780
gcaggccgct aa 792
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物F(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcggatcca tggttggcac gactaccct 29
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物R(Artificial Sequence)
<400> 4
cccaagcttt tatttgattt tgaccgcatt tttacaag 38
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物F2(Artificial Sequence)
<400> 5
cccatatgat ggacatgtat ccggatttat a 31
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物R2(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgctcgagt tagcggcctg cctg 24
Claims (5)
1.一种全细胞催化制备依利格鲁司特中间体的方法，其特征在于：以化合物II为底物，在全细胞、NADP+、NADPH、氢供体、助溶剂和缓冲液的存在下，进行生物催化反应生成依利格鲁司特中间体，即化合物I；所述全细胞为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)；所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中的外源表达载体为pRSFDuet-1；所述外源表达载体中的外源序列包括羰基还原酶基因及辅酶循环酶基因，分别如SEQ ID No：1-2所示；外源表达载体的构建是优化pRSFDuet-1，同时载入羰基还原酶基因与辅酶循环酶基因共表达；
合成路线如下：
。
2.根据权利要求1所述的全细胞催化制备依利格鲁司特中间体的方法，其特征在于：所述全细胞的制备方法具体为：将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的羰基还原酶经过DNA序列后合成后，进行PCR扩增后导入羰基还原酶表达载体的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点获得重组表达载体编号pRSFDuet-1-001，随后将SEQ ID No：2所示的辅酶循环酶基因经过DNA序列后合成后，进行PCR扩增，选择质粒pRSFDuet-1-001的NdeI和XhoI酶切位点导入辅酶循环酶基因，之后，将重组表达载体电转入羰基还原酶表达细胞中，得到表达工程菌，经过抗生素抗性平板涂布筛选后，获得克隆菌株，经检验重组成功后，对获得的菌株进行活化后发酵培养，离心收集菌体，洗涤后获得大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)全细胞。
3.根据权利要求1所述的全细胞催化制备依利格鲁司特中间体的方法，其特征在于：所述化合物II与所述全细胞的质量比为1:0.1~2；所述助溶剂为异丙醇、DMSO或乙醇。
4.根据权利要求1所述的全细胞催化制备依利格鲁司特中间体的方法，其特征在于，所述的氢供体为葡萄糖、甲酸或异丙醇；所述化合物II与所述氢供体的质量比为1：0.1-0.5。
5. 根据权利要求1所述的全细胞催化制备依利格鲁司特中间体的方法，其特征在于，所述化合物II与助溶剂的质量体积比为1g：5~50/mL；所述缓冲液为PBS缓冲液，其浓度为0.2mM，pH 为7.5~8.0，化合物II与辅酶质量比为1g：0.1-20mg。
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