CN106282257A

CN106282257A - 一种双相多酶偶联体系高效制备(s)‑2‑(4‑硝基苯基)环氧乙烷的方法

Info

Publication number: CN106282257A
Application number: CN201610938662.2A
Authority: CN
Inventors: 邬敏辰; 石小玲; 胡蝶; 王瑞; 李闯; 李剑芳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2017-01-04

Abstract

本发明公开了一种双相多酶偶联体系高效制备(S)‑2‑(4‑硝基苯基)环氧乙烷的方法，属于生物工程技术领域。本发明以含羰基还原酶(SyS1)基因和葡萄糖脱氢酶(SyGDH)基因的共表达重组大肠杆菌BL21(pETDuet‑Sygdh‑Sys1)为催化剂，并添加一定量的NADP⁺和葡萄糖，在磷酸钾缓冲液/异丁醇两相反应体系中实现双酶偶联催化α‑溴代对硝基苯乙酮高效制备中间产物(S)‑2‑溴‑1‑(4‑硝基苯基)乙醇，其摩尔产率可达99.8％。继续向反应体系中添加破碎SyHheC粗酶液和缓冲液，反应得到产物(S)‑2‑(4‑硝基苯基)环氧乙烷摩尔产率可达99.9％，e.e.值＞99％。

Description

一种双相多酶偶联体系高效制备(S)-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的方法

技术领域

本发明涉及一种双相多酶偶联体系高效制备(S)-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

(S)-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷((S)-p-nitrostyrene oxide,(S)-pNSO)分子式为C₈H₇NO₃，与(R)-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷互为对映异构体，是一类在有机合成和药物制备中非常重要的中间体物质，可用于β-受体阻滞剂硝苯洛尔等药物的合成。

手性环氧化物的制备方法有拆分法和合成法。

拆分法包括生物拆分法和化学拆分法，由于拆分法固有的限制，得到的产物最大理论得率仅为50％。通过合成法可突破这一限制，得到理论产率为100％的产物。

合成法分为化学合成法和生物合成法。其中，化学合成法以金属催化的不对称合成为主，但目前大多数还存在成本太高、反应条件比较苛刻、不绿色环保、收率太低、光学纯度不够等诸多问题。生物合成法则具有选择性高、反应条件温和、绿色环保的特点，目前逐渐成为研究热点。通过把微生物的完整全细胞或者其中的酶当作生物催化剂，可实现物质的转化，有的反应可通过一种酶一步反应就可以完成，有的需要多种酶和一定反应条件或多种酶几步反应来完成催化反应。

对于(S)-pNSO合成方法，目前主要集中于化学合成法和化学酶促法，也有通过双酶串联法制备得到(S)-pNSO，但是也需要经由化学法得到双酶的底物。

其中，化学合成法是将α-溴代对硝基苯乙酮溶于适量甲醇中，加入硼氢化钠还原α-溴代对硝基苯乙酮，得到消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷，再通过手性柱制备得到(S)-pNSO，化学制备法生成大量副反应，得到产品产率低，手性柱制备成本高，难以应用于实际工业生产中。

化学酶促法虽然得到的产物(S)-pNSO的光学纯度大于99％ee，但是步骤复杂，要通过一步化学合成方法和两步生物合成法得到终产物(S)-pNSO。首先将α-溴代对硝基苯乙酮溶于甲醇中，加入硼氢化钠反应一定时间后向反应液中加入水，用乙酸乙酯提取混合物，加入卤水处理以除去杂质，经干燥、旋蒸去除溶剂，得到消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇和消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的混合物。将混合物溶解后加入缓冲液，添加含有卤代醇脱卤酶的全细胞开始脱卤闭环反应，待消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇完全转化为2-(4-硝基苯基)环氧乙烷，迅速调整pH和温度，添加亚硝酸钠及卤代醇脱卤酶，得到(S)-pNSO的ee值大于99％，最后通过硅胶色谱柱将产物纯化。化学酶促法步骤冗长、后处理过程复杂使得大规模经济生产(S)-pNSO较为困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种双相多酶偶联的方法，提高生物合成法制备(S)-pNSO的得率和e.e.值，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值。

本发明的技术方案：

(1)将共表达葡萄糖脱氢酶和羰基还原酶的单质粒双启动子的菌株E.coli/pETDuet-Sygdh-Sys1发酵后，离心收集菌体，添加到缓冲溶液/异丁醇两相反应溶液中，同时添加添加一定量的NADP⁺、葡萄糖、对硝基溴代苯乙酮(BNP)，实现不对称还原对硝基溴代苯乙酮(BNP)产生中间产物(S)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇((S)-BNE)的过程；

(2)将单表达卤代醇脱卤酶基因的菌株E.coli/pET-28a(+)-SyHheC发酵培养后，破碎菌体，离心收集上清液得到卤代醇脱卤酶粗酶液，待步骤(1)中底物BNP转化为(S)-BNE后，向其中添加卤代醇脱卤酶粗酶液，并补充适量缓冲溶液，反应一定时间；

(3)酶促反应结束后，向反应体系中加入异丁醇进行萃取，离心得到萃取相，并干燥、过滤得到(S)-pNSO。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述缓冲溶液/异丁醇两相反应溶液是按体积比7:3或6:4或5:5或4:6或3:7混合的100mmol/L的pH 8.0的磷酸钾缓冲液与异丁醇。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述缓冲溶液/异丁醇两相反应溶液是按体积比7:3混合的100mmol/L的pH 8.0的磷酸钾缓冲液与异丁醇。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)底物BPN的初始反应浓度为10-30mmol/L，葡萄糖初始反应浓度为80mmol/L、辅因子NADP⁺的初始浓度为0.2mmol/L，重组大肠杆菌E.coli/pETDuet-Sygdh-Sys1的用量以湿细胞计为70mg/ml。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)反应温度为35℃，搅拌转速为220rpm，反应时间为0.5～9h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)反应温度为35℃，搅拌转速为220rpm，反应时间为4～9h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)反应时间为9h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)是向步骤(1)的体系中添加50μl的3.03U/ml的卤代醇脱卤酶粗酶液和一定量的磷酸钾缓冲液，反应180min。

本发明先利用葡萄糖脱氢酶和羰基还原酶催化BNP得到中间产物(S)-BNE，再通过卤代醇脱卤酶催化(S)-BNE反应得到(S)-pNSO；本发明通过有机-水两相反应体系可解决单相溶液系统中底物溶解度差和环氧底物会发生自发水解的问题，利用多酶偶联的方法，不用经过化学法合成酶的底物，仅需相对便宜的前手性底物、廉价的辅助底物和添加少量的辅酶就可以得到高e.e.值、高收率的目标产品，产物(S)-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷摩尔产率可达99.9％，e.e.值＞99％。可见，本发明能使生产成本降低，且条件温和、方法简便。

附图说明

图1：水/有机两相体系中多酶偶联催化合成(S)-pNSO的工艺路线；

图2：BNP浓度对多酶催化反应的影响；

图3：不同配比的缓冲液/异丁醇对多酶催化反应的影响；

图4：反应时间对合成(S)-pNSO第一步反应的影响；

图5：反应时间对合成(S)-pNSO第二步反应的影响。

具体实施方式

以2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇为底物，每分钟消耗1μmol底物所需的酶量定义为1个卤代醇脱卤酶酶活性单位(U)。

产物的检测方法：在反应体系中加入等体积的异丁醇进行萃取，离心吸取异丁醇相，适量无水硫酸镁干燥，0.22μm有机膜过滤后进行HPLC检测。所用HPLC检测(S)-BNE、(S)-pNSO产率和e.e.值的方法：高效液相色谱(HPLC)为Waters高效液相色谱仪，反相色谱柱为AS-H(4.6mmΦ×250mmL×5μm)，柱温为30℃，采用2489紫外检测器，检测波长220nm，一步等度洗脱，流动相为异丙醇/正己烷(8/2,v/v)，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。(S)-BNE的出峰时间为15.783min，(S)-pNSO的出峰时间为16.940min，底物BPN出峰时间为22.518min。

计算产物的产率和e.e.值采用外标法计算：分别配置0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L和2mmol/L的(S)-BNE、(S)-pNSO的标准品溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线。c_待＝A_待×c_标/A_标，其中c_待和A_待代表待测样品的摩尔浓度和峰面积；c_标和A_标代表标准品的摩尔浓度和峰面积。e.e.值＝[(S-R)/(S+R)]×100％：其中S和R分别代表(S)-和(R)-BNE或(S)-和(R)-pNSO的最终摩尔浓度。

实施例1重组菌E.coli BL21/pETDuet-Sygdh-Sys1及E.coli/pET-28a(+)-SyHheC的发酵及菌液、酶液的获取

共表达葡萄糖脱氢酶和羰基还原酶的单质粒双启动子的菌株E.coli/pETDuet-Sygdh-Sys1的构建方法，参见公布号为CN104388373A的、发明名称为“一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌系统的构建”的中国专利申请。

单表达卤代醇脱卤酶基因的菌株E.coli/pET-28a(+)-SyHheC的构建方法参见《食品与生物技术学报》2015年34(5)：494-500发表的文章《新型卤代醇脱卤酶基因的克隆，序列分析及表达》。是登录号为KF853591.1的编码卤代醇脱卤酶的基因SyHheC，与表达载体pET28a连接，构建重组表达质粒pET28a-SyHheC，酶切位点为NcoⅠ和NotⅠ，转化入E.coliBL21(DE3)。

将E.coli BL21/pETDuet-Sygdh-Sys1菌株接种于含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的2mL LB培养基中，37℃、215rpm培养过夜；再分别以2mL/dL转接入30mL LB培养基中，培养至OD₆₀₀约为0.8时，加入IPTG至终浓度0.6mmol/L，26℃诱导表达12h。离心培养液(8000rpm,10min)收集得到E.coli BL21/pETDuet-Sygdh-Sys1湿菌体。

将E.coli/pET-28a(+)-SyHheC菌株接种于含终浓度为100μg/mL卡那霉素的2mLLB培养基中，37℃、215rpm培养过夜；再分别以2mL/dL转接入30mL LB培养基中，培养至OD₆₀₀约为0.8时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，30℃诱导表达8h。离心培养液(8 000rpm,10min)收集得到E.coli/pET-28a(+)-SyHheC菌体后，用6mL磷酸钾缓冲液(20mmol/L,pH 8.0)悬浮。以功率200W、工作3s、间隔8s的条件冰浴超声波破碎E.coli/pET-28a(+)-SyHheC菌体，破碎时间为15min。超声破碎后，冷冻离心机离心(14000rpm,15min)，上清即是SyHheC粗酶液。4℃保存备用。

实施例2有机溶剂的选择

分别选用对三种酶活性影响较少的几种有机溶剂，包括二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、正己烷、环己烷、正辛烷、异辛烷、正庚烷和异丁醇，溶解底物BNP，肉眼观察底物的溶解情况。由于底物BNP的溶解性非常差，不溶于水和烷类等有机溶剂，只溶于DMF等高极性溶剂，而另一方面对于产物的检测技术有限，需要高效液相色谱的检测方法，而高效液相色谱采用的手性色谱柱AS-H是极性填料，对于BNP的助溶剂的要求是不能使用DMF等极性溶剂。故要选择一种对BNP、(S)-BNE和(S)-pNSO都有很好的溶解性的且对色谱柱无伤害或伤害最小的，又对涉及的三种酶的酶活性影响小的有机溶剂。本发明选定异丁醇作为有机溶剂。

实施例3底物BNP浓度对中间产物生成的影响

向按体积比4:6混合的100mmol/L的pH 8.0磷酸钾缓冲液/异丁醇中添加终浓度为80mmol/L的D-葡萄糖、0.2mmol/L的NADP⁺和70mg/mL的E.coli/Sygdh-Sys1湿菌体，构成1mL反应体系，添加不同浓度的BNP(10～30mmol/L)进行酶促反应，35℃、220rpm摇床中反应12h后，加入1mL异丁醇进行萃取，10000rpm，2min离心吸取异丁醇相，适量无水硫酸镁干燥，0.22μm有机膜过滤。用高效液相色谱对中间产物(S)-BNE的产率和e.e.值进行分析，结果如下图2所示，当BNP浓度低于15mmol/L时，中间产物(S)-BNE的产率可达90％以上；而随着底物浓度的继续加大，产率急速下降。

实施例4缓冲液/异丁醇配比的选择对中间产物生成的影响

向按体积比4:6混合的100mmol/L的pH 8.0磷酸钾缓冲液/异丁醇中添加终浓度为15mmol/L的BNP作为底物、80mmol/L的D-葡萄糖、0.2mmol/L的NADP⁺作为辅酶循环底物和辅酶、70mg/mL的E.coli/Sygdh-Sys1湿菌体，构成1mL反应体系；改变磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH 8.0)/异丁醇的两相配比为7:3、6:4、5:5、4:6、3:7，反应体系终体积为1mL，置于35℃、220rpm摇床中反应12h后，加入1mL异丁醇进行萃取，离心吸取异丁醇相，干燥过滤。高效液相色谱对中间产物(S)-BNE的产率和e.e.值进行分析，发现在不同比例的缓冲液/异丁醇反应体系中，如图3所示，中间产物(S)-BNE的产率随着有机相异丁醇的增大而下降。酶在有机溶剂中会损失一部分的酶活性，而且菌体需要一定的水相保持流动性而增加底物和酶的接触，所以选择缓冲液/异丁醇配比为7:3，此时(S)-BNE的产率最大。

实施例5合成(S)-pNSO第一步的反应时间进程

1mL体系中含体积比为7:3的100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)/异丁醇、15mmol/L底物BNP、80mmol/LD-葡萄糖、0.2mmol/LNADP⁺和E.coli/Sygdh-Sys1湿菌体70mg/mL，于35℃、220rpm分别反应0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h，加入1mL异丁醇进行萃取，离心吸取异丁醇相，干燥，0.22μm有机膜过滤。高效液相色谱对中间产物(S)-BNE的产率和e.e.值进行分析，如图4，时间为横坐标，产率和e.e.值为纵坐标所得曲线即为合成(S)-pNSO第一步的反应时间进程。在反应开始的前6h产物(S)-BNE的摩尔产率增加比较快速；6h后趋于平缓；反应9h后(S)-BNE的摩尔产率可达99.8％；反应过程中e.e.值始终保持在99.9％以上。所以选择合成(S)-pNSO第一步的最佳时间为9h。

实施例6合成(S)-pNSO第二步的反应时间进程

实施例4的第一步反应完成后，加入50μL的3.03U/ml的SyHheC酶液(每分钟消耗1μmol中间产物(S)-BNE所需的酶量定义为1个酶活单位U)，并添加适量100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)至反应终体积为2mL，于35℃、220rpm分别反应30～180min，间隔30min，加入2mL异丁醇进行萃取，离心吸取异丁醇相，适量无水硫酸镁干燥，0.22μm有机膜过滤。高效液相色谱对中间产物(S)-pNSO的产率和e.e.值进行分析，如图5，时间为横坐标，产率和e.e.值为纵坐标所得曲线即为合成(S)-pNSO第二步的反应时间进程。反应前2h反应速率较大，后趋于平稳，3h后(S)-pNSO的摩尔产率可达99.9％，反应过程中e.e.值始终保持在99.9％以上。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种双相多酶偶联制备(S)-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的方法，其特征在于，在缓冲溶液/异丁醇两相反应溶液中，利用葡萄糖脱氢酶和羰基还原酶不对称还原对硝基溴代苯乙酮得到中间产物(S)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇，再以卤代醇脱卤酶催化(S)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇生成(S)-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，葡萄糖脱氢酶和羰基还原酶以共表达葡萄糖脱氢酶和羰基还原酶的单质粒双启动子的菌株的全细胞形式添加到缓冲溶液/异丁醇两相反应溶液中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将共表达葡萄糖脱氢酶和羰基还原酶的单质粒双启动子的菌株E.coli/pETDuet-Sygdh-Sys1发酵后，离心收集菌体，添加到缓冲溶液/异丁醇两相反应溶液中，同时添加添加一定量的NADP⁺、葡萄糖、对硝基溴代苯乙酮，实现不对称还原对硝基溴代苯乙酮(BNP)产生中间产物(S)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇((S)-BNE)的过程；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述缓冲溶液/异丁醇两相反应溶液是按体积比7:3或6:4或5:5或4:6或3:7混合的100mmol/L的pH 8.0的磷酸钾缓冲液与异丁醇。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述缓冲溶液/异丁醇两相反应溶液是按体积比7:3混合的100mmol/L的pH 8.0的磷酸钾缓冲液与异丁醇。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)底物BPN的初始反应浓度为10-30mmol/L，葡萄糖初始反应浓度为80mmol/L、辅因子NADP⁺的初始浓度为0.2mmol/L，重组大肠杆菌E.coli/pETDuet-Sygdh-Sys1的用量以湿细胞计为70mg/ml。

7.根据权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于，步骤(1)反应温度为35℃，搅拌转速为220rpm，反应时间为0.5～9h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)反应温度为35℃，搅拌转速为220rpm，反应时间为4～9h。

9.根据权利要求3～7任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)是向步骤(1)的体系中添加50μl的3.03U/ml的卤代醇脱卤酶粗酶液和一定量的磷酸钾缓冲液，反应180min。