CN101717745A - 一株羰基还原酶重组菌高效制备(s)-苯基乙二醇的方法 - Google Patents

Abstract

一株羰基还原酶重组菌高效制备(S)-苯基乙二醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明提供了一种新型的近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)羰基还原酶基因scr II，Genbank序列号为GQ411433，将scrII插入载体pET28a构建重组质粒pETSCR II，再转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含100μg/mL卡那霉素的LB平板筛选，获得重组菌株E.coliBL21/pETSCRII，保藏编号CCTCC NO：M209290。该重组菌细胞不对称还原5g/L 2-羰基苯乙酮，催化获得(S)-苯基乙二醇，产物的光学纯度为100％，产率达98.1％。本发明为高效制备(S)-苯基乙二醇提供了新型功能基因和有效途径。

Description

一株羰基还原酶重组菌高效制备(S)-苯基乙二醇的方法

技术领域

从近平滑假丝酵母基因组中钓取新型羰基还原酶基因scr II，通过基因工程手段构建重组菌株，用于高效制备(S)-苯基乙二醇的方法及其应用，属于生物催化不对称转化技术领域。

背景技术

光学纯的苯基乙二醇不仅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂，也是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体，开展苯基乙二醇拆分方法的研究极具意义。

苯基乙二醇的化学结构为：

手性化合物的制备方法包括化学拆分法，色谱拆分法，液体膜拆分法或手性固体膜拆分的膜拆分法和生物法。其中生物法具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，能完成化学合成法难以进行的反应。

在生物制备(S)-苯基乙二醇的反应中，仅少数真菌或酶能催化底物2-羰基苯乙酮，产生不同空间构型的苯基乙二醇。Bakers’yeast和Geotrichum sp.能将低浓度的2-羰基苯乙酮分别还原为(R)-和(S)-苯基乙二醇。来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC NO：M203011的(R)-和(S)-羰基还原酶能催化2-羟基苯乙酮产生苯基乙二醇的不同对映体。但多数已报道的不对称还原反应中，酶催化的底物浓度和终产物的光学纯度都较低。通过构建基因工程菌来增加目标蛋白的表达量以促进转化反应，但是效果不显著。吕腾飞等采用过量表达(S)-羰基还原酶SCR的重组菌制备(S)-苯基乙二醇，底物2-羰基苯乙酮的浓度只有3g/L，产物的光学纯度也仅为91％。

近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC NO：M203011可催化制备(S)-苯基乙二醇，在此基础上，利用全基因组分析方法从中钓取一种新型(S)-羰基还原酶基因scrr II，构建了目标基因的重组菌，实现了高底物浓度下高效低成本不对称转化制备(S)-苯基乙二醇。

发明内容

本发明的目的在于根据近平滑假丝酵母基因组序列分析方法，克隆出一种新型(S)-羰基还原酶基因scrr II，利用构建的重组菌CCTCC NO：M 209289催化2-羟基苯乙酮，高效制备具有光学活性的(S)-苯基乙二醇的方法，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为100％e.e.和98.1％。

本发明的技术方案：一株制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETSCR II，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 209290。

所述重组菌株CCTCC NO：M 209290的构建方法，将羰基还原酶基因scrII插入载体pET28a构建重组质粒pETSCR II，重组质粒pETSCR II转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含100μg/mL卡那霉素的LB平板筛选，获得重组菌株E.coli BL21/pETSCR II，即CCTCC NO：M 209290；步骤为：

①(S)-羰基还原酶基因scr II的获取

用于钓取scr II基因的菌种为近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC NO：M 203011；

羰基还原酶基因scr II的克隆：以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC NO：M203011基因组为模板，以含有BamHI酶切位点的

SCR II_F：5’-ATCGGATCCATGGGCGAAATCG AATCTTATTGC-3’，和含有XhoI酶切位点的

SCR II_R：5’-TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATCGAC-3’为引物，PCR扩增反应获得scr II基因，基因全长840bp；基因scr II的GenBank编号为：GQ411433；

PCR体系为：ddH₂O 35.5μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L Mg²⁺3μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，Taq DNA Polymerase 0.5μL，25pmol/μL的引物SCRII_F和SCR II_R各1μL；

PCR反应条件：94℃4min；94℃1min、56℃1min、72℃1min，30个循环；72℃10min；

②重组质粒pETSCR II的构建：

利用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因scr II和表达载体pET28a分别进行双酶切，处理后的DNA片断通过粘性末端连接，获得带有羰基还原酶基因scr II的重组质粒pETSCRII；

③重组质粒转化大肠杆菌：取重组质粒pETSCR II 2μL，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化液涂布到含有100μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得阳性克隆E.coli BL21/pETSCR II。

利用重组菌CCTCC NO：M209290不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法：

(1)重组菌株CCTCC NO：M 209290的培养

LB液体培养基，以g/100mL计：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0；需要时使用前加入卡那霉素100μg/mL，固体培养基再添加1.5％琼脂粉；

培养条件：挑取重组菌CCTCC NO：M 209290的单菌落接种于3mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀0.6，在培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.1mmol/L，于30℃诱导培养6h；10,000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞；

(2)以重组菌全细胞为催化剂，以2-羟基苯乙酮为底物，进行不对称转化反应：在1mL 0.1mol/L pH4.5～6.0的醋酸缓冲液，或者1mL 0.1mol/L pH6.5～7.5的磷酸缓冲液，或者1mL 0.1mol/L pH8.0～9.0的Tris-HCl缓冲中进行反应，底物2-羰基苯乙酮浓度为5g/L，反应温度为25～35℃；

采用重组菌全细胞生物转化：重组菌全细胞浓度为0.1g/mL，反应48h，反应前不需要加入辅酶，产物为(S)-苯基乙二醇；

或采用重组菌破碎后的上清液经纯化后的重组蛋白SCRII生物转化：重组蛋白SCRII浓度为1～2μg/mL，反应8h，反应前加5mmol/L辅酶NADPH，产物为(S)-苯基乙二醇；

反应结束后，将反应混合物离心除去固体物质，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100)进行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6mm×25cm；Daicel Chemical Ind.，Ltd.，Japan)，流动相为正己烷/异丙醇(9/1，VN)，流速0.5mL/min，检测波长为215nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。

产物(S)-苯基乙二醇对映过量值的计算：

对映过量值(e.e.％)＝[(C_S-C_R)/(C_R+C_S)]×100％

产物(S)-苯基乙二醇产率的计算：产率(％)＝C_S/C₀×100％

式中C_R为反应后(R)-苯基乙二醇的浓度，C_S为反应后(S)-对映体的浓度，C₀为反应前底物(R)-苯基乙二醇的浓度。

以重组菌细胞为催化剂，不对称生物转化反应后，产物均为(S)-苯基乙二醇。

所述重组蛋白SCRII的纯化：

MCAC-0缓冲液：20mmol/L Tris/HCl，pH8.0；

MCAC-20：在MCAC-0缓冲液中加入20mmol/L的咪唑，pH8.0；

MCAC-200：在MCAC-0缓冲液中加入200mmol/L的咪唑，pH8.0；

菌体收集：将收集的重组菌全细胞用MCAC-0缓冲液重悬，超声破碎：工作时间2s，间歇时间6s，共20min；破碎液16,000rpm离心40min；弃沉淀，取上清进行后续的蛋白纯化工作；

蛋白纯化：先将上清挂Pharmacia公司的Ni柱两遍，用MCAC-20缓冲液洗脱杂蛋白，用MCAC-200缓冲液洗脱目的蛋白；再用Pharmacia公司的Hitrap柱蛋白脱盐，利用Pharmacia公司的

蛋白纯化系统将蛋白溶液换为无盐的缓冲液；接着用Pharmacia公司的Resource Q阴离子交换柱，1×1cm，进行蛋白纯化；最后用Pharmacia公司的Superdex 200，HiLoad 26/60，进行蛋白纯化；经SDS-PAGE检测目的蛋白纯度达到95％以上。

本发明的有益效果：

成功从近平滑假丝酵母基因组中克隆出一种新型(S)-羰基还原酶基因scr II，该基因全长840bp，Genbank序列号为GQ411433。

将scr II插入表达载体pET28a中，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，构建带有目的基因的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETSCR II。

通过生物转化反应条件的优化，在pH5.5的醋酸缓冲液中，利用0.1g/mL重组细胞对5g/L的底物2-羟基苯乙酮催化转化48h，最终产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e.，产率为98.1％。

在pH5.5的醋酸缓冲液中，利用约2μg的重组纯蛋白对6g/L底物2-羟基苯乙酮催化转化8h，最终产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e，产率为98.9％。

这些工作不仅为制备高光学纯度的(S)-苯基乙二醇提供了一种优良的催化剂，同时也为工业上采用生物法合成(S)-苯基乙二醇提供了有效途径。生物材料样品保藏

大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETSCRII，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 209290，保藏日期：2009年11月29日。

具体实施方式

实施例1scrII基因的获得：

以scr基因(DQ675534)为出发序列，在近平滑假丝酵母基因组中(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/c_parapsilosis)发现一段同源序列scr II，利用引物SCR II_F和SCR II_R，以近平滑假丝酵母基因组为模板，采用PCR的方法来扩增scr II基因。

SCR II_F：5′-ATCGGATCCATGGGCGAAATCGAATCTTATTGC-3′(BamH I)

SCR II_R：5′-TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATC GAC-3′(Xho I)

PCR体系为：ddH₂O 35.5μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L Mg²⁺3μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，Taq DNA Polymerase 0.5μL，25pmol/μL的引物SCRII_F和SCR II_R各1μL；

PCR反应条件：94℃4min；94℃1min、56℃1min、72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR反应获得scr II基因，GenBank编号为：GQ411433。

实施例2重组质粒pETSCRII的获得：

利用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因scr II和载体pET28a分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有scr II基因的重组质粒pETSCR II。利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(购买于北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pETSCR II。

实施例3重组菌株E.coli BL21/pETSCRII的获得：

重组质粒pETSCR II转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含有100μg/mL卡那霉素的LB平板筛选，获得重组菌株E.coli BL21/pETSCRII。该重组大肠杆菌送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M209290。

重组质粒转化大肠杆菌：在每管的100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀后冰浴30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。每管中加入700μL LB液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清600μL，剩余菌液混匀后涂布含100μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

LB液体培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH 7.0。使用前加入卡那霉素(100μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。

挑取4个克隆，转接入装有3mL的含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)从培养的菌液中提取质粒。经下列酶切体系验证：10×Buffer H 2μL，质粒DNA 5μL，BamH I 0.5μL，XhoI 0.5μL，ddH₂O将体系补足20μL。酶切结果为阳性的菌体即为重组菌E.coli BL21/pETSCRII。

实施例4重组菌的培养：

挑取实施例3中E.coli BL21/pETSCR II的单菌落接种于3mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜，取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6后，加入0.1mmol/L异丙基-B-D-硫代半乳糖苷，于30℃诱导培养6h；10,000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集重组菌全细胞。

实施例5

取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞，在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH5.0)中，加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为83.1％e.e.，产率为68.4％。

实施例6

取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞，在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH5.5)中，加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e.，产率为98.1％。

实施例7

取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞，在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.0)中，加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为95.3％e.e.，产率为79.7％。

实施例8

取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞，在1mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)中，加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为88.7％e.e.，产率为68.2％。

实施例9

取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞，在1mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为71.5％e.e.，产率为57.6％。

实施例10

取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞，在1mL 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为51.9％e.e.，产率为39.1％。

实施例11

取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞，在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH5.5)中，加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在25℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为84.5％e.e.，产率为68.6％。

实施例12

取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞，在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH5.5)中，加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为94.3％e.e.，产率为73.7％。

实施例13目标蛋白的表达

用实施例4中的菌液，进行SDS-PAGE检测，凝胶定量软件(Quantity One)分析蛋白表达；将收集的重组菌溶解于20mmol/L，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，超声破碎20min，工作时间2s，间歇时间6s。将破碎后的菌体于16,000rpm离心40min，分别取上清和沉淀，SDS-PAGE检测目标蛋白的表达。

实施例14目标蛋白的纯化

用实施例12中所获得的菌体上清在

蛋白纯化系统中进行蛋白纯化。第一步将上清挂Ni柱(His-Trap Kit，Pharmacia)两次，用MCAC-50的缓冲液洗脱杂蛋白，用MCAC-200的缓冲液洗脱含有目的蛋白的溶液；第二步用Hitrap(Pharmacia)柱蛋白脱盐，缓冲液A：20mmol/L Tris/HCl，500mmol/L NaCl，pH8.0。缓冲液B：20mmol/L Tris/HCl，pH 8.0。利用

蛋白纯化系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，将蛋白溶液由A缓冲液换为B缓冲液；第三步用Resource Q阴离子交换柱(1×1cm，Pharmacia)进行蛋白纯化。缓冲液A：20mmol/L Tris/HCl，pH8.0。缓冲液B：20mmol/L Tris/HCl，1mol/LNaCl，pH8.0。利用

蛋白纯化系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，收集含有目的蛋白的溶液；第四步用Superdex 200(HiLoad 26/60，Pharmacia)进行蛋白纯化。缓冲液：20mmol/LTris/HCl，150mmol/L NaCl，pH8.0。利用蛋白纯化系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，最终收集目的蛋白。

经过以上四个步骤的纯化工作，蛋白液经SDS-PAGE检测为单一条带，纯度可达95％以上。

实施例15

用实施例13中所获得的1μg纯蛋白进行生物转化实验。在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 5.5)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，5mmol/LNADPH，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应8h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物为(R)-苯基乙二醇的光学纯度为96.8％e.e.，产率为90.2％。

实施例16

用实施例13中所获得的2μg纯蛋白进行生物转化实验。在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 5.5)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，5mmol/L NADPH，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应8h。反应结束后混合物离心，取上清液萃取，产物为(R)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e.，产率为98.9％。

Claims (4)

1.一株制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pETSCRII，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M 209290。

2.权利要求1所述重组菌株CCTCC NO：M 209290的构建方法，其特征是将羰基还原酶基因scr II插入载体pET28a构建重组质粒pETSCR II，重组质粒pETSCRII转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含100μg/mL卡那霉素的LB平板筛选，获得重组菌株E.coli BL21/pETSCRII，即CCTCCNO：M 209290；步骤为：

①(S)-羰基还原酶基因scr II的获取

用于钓取scr II基因的菌种为近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC NO：M 203011；

羰基还原酶基因scr II的克隆：以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC NO：M203011基因组为模板，以含有BamHI酶切位点的

SCR II_F：5’-ATCGGATCCATGGGCGAAATCG AATCTTATTGC-3’，和含有XhoI酶切位点的

SCR II_R：5’-TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATCGAC-3’为引物，PCR扩增反应获得scr II基因，基因全长840bp；基因scr II的GenBank编号为：GQ411433；

PCR体系为：ddH₂O 35.5μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L Mg²⁺3μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，Taq DNA Polymerase 0.5μL，25pmol/μL的引物SCR II_F和SCR II_R各1μL；

PCR反应条件：94℃4min；94℃1min、56℃1min、72℃1min，30个循环；72℃10min；

②重组质粒pETSCR II的构建：

利用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因scr II和表达载体pET28a分别进行双酶切，处理后的DNA片断通过粘性末端连接，获得带有羰基还原酶基因scr II的重组质粒pETSCR II；

③重组质粒转化大肠杆菌：取重组质粒pETSCR II 2μL，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化液涂布到含有100μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得阳性克隆E.coli BL21/pETSCR II。

3.利用构建的重组菌CCTCC NO：M209290不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征是

(1)重组菌株CCTCC NO：M 209290的培养

LB液体培养基，以g/100mL计：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0；需要时使用前加入卡那霉素100μg/mL，固体培养基再添加1.5％琼脂粉；

培养条件：挑取重组菌CCTCC NO：M 209290的单菌落接种于3mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀ 0.6，在培养物中加入诱导物0.1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于30℃诱导培养6h；10,000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞；

(2)以2-羟基苯乙酮为底物，进行不对称转化反应：在1mL 0.1mol/LpH4.5～6.0的醋酸缓冲液，或者1mL 0.1mol/L pH6.5～7.5的磷酸缓冲液，或者1mL 0.1mol/L pH8.0～9.0的Tris-HCl缓冲中进行反应，底物浓度2-羰基苯乙酮为5g/L，反应温度为25-35℃；

采用重组菌全细胞生物转化：重组菌全细胞浓度为0.1g/mL，反应48h，反应前不需要加入辅酶，产物为(S)-苯基乙二醇；

或采用重组菌破碎后的上清液经纯化后的重组蛋白SCRII生物转化：重组蛋白SCRII浓度为1～2μg/mL，反应8h，反应前加5mmol/L辅酶NADPH，产物为(S)-苯基乙二醇。

4.根据权利要求3所述的不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征是重组蛋白SCRII的纯化

菌体收集：将收集的重组菌全细胞用MCAC-0缓冲液重悬，超声破碎：工作时间2s，间歇时间6s，共20min；破碎液16,000rpm离心40min；弃沉淀，取上清进行后续的蛋白纯化工作；

蛋白纯化：先将上清挂Pharmacia公司的Ni柱两遍，用MCAC-20缓冲液洗脱杂蛋白，用MCAC-200缓冲液洗脱目的蛋白；再用Pharmacia公司的Hitrap柱蛋白脱盐，利用Pharmacia公司的

蛋白纯化系统将蛋白溶液换为无盐的缓冲液；接着用Pharmacia公司的Resource Q阴离子交换柱，1×1cm，进行蛋白纯化；最后用Pharmacia公司的Superdex 200，HiLoad 26/60，进行蛋白纯化；经SDS-PAGE检测目的蛋白纯度达到95％以上。