CN101717745A - 一株羰基还原酶重组菌高效制备(s)-苯基乙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
一株羰基还原酶重组菌高效制备(S)-苯基乙二醇的方法,属于生物催化不对称转化技术领域。本发明提供了一种新型的近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)羰基还原酶基因scr II,Genbank序列号为GQ411433,将scrII插入载体pET28a构建重组质粒pETSCR II,再转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,通过含100μg/mL卡那霉素的LB平板筛选,获得重组菌株E.coliBL21/pETSCRII,保藏编号CCTCC NO:M209290。该重组菌细胞不对称还原5g/L 2-羰基苯乙酮,催化获得(S)-苯基乙二醇,产物的光学纯度为100%,产率达98.1%。本发明为高效制备(S)-苯基乙二醇提供了新型功能基因和有效途径。
Description
技术领域
从近平滑假丝酵母基因组中钓取新型羰基还原酶基因scr II,通过基因工程手段构建重组菌株,用于高效制备(S)-苯基乙二醇的方法及其应用,属于生物催化不对称转化技术领域。
背景技术
光学纯的苯基乙二醇不仅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂,也是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体,开展苯基乙二醇拆分方法的研究极具意义。
手性化合物的制备方法包括化学拆分法,色谱拆分法,液体膜拆分法或手性固体膜拆分的膜拆分法和生物法。其中生物法具有反应条件温和,产物单一,立体选择性、区域选择性和化学选择性较高,能完成化学合成法难以进行的反应。
在生物制备(S)-苯基乙二醇的反应中,仅少数真菌或酶能催化底物2-羰基苯乙酮,产生不同空间构型的苯基乙二醇。Bakers’yeast和Geotrichum sp.能将低浓度的2-羰基苯乙酮分别还原为(R)-和(S)-苯基乙二醇。来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC NO:M203011的(R)-和(S)-羰基还原酶能催化2-羟基苯乙酮产生苯基乙二醇的不同对映体。但多数已报道的不对称还原反应中,酶催化的底物浓度和终产物的光学纯度都较低。通过构建基因工程菌来增加目标蛋白的表达量以促进转化反应,但是效果不显著。吕腾飞等采用过量表达(S)-羰基还原酶SCR的重组菌制备(S)-苯基乙二醇,底物2-羰基苯乙酮的浓度只有3g/L,产物的光学纯度也仅为91%。
近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC NO:M203011可催化制备(S)-苯基乙二醇,在此基础上,利用全基因组分析方法从中钓取一种新型(S)-羰基还原酶基因scrr II,构建了目标基因的重组菌,实现了高底物浓度下高效低成本不对称转化制备(S)-苯基乙二醇。
发明内容
本发明的目的在于根据近平滑假丝酵母基因组序列分析方法,克隆出一种新型(S)-羰基还原酶基因scrr II,利用构建的重组菌CCTCC NO:M 209289催化2-羟基苯乙酮,高效制备具有光学活性的(S)-苯基乙二醇的方法,产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为100%e.e.和98.1%。
本发明的技术方案:一株制备(S)-苯基乙二醇的重组菌,其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETSCR II,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:M 209290。
所述重组菌株CCTCC NO:M 209290的构建方法,将羰基还原酶基因scrII插入载体pET28a构建重组质粒pETSCR II,重组质粒pETSCR II转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,通过含100μg/mL卡那霉素的LB平板筛选,获得重组菌株E.coli BL21/pETSCR II,即CCTCC NO:M 209290;步骤为:
①(S)-羰基还原酶基因scr II的获取
用于钓取scr II基因的菌种为近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC NO:M 203011;
羰基还原酶基因scr II的克隆:以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC NO:M203011基因组为模板,以含有BamHI酶切位点的
SCR II_F:5’-ATCGGATCCATGGGCGAAATCG AATCTTATTGC-3’,和含有XhoI酶切位点的
SCR II_R:5’-TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATCGAC-3’为引物,PCR扩增反应获得scr II基因,基因全长840bp;基因scr II的GenBank编号为:GQ411433;
PCR体系为:ddH2O 35.5μL,10×Reaction Buffer 5μL,25mmol/L Mg2+3μL,2.5mmol/L dNTP 4μL,Taq DNA Polymerase 0.5μL,25pmol/μL的引物SCRII_F和SCR II_R各1μL;
PCR反应条件:94℃4min;94℃1min、56℃1min、72℃1min,30个循环;72℃10min;
②重组质粒pETSCR II的构建:
利用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因scr II和表达载体pET28a分别进行双酶切,处理后的DNA片断通过粘性末端连接,获得带有羰基还原酶基因scr II的重组质粒pETSCRII;
③重组质粒转化大肠杆菌:取重组质粒pETSCR II 2μL,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,转化液涂布到含有100μg/mL卡那霉素的LB平板上,37℃倒置培养过夜,获得阳性克隆E.coli BL21/pETSCR II。
利用重组菌CCTCC NO:M209290不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法:
(1)重组菌株CCTCC NO:M 209290的培养
LB液体培养基,以g/100mL计:胰蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,NaCl 1%,pH7.0;需要时使用前加入卡那霉素100μg/mL,固体培养基再添加1.5%琼脂粉;
培养条件:挑取重组菌CCTCC NO:M 209290的单菌落接种于3mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃,200rpm振荡培养过夜;取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃,200rpm振荡培养至OD6000.6,在培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.1mmol/L,于30℃诱导培养6h;10,000rpm离心10min,收集菌体,用生理盐水洗涤两次,收集得到重组菌全细胞;
(2)以重组菌全细胞为催化剂,以2-羟基苯乙酮为底物,进行不对称转化反应:在1mL 0.1mol/L pH4.5~6.0的醋酸缓冲液,或者1mL 0.1mol/L pH6.5~7.5的磷酸缓冲液,或者1mL 0.1mol/L pH8.0~9.0的Tris-HCl缓冲中进行反应,底物2-羰基苯乙酮浓度为5g/L,反应温度为25~35℃;
采用重组菌全细胞生物转化:重组菌全细胞浓度为0.1g/mL,反应48h,反应前不需要加入辅酶,产物为(S)-苯基乙二醇;
或采用重组菌破碎后的上清液经纯化后的重组蛋白SCRII生物转化:重组蛋白SCRII浓度为1~2μg/mL,反应8h,反应前加5mmol/L辅酶NADPH,产物为(S)-苯基乙二醇;
反应结束后,将反应混合物离心除去固体物质,上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取,有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100)进行分析,条件为Chiralcel OB-H柱(4.6mm×25cm;Daicel Chemical Ind.,Ltd.,Japan),流动相为正己烷/异丙醇(9/1,VN),流速0.5mL/min,检测波长为215nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
产物(S)-苯基乙二醇对映过量值的计算:
对映过量值(e.e.%)=[(CS-CR)/(CR+CS)]×100%
产物(S)-苯基乙二醇产率的计算:产率(%)=CS/C0×100%
式中CR为反应后(R)-苯基乙二醇的浓度,CS为反应后(S)-对映体的浓度,C0为反应前底物(R)-苯基乙二醇的浓度。
以重组菌细胞为催化剂,不对称生物转化反应后,产物均为(S)-苯基乙二醇。
所述重组蛋白SCRII的纯化:
MCAC-0缓冲液:20mmol/L Tris/HCl,pH8.0;
MCAC-20:在MCAC-0缓冲液中加入20mmol/L的咪唑,pH8.0;
MCAC-200:在MCAC-0缓冲液中加入200mmol/L的咪唑,pH8.0;
菌体收集:将收集的重组菌全细胞用MCAC-0缓冲液重悬,超声破碎:工作时间2s,间歇时间6s,共20min;破碎液16,000rpm离心40min;弃沉淀,取上清进行后续的蛋白纯化工作;
蛋白纯化:先将上清挂Pharmacia公司的Ni柱两遍,用MCAC-20缓冲液洗脱杂蛋白,用MCAC-200缓冲液洗脱目的蛋白;再用Pharmacia公司的Hitrap柱蛋白脱盐,利用Pharmacia公司的蛋白纯化系统将蛋白溶液换为无盐的缓冲液;接着用Pharmacia公司的Resource Q阴离子交换柱,1×1cm,进行蛋白纯化;最后用Pharmacia公司的Superdex 200,HiLoad 26/60,进行蛋白纯化;经SDS-PAGE检测目的蛋白纯度达到95%以上。
本发明的有益效果:
成功从近平滑假丝酵母基因组中克隆出一种新型(S)-羰基还原酶基因scr II,该基因全长840bp,Genbank序列号为GQ411433。
将scr II插入表达载体pET28a中,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),构建带有目的基因的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETSCR II。
通过生物转化反应条件的优化,在pH5.5的醋酸缓冲液中,利用0.1g/mL重组细胞对5g/L的底物2-羟基苯乙酮催化转化48h,最终产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.,产率为98.1%。
在pH5.5的醋酸缓冲液中,利用约2μg的重组纯蛋白对6g/L底物2-羟基苯乙酮催化转化8h,最终产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e,产率为98.9%。
这些工作不仅为制备高光学纯度的(S)-苯基乙二醇提供了一种优良的催化剂,同时也为工业上采用生物法合成(S)-苯基乙二醇提供了有效途径。生物材料样品保藏
大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pETSCRII,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,简称CCTCC,保藏编号:CCTCC NO:M 209290,保藏日期:2009年11月29日。
具体实施方式
实施例1scrII基因的获得:
以scr基因(DQ675534)为出发序列,在近平滑假丝酵母基因组中(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/c_parapsilosis)发现一段同源序列scr II,利用引物SCR II_F和SCR II_R,以近平滑假丝酵母基因组为模板,采用PCR的方法来扩增scr II基因。
SCR II_F:5′-ATCGGATCCATGGGCGAAATCGAATCTTATTGC-3′(BamH I)
SCR II_R:5′-TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATC GAC-3′(Xho I)
PCR体系为:ddH2O 35.5μL,10×Reaction Buffer 5μL,25mmol/L Mg2+3μL,2.5mmol/L dNTP 4μL,Taq DNA Polymerase 0.5μL,25pmol/μL的引物SCRII_F和SCR II_R各1μL;
PCR反应条件:94℃4min;94℃1min、56℃1min、72℃1min,30个循环;72℃10min。PCR反应获得scr II基因,GenBank编号为:GQ411433。
实施例2重组质粒pETSCRII的获得:
利用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因scr II和载体pET28a分别进行双酶切处理,处理后DNA片断通过粘性末端连接,获得带有scr II基因的重组质粒pETSCR II。利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(购买于北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pETSCR II。
实施例3重组菌株E.coli BL21/pETSCRII的获得:
重组质粒pETSCR II转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,通过含有100μg/mL卡那霉素的LB平板筛选,获得重组菌株E.coli BL21/pETSCRII。该重组大肠杆菌送中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号:CCTCC NO:M209290。
重组质粒转化大肠杆菌:在每管的100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10μL连接产物,轻轻混匀后冰浴30min。转入42℃水浴中,热击90s。快速转移至冰浴中,冷却2min。每管中加入700μL LB液体培养基,37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min,弃上清600μL,剩余菌液混匀后涂布含100μg/mL卡那霉素的LB平板上,37℃倒置培养过夜。
LB液体培养基:胰蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,NaCl 1%,pH 7.0。使用前加入卡那霉素(100μg/mL),固体培养基添加1.5%琼脂粉。
挑取4个克隆,转接入装有3mL的含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养12h,利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)从培养的菌液中提取质粒。经下列酶切体系验证:10×Buffer H 2μL,质粒DNA 5μL,BamH I 0.5μL,XhoI 0.5μL,ddH2O将体系补足20μL。酶切结果为阳性的菌体即为重组菌E.coli BL21/pETSCRII。
实施例4重组菌的培养:
挑取实施例3中E.coli BL21/pETSCR II的单菌落接种于3mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃,200rpm振荡培养过夜,取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃,200rpm振荡培养至OD600为0.6后,加入0.1mmol/L异丙基-B-D-硫代半乳糖苷,于30℃诱导培养6h;10,000rpm离心10min收集菌体,用生理盐水洗涤菌体两次,收集重组菌全细胞。
实施例5
取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞,在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH5.0)中,加入5g/L底物2-羟基苯乙酮,混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心,取上清液萃取,产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为83.1%e.e.,产率为68.4%。
实施例6
取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞,在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH5.5)中,加入5g/L底物2-羟基苯乙酮,混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心,取上清液萃取,产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.,产率为98.1%。
实施例7
取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞,在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.0)中,加入5g/L底物2-羟基苯乙酮,混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心,取上清液萃取,产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为95.3%e.e.,产率为79.7%。
实施例8
取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞,在1mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)中,加入5g/L底物2-羟基苯乙酮,混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心,取上清液萃取,产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为88.7%e.e.,产率为68.2%。
实施例9
取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞,在1mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中,加入5g/L底物2-羟基苯乙酮,混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心,取上清液萃取,产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为71.5%e.e.,产率为57.6%。
实施例10
取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞,在1mL 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中,加入5g/L底物2-羟基苯乙酮,混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心,取上清液萃取,产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为51.9%e.e.,产率为39.1%。
实施例11
取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞,在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH5.5)中,加入5g/L底物2-羟基苯乙酮,混匀后在25℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心,取上清液萃取,产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为84.5%e.e.,产率为68.6%。
实施例12
取0.1g/mL实施例4中的重组菌全细胞,在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH5.5)中,加入5g/L底物2-羟基苯乙酮,混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应48h。反应结束后混合物离心,取上清液萃取,产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为94.3%e.e.,产率为73.7%。
实施例13目标蛋白的表达
用实施例4中的菌液,进行SDS-PAGE检测,凝胶定量软件(Quantity One)分析蛋白表达;将收集的重组菌溶解于20mmol/L,pH8.0的Tris-HCl缓冲液中,超声破碎20min,工作时间2s,间歇时间6s。将破碎后的菌体于16,000rpm离心40min,分别取上清和沉淀,SDS-PAGE检测目标蛋白的表达。
实施例14目标蛋白的纯化
用实施例12中所获得的菌体上清在蛋白纯化系统中进行蛋白纯化。第一步将上清挂Ni柱(His-Trap Kit,Pharmacia)两次,用MCAC-50的缓冲液洗脱杂蛋白,用MCAC-200的缓冲液洗脱含有目的蛋白的溶液;第二步用Hitrap(Pharmacia)柱蛋白脱盐,缓冲液A:20mmol/L Tris/HCl,500mmol/L NaCl,pH8.0。缓冲液B:20mmol/L Tris/HCl,pH 8.0。利用蛋白纯化系统(Pharmacia,Uppsala,Sweden),将蛋白溶液由A缓冲液换为B缓冲液;第三步用Resource Q阴离子交换柱(1×1cm,Pharmacia)进行蛋白纯化。缓冲液A:20mmol/L Tris/HCl,pH8.0。缓冲液B:20mmol/L Tris/HCl,1mol/LNaCl,pH8.0。利用蛋白纯化系统(Pharmacia,Uppsala,Sweden),收集含有目的蛋白的溶液;第四步用Superdex 200(HiLoad 26/60,Pharmacia)进行蛋白纯化。缓冲液:20mmol/LTris/HCl,150mmol/L NaCl,pH8.0。利用蛋白纯化系统(Pharmacia,Uppsala,Sweden),最终收集目的蛋白。
经过以上四个步骤的纯化工作,蛋白液经SDS-PAGE检测为单一条带,纯度可达95%以上。
实施例15
用实施例13中所获得的1μg纯蛋白进行生物转化实验。在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 5.5)中,分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮,5mmol/LNADPH,混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应8h。反应结束后混合物离心,取上清液萃取,产物为(R)-苯基乙二醇的光学纯度为96.8%e.e.,产率为90.2%。
实施例16
用实施例13中所获得的2μg纯蛋白进行生物转化实验。在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 5.5)中,分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮,5mmol/L NADPH,混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应8h。反应结束后混合物离心,取上清液萃取,产物为(R)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.,产率为98.9%。
Claims (4)
1.一株制备(S)-苯基乙二醇的重组菌,其分类命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pETSCRII,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCCNO:M 209290。
2.权利要求1所述重组菌株CCTCC NO:M 209290的构建方法,其特征是将羰基还原酶基因scr II插入载体pET28a构建重组质粒pETSCR II,重组质粒pETSCRII转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,通过含100μg/mL卡那霉素的LB平板筛选,获得重组菌株E.coli BL21/pETSCRII,即CCTCCNO:M 209290;步骤为:
①(S)-羰基还原酶基因scr II的获取
用于钓取scr II基因的菌种为近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC NO:M 203011;
羰基还原酶基因scr II的克隆:以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC NO:M203011基因组为模板,以含有BamHI酶切位点的
SCR II_F:5’-ATCGGATCCATGGGCGAAATCG AATCTTATTGC-3’,和含有XhoI酶切位点的
SCR II_R:5’-TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATCGAC-3’为引物,PCR扩增反应获得scr II基因,基因全长840bp;基因scr II的GenBank编号为:GQ411433;
PCR体系为:ddH2O 35.5μL,10×Reaction Buffer 5μL,25mmol/L Mg2+3μL,2.5mmol/L dNTP 4μL,Taq DNA Polymerase 0.5μL,25pmol/μL的引物SCR II_F和SCR II_R各1μL;
PCR反应条件:94℃4min;94℃1min、56℃1min、72℃1min,30个循环;72℃10min;
②重组质粒pETSCR II的构建:
利用限制性内切酶BamHI和XhoI对目的基因scr II和表达载体pET28a分别进行双酶切,处理后的DNA片断通过粘性末端连接,获得带有羰基还原酶基因scr II的重组质粒pETSCR II;
③重组质粒转化大肠杆菌:取重组质粒pETSCR II 2μL,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,转化液涂布到含有100μg/mL卡那霉素的LB平板上,37℃倒置培养过夜,获得阳性克隆E.coli BL21/pETSCR II。
3.利用构建的重组菌CCTCC NO:M209290不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法,其特征是
(1)重组菌株CCTCC NO:M 209290的培养
LB液体培养基,以g/100mL计:胰蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,NaCl 1%,pH7.0;需要时使用前加入卡那霉素100μg/mL,固体培养基再添加1.5%琼脂粉;
培养条件:挑取重组菌CCTCC NO:M 209290的单菌落接种于3mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃,200rpm振荡培养过夜;取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃,200rpm振荡培养至OD600 0.6,在培养物中加入诱导物0.1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,于30℃诱导培养6h;10,000rpm离心10min,收集菌体,用生理盐水洗涤两次,收集得到重组菌全细胞;
(2)以2-羟基苯乙酮为底物,进行不对称转化反应:在1mL 0.1mol/LpH4.5~6.0的醋酸缓冲液,或者1mL 0.1mol/L pH6.5~7.5的磷酸缓冲液,或者1mL 0.1mol/L pH8.0~9.0的Tris-HCl缓冲中进行反应,底物浓度2-羰基苯乙酮为5g/L,反应温度为25-35℃;
采用重组菌全细胞生物转化:重组菌全细胞浓度为0.1g/mL,反应48h,反应前不需要加入辅酶,产物为(S)-苯基乙二醇;
或采用重组菌破碎后的上清液经纯化后的重组蛋白SCRII生物转化:重组蛋白SCRII浓度为1~2μg/mL,反应8h,反应前加5mmol/L辅酶NADPH,产物为(S)-苯基乙二醇。
4.根据权利要求3所述的不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法,其特征是重组蛋白SCRII的纯化
菌体收集:将收集的重组菌全细胞用MCAC-0缓冲液重悬,超声破碎:工作时间2s,间歇时间6s,共20min;破碎液16,000rpm离心40min;弃沉淀,取上清进行后续的蛋白纯化工作;
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CN2009102631479A CN101717745B (zh) | 2009-12-16 | 2009-12-16 | 一株羰基还原酶重组菌高效制备(s)-苯基乙二醇的方法 |
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