CN101273137A - 用于酮基化合物的立体选择还原的氧化还原酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在辅因子的情况下用氧化还原酶还原，其特征在于使用具有氨基酸序列的氧化还原酶，在所述氨基酸序列中(a)至少70％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8之一的氨基酸，或(b)至少55％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：2的氨基酸，或(c)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：3的氨基酸，或(d)至少75％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：4的氨基酸，或(e)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：5的氨基酸，或(f)至少50％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：7的氨基酸，或(g)至少72％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：129的氨基酸。

Description

用于酮基化合物的立体选择还原的氧化还原酶
本发明涉及用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物用氧化还原酶还原。此外，本发明涉及用于酮基化合物向手性羟基化合物的对映体选择性还原的新的氧化还原酶。
光学活性化合物是对于药学活性化合物、芳香物质、信息素、农业药品和酶抑制物的合成具有广泛应用性的有价值的手性子(chiron)。因而，手性化合物以及手性合成技术的提高的需求是在药物工业中特别受注意的，因为在将来，外消旋化合物难以用作药物制品。
原手性酮基化合物的不对称还原是立体选择性催化的一部分，其中生物催化构成了对化学催化的强有力的竞争技术。化学的不对称氢化作用需要使用高度毒性和环境有害的重金属催化剂，使用极端的因而耗能的反应条件以及大量的有机溶剂。此外，这些方法通常特征是副反应和不充分的对映体过量(enantiomeric excesse)。
在自然中，原手性酮基化合物向羟基化合物的还原和相反的过程在许多生物化学途径中发生，在初级新陈代谢和在次级新陈代谢中，在每个器官中，并且被不同种类的仲醇脱氢酶和氧化还原酶催化。通常地，这些酶是辅因子依赖性的。
对原手性酮基化合物向手性羟基化合物的还原使用生物催化剂的基础可能性过去在模型系统的基础上被反复展现，其中分离的氧化还原酶和各种全细胞生物转化系统被用于该任务。从而，对于适度的反应条件、没有副产物和通常显著更可实现的对映体过量，生物催化方法成为非常有利的。对于可实现的对映体过量、降解产物和副产物的形成、以及对于产物分离，相对于涉及全细胞的方法，使用分离的酶是有益的。此外，使用全细胞处理不可能用于每一个化学公司，因为为此需要特定设备和知识。
近来，可能展现的是，在具有有机溶剂的水性/有机两相系统中使用分离的氧化还原酶是极度有效的、经济的以及在高浓度(＞5％)也是可行的。在所描述的系统中，通常在水中难溶的要还原的酮基化合物从而形成与有机溶剂在一起的有机相。并且，有机溶剂本身可能部分地被一起分配。在这种情况下，有机相从要还原的酮基化合物形成(DE10119274、DE 10327454.4、DE 103 37401.9、DE 103 00 335.5)。辅酶再生因而通过仲醇的同时发生的氧还而实现，为此，在大多数情况下，使用便宜的水可混合的2-丙醇。
高对映体选择性的适合的R-和S-特异性氧化还原酶和脱氢酶的实例有：
来自Candida parapsilosis的羰基还原酶(CPCR)(US 5,523,223和US 5,763,236(Enzyme Microb Technol.1993 Nov；15(11)：950-8))和来自Pichia capsulata(DE10327454.4)的羰基还原酶。来自红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)的羰基还原酶(RECR)(US 5,523,223)、来自Norcardia fusca(Biosci.Biotechnol.Biochem.，63(10)(1999)，pp.1721-1729)、(Appl Microbiol Biotechnol.2003 Sep；62(4)：380-6.Epub 2003 Apr 26)和赤红球菌(Rhodococcus ruber)(J Org Chem.2003Jan 24；68(2)：402-6)的羰基还原酶。
来自乳杆菌属(Lactobacillus)(Lactobacillus kefir(US5200335)、Lactobacillus brevis(DE 19610984 A1)(Acta Crystallogr D BiolCrystallogr.2000 Dec；56 Pt 12：1696-8)、Lactobacillus minor(DE10119274)或假单胞菌属(Pseudomonas)(US 05385833)(ApplMicrobiol Biotechnol.2002 Aug；59(4-5)：483-7.Epub 2002 Jun 26.，J.Org.Chem.1992，57，1532)的R-特异性仲醇脱氢酶。
然而，迄今已知的酶还不足够用于开发酮基化合物的立体选择性还原的完整市场潜力。一个方面，这可以由工业酶对于底物谱、最适pH值以及温度和溶剂稳定性具有非常不同的性质的事实来解释，所述性质通常是相互补充的。因而，甚至相对类似的同源酶可能对于一种特定的底物展现完全不同的转化行为。另一方面，不是几乎所有的所描述的酶都被克隆和可过量表达到足够的数量，这意味着这些酶对以工业使用是不可获得的。为了尽可能广泛地发挥酶学不对称氢化作用的合成潜力，因而必需的是拥有一包尽可能地广泛的、不同的工业可接受的氧化还原酶，所述氧化还原酶进一步适合于在具有有机溶剂的水性/有机两相系统中使用。
现在本发明的主题是多种新的、对映体选择性R-和S-特异性氧化还原酶，特征在于在水性/有机两相系统中良好的稳定性以及在大肠杆菌Escherichia coli中良好的表达能力(＞500单位/g E.coli湿重)，以及是酮基化合物向相应的手性羟基化合物的对映体选择性酶促还原的过程。
根据本发明的氧化还原酶的特征在于它们具有氨基酸序列，在所述氨基序列中：
(a)至少70％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8之一的氨基酸，或
(b)至少55％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：2的氨基酸，或
(c)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：3的氨基酸，或
(d)至少75％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：4的氨基酸，或
(e)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：5的氨基酸，或
(f)至少50％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：7的氨基酸，或
(g)至少72％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：129的氨基酸。
根据SEQ ID NO：1的多肽可以从酵母、特别是从红酵母属(Rhodotorula)的酵母、特别是从粘质红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)获得。
本发明的进一步的主题是核酸序列SEQ ID NO：9，其编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白。
来自粘质红酵母的氧化还原酶促还原，例如，2-辛酮为S-2-辛醇，并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。来自粘质红酵母的氧化还原酶是，例如，具有SDS-凝胶中测定的分子量30±2k Da的同型二聚体。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围从7.0到8.0，氧化反应的最佳pH值在8.5-10的范围内。来自粘质红酵母的氧化还原酶展现了良好的温度和pH值稳定性，并在5.5到10的pH值范围中和最高达35℃的温度下、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。此外，来自粘质红酵母的氧化还原酶展现了有机溶剂中的高稳定性。
根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的多肽可以从酵母、特别是从毕赤酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)、Pachysolen、Debaromyces或Issatschenkia属的酵母、特别是从粉状毕赤酵母(Pichia farinose)DSMZ 3316或Candida nemodendra DSMZ70647获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQ ID NO：10和核酸序列SEQ ID NO：16，其分别编码氨基酸序列SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8。所述氧化还原酶优选地还原2-丁酮成R-2-丁醇，并优选地氧化2-丁醇的两种对映体中的R-2-丁醇。
来自粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)的氧化还原酶展现了与针对R-2-辛醇相比显著更高的针对R-2-丁醇和2-丙醇的活性，此外，该酶展现了与针对2-辛酮相比显著更高的针对丙酮和2-丁酮的活性。
然而，来自Candida nemodendra的氧化还原酶展现了针对R-2-丁醇、2-丙醇和R-2-辛醇的相似的活性，此外，该酶还展现了针对2-辛酮的大约相似的活性。
来自粉状毕赤酵母的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量27±2k Da的同型二聚体。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围从5.0到6.0，氧化反应的最佳pH值在7.5-10的范围内。来自粉状毕赤酵母的氧化还原酶展现了良好的pH值和溶剂稳定性，并在5.5到10的pH值范围中、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。
来自Candida nemodendra的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量27±2k Da的homomer。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值是pH6，氧化反应的最佳pH值范围从10到11。来自Candidanemodendra的氧化还原酶展现了良好的pH值和溶剂稳定性，并在6.5到9.5的pH值范围中、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。
根据SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7的多肽可以从酵母、特别是从毕赤酵母属和念珠菌属的酵母、特别是从树干毕赤酵母(Pichia stipitis)DSMZ 3651和Pichia trehalophila DSMZ 70391获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQ ID NO：11和核酸序列SEQ ID NO：15，其分别编码SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7的多肽。
来自毕赤酵母属和念珠菌属的酵母的羰基还原酶，其具有与氨基酸序列SEQ ID NO：3的至少65％同一性，或与氨基酸序列SEQ ID NO：7的至少50％同一性，优选地还原2-辛酮成S-2-辛酮，并优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它们还特别适合于4-卤代乙酰乙酸酯还原成R-4-卤代-3-羟基丁酸酯。
来自树干毕赤酵母的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量36±2k Da的同型二聚体。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围从5.5到6.5，氧化反应的最佳pH值范围是6.5-8.0。来自树干毕赤酵母的氧化还原酶展现了良好的pH值和溶剂稳定性，并在5.5到10的pH值范围中、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。
来自Pichia trehalophila的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量36±2k Da的homomer。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围是7-7.5，氧化反应的最佳pH值范围是7-8。
根据SEQ ID NO：4的多肽可以从明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌、特别是从肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)DSMZ 5576获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQ ID NO：12，其编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的蛋白。所述多肽特别适合于2-辛酮向R-2-辛醇的还原，以及适合于R-2-辛醇的氧化。它还非常适合于4-卤代乙酰乙酸酯向S-4-卤代-3-羟基丁酸酯的还原。
来自肉色明串珠菌的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量27±2k Da的同型二聚体。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围是5.0到6.0，氧化反应的最佳pH值范围是6.0-9.0。来自肉色明串珠菌的氧化还原酶展现了良好的温度、pH值和溶剂稳定性，并在4.5到10的pH值范围中以及在最高达35℃的温度下、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。
根据SEQ ID NO：5的多肽可以从放线细菌(Actinobacteria)纲的细菌、特别是从微杆菌属(Microbacterium)的细菌、特别是从微杆菌属细菌DSMZ 20028获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQ ID NO：13，其编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的蛋白。所述多肽非常适合于2-辛酮向S-2-辛醇的还原，并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它还非常适合于4-卤代乙酰乙酸酯向R-4-卤代-3-羟基丁酸酯的还原。
来自微杆菌属细菌DSMZ 20028的氧化还原酶是，例如，具有SDS-凝胶中测定的分子量35±2k Da的同型四聚体。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围是6.0到7.5，氧化反应的最佳pH值范围是7.5-9.5。来自微杆菌属细菌的氧化还原酶展现了良好的温度、pH值和溶剂稳定性，并在4.5到10的pH值范围中以及在最高达50℃的温度下、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。
根据SEQ ID NO：6的多肽可以从放线细菌(Actinobacteria)纲的细菌、特别是从戈登氏菌属(Gordona)的细菌、特别是从深红戈登氏菌(Gordona rubripertincta)DSMZ 43570获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQ ID NO：14，其编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：6的蛋白。所述多肽非常适合于2-辛酮向S-2-辛醇的还原，并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它还非常适合于4-卤代乙酰乙酸酯向R-4-卤代-3-羟基丁酸酯的还原。
来自深红戈登氏菌DSMZ 43570的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量41±3k Da的homomer。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围是4.5到5.5，氧化反应的最佳pH值范围是7.5到9.5。来自深红戈登氏菌DSMZ 43570的氧化还原酶展现了良好的温度、pH值和溶剂稳定性，并在4.5-10的pH值范围中以及在最高达55℃的温度下、甚至数小时的孵育时间，仅显示了微小的活性损失。
根据SEQ ID NO：129的多肽可以从酵母、特别是从路德酵母属(Lodderomyces)、特别是从Lodderomyces elongisporus DSMZ 70320获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQ ID NO：130，其编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：129的蛋白。所述多肽非常适合于2-辛酮向S-2-辛醇的还原，并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它还非常适合于4-卤代乙酰乙酸酯向R-4-卤代-3-羟基丁酸酯的还原。
此外，本发明涉及融合蛋白，其特征在于它们代表具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：129的氧化还原酶或其同源物，其在N-末端或羧基末端肽键地连接到进一步的多肽。融合蛋白可以，例如，更容易地从其他蛋白分离，或可以以更大的数量重组表达。
此外，本发明涉及抗体，所述抗体特异性地结合根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：129的氧化还原酶或结合其同源物。这些抗体的产生根据已知的方法通过免疫适合的动物和随后回收抗体来进行。所述抗体可以是单克隆的或多克隆的。
氨基酸序列的比较可以，例如，在互联网上在蛋白质数据库例如SWISS-PROT、PIR以及在DNA数据库例如EMBL、GeneBank等等中使用FASTA程序或BLAST程序进行。
在这样做时，通过BLAST算法(Basic Local Alignement SearchTool)(Altschul et al.1990，Proc.Natl.Acd Sci.USA.87：2264-2268)的方式确定最佳比对。作为基础，使用PAM30矩阵作为评估序列相似性的计分矩阵。(Dayhoff；M.O.，Schwarz，R.M.，Orcutt，B.C.1978.，Amodel of evolutionary change in Proteins“in，Atlas of Protein Sequenceand structure”5(3)M.O.Dayhoff(ed)345-352，National BiomedicalResearch foundation)。
此外，本发明涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQID NO：1的片段，每个片段具有数量超过26个的氨基酸。
本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氢酶，其包含N-末端氨基酸序列MPATLRLDK(SEQ ID NO：17)和/或C-末端氨基酸序列QALAAPSNLAPKA(SEQ ID NO：18)和/或内部部分序列VEIIKTQVQD(SEQ ID NO：19)、KVAIITGGASGIGL(SEQ ID NO：20)、SCYVTPEG(SEQ ID NO：21)、TDFKVDGG(SEQ ID NO：20)、VMFNNAGIMH(SEQ ID NO：23)或VHAREGIRIN(SEQ ID NO：24)之一。
此外，本发明还涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQ ID NO：2的片段，每个片段具有数量超过15个的氨基酸。
本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氢酶，其包含N-末端氨基酸序列MAYNFTNKVA(SEQ ID NO：25)和/或C-末端氨基酸序列TTLLVDGGYTAQ(SEQ ID NO：26)和/或内部部分序列EYKEAAFTN(SEQ ID NO：27)、NKVAIITGGISGIGLA(SEQ ID NO：28)、DVNLNGVFS(SEQ ID NO：29)、HYCASKGGV(SEQ ID NO：30)、NCINPGYI(SEQ ID NO：31)或LHPMGRLGE(SEQ ID NO：32)之一。
此外，本发明涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQID NO：3的片段，每个片段具有数量超过15个的氨基酸。
本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氢酶，其包含N-末端氨基酸序列MSIPATQYGFV(SEQ ID NO：33)和/或C-末端氨基酸序列SAYEGRVVFKP(SEQ ID NO：34)和/或内部部分序列CHSDLHAIY(SEQ ID NO：35)、GYQQYLLVE(SEQ ID NO：36)、TFDTCQKYV(SEQ ID NO：37)、LLTPYHAM(SEQ ID NO：38)、LVSKGKVKP(SEQ ID NO：39)、GAGGLGVNG(SEQ ID NO：40)、IQIAKAFGAT(SEQ ID NO：41)或LGSFWGTS(SEQ ID NO：42)之一。
此外，本发明涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQID NO：4的片段，每个片段具有数量超过18个的氨基酸。
本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氢酶，其包含N-末端氨基酸序列MTDRLKNKVA(SEQ ID NO：43)和/或C-末端氨基酸序列AEFVVDGGYLAQ(SEQ ID NO：44)和/或内部部分序列VVITGRRAN(SEQ ID NO：45)、GGASIINMS(SEQ ID NO：46)、TQTPMGHI(SEQID NO：47)或GYIKTPLVDG(SEQ ID NO：48)之一。
此外，本发明涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQID NO：5的片段，每个片段具有数量超过18个的氨基酸。
本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氢酶，其包含N-末端氨基酸序列MKALQYTKIGS(SEQ ID NO：49)和/或C-末端氨基酸序列LAAGTVRGRAVIVP(SEQ ID NO：50)和/或内部部分序列CHSDEFVMSLSE(SEQ ID NO：51)、VYGPWGCGRC(SEQ ID NO：52)、VSLTDAGLTPYHA(SEQ ID NO：53)、LRAVSAATVIAL(SEQID NO：54)或DFVGADPTI(SEQ ID NO：55)之一。
此外，本发明涉及蛋白片段，其特征在于它们代表氨基酸序列SEQID NO：6的片段，每个片段具有数量超过26个的氨基酸。
本发明的进一步的主题是微生物羰基脱氢酶，其包含N-末端氨基酸序列MKAIQIIQ(SEQ ID NO：56)和/或C-末端氨基酸序列DLRGRAVVVP(SEQ ID NO：57)和/或内部部分序列TAAGACHSD(SEQ ID NO：58)、TPYHAIKPSLP(SEQ ID NO：59)、DFVGLQPT(SEQ ID NO：60)、VYGAWGCG(SEQ ID NO：61)、DDARHLVP(SEQ ID NO：62)、MTLGHEGA(SEQ ID NO：63)或GGLGHVGIQLLRHL(SEQ ID NO：64)之一。
此外，本发明涉及包含一个或几个核酸序列的克隆载体，所述核酸序列编码根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：129的羰基还原酶或其同源物。此外，本发明包含克隆载体，其除了羰基还原酶之外包括用于NAD(P)的再生的适合的酶，例如，甲酸脱氢酶、醇脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。
此外，本发明涉及位于细菌、昆虫、植物或哺乳动物细胞中的、包含核酸序列的表达载体，所述核酸序列编码根据SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：129的羰基还原酶或其同源物，并以适合的方式连接到表达控制序列。此外，本发明涉及重组宿主细胞，其是细菌、酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞，并且用这样的表达载体转化或转染，还涉及根据培养这种重组宿主细胞获得羰基还原酶的生产方法。
适合的克隆载体是，例如，ppCR-Scrip、pCMV-Script、pBluescript(Stratagene)、pDrive克隆载体(Quiagen，Hilden，Germany)、pS Blue、pET Blue、pET LIC载体(Novagen，Madison，USA)和TA-PCR克隆载体(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)。
适合的表达载体是，例如，pKK223-3、pTrc99a、pUC、pTZ、pSK、pBluescript、pGEM、pQE、pET、PHUB、pPLc、pKC30、pRM1/pRM9、pTrxFus、pAS1、pGEx、pMAL或pTrx。
适合的表达控制序列是，例如，trp-lac(tac)启动子、trp-lac(trc)启动子、lac启动子、T7启动子或λpL启动子。
根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：129的氧化还原酶或其同源物可以以这样的方式获得，其中培养上述重组E.coli细胞，诱导相应的氧化还原酶的表达，随后在约10到18小时之后，通过超声波处理、在球形磨(Retsch，GmbH，HaanGermany 10分钟，24Hz)中用玻璃珠湿磨或使用高压匀化器来消化细胞。获得的细胞提取物可以直接使用或进一步纯化。为此，例如，细胞提取物被离心，获得的上清液进行离子交换层析，例如，通过在Q-Sepharose Fast(Pharmacia)上离子交换层析。
此外，本发明涉及用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在辅因子的情况下使用氧化还原酶来还原，其特征在于使用具有氨基酸序列的氧化还原酶，在所述氨基酸序列中
(a)至少70％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8之一的氨基酸，或
(b)至少55％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：2的氨基酸，或
(c)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：3的氨基酸，或
(d)至少75％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：4的氨基酸，或
(e)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：5的氨基酸，或
(f)至少50％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：7的氨基酸，或
(g)至少72％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：129的氨基酸。
根据本发明的所述方法的进一步优选的实施方式在于所述酮基化合物具有通式I
R1-C(O)-R2       (I)
其中所述R1代表以下部分之一
1)-(C1-C20)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，
2)-(C2-C20)-烯基，其中所述烯基是直链或支链的，并任选含有最多达四个双键，
3)-(C2-C20)-炔基，其中所述炔基是直链或支链的，并任选含有最多达四个三键，
4)-(C6-C14)-芳基，
5)-(C1-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基
6)-(C5-C14)-杂环，其是未取代的或被-OH、卤素、-NO2和/或-NH2取代一次、两次或三次，或
7)-(C3-C7)-环烷基，
其中在1)到7)中的上述部分是未取代的或相互独立地被-OH、卤素、-NO2和/或-NH2取代一次、两次或三次，
R2代表以下部分之一
8)-(C1-C6)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，
9)-(C2-C6)-烯基，其中所述烯基是直链或支链的，并任选含有最多达三个双键，
10)-(C2-C6)-炔基，其中所述炔基是直链或支链的，并任选含有两个三键，或
11)-(C1-C10)-烷基-C(O)-O-(C1-C6)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，并且是未取代的或被-OH、卤素、-NO2和/或-NH2取代一次、两次或三次，其中在8)到11)中的上述部分是未取代的或相互独立地被-OH、卤素、-NO2和/或-NH2取代一次、两次或三次。
此外，本发明涉及用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在辅因子的情况下使用氧化还原酶来还原，所述方法特征在于使用的氧化还原酶
(a)由来自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：130的组的核酸序列编码，或
(b)由核酸序列编码，该核酸序列的互补链在高度严格条件下与(a)中所述核酸序列之一杂交。
术语“芳基”被理解为在环内包含6到14个碳原子的芳香碳部分。-(C6-C14)-芳基部分是，例如，苯基、萘基，例如，1-萘基、2-萘基、联苯基，例如，2-联苯基、3-联苯基和4-联苯基，蒽基或芴基。联苯基部分、萘基部分以及特别是苯基部分是优选的芳基部分。术语“卤素”，被理解为来自氟、氯、溴、碘家族的元素。术语“-(C1-C20)-烷基”被理解为烃部分，它的碳链是线性链或是分支的，并且包含1到20个碳原子，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或葵基。术语“-C0-烷基”被理解为共价键。
术语“-(C3-C7)-环烷基”被理解为环烃部分，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。
术语“-(C5-C14)-杂环”代表单环或双环的5成员到14成员的杂环形环，其是部分地或完全地饱和的。N、O和S是杂原子的实例。衍生自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、唑、噻唑、异噻唑、四唑、1，2，3，5-噁噻二唑-2-氧化物、三唑酮、噁二唑酮、异噁唑酮、噁二唑啉硫酮、被F、-CN、-CF3或-C(O)-O-(C1-C4)烷基取代的三唑、3-羟基吡咯-2，4-二酮、5-氧代-1，2，4-噻二唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吲哚、异吲哚、吲唑、2，3-二氮杂萘、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、咔啉的部分，所述杂环的苯并稠合的，环戊二烯并、环己二烯并或环庚三烯并稠合的的衍生物。所述部分特别优选的是2-或3-吡咯基、苯基吡咯基，例如4-或5-苯基吡咯基、2-呋喃基、2-噻吩基、4-咪唑基、甲基咪唑基，例如1-甲基-2-、-4-或-5-咪唑基，1，3-噻唑-2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基，2-、3-或4-吡啶-N-氧化物、2-吡嗪基，2-、4-或5-嘧啶基，2-、3-或5-吲哚基，取代的2-吲哚基，例如1-甲基、5-甲基、5-甲氧基-、5-苄氧基-、5-氯-或4，5-二甲基-2-吲哚基，1-苄基-2-或-3-吲哚基，4，5，6，7-四氢-2-吲哚基，环庚三烯并[b]-5-吡咯基，2-、3-或4-喹啉基，1-、3-或4-异喹啉基，1-氧代-1，2-二氢-3-异喹啉基，2-喹喔啉基，2-苯并呋喃基，2-苯并噻吩基，2-苯并噁唑基或苯并噻唑基或二氢吡啶基，吡咯烷基，例如2-或3-(N-甲基吡咯烷基)，哌嗪基，吗啉基，硫代吗啉基，四氢噻吩基或苯并二氧杂环戊烷基。
优选的具有式I的化合物是，例如，4-氯-乙酰乙酸乙酯，乙酰乙酸甲酯，8-氯-6-氧代辛酸乙酯，3-氧代戊酸乙酯，4-羟基-2-丁酮，2-氧代戊酸乙酯，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯，丙酮酸乙酯，乙醛酸乙基苯基酯，1-苯基-2-丙酮，2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-酮，苯乙酮，2-辛酮，3-辛酮，2-丁酮，1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙烷-1-酮，2，5-己二酮，1，4-二氯-2-丁酮，乙酸基丙酮，苯酰甲基氯，4-溴乙酰乙酸乙酯，1，1-二氯丙酮，1，1，3-三氯丙酮或1-氯丙酮。
在根据本发明的方法中，氧化还原酶可以以完全纯化的或部分纯化的状态使用，或者所述方法可以用含有根据本发明的氧化还原酶的细胞来进行。在这样做时，使用的细胞可以以天然的、渗透化的或裂解的状态来提供。优选的相应地使用根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：129的氧化还原酶或其同源物。
每kg要转化的式I的化合物使用5.000到10 Mio U的氧化还原酶(没有上限)。酶单位1U相应于每分钟(min)转化1μmol式I化合物所需的酶数量。
酶促还原本身在温和条件下进行，从而产生的醇不进一步反应。根据本发明的方法展现了高残留时间、和产生的手性醇的一般超过95％的对映异构纯度、和高产率，相对于所采用的酮基化合物的量。
在根据本发明的方法中，基于总体积，以3％到50％的数量、优选的5％到40％、特别是10％-30％来使用羰基化合物。
此外，本发明的优选的实施方式的特征在于在还原期间形成的NAD或NADP被分别持续地还原成NADH或NADPH，使用共底物。
所述共底物分别与相应的醛或酮以及NADH或NADPH反应，分别借助于氧化还原酶和NAD或NADP。这分别导致NADH和NADPH的再生。基于总体积，用于借此再生的共底物的比例从按体积的5％到95％。
对于辅因子的再生，可以添加另外的醇脱氢酶。适合的NADH依赖性醇脱氢酶是可获得的，例如，来自面包酵母、来自Candida boidinii、Candida parapsilosis或Pichia capsulata。此外，适合的NADPH依赖性醇脱氢酶在短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(DE 19610984 A1)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)(DE 10119274)、假单胞菌(Pseudomonas)(US5,385,833)中或在布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobium brockii)中存在。这些醇脱氢酶的适合的共底物是已经提及的仲醇，例如乙醇、2-丙醇(异丙醇)、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-辛醇或环己醇。
此外，辅因子再生也可以使用例如NAD-或NADP-依赖性加酸脱氢酶来实现(Tichkov等人，J.Biotechnol.Bioeng.[1999]64，187-193，Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADPspecific Formate dehydrogenase)。甲酸脱氢酶的适合的共底物是，例如，甲酸的盐，如甲酸铵、甲酸钠或甲酸钙。然而，根据本发明的方法优选地没有这种额外的脱氢酶来进行，即，发生底物联结的辅酶再生。
酶促还原进行的反应混合物的水性部分优选的含有缓冲液，例如，磷酸钾、tris/HCl或三乙醇胺缓冲液，具有5到10的pH值，优选的6到9的pH值。此外，所述缓冲液可以包含离子用于稳定或活化所述酶，例如锌离子或镁离子。
当进行本发明的方法时，温度适合地在约10℃到70℃的范围内，优选的20℃到40℃。
在根据本发明的方法的进一步优选的实施方式中，在存在有机溶剂的情况下实现所述酶学转化，所述溶剂是与水不可混溶的，或与水可混溶的仅到有限的程度。例如，所述溶剂是对称的或不对称的二(C1-C6)烷基酯、直链或支链的烷烃或环烷烃或同时作为共底物的水可溶的仲醇。例如，优选的有机溶剂是乙醚、叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸丁酯、庚烷、己烷、2-辛醇、2-庚醇、4-甲基-2-戊醇或环己烷。同时，所述溶剂也可以充当辅因子再生的共底物。
如果分别使用水可溶的溶剂和共底物，反应批次由水性和有机相构成。底物根据它的溶解度分布在有机相和水相中。基于总反应体积，有机相一般具有5到95％的比例，优选的10％到90％。优选的机械地混合两种液相从而在它之间产生大的表面。同样在这个实施方式中，在酶促还原期间分别形成的NAD或NADP被分别还原回NADH或NADPH，使用如上描述的共底物。
NADH或NADPH分别在水相中的浓度一般从0.001mM到1mM，特别是从0.01mM到0.1mM。
在根据本发明的方法中，氧化还原酶/脱氢酶的稳定剂可以另外使用。适合的稳定剂是，例如，甘油、山梨醇、1，4-DL-二硫苏糖醇、二甲亚砜(DMSO)。
例如，在由玻璃或金属制成的封闭反应容器中进行根据本发明的方法。为此，成分被单独地转移到反应容器中并在气体，例如氮气或空气的情况下搅动。反应时间从1小时到48小时，特别是从2小时到24小时。
随后，加工反应混合物。为此，分离水相，过滤有机相。所述水相可以任选的提取一次或多次并可以如有机相一样进一步处理。随即，任选的从过滤的有机相蒸发溶剂。
此外，本发明涉及获得式II的手性羟基化合物的方法，
R1-C(OH)-R2      (II)
其中R1和R2如以上定义的，其特征在于
a)在存在根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：129的本发明的氧化还原酶或其同源物之一、NAD(P)和水的情况下孵育含有式II的外消旋化合物的混合物，从而式II的羟基化合物的对映体被转化成相应的酮化合物和NAD(P)H，以及
b)分离式II的羟基化合物的剩余的对映体。
如果使用根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：129的羰基还原酶，优选的获得相应的手性R-羟基化合物。如果使用根据SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8的羰基还原酶，优选的获得相应的S-羟基化合物。
反应混合物基本上与上述的式I的酮基化合物的对映异构特异性还原方法的相同。然而，式I的酮基化合物的对映异构特异性还原和式II化合物的外消旋混合物不同，式II的羟基化合物的仅一种对映体被对映异构地氧化成相应的酮基化合物。因而，式II的羟基化合物的相对的对映体保留下来并可以被分离。此外，除了用作共底物的醇，例如乙醇、2-丙醇(异丙醇)、2-丁醇、2-戊醇或2-辛醇，在NAD的再生的过程中使用其相应的酮例如丙酮。例如，通过根据本发明的氧化还原酶或其他脱氢酶，丙醇和NAD(P)H被转化成NAD和异丙醇。
通过以下的实施例进一步详细地说明了本发明的优选的实施方式。
实施例1：
有机体的培养和羰基还原酶活性的筛选
为了筛选，在以下培养基中培养酵母菌株粘质红酵母DSMZ70825、粉状毕赤酵母DSMZ 3316、Candida nemodendra DSMZ 70647、树干毕赤酵母DSMZ 3651和Pichia trehalophila DSMZ 70391、Lodderomyces elongisporus DSMZ 70320：酵母提取物(3)、麦芽提取物(3)、蛋白胨(5)和葡萄糖(10)(在每种情况下，括号中的数字单位g/l)。培养基在121℃灭菌，酵母在25℃没有进一步pH调节的、在160转每分钟(rpm)的摇动器上培养。
菌株Leuconostoc carnosu DSMZ 5576在以下培养基中培养：葡萄糖(20)、酵母提取物(5)、麦芽提取物(10)、柠檬酸氢二铵(2)、醋酸钠(5)、硫酸镁(0.2)、硫酸锰(0.05)、磷酸氢二钾(2)。培养基在121℃灭菌，在30℃培养有机体，没有进一步的pH调节或氧供应。
菌株Microbacterium spec.DSMZ 20028在酵母提取物(3)和胰酶大豆粉(30)的培养基上在30℃用160转每分钟(rpm)培养。
菌株深红戈登氏菌DSMZ 43570在酵母提取物(4)、葡萄糖(4)、麦芽提取物(10)和CaCO3(2)的培养基上在37℃用160转每分钟(rpm)培养。
随后使用800μl消化缓冲液(100mM三乙醇胺(TEA)，pH＝7.0)重悬浮125mg细胞，与1g玻璃珠混合，在球磨(Retsch)中在4℃消化10分钟。在12.000rpm离心2分钟后获得的上清液(溶胞产物)在随后的活性筛选中使用，并用于测定对映体过量(ee-值)。使用不同的酮，例如2-丁酮、2-辛酮、4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮或2-氧代-4-苯基丁酸乙酯作为底物。
活性筛选的批次：
860μl   0.1M KH2PO4/K2PO4 pH＝7.0 1mM MgCl2
20μl    NADPH或NADH(10mM)
20μl    溶胞产物
100μl   底物(100mM)
在340nm跟踪反应1分钟。
用于ee-值测定的批次：
20μl溶胞产物
100μl NADH或NADPH(50mM)
60μl  底物(100mM)
在24小时(h)之后，使用例如氯仿提取用于ee测定的批次，经由气相色谱(GC)测定对映体过量。对映体过量如下计算：
ee(％)＝((R-醇-S-醇)/(R-醇+S-醇)×100
表1
Figure A20068003568000211
DSMZ代表Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen，Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig。酶单位的定义：1U相应于每分钟转化1μmol底物所需的酶数量。
实施例2
N4D(P)H依赖性微生物氧化还原酶的分离和纯化
为了分离NAD(P)H依赖性微生物氧化还原酶，如实施例1中描述培养微生物体。在达到稳定阶段时，通过离心从培养基收获和分离细胞。通过使用玻璃珠湿磨实现酶释放，但也可以通过其他消化方法实现。为此，例如，100g的湿细胞团用400ml消化缓冲液(100mM三乙醇胺，1mM MgCl2，pH＝7.0)悬浮，通过French压力的方法匀质化。
在离心(7000rpm)后获得的粗提取物然后经由FPLC(快速蛋白液相层析)来纯化。
根据本发明的所有氧化还原酶可以通过不同组合的离子交换层析例如，在Q-Sepharse Fast Flow(Pharmacia)或Uno Q(Biorad，Munich，Germany)上、疏水相互作用层析，例如在Octyl-Sepharose Fast Flow或Butyl-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)上、陶瓷羟磷灰石层析和凝胶渗透来纯化。
实施例2a：
来自粉状毕赤酵母DSMZ 3316的NADH依赖性氧化还原酶的纯化
对于蛋白质分离，在离心后获得的来自粉状毕赤酵母DSMZ 3316的溶胞产物直接施加到用100mM三乙醇胺缓冲液pH＝7.0 1M(NH4)SO4平衡的Butyl-Sepharose FF柱上，用降低的线性盐梯度洗脱。组合含有氧化还原酶的级分并通过超滤(排阻限制10kDa)的方式浓缩到适合的体积。
随后，氧化还原酶的浓缩的级分进一步通过Uno.Q纯化。为此，氧化还原酶直接施加到用50mM磷酸钾缓冲液pH＝7.0平衡的UnoQ柱(Biorad)上并用提高的线性盐梯度洗涤，借此氧化还原酶在0M NaCl洗脱而没有结合，而混杂物的主要部分是结合的并在更高的盐浓度下洗脱。
第三个纯化步骤在陶瓷羟磷灰石柱(Pharmacia)上进行，其中氧化还原酶被施加到用10mM磷酸钾缓冲液、1mM MgCl2 pH＝6.8平衡的柱上，使用提高的缓冲液浓度洗脱(400mM磷酸钾缓冲液1mMMgCl2 pH＝6.8)。在80-100mM磷酸钾缓冲液处洗脱氧化还原酶。
由此，获得的纯化氧化还原酶的分子量经由凝胶渗透来测定(Superdex 200 HR；Pharmacia，100mM三乙醇胺，pH＝7，0.15MNaCl)。过氧化氢酶(232kDa)、醛缩酶(158kDa)、白蛋白(69.8kDa)和卵清蛋白(49.4kDa)被用作分子量标准。
以下的表2概括了获得的结果。
表2：
 纯化步骤   体积[ml]   活性[U/ml]2-丁酮   总活性[U]2-丁酮   比活性[U/mg]2-丁酮   产率
 粗提取物   70   1.3   80   0.1   100％
 Butyl-Sepharose   10   4.4   44   1.7   55％
 Uno Q   1.4   17   24   5   30％
 羟磷灰石   0.7   13.5   9.5   16   12％
在根据实施例1(分批活性筛选)的测试系统中测定氧化还原酶的酶活性，蛋白质数量的测定根据Lowry et al.，Journal of BiologicalChemistry，193(1951)：265-275或Peterson et al.，AnalyticalBiochemicstry，100(1979)：201-220)进行。酶活性比蛋白质数量的商产生比活性，其中1μmol每分钟的转化相应于1单位(U)。
实施例2b：
来自微杆菌属DSMZ 20028的NADH依赖性氧化还原酶的纯化
对于蛋白质分离，在离心后获得的来自Microbacterium spec.DSMZ20028的溶胞产物直接施加到用50mM磷酸钾缓冲液pH＝7.0平衡的Q-Sepharose FF柱上，用提高的线性盐梯度洗脱。从而，氧化还原酶在0.6到0.8M NaCl处洗脱。组合含有氧化还原酶的级分并通过超滤(排阻限制10kDa)的方式浓缩到适合的体积。
随后，氧化还原酶的浓缩的级分进一步通过Uno.Q纯化。为此，氧化还原酶直接施加到用50mM磷酸钾缓冲液pH＝7.0平衡的UnoQ柱(Biorad)上并用提高的线性盐梯度洗涤，借此氧化还原酶在0.2-0.25M NaCl洗脱。
第三个纯化步骤在陶瓷羟磷灰石柱(Pharmacia)上进行，其中来自微杆菌属DSMZ 20028的氧化还原酶被施加到用10mM磷酸钾缓冲液、1mM MgCl2 pH＝6.8平衡的柱上，使用提高的缓冲液浓度洗脱(400mM磷酸钾缓冲液1mM MgCl2 pH＝6.8)。在80-100mM磷酸钾缓冲液处洗脱氧化还原酶。由此，获得的纯化氧化还原酶的分子量如2a所描述的测定。
以下的表3概括了获得的结果。
表3
 纯化步骤   体积[ml]   活性[U/ml]2-辛酮   总活性[U]2-辛酮   比活性[U/mg]2-辛酮   产率
 粗提取物   55   3.8   212   0.4   100％
 Butyl-Sepharose   34   4.1   139   0.56   65％
 Uno Q   0.8   9.3   7.5   3.8   3.5％
 羟磷灰石   0.5   4.2   2.1   117   1％
实施例3：
根据本发明的氧化还原酶的N-末端序列的测定
在10％十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶中凝胶渗透之后，根据实施例2的酶制品被分离并转移到聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)上。
显著的条带进行经由Edman降解的N-末端测序(Procise 492(PE-Biosystems))。
实施例4：
从酵母分离的对映体选择性醇脱氢酶的一般克隆策略
根据Manniatis&Sambrook的“Molecular cloning”中描述的方法提取染色体DNA。产生的核酸充当使用简并引物的聚合酶链式反应(PCR)的模板。在这样做时，5’引物来自氨基酸序列(SEQ ID NO：66、72、80)，3’引物来自氨基酸序列(SEQ ID NO：67、73、81)，涉及特异于有机体的遗传编码(SEQ ID NO：68、68、74、75、82、83)。
在PCR缓冲液[67mM Tris-HCl(pH8.3)，16mM(NH4)2SO4，115mM MgCl2，0.01％Tween20]、0.2mM脱氧核苷三磷酸混合物(dNTP)、40pMol每种引物和2.5U BioTherm Star聚合酶(Genecraft，Lüdingshausen，Germany)]中进行扩增。在BioTherm Star聚合酶活化(95℃8分钟)和随后45-50个循环的Touch-Down PCR之后，反应冷却到4℃，整个PCR批次施加到1％琼脂糖凝胶上用于分析。
来自聚合酶链式反应的特异性片段被连接到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中，并使用引物M13 rev(SEQ IDNO：65)和M13 uni(SEQ ID NO：128)借助ABI DNA测序仪来测序。
基因编码序列的5’和3’末端区域使用RACE方法(cDNA末端的快速扩增)来测定。根据特异性片段的核酸序列，构建3’-RACE和5’-RACE的寡核苷酸。从细胞制备的总RNA充当模板用于利用3’-RACE系统(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)的第一cDNA链的合成。这随后是借助3’-RACE寡核苷酸(SEQ ID NO：76、77、84、85)的特异性cDNA的扩增和再扩增。随后，批次施加到1％琼脂糖凝胶上用于分析。携带缺失3’-侧翼序列信息的特定片段被分离，连接到TA克隆载体pCR2.1并测序。
序列的编码和非编码5’末端序列使用5’-RACE系统(Invitrogen)来测定。为此，来自早先获得的总RNA的mRNA借助Oligo dT-纤维素(NEB，Beverly，USA)来富集，并用于利用基因特异性寡核苷酸(SEQ ID NO：70；71；78；79；86；87)的第一cDNA链的合成。特异性cDNA的随后的扩增和再扩增产生片段，其被连接到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen)用于分析。借助ABI DNA测序仪分析含有片段的质粒。因而，获得关于基因的5’末端的缺失序列信息。
  蛋白质   粘质红酵母   粉状毕赤酵母   树干毕赤酵母
  部分测序的肽   VATAVETFGR(SEQIDNo 66)FGEAVEQAR(SEQIDNo 67)   LLTQTLALEQAK(SEQIDNo 72)YNFTNKVAIITGGI(SEQIDNo 73)   ADQVLLK(SEQIDNo 80)ISFNLGDLALR(SEQIDNo 81)
  Touch-CownPCR的引物   CCRAAYTCVACVGCVGTSGC(SEQIDNo 68)GCCTGYTCGACVGCYTCRCC(SEQIDNo 69)   YTGYTCYAANGCYAADGTYTG(SEQIDNo 74)CHAAYAARGTNGCHATHATYACHGG(SEQIDNo 75)   GCYGAYCARGTNTTRTTRAAR(SEQIDNo 82)CTYAARGCYAARTCDCCYAAR(SEQIDNo 83)
  3’-RACE的引物   CAACGTTCTGAAGAGATGACTTATG(SEQIDNo 76)GGTGGAGTGAAGTTATTGAC(SEQIDNo 77)   CTACCATGCCATGAGATTAG(SEQIDNo 84)GCTGTAGACGTCGCTAAGAG(SEQIDNo 85)
  5’-RACE的引物   CTCCGAGGTGTTGAGCGCATTG(SEQIDNo 70)GACGAGGTTCTTGATGTCGTCCTCC(SEQIDNo 71)   GCCATTCTTAGCCTGTTCGAGAG(SEQIDNo 78)GTCATCTCTTCAGAACGTTGATCTT(SEQIDNo 79)CCAAAGGAGCTTATAGCAGTCT(SEQIDNo 88)   GATTCTCAAGGCTAAGTCAC(SEQIDNo 86)GATCTAACACCAGCTAATCT(SEQIDNo 87)
根据编码全长基因(SEQ ID NO：9；10；11)的序列，构建了用于随后将所述DNA片段克隆到适合的表达系统中的特异性引物。为此，例如，分别具有Nde I的识别序列、或具有Sph I的识别序列、或BamHI的识别序列的5’引物，以及具有Hind III的识别序列的3’引物被修饰(SEQ ID NO：89；90；91；92；93；94；95；96)。
在随后的PCR中，染色体DNA充当模板。编码相应的氧化还原酶的DNA片段借助Platinum pfx聚合酶(Invitrogen)来扩增。在1％琼脂糖凝胶上纯化之后，产生的PCR产物用适合的DNA内切酶处理，并分别连接到pET21载体(Novagen，Madison，USA)的主干中、或pQE70载体(Qiagen，Hilden，Germany)的主干中，所述主干用相同的核酸内切酶处理。
在测序之后，形成表达构建体被分别带入表达菌株BL21 Star(Invitrogen)或RB791(E.coli遗传库，Yale，USA)。
4a.来自酵母粉状毕赤酵母的对映体选择性氧化还原酶的克隆
对于从粉状毕赤酵母克隆氧化还原酶，例如，根据Manniatis&Sambrook的“Molecular cloning”中描述的方法从粉状毕赤酵母的新鲜细胞提取染色体DNA。产生的核酸充当利用寡核苷酸SEQID NO：74、75的Touch-Down PCR的模板。在PCR循环仪(BioRad，Hercule，USA)中活化Biotherm Star聚合酶8分钟之后，编程以下30个循环用于特异性DNA片段的鉴定：
94℃                  45秒
60℃-0.5℃/循环       45秒
68℃                  2分钟
随后，通过另外20个循环提高扩增信号
94℃              40秒
52℃              40秒
72℃              1分钟。
在1％琼脂糖凝胶中整个反应批次的分级之后，检测到具有550bp大小的特定片段。所述片段从凝胶上脱除并连接到pCR2.1TA载体(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。形成的质粒pCR2.1-PF550进行测序。
具有550bp长度的基因片段的序列分析显示了174个氨基酸残基的开放阅读框，其中还发现了N-末端和内部肽的两个序列片段。
根据具有521bp长度的片段的核苷酸序列，构建了3’-RACE(SEQID NO：76、77)和5’-RACE(SEQ ID NO：78、79、88)的寡核苷酸。对于cDNA合成反应，如下制备来自粉状毕赤酵母的细胞的总RNA。
600mg新鲜细胞重悬浮在2.5ml冰冷的LETS缓冲液中。在硝酸中洗涤并用3ml苯酚平衡的5ml(约20g)玻璃珠添加到所述细胞悬浮液中。在每种情况下整个批次涡旋30秒，总共10分钟，在冰上冷却30秒。随后，添加5ml冰冷的LETS缓冲液，再次充分地涡旋。所述细胞悬浮液在4℃以11000g离心5分钟。回收水相并用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(24∶24∶1)提取两次。这随后是用氯仿提取。在最后的提取之后，通过添加1/10体积的5M LiCl2在-20℃ 4h沉淀总RNA。第一cDNA链的合成使用3’RACE系统(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)进行。随后，使用寡核苷酸SEQ ID NO：76和AUAP(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)在反应：67mM Tris-HCl(pH8.3)，16mM(NH4)2SO4，115mM MgCl2，0.01％Tween20]、0.2mM脱氧核苷三磷酸混合物(dNTP)、10pMol每种引物和2.5U BioTherm Star聚合酶(Genecraft，Lüdingshausen，Germany)]中控制特异性cDNA，使用以下30个温度循环：94℃ 40秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟。
使用引物SEQ ID NO：77和引物UAP(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)使用30个温度循环：94℃ 40秒，55℃ 40秒，72℃ 50秒通过嵌套PCR来提高PCR信号。结果是具有约400bp大小的特异性DNA片段，其在从1％琼脂糖凝胶分离之后连接到载体pCR2.1(Invitrogen)。具有382bp长度的DNA片段序列分析产生了序列信息，关于编码来自粉状毕赤酵母的氧化还原酶的cDNA的3’-延伸直到终止密码子和ploy-A环。
对于5’RACE反应，使用从粉状毕赤酵母的细胞制备的5μg总RNA。基因特异性cDNA的合成使用5’RACE系统(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)和寡核苷酸SEQ ID NO：78进行。产生的基因特异性cDNA进行同多聚化dCTP添加反应。这之后是在PCR[67mMTris-HCl(pH8.3)，16mM(NH4)2SO4，115mM MgCl2，0.01％Tween20]、0.2mM脱氧核苷三磷酸混合物(dNTP)、20pMol引物SEQ ID NO：79和引物AAP(Invitrogen)、2.5U BioTherm Star聚合酶(Genecraft，Lüdingshausen，Germany)]中的cDNA扩增，使用以下35个温度循环：94℃ 45秒、54℃ 45秒、72℃ 1分30秒。通过使用嵌套PCR用引物SEQ ID NO：88和引物UAP(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)使用30个温度循环：94℃ 40秒、55℃ 40秒、72℃ 1分钟来提高PCR信号。结果是具有约350bp大小的特异性DNA片段，其在从1％琼脂糖凝胶分离之后连接到载体pCR2.1(Invitrogen)。具有352bp长度的DNA片段序列分析产生了序列信息，关于编码醇脱氢酶/还原酶的cDNA的5’-末端。
编码蛋白质的DNA片段具有765bp(SEQ ID NO：10)的总长度和254个氨基酸的开放阅读框(SEQ ID NO：2)。粉状毕赤酵母细胞的染色体DNA用作模板用于在聚合酶链式反应中产生全长DNA[10mMTris-HCl，(pH8.0)；50mM KCl；10mM MgSO4；0.2mM dNTP Mix；20pMol引物SEQ ID NO：91，或，分别地，20pMol引物SEQ ID NO：92、20pMol引物SEQ ID NO：93和2U Platinum pfx聚合酶(Invitrogen)]，使用温度循环：
循环1                  94℃，2分钟
循环2×30              94℃，15秒
                       56℃，20秒
                       68℃，1分15秒
在1％琼脂糖凝胶上纯化之后，用Nde I和Hind III、或用Sph I和Hind III处理产生的PCR产物，分别连接到载体pET21a(Novagen，Madison，USA)或pQE70(Qiagen，Hilden，Germany)的主干中，所述主干用相同的核酸内切酶处理。在将2μl的连接批次转化到E.coliTop10F’细胞中之后，检查氨苄青霉素抗性克隆的质粒DNA中连接的正确性，所述连接通过分别使用内切酶Nde I或Sph I和Hind III的限制性分析的方式进行。对于插入为阳性的载体的DNA分别转化到表达菌株BL21 Star(Invitrogen)和RB79(E.coli遗传库，Yale，USA)中。
实施例5：
从细菌分离的对映体选择性氧化还原酶的一般克隆策略
根据Manniatis&Sambrook的“Molecular cloning”中描述的方法提取基因组DNA。产生的核酸充当使用简并引物的聚合酶链式反应(PCR)的模板。在这样做时，5’-引物来自氨基酸序列(SEQ ID NO：104；112)，3’-引物来自氨基酸序列(SEQ ID NO：105；113)，涉及特异于有机体的遗传编码(SEQ ID NO：106；107；114；115)。
在PCR缓冲液[67mM Tris-HCl(pH8.3)，16mM(NH4)2SO4，115mM MgCl2，0.01％Tween20]、0.2mM脱氧核苷三磷酸混合物(dNTP)、40pMol每种引物和2.5U BioTherm Star聚合酶(Genecraft，Lüdingshausen，Germany)]中进行扩增。在BioTherm Star聚合酶活化(95℃8分钟)和随后45-50个循环的Touch-Down PCR之后，反应冷却到4℃，整个PCR批次施加到1％琼脂糖凝胶上用于分析。
来自聚合酶链式反应的特异性片段被连接到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中，并使用引物M13 rev(SEQ IDNO：65)和M13 uni(SEQ ID NO：128)借助ABI DNA测序仪来测序。
基因编码序列的5’和3’末端区域使用反向聚合酶链式反应方法(iPCR)来测定。根据内部特异性片段的核酸序列，构建寡核苷酸SEQID NO：100；101；102；103；108；109；110；111；116；117；118；119。通过限制性内切酶的方式消化基因组DNA并用于连接，从而可以环化小的DNA片段。所述然后使用所述连接化合物作为iPCR的模板，引物SEQ ID NO：100；102；108；119；116；118信号通过随后的嵌套PCR用引物SEQ ID NO：101；103；109；111；117；119来提高。产生的特异性片段从1％琼脂糖凝胶洗脱之后连接到载体pCR2.1(Invitrogen)中。
因而，含有片段的载体pCR2.1的序列分析产生了关于醇脱氢酶/还原酶基因的3’-和5’-编码区的缺失序列信息。
  蛋白质   肉色明串珠菌   微杆菌属   深红戈登氏菌
  部分测序的肽   NIEETTYEDWK(SEQIDNo 97)   MKALQYTKIGSHPE(SEQIDNo104)AYEALAAGTVV(SEQIDNo 105)   MKAIQIIQPG(SEQIDNo 112)VGFFTQPYEVSVR(SEQIDNo 113)
  Touch-CownPCR的引物   GACAGAWMGWTTNAARGGWAARGTHGC(SEQIDNo 98)GCBGTRTAWCCNCCRTCDACDACRAAYTC(SEQIDNo 99)   CTSCARTACACVAAGATCGG(SEQIDNo 106)GCBGCSAGBGCYTCRTABGC(SEQIDNo 107)   ATGAARGCNATYCARATYATYCARCC(SEQIDNo 114)CYTCRTANGGYTGNGTRAARAA(SEQIDNo 115)
  iPCR的引物   CTAAGCCAATACCAAGTGTACCA(SEQIDNo 100)GAACAAATCGTGCTACTGATTCATCAC(SEQIDNo 101)GAAGAAGCCCAATCACAAAGAACTC(SEQIDNo 102)GGCAGTCTATTTAGCTAGTGAAG(SEQIDNo 103)   TCCTCGCTGAGGCTCATCAC(SEQIDNo 108)GCTTCTCGATCTCGACGACTTC(SEQIDNo 109)GCGCAGCGAACTGATCGAG(SEQIDNo 110)GATCCAGCGCTACTCACTCGAC(SEQIDNo 111)   GAGGACGAAGTCGTCCGAATG(SEQIDNo 116)GCCGTCACCTTCAGCAACACC(SEQIDNo 117)CTCGACGTGAGCGACGACAAG(SEQIDNo 118)GCAAGATCACCGGCAACGATG(SEQIDNo 119)
根据编码全长基因的序列(SEQ ID NO：12；13；14)，构建了特异性引物，用于随后克隆所述DNA片段到适合的表达系统中。在这样做时，分别用Nde I的识别序列或用Sph I的识别序列或Bam HI的识别序列修饰5’-引物，用Hind III的识别序列修饰3’-引物(SEQ ID NO：120；121；122；123；124；125；126；127)。
如实施例3中描述的进行，编码蛋白质的全长DNA从基因组的扩增，随后限制性酶切并连接到表达载体中。表达菌株BL21 Star(Invitrogen)或RB791(E.coli遗传库，Yale，USA)分别用形成的表达构建体转化。
5a来自微生物微杆菌属的对映体选择性醇脱氢酶/还原酶的克隆
对于从微杆菌属克隆氧化还原酶，例如，根据Manniatis&Sambrook的“Molecular cloning”中描述的方法从微杆菌属的新鲜细胞提取基因组DNA。产生的核酸充当利用30pMol每种寡核苷酸SEQ ID NO：106；107的PCR的模板。在PCR循环仪(BioRad，Hercule，USA)中活化Biotherm Star聚合酶10分钟之后，编程以下30个循环用于特异性DNA片段的鉴定：
94℃              50秒
60℃              1分钟
72℃              1分钟
在1％琼脂糖凝胶中整个反应批次的分级之后，检测到具有1000bp大小的特定片段。所述片段从凝胶上脱除并连接到pCR2.1TA载体(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。形成的质粒pCR2.1-Ms1000进行测序。
具有1002bp长度的基因片段的序列分析显示了334个氨基酸残基的开放阅读框，其中还发现了N-末端和内部肽的两个序列片段。
根据具有1002bp长度的片段的核苷酸序列，构建了用于反向PCR(iPCR)的寡核苷酸(SEQ ID NO：108；109；110；111)。
来自微杆菌属的基因组DNA(2.5ug)以50μl批次用20U限制性内切酶Sac I处理25分钟。在整个批次的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取和用1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积乙醇沉淀之后，由此消化的DNA转移到25μl H2O中。其中的5μl(200ng)用于在总体积40μl和2U T4连接酶(Fermentas)中的连接反应。重新连接的基因组DNA(2μl＝200ng)然后用于iPCR[67mM Tris-HCl(pH8.3)，16mM(NH4)2SO4，115mM MgCl2，0.01％Tween20]、0.2mM脱氧核苷三磷酸混合物(dNTP)、30pMol每种引物(SEQ ID NO：108、110)和2.5U BioTherm Star聚合酶(Genecraft，Lüdingshausen，Germany)]]。使用以下循环进行扩增：
循环1              95℃，10分钟
循环2×30          95℃，1分钟
                   56℃，1分钟
                   72℃，2分钟
在嵌套PCR中使用寡核苷酸SEQ ID NO：109和110提高扩增信号。
随后扩增反应冷却到4℃并作为整体施加到1％琼脂糖凝胶上。结果是约1000bp大小的特异性片段。在从凝胶洗脱之后，片段连接到pCR2.1载体(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。
含有所述片段的质粒的序列分析产生了信息，关于5’-和3’-侧翼序列。因而，编码蛋白质的DNA片段具有1044bp的总长度，以终止密码子结束(SEQ ID NO：13)，展现了347个氨基酸的开放阅读框(SEQID NO：5)。
使用微杆菌属细胞的基因组DNA作为模板用于在聚合酶链式反应中产生编码蛋白的全长DNA，使用GC-Rich PCR系统(Roche，Mannhein，Germany)和分别30pMol的寡核苷酸SEQ ID NO：123或SEQ ID NO：124，和30pMol寡核苷酸SEQ ID NO：125以及温度循环：
循环1                  95℃，3分钟
循环2×30              95℃，30秒
                       59℃，30秒
                       72℃，45秒
在1％琼脂糖凝胶上纯化之后，用Nde I和Hind III、或用Sph I和Hind III处理产生的PCR产物，分别连接到载体pET21a(Novagen，Madison，USA)或pQE32(Qiagen，Hilden，Germany)的主干中，所述主干用相同的核酸内切酶处理。在将2μl的连接批次转化到E.coliTop10F’细胞中之后，检查氨苄青霉素抗性克隆的质粒DNA中连接的正确性，所述连接通过分别使用内切酶Nde I或Sph I和Hind III的限制性分析的方式进行。对于插入为阳性的载体的DNA分别转化到表达菌株BL21 Star(Invitrogen)和RB791(E.coli遗传库，Yale，USA)中。
实施例6：
重组纯脱氢酶/还原酶在E.coli中的表达
用表达构建体转化的Escherichia coli菌株BL21 Star(Invitrogen)和RB79(E.coli遗传库，Yale，USA)分别在具有氨苄青霉素(50μg/ml)和羧苄青霉素(50μg/ml)的200ml LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物，1％NaCl)中培养，直到达到在550nm测量的0.5光密度。重组蛋白的表达通过添加浓度0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导。在25℃和220rpm分别诱导8小时或16小时之后，收获细胞并在-20℃冷冻。对于活性测试，10mg细胞与500μl 100mMTEA缓冲液pH7.0以及500μl玻璃珠混合，使用球磨消化10分钟。获得的溶胞产物然后用于在稀释状态的相应测量。活性测试包括以下的：870μl 100mM TEA缓冲液pH7.0，160μg NAD(P)H，10μl稀释的细胞溶胞产物。向反应混合物添加100μl 100mM底物溶液来开始反应。
  表达载体   表达菌株   底物   活性U/g
  SEQ ID No 1   pET21a   BL21 Star   苯乙酮   4700U/g
  SEQ ID No 2   pET21a   BL21 Star   2-丁酮   1900U/g
  SEQ ID No 3   pQE70   RB791   CLAEE   5220U/g
  SEQ ID No 4   pET21a   BL21 Star   CLAEE   8300U/g
  SEQ ID No 5   pET21a   BL21 Star   2-辛酮   8000U/g
  SEQ ID No 6   pQE70   RB791   2-辛酮   1600U/g
  SEQ ID No 7   pET21a   BL21 Star
SEQ ID No 8 pET21a BL21 Star   CLAEE 7000U/g
实施例7：
重组氧化还原酶的特征
7a：最佳pH值
产生表4中所列的缓冲液。相应缓冲液成分的浓度在每种情况下数量为50mM。
表4
  pH值   缓冲系统   pH值   缓冲系统
  4   乙酸钠/乙酸   7.5   KH2PO4/K2PO4
  4.5   乙酸钠/乙酸   8   KH2PO4/K2PO4
  5   乙酸钠/乙酸   8.5   KH2PO4/K2PO4
  5.5   KH2PO4/K2PO4   9   甘氨酸/NaOH
  6   KH2PO4/K2PO4   9.5   甘氨酸/NaOH
  6.5   KH2PO4/K2PO4   10   甘氨酸/NaOH
  7   KH2PO4/K2PO4   11   甘氨酸/NaOH
测量批次(30℃)-最佳pH还原：
870μl    表3中所述每种缓冲系统
20μl     NAD(P)H 10mM
10μl     稀释的酶
孵育进行约2到3分钟，随后
100μl    底物溶液(100mM)被添加。
根据氧化还原酶，使用2-丁酮或2-辛酮作为底物。反应在340nm监视1分钟。为了测量最佳pH值，分析了表4所列各种缓冲液中的酶反应。为了确定氧还反应的最佳pH值，使用NAD(P)作为辅因子，2-丙醇或2-辛醇用作底物。
根据本发明的氧化还原酶的结果在表5中综合。
表5
  DSMZ No.   微生物   还原最佳pH值   氧化最佳pH值
  70825   粘质红酵母 7-8 8.0-9.5
  3316   粉状毕赤酵母   5-6   7-11
  70647   Candida nemodendra   6   10-11
  3651   树干毕赤酵母   5.5-6.5   6.5-7.5
  70391   Pichia trehalophila   7-7.5   7-8
  5576   肉色明串珠菌   5.0-6   6.5-9.5
  20028   微杆菌属   6.5-7.5   7.5-8.5
  43570   深红戈登氏菌   5   7.5-9.5
7b：pH稳定性
通过将重组氧化还原酶保存在表4所提及的缓冲系统中来检查重组氧化还原酶活性的测定。为此，在pH4到11的范围内制备不同的缓冲液(50mM)，用来稀释根据实施例4产生的氧化还原酶。在孵育30、60和120分钟之后，在批次中取出10μl并用于根据实施例1的活性测试。
初始值是在磷酸钾缓冲液50mM pH＝7.0中稀释(1∶20)酶之后立即获得的测量值。在给定的条件下，所述值相应于约0.70/分钟的消光改变(extinction change)，并被设置为100％值，所有随后测量的值与该值相关联。
在表6中，综合了对于根据本发明的氧化还原酶，在持续120分钟的孵育中酶展现了不低于初始活性的50％的pH范围。
表6
  DSMZ No.   微生物   pH范围稳定性
  70825   粘质红酵母   5.5-9.5
  3316   粉状毕赤酵母   5.5-10.0
  70647   Candida nemodendra   6.5-9.5
  3651   树干毕赤酵母   6.0-7.0
  70391   Pichia trehalophila   6.0-8.0
  5576   肉色明串珠菌   4.5-9.5
  20028   微杆菌属   5.0-9.5
  43570   深红戈登氏菌   4.5-10
7c：最佳温度
为了确定最佳测试温度，在15℃到70℃的温度范围内在标准测量批次中测量根据本发明的氧化还原酶的酶活性。
测定的最佳温度在表7中综合：
表7
  DSMZ No.   微生物   pH范围稳定性
  70825   粘质红酵母   50℃
  3316   粉状毕赤酵母   40℃
  70647   Candida nemodendra   65℃
  3651   树干毕赤酵母   40℃
  70391   Pichia trehalophila   n.b.
  5576   肉色明串珠菌   60℃
  20028   微杆菌属   60℃
  43570   深红戈登氏菌   45-55℃
7d：温度稳定性
按照如实施例5c描述的类似的方式，在15℃到70℃的范围测定温度稳定性。维持，根据本发明的氧化还原酶的稀释物在每种情况下在相应的温度孵育60分钟和180分钟，随后使用上述的测量批次在30℃测量。在表8中，综合了对于根据本发明的氧化还原酶，在持续120分钟的孵育中酶展现了不低于初始活性的50％的温度范围。
表8
  DSMZ No.   微生物   pH范围稳定性
  70825   粘质红酵母   1155-35℃
  3316   粉状毕赤酵母   15-25℃
  70647   Candida nemodendra   15-35℃
  3651   树干毕赤酵母   15-35℃
  70391   Pichia trehalophila   15-35℃
  5576   肉色明串珠菌   15-35℃
  20028   微杆菌属   15-60℃
  43570   深红戈登氏菌   15-55℃
7e：底物谱
通过用许多酮类和醇类测试酶的氧还和还原活性，测定了根据本发明的氧化还原酶的底物谱。为此，用不同的引物使用根据实施例1的标准测量批次。
对于所有的酶，对乙酰乙酸甲酯的活性被设置为100％，所有其他的底物与之相关联。
表9：底物谱还原
  底物   粘质红酵母SEQ ID NO1   粉状毕赤酵母SEQ ID NO2   树干毕赤酵母SEQ ID NO3   肉色明串珠菌SEQ ID NO4 微杆菌属SEQ ID NO5   深红戈登氏菌SEQ ID NO6
  1-苯基-2-丙酮   66％   10％   30％   13％ 80％   82％
  苯甲酰甲基氯   36％   130％   9％   37％ ＜2％   7％
  苯乙酮   12％   195％   32％   28％ 52％   23％
  萘乙酮   n.b.   25％   84％   n.b. 125％   68％
  丙基苯基酮   0％   0％   0％   0％ 0％   0％
  2-辛酮   71％   20％   27％   28％ 227％   75％
  3-辛酮   29％   10％   40％   18％ 47％   52％
  2-丁酮   190％   65％   49％   36％ 4％   14％
  2-氧代戊酸乙酯   4％   85％   60％   25％ ＜2％   23％
  2-氧代-4-苯基丁酸乙酯 4％ 35％ 16％ 10％ ＜2％ 18％
  丙酮酸乙酯   60％   560％   148％   122％ 480％   160％
  乙醛酸乙基苯基酯   8％   35％   3％   4％ ＜2％   11％
  4-氯乙酰乙酸乙酯   79％   70％   100％   80％ 110％   110％
  乙酰乙酸甲酯   100％   100％   100％   100％ 100％   100％
  3-氧代戊酸乙酯   60％   45％   73％   30％ ＜2％   56％
  丙酮   82％   55％   100％   28％ ＜2％   7％
7f：在水性/有机两相系统中的稳定性
通过在适合于相应的氧化还原酶的水性缓冲液中稀释实施例6中获得的(来自重组表达)溶胞产物(约10单位/ml缓冲液)，检查了在水性/有机两相系统中新的氧化还原酶的稳定性。然后，与水不可混溶的相同体积的有机溶剂被添加到所述缓冲液中稀释的氧化还原酶中，在恒定的整体混合(170rpm的热混合器)下在室温下孵育批次。在24h的孵育之后，从水相中各采集10μl，用于在标准的测试批次(磷酸钾缓冲液(KPP)100mM，pH＝7.0，0.2mM NAD(P)H，10mM底物)中确定酶活性。同样在这种情况中，在缓冲液中稀释之后即刻的初始值被设为100％，所有进一步的值与之相关联。
表9：在水性/有机两相系统中孵育24小时之后的酶活性
  系统   缓冲液   乙酸丁酯   乙醚   MTBE   二异丙基醚   庚烷   环己烷
  粘质红酵母SEQIDNo 1 100％ 80-100％ 80-100％ 80-100％ 80-100％ 80-100％ 80-100％
  粉状毕赤酵母SEQ ID No 2 100％ 40-60 60-80％ 80-100％ 40-60％ 40-60 40-60％
  CandidanemodendraSEQ ID No 8 100％   80-100％   80-100％   80-100％   80-100％   80-100％   80-100％
  树干毕赤酵母SEQ ID No 3 100％   40-60％   n.b.   20-50％ 60-80％   80-100％   40-60％
  肉色明串珠菌SEQ ID No 4 100％ 80-100％ 80-100％ 80-100％ 80-100％ 80-100％   80-100％
  微杆菌属SEQ ID No 5 100％ 80-100％ 80-100％   80-100％   80-100％   80-100％   80-100％
  深红戈登氏菌SEQ ID No 6 100％ 80-100％ 80-100％ 80-100％   80-100％   80-100％   80-100％
MTBE＝甲基叔丁基醚
表10：底物谱氧化
  底物   粘质红酵母SEQ ID NO1   粉状毕赤酵母SEQ ID NO2   树干毕赤酵母SEQ ID NO3   肉色明串珠菌SEQ ID NO4 微杆菌属SEQ ID NO5   深红戈登氏菌SEQ ID NO6
  S-2-辛醇   100％   0％   100％   0％ 100％   100％
  R-2-辛醇   0％   100％   0％   100％ 0％   0％
  S-2-丁醇   266％   100％   237％   56％ 5％   45％
  R-2-丁醇   60％   340％   74％   178％ 0％   17％
  S-苯基-2-丙醇   200％   0％   26％   0％ 10％   0％
  R-苯基-2-丙醇   0％   0％   0％   6％ 0％   0％
  (s)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯 0％ 0％ 0％ 0％ 0％ 0％
  (R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯 0％ 0％ 0％ 0％ 10％ 0％
  2-丙醇   180％   180％   218％   67％ ＜1％   27％
  环己醇   26％   120％   0％   n.b. n.b.   7％
实施例8：预备性转化
8a：使用来自粘质红酵母的氧化还原酶的甲基-(3S)-3-羟基戊酸 的合成
对于预备性批次，25mL缓冲液(100mM TEA，pH＝7，1mM ZnCl2，10％甘油)、375mL 4-甲基-2-戊醇、100mL甲基-3-氧戊酸、100mg NAD和37kU来自Rhodotorula mucillaginosa DSMZ 70825的重组氧化还原酶的混合物在室温下恒定完全混合地孵育24h。在24h之后，所使用的97％的甲基-3-氧戊酸被还原成甲基-(3S)-3-羟基戊酸。随后，含有产物的4-甲基-2-戊醇相从水相中分离、过滤，通过蒸馏获得产物甲基-(3S)-3-羟基戊酸。
按照这种方式，产物甲基-(3S)-3-羟基戊酸以高产量获得，纯度＞99％，对映体过量＞99.5％。
8b：使用来自粉状毕赤酵母的氧化还原酶的(2R)-1-氯丙烷-2-醇 的合成
为了转化，80mL缓冲液(100mM TEA，pH＝7，1mM MgCl2，10％甘油)、15ml 2-丙醇、5ml氯丙酮、10mg NAD和2kU来自粉状毕赤酵母DSMZ 3316的重组氧化还原酶的混合物在室温下恒定完全混合地孵育24h。24h之后，所使用的氯丙酮被完全还原成(2R)-1-氯丙烷-2-醇。随后，用乙酸乙酯提取反应化合物，使用旋转蒸发器除去溶剂，获得粗产物。按这种方式产生的(2R)-1-氯丙烷-2-醇具有＞99％的对映体过量。
8c：使用来自树干毕赤酵母的氧化还原酶的(R)-2-氯-1-(3-氯苯 基)乙烷-1-醇的合成
为了转化，20mL缓冲液(100mM磷酸钾，pH＝8.5，1mM MgCl2，10％甘油)、溶解在80ml 4-甲基-2-戊醇中的20g 2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-酮、10mg NAD和2kU来自树干毕赤酵母DSMZ 3651的重组氧化还原酶的混合物在室温下恒定完全混合地孵育24h。24h之后，所使用的超过99％的2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-酮被还原。随后，含有产物的4-甲基-2-戊醇相从水相中分离，过滤，通过蒸馏获得产物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-醇。
按照这种方式，产物(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙烷-1-醇以高产量获得，纯度＞98％，对映体过量＞99.9％。
8d：使用来自肉色明串珠菌的氧化还原酶的(S)-4-氯-3-羟基丁酸 乙酯的合成
为了转化，8mL缓冲液(100mM TEA，pH＝7，1mM MgCl2)、24ml异丙醇、8ml 4-氯乙酰乙酸乙酯、2mg NADP和6.7kU(＝6ml)来自肉色明串珠菌DSMZ5576的重组氧化还原酶的混合物在室温下恒定完全混合地孵育24h。24h之后，所使用的超过99％的4-氯乙酰乙酸乙酯被还原成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。通过使用旋转蒸发器首先除去2-丙醇来重新处理反应混合物。随后，用乙酸乙酯提取反应混合物，使用旋转蒸发器除去溶剂，获得粗产物。按这种方式产生的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯具有＞99.5％的对映体过量。
8e：使用来自微杆菌属的氧化还原酶的(1S)-1-[3，5-二(三氟甲 基)苯基]乙烷-1-醇的合成
为了转化，1mL缓冲液(100mM TEA，pH＝7，10％甘油，1mMZnCl2)、3ml 4-甲基-2-戊醇、1ml 1-[3，5-(三氟甲基)苯基]乙烷-1-酮、2mg NAD和0.7kU来自微杆菌属DSMZ 20028的重组氧化还原酶的混合物在室温下恒定完全混合地孵育24h。在24h之后，所使用的超过90％的1-[3，5-(三氟甲基)苯基]乙烷-1-酮被还原成(1S)-1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙烷-1-醇。随后，含有产物的4-甲基-2-戊醇相从水相中分离，过滤、通过蒸馏获得产物(1S)-1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙烷-1-醇。照这样获得的粗产物(1S)-1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙烷-1-醇展现了＞99.5％的对映体过量。
序列表
<110>IEP GmbH
<120>用于酮基化合物的立体选择还原的氧化还原酶
<130>I 7984
<140>A 1261/2005
<141>2005-07-27
<160>130
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>282
<212>PRT
<213>粘质红酵母
<400>1
Met Pro Ala Thr Leu Arg Leu Asp Lys Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly
1                5                    10                  15
Gly Ala Ser Gly Ile Gly Leu Glu Ser Ala Leu Val Phe Ala Gly Glu
             20                   25                  30
Gly Ala His Val Val Val Ala Asp Ile Asn Val Glu Ala Ala Asn Arg
         35                   40                  45
Ala Val Glu Ile Ile Lys Thr Gln Val Gln Asp Ala Pro Lys Ala Ile
    50                   55                   60
Ala Val Lys Cys Asp Val Ser Lys Glu Asp Asp Ile Lys Asn Leu Val
65                   70                   75                  80
Ala Thr Ala Val Glu Thr Phe Gly Arg Leu Asp Val Met Phe Asn Asn
                 85                   90                  95
Ala Gly Ile Met His Pro Glu Asp Asp Asn Ala Leu Asn Thr Ser Glu
            100                   105                 110
Arg Ile Trp Asp Leu Thr Met Asn Ile Asn Val Lys Gly Val Trp Trp
        115                  120                  125
Gly Cys Lys Tyr Ala Ile Asp Ala Met Arg Lys Asn Pro Gly Gly Ser
    130                  135                  140
Lys Gly Ser Ile Ile Asn Thr Ala Ser Phe Val Ala Ile Leu Gly Ala
145                  150                  155                 160
Ala Thr Pro Gln Ile Ala Tyr Thr Ala Ser Lys Gly Ala Val Leu Ala
                165                   170                 175
Met Thr Arg Glu Leu Ala Met Val His Ala Arg Glu Gly Ile Arg Ile
            180                   185                 190
Asn Ser Leu Cys Pro Gly Pro Leu Lys Thr Glu Leu Leu Met Lys Phe
        195                  200                  205
Leu Asp Thr Pro Glu Lys Lys Glu Arg Arg Met Val His Ile Pro Met
    210                  215                  220
Gly Arg Phe Gly Glu Ala Val Glu Gln Ala Arg Ala Ala Ala Phe Leu
225                  230                  235                 240
Ala Ser Asp Asp Ser Ser Phe Ile Thr Gly Thr Asp Phe Lys Val Asp
                 245                  250                 255
Gly Gly Ile Ser Ser Cys Tyr Val Thr Pro Glu Gly Glu Gln Ala Leu
             260                  265                 270
Ala Ala Pro Ser Asn Leu Ala Pro Lys Ala
        275                  280
<210>2
<211>254
<212>PRT
<213>粉状毕赤酵母
<400>2
Met Ala Tyr Asn Phe Thr Asn Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Ile
1                5                    10                  15
Ser Gly Ile Gly Leu Ala Thr Val Glu Lys Phe Ala Lys Leu Gly Ala
            20                   25                   30
Lys Val Val Ile Gly Asp Ile Gln Lys Glu Glu Tyr Lys Glu Ala Ala
        35                   40                   45
Phe Thr Asn Leu Lys Asn Lys Gly Ile Asn Leu Asp Gln Leu Thr Tyr
    50                   55                   60
Val His Thr Asp Val Thr Ala Asn Ser Ala Asn Glu Asn Leu Leu Lys
65                   70                   75                  80
Thr Ala Ile Ser Ser Phe Gly Gly Val Asp Phe Val Val Ala Asn Ser
                 85                   90                  95
Gly Ile Ala Lys Asp Gln Arg Ser Glu Glu Met Thr Tyr Glu Asp Phe
            100                  105                  110
Lys Lys Ile Ile Asp Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Ser Leu Asp Lys
        115                  120                  125
Leu Ala Ile Asp Tyr Trp Leu Lys Asn Lys Lys Lys Gly Ser Ile Val
    130                  135                  140
Asn Thr Gly Ser Ile Leu Ser Phe Val Gly Thr Pro Gly Leu Ser His
145                  150                  155                 160
Tyr Cys Ala Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Leu Thr Gln Thr Leu Ala
                165                   170                 175
Leu Glu Gln Ala Lys Asn Gly Ile Arg Val Asn Cys Ile Asn Pro Gly
            180                   185                 190
Tyr Ile Arg Thr Pro Leu Leu Glu Phe Leu Pro Lys Asp Lys Tyr Asp
        195                  200                  205
Ala Leu Val Asp Leu His Pro Met Gly Arg Leu Gly Glu Pro Glu Glu
    210                  215                  220
Ile Ala Asn Ala Ile Ala Phe Leu Val Ser Asp Glu Ala Ser Phe Ile
225                  230                  235                 240
Thr Gly Thr Thr Leu Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
                245                  250
<210>3
<211>336
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<400>3
Met Ser Ile Pro Ala Thr Gln Tyr Gly Phe Val Phe Thr Lys Lys Asp
1                5                    10                  15
Gly Leu Lys Ile Arg Glu Asn Met Pro Val Leu Glu Pro Lys Ala Asp
            20                    25                  30
Gln Val Leu Leu Lys Val Asp Ala Val Gly Leu Cys His Ser Asp Leu
        35                   40                   45
His Ala Ile Tyr Asp Gly Phe Asp Phe Gly Asp Asn Tyr Val Met Gly
    50                   55                   60
His Glu Ile Ala Gly Thr Ile Val Lys Lys Gly Ala Met Val Asp Phe
65                   70                   75                   80
Trp Asp Leu Asn Thr Arg Val Ala Cys Phe Gly Pro Asn Ser Cys Gly
                 85                   90                  95
His Cys Gln Leu Cys Arg Thr Gly Phe Glu Asn Asp Cys Ile Asn Val
            100                  105                  110
Val Asn Gly Trp Phe Gly Leu Gly Lys Asn Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr
        115                  120                  125
Leu Leu Val Glu Lys Pro Arg Asn Leu Val Ala Ile Pro Asp Asn Val
    130                  135                  140
Glu Leu Ser Asp Ala Ala Ala Ile Thr Asp Ala Leu Leu Thr Pro Tyr
145                  150                  155                 160
His Ala Met Arg Leu Ala Gly Val Arg Ser Gly Thr Lys Leu Leu Gln
                165                   170                 175
Ile Gly Ala Gly Gly Leu Gly Val Asn Gly Ile Gln Ile Ala Lys Ala
            180                   185                 190
Phe Gly Ala Gln Val Thr Val Ile Asp Lys Lys Pro Glu Ala Val Asp
        195                  200                  205
Val Ala Lys Ser Leu Gly Ala Asp Glu Val Tyr Ser Ala Leu Pro Glu
    210                  215                  220
Ser Thr Ser Pro Gly Ser Phe Asp Val Ala Ile Asp Tyr Val Ser Thr
225                  230                 235                  240
Gln Gly Thr Phe Asp Thr Cys Gln Lys Tyr Val Arg Ser Lys Gly Asn
                245                  250                  255
Ile Val Pro Val Gly Leu Ala Ala Pro Arg Ile Ser Phe Asn Leu Gly
            260                  265                  270
Asp Leu Ala Leu Arg Glu Ile Asn Val Leu Gly Ser Phe Trp Gly Thr
        275                  280                  285
Ser Ser Asp Leu Lys Glu Cys Phe Asp Leu Val Ser Lys Gly Lys Val
    290                  295                  300
Lys Pro Lys Val Thr Val Ala Pro Leu Lys Gln Leu Pro Glu Tyr Ile
305                  310                  315                 320
Val Lys Leu Gln Asn Ser Ala Tyr Glu Gly Arg Val Val Phe Lys Pro
                325                   330                  335
<210>4
<211>252
<212>PRT
<213>肉色明串珠菌
<400>4
Met Thr Asp Arg Leu Lys Asn Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Thr
1                5                    10                  15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Met Ala Gln Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
            20                    25                  30
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg Arg Ala Asn Val Gly Ala Glu Ala Leu
        35                   40                   45
Lys Thr Ile Gly Asp Glu Ser Val Ala Arg Phe Val Gln His Asp Ala
    50                   55                   60
Ser Asp Glu Lys Gly Trp Ile Asp Leu Phe Glu Asn Thr Ile Lys Trp
65                   70                   75                  80
Phe Gly His Val Asp Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Val Ala Ile Ala
                85                    90                   95
Lys Asn Ile Glu Glu Thr Thr Tyr Glu Asp Trp Lys Phe Leu Gln Ser
            100                  105                  110
Ile Asn Ser Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Lys Tyr Gly Met Gln Tyr
        115                  120                  125
Met Lys Asn Gln Ala Gly Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
    130                  135                  140
Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Asn Leu Ala Ala Tyr Asn His Ser Lys
145                  150                  155                 160
Gly Gly Val Arg Ile Leu Ser Lys Ser Ala Ala Leu His Ala Ala Leu
                165                  170                  175
Asn Asp Tyr Asn Leu Arg Val Asn Thr Ile His Pro Gly Tyr Ile Lys
            180                  185                  190
Thr Pro Leu Val Asp Gly Ile Asp Gly Ala Glu Glu Ala Gln Ser Gln
        195                  200                  205
Arg Thr Gln Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
    210                  215                  220
Tyr Met Ala Val Tyr Leu Ala Ser Glu Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225                  230                  235                 240
Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Leu Ala Gln
                245                  250
<210>5
<211>347
<212>PRT
<213>微杆菌属
<400>5
Met Lys Ala Leu Gln Tyr Thr Lys Ile Gly Ser His Pro Glu Val Val
1                5                    10                  15
Glu Ile Glu Lys Pro Ser Pro Gly Pro Gly Gln Val Leu Leu Lys Val
            20                   25                   30
Thr Ala Ala Gly Val Cys His Ser Asp Glu Phe Val Met Ser Leu Ser
        35                   40                   45
Glu Glu Gln Tyr Thr Ala Ala Gly Tyr Pro Leu Pro Leu Thr Leu Gly
    50                   55                   60
His Glu Gly Ala Gly Ile Val Glu Glu Leu Gly Glu Gly Val Glu His
65                   70                   75                  80
Leu Ser Val Gly Asp Ala Val Ala Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly
                85                   90                   95
Arg Cys Arg Asn Cys Ala Gln Gly Lys Glu Asn Tyr Cys Thr Asn Ala
            100                  105                  110
Gln Ala Glu Gly Ile Met Pro Pro Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Met
        115                  120                  125
Ala Glu Tyr Met Ile Val Asp Ser Ala Arg His Leu Val Pro Leu Gly
    130                  135                  140
Asp Leu Asp Pro Val Gln Asn Val Ser Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr
145                  150                  155                 160
Pro Tyr His Ala Val Lys Thr Ser Leu Pro Lys Leu Gly Ala Gly Thr
                165                  170                  175
Thr Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu Gly His Val Ala Ile Gln
            180                  185                  190
Ile Leu Arg Ala Val Ser Ala Ala Thr Val Ile Ala Leu Asp Val Asn
        195                  200                  205
Asp Glu Lys Leu Ala Leu Ala Lys Glu Val Gly Ala His His Thr Val
    210                  215                  220
Met Ser Asp Gly Gly Ala Val Asp Ala Ile Arg Arg Leu Thr Asp Gly
225                  230                  235                 240
Leu Gly Ala Asn Ala Val Phe Asp Phe Val Gly Ala Asp Pro Thr Ile
                245                  250                  255
Ala Thr Ala Ile Gly Ala Ala Ala Leu Asp Ala Asp Ile Thr Ile Val
            260                  265                  270
Gly Ile Gly Gly Gly Thr Ala His Val Gly Phe Gly Thr Val Ala Tyr
        275                  280                  285
Asp Ala Ala Leu Arg Ile Pro Tyr Trp Gly Ser Arg Ser Glu Leu Ile
    290                  295                  300
Glu Val Leu Asp Leu Ala Arg Ser Gly Gln Val Gly Val Glu Ile Gln
305                  310                  315                 320
Arg Tyr Ser Leu Asp Asp Gly Pro Lys Ala Tyr Glu Ala Leu Ala Ala
                325                  330                  335
Gly Thr Val Arg Gly Arg Ala Val Ile Val Pro
            340                  345
<210>6
<211>347
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<400>6
Met Lys Ala Ile Gln Ile Ile Gln Pro Gly Lys Pro Pro Glu Leu Arg
1                5                    10                  15
Glu Val Glu Lys Pro Thr Pro Arg Pro Gly Gln Val Leu Leu Lys Val
            20                   25                   30
Thr Ala Ala Gly Ala Cys His Ser Asp Asp Phe Val Leu Asn Leu Pro
        35                   40                   45
Glu Glu Gly Phe Pro Tyr Pro Leu Pro Met Thr Leu Gly His Glu Gly
    50                   55                   60
Ala Gly Val Val Ala Glu Val Gly Thr Gly Val Thr Gly Ile Ser Glu
65                   70                   75                   80
Gly Thr Ser Val Ala Val Tyr Gly Ala Trp Gly Cys Gly Val Cys His
                 85                   90                   95
Phe Cys Ala Arg Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Gly Glu Leu
            100                  105                  110
Gly Ile Thr Pro Pro Gly Leu Gly Asn Pro Gly Ala Met Ala Glu Tyr
        115                  120                  125
Leu Leu Val Asp Asp Ala Arg His Leu Val Pro Leu Gly Asp Leu Asp
    130                  135                  140
Pro Val Ala Ala Val Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His
145                  150                  155                 160
Ala Ile Lys Pro Ser Leu Pro Lys Leu Val Gly Gly Thr Thr Ala Val
                165                  170                  175
Val Ile Gly Ala Gly Gly Leu Gly His Val Gly Ile Gln Leu Leu Arg
            180                  185                  190
His Leu Thr Pro Ser Arg Val Ile Ala Leu Asp Val Ser Asp Asp Lys
        195                  200                  205
Leu Ala Phe Ala Arg Glu Val Gly Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp
    210                  215                  220
Ala Asp Ala Val Ala Asn Val Arg Lys Ile Thr Gly Asn Asp Gly Ala
225                  230                  235                 240
Thr Ala Val Phe Asp Phe Val Gly Leu Gln Pro Thr Leu Asp Ile Ala
                245                  250                  255
Met Gly Val Val Gly Thr Met Gly Asp Val Val Ile Val Gly Ile Gly
            260                  265                  270
Asp Met Val Ala Thr Ala Lys Val Gly Phe Phe Thr Gln Pro Tyr Glu
        275                  280                  285
Val Ser Val Arg Ala Pro Tyr Trp Gly Ala Arg Asp Glu Leu Ile Glu
    290                  295                  300
Val Leu Asp Leu Ala Arg Asp Gly Val Leu Glu Val Ala Val Glu Arg
305                  310                  315                 320
Phe Ser Leu Asp Asp Gly Val Glu Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Ala Asn
                 325                  330                  335
Asp Leu Arg Gly Arg Ala Val Val Val Pro Asp
            340                  345
<210>7
<211>339
<212>PRT
<213>Pichia trehalophila
<400>7
Met Cys Thr Ser Gln Ser Gly Tyr Val Tyr His Ser Gly Arg Pro Leu
1                5                    10                  15
Leu Thr Lys Glu Glu Leu Ser Ile Pro Glu Pro Lys Gly Ser Glu Ile
            20                   25                   30
Val Leu Lys Val Arg Ala Ala Gly Leu Cys Ser Ser Asp Val His Val
        35                   40                   45
Leu Asn Ser Ser Leu Pro Leu Thr Tyr Pro Asn Ser Phe Ala Met Gly
    50                   55                   60
His Glu Ile Ala Gly Glu Ile Tyr Lys Leu Gly Pro Asn Val Asp Ala
65                   70                   75                  80
Asp Lys Tyr Ser Ile Gly Asp Gly Tyr Ala Val His Gly Leu Asn Ser
                85                   90                   95
Cys Gly Asp Cys Ser Phe Cys Lys Val Gly Ser Gln Asn Leu Cys Thr
            100                  105                  110
Asp Asn Asn Ser Thr Trp Tyr Gly Leu Gly Lys Asn Gly Gly Tyr Glu
        115                  120                  125
Gln Tyr Val Leu Val Lys Ser Val His Asp Leu Ile Lys Ile Pro Glu
    130                  135                  140
Gly Val Ser Phe Ser Glu Ala Ala Val Ala Ser Asp Ala Val Leu Thr
145                  150                  155                 160
Pro Tyr His Ala Ile Ser Thr Cys Asn Leu Lys Ala Thr Ser Lys Val
                165                  170                  175
Leu Val Ile Gly Cys Gly Gly Leu Gly Thr Cys Ala Leu Gln Ile Ile
            180                  185                  190
Lys Leu Tyr Ser Ala Tyr Val Val Cys Val Asp Ser Lys Ala Glu Leu
        195                  200                  205
Glu Glu Leu Ala Lys Glu Tyr Gly Ala Asp Glu Phe Tyr Thr Asp Leu
    210                  215                  220
Ser Lys Ser Ser Val Pro Lys Met Ser Phe Asp Cys Val Phe Asp Phe
225                  230                  235                 240
Val Ala Ile Gln Pro Thr Phe Thr Ile Ser Gln Asn Tyr Val Lys Ser
                245                  250                  255
Gly Gly Ile Ile Lys Pro Val Gly Leu Gly Ala Pro Ser Leu Thr Phe
            260                  265                  270
Ser Leu Leu Asp Leu Gly Cys Arg Asp Val Lys Ile Ile Gly Ser Phe
        275                  280                  285
Trp Gly Thr Gln Ala Glu Gln Lys Asp Cys Met Glu Leu Ile Gln Arg
    290                  295                  300
Gly Leu Val Lys Pro Leu Ile Thr Ser Phe Thr Phe Asp Glu Phe Pro
305                  310                  315                 320
Gln Ala Tyr Glu Leu Leu Ser Thr Gly Lys Ser Lys Gly Arg Leu Val
                325                  330                  335
lle Ser Gln
<210>8
<211>254
<212>PRT
<213>Candida nemodendra
<400>8
Met Gly Tyr Asn Leu Ile Asn Lys Val Ala Val Val Thr Gly Gly Cys
1                5                    10                  15
Ser Gly Ile Gly Leu Ala Val Thr Lys Lys Tyr Leu Glu Leu Gly Ala
            20                    25                  30
Lys Val Val Ile Gly Asp Val Ser Thr Lys Glu Lys Phe Asn Glu Val
        35                    40                  45
Ser Ser Glu Leu Lys Val Ala Gly Leu Asn Val Asn Asn Leu Asn Phe
    50                   55                   60
Val Ser Ala Asp Ser Ser Lys Glu Asp Asp Asn Lys Arg Leu Val Asp
65                   70                   75                   80
Glu Ala Ile Lys Asn Phe Gly Gly Leu Asp Ile Val Cys Ala Asn Ala
                85                    90                   95
Gly Ile Gly Ser Met Ile Pro Phe His Glu Met Thr Phe Glu Ala Trp
            100                  105                  110
Arg Lys Leu Leu Ala Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Leu Asp Arg
        115                  120                  125
Phe Ala Ile Asp Tyr Trp Leu Lys Asn Ser Lys Pro Gly Val Ile Val
    130                  135                  140
Asn Met Gly Ser Ile His Ser Phe Val Ala Ala Pro Gly Leu Ala His
145                  150                  155                 160
Tyr Ser Ala Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Leu Thr Glu Ala Leu Ala
                165                  170                  175
Leu Glu Tyr Ser Ser Lys Gly Ile Arg Val Asn Ser Val Asn Pro Ala
            180                  185                  190
Tyr Ile Gln Thr Ser Leu Leu Glu Phe Leu Pro Glu Asp Lys Met Asn
        195                  200                  205
Ala Leu Lys Ala Val His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Lys Pro Glu Glu
    210                  215                  220
Val Ala Asn Ala Val Ala Phe Leu Ser Ser Asp Glu Ala Thr Phe Ile
225                  230                  235                 240
His Gly Thr Ser Leu Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
                 245                  250
<210>9
<211>849
<212>DNA
<213>粘质红酵母
<220>
<221>基因
<222>(1)..(849)
<400>9
atgcctgcca ctctccgcct cgacaagaag gttgccatca tcaccggagg agcatccggg     60
atcggcctcg agtcggccct cgtctttgcc ggagaaggcg cccacgtcgt cgtcgccgac    120
atcaacgtcg aagctgccaa ccgcgccgtc gagatcatca agacccaggt tcaggacgcc    180
cccaaggcga tcgccgtcaa gtgcgacgtc tccaaggagg acgacatcaa gaacctcgtc    240
gcgactgctg tcgaaacttt tggcaggctc gatgtcatgt tcaacaacgc cggcatcatg    300
caccccgagg acgacaatgc gctcaacacc tcggagcgca tctgggacct gaccatgaac   360
attaacgtca agggagtctg gtggggctgc aagtacgcga tcgacgccat gcgcaagaac   420
ccgggcggca gcaaggggag catcatcaac acggcttcgt tcgtcgccat cctcggagcg   480
gcgacgcctc agatcgcata caccgcttcg aagggtgccg tcttggccat gactcgcgag   540
ctcgccatgg ttcacgcgcg cgaagggatc cgaatcaact cgctctgccc cggtccgctc   600
aagacagagc tcctgatgaa gttcctcgac acgccggaga agaaggagcg ccggatggtg   660
cacatcccga tgggtcgctt cggtgaggcg gttgagcagg ctcgcgcggc cgcgttcctc   720
gctagcgacg acagcagctt catcaccgga actgacttca aggtcgacgg cggtatcagc   780
tcgtgctacg tcacgccgga gggcgagcag gccctcgcgg cgccgtccaa cttggctccc   840
aaggcgtag                                                           849
<210>10
<211>765
<212>DNA
<213>粉状毕赤酵母
<220>
<221>基因
<222>(1)..(765)
<400>10
atggcctata acttcactaa caaagtcgct atcattacag gaggaatttc cggtattggt  60
ttagctacag tcgagaaatt cgctaagttg ggtgctaaag tcgtcatagg agacattcaa  120
aaagaagaat ataaagaagc tgcttttaca aatttgaaga acaaaggaat taatcttgat  180
caattgacgt atgtccacac ggacgtcacc gcaaattcgg caaatgagaa ccttttaaag  240
actgctataa gctcctttgg tggcgttgac tttgtcgtag caaactctgg aatagcaaaa  300
gatcaacgtt ctgaagagat gacttatgaa gatttcaaga aaataatcga tgtcaactta  360
aacggtgttt tttccttgga taagctagca attgattatt ggttaaaaaa taagaaaaag  420
ggctctattg tcaacacggg atctattctt tcatttgttg gtacccccgg gttatcacat  480
tattgtgcgt caaagggtgg agtgaagtta ttgacacaaa ccttggctct cgaacaggct  540
aagaatggca taagagtgaa ttgtataaat cctggttata taagaacacc tttattagag  600
tttttgccta aggacaagta tgacgcttta gtggatcttc atccaatggg tagattaggt  660
gaacctgagg aaattgccaa tgccattgca ttcctcgtct ctgacgaagc gagcttcata  720
actggtacta ctctactcgt tgatggagga tatacagccc agtaa                  765
<210>11
<211>1011
<212>DNA
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>基因
<222>(1)..(1011)
<400>11
atgtctattc ctgctacaca atatggtttc gtcttcacca aaaaggacgg tttaaaaatt     60
cgcgagaaca tgcctgttct cgaacccaag gctgaccaag tcttgcttaa agtcgacgca    120
gtaggattgt gtcactctga ccttcatgcc atctacgacg gcttcgactt tggtgacaat    180
tacgttatgg gccacgaaat cgccggcacc attgtcaaga agggagccat ggtcgacttt    240
tgggacctaa acacccgtgt tgcctgtttt ggtccaaact cctgtggcca ttgtcaactt    300
tgtcgtactg gttttgaaaa tgattgtatc aatgtcgtca acggctggtt tggattaggt    360
aaaaacggag gctaccagca atatttgttg gttgaaaagc ctcgtaattt ggttgctatt    420
ccagacaacg tcgagctgtc cgatgcagct gccattaccg acgctttgtt gaccccctac    480
catgccatga gattagctgg tgttagatca ggcacgaagc tcttgcaaat tggtgctgga    540
ggattgggag taaatggtat tcagattgct aaagcatttg gagctcaagt cactgttatc    600
gacaaaaagc ccgaggctgt agacgtcgct aagagcctag gcgcagatga agtatattct    660
gcacttcctg aatcaaccag tccgggaagt ttcgatgttg ctatcgacta cgtttctact    720
caaggcactt tcgacacttg tcaaaagtac gtcagatcta agggtaatat tgttcccgtt    780
ggattggccg ctccaagaat ttcgtttaac ttgggagatt tggcccttag agaaattaat   840
gtccttggta gcttctgggg tacatcatcc gacttgaagg aatgtttcga tttggtcagc   900
aagggcaaag tcaaacctaa ggtgactgtt gctccattga agcaattgcc tgaatacatt   960
gtcaagttac agaattcggc ctacgaaggt agagtcgtgt tcaagccatg a           1011
<210>12
<211>759
<212>DNA
<213>肉色明串珠菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(759)
<400>12
atgacagatc ggttaaagaa taaagttgct attatcactg gtggtacact tggtattggc     60
ttagcaatgg ctcaaaagtt tgtagaagaa ggcgctaaag ttgtcattac tgggcgtcgt    120
gctaatgttg gtgcagaagc gctaaagaca attggtgatg aatcagtagc acgatttgtt    180
caacatgatg catctgatga aaaaggctgg attgatttat ttgaaaatac gattaaatgg    240
tttggtcatg tcgatacggt tgtcaataat gccggtgttg caattgctaa aaacattgaa    300
gagacaacat atgaagactg gaaatttttg caatcaatca actctgatgg cgttttctta    360
ggaactaagt acggtatgca atatatgaaa aaccaagctg gtggtgcctc aattattaat    420
atgtcatcta ttgaaggatt tgttggtgat cctaacttag ctgcttataa tcattcaaaa    480
ggtggtgtcc gcattttgag taagtcagct gcactacatg cagcattgaa tgactataac    540
ttacgtgtca acacgattca cccaggatat atcaaaacac cattggttga tggtattgat    600
ggtgcagaag aagcccaatc acaaagaact caaacaccta tgggacatat tggtgaacct    660
aatgatattg catatatggc agtctattta gctagtgaag aatcaaagtt tgcaacaggt    720
gctgaattcg ttgttgatgg cggctatttg gcacaataa                           759
<210>13
<211>1044
<212>DNA
<213>微杆菌属
<220>
<221>基因
<222>(1)..(1044)
<400>13
atgaaggcac tccagtacac gaagatcgga tcccaccccg aagtcgtcga gatcgagaag     60
ccctcgccgg gtcccgggca ggtactgctc aaagtcaccg ccgccggcgt ctgccactcg    120
gacgagttcg tgatgagcct cagcgaggag cagtacaccg ctgccggcta ccccctgccg    180
ctcaccctcg ggcacgaagg cgccggcatc gtcgaggagc tcggcgaagg tgtcgagcac    240
ctgagcgtcg gagacgccgt cgccgtctac ggcccctggg gttgcggccg ctgccgcaac    300
tgcgcgcagg gcaaggagaa ctactgcacg aacgcccagg cggaggggat catgcctccc    360
ggtctcgggg ctcccggctc aatggcggag tacatgatcg tcgacagcgc gcgacacctc    420
gttccgctcg gcgacctcga ccccgtgcag aacgtttcct tgacggatgc cggcctgacc    480
ccgtaccacg cggtcaagac gtcacttccg aagctgggcg ccggaacgac ggcggtcgtg    540
atcggcaccg ggggtctcgg acacgtcgcg attcagatcc tgcgggcggt gtcggccgcg    600
accgtgatcg cgttggacgt caacgacgag aaactcgcgc tggccaagga ggtcggcgcc    660
catcacaccg tcatgagcga cggcggcgcc gtcgacgcga ttcgccggct caccgacggt    720
ctgggcgcga acgccgtctt cgacttcgtc ggtgcggacc cgacgatcgc gacggcgata    780
ggagcagccg cgctcgacgc agacatcacg atcgtcggca tcggcggcgg aacggctcac    840
gtcggtttcg gcaccgtcgc ttatgacgcg gcgcttcgca tcccgtattg gggctcgcgc    900
agcgaactga tcgaggtgct cgacctcgcg cgctcagggc aggtgggagt cgagatccag    960
cgctactcac tcgacgacgg cccgaaggcg tacgaggcgc tcgccgcggg cacggtccgc   1020
ggccgcgccg tcatcgtccc ctga                                          1044
<210>14
<211>1044
<212>DNA
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(1044)
<400>14
atgaaggcca ttcagatcat ccagccgggc aaaccgccgg agctgcgcga ggtcgagaaa     60
cccacgccgc gtcccgggca ggtgttgctg aaggtgacgg cagccggcgc ctgccattcg    120
gacgacttcg tcctcaacct gcccgaggaa ggattcccct atcccctgcc gatgacgctc    180
ggccacgaag gggccggcgt ggtcgccgag gtcggtaccg gcgtcaccgg catctccgag    240
ggcacctcgg tggccgtgta cggagcctgg ggttgcggcg tctgtcactt ctgcgcccgc    300
ggcctggaga actactgcag ccgagccggc gaactcggca tcaccccacc gggtctcggc    360
aacccgggcg cgatggccga gtacctgctc gtggacgacg cacggcatct ggtgccgctc    420
ggtgacctcg acccggtggc tgcagtccca ctcaccgatg ccggcctcac gccctaccac    480
gcgatcaaac cctcgcttcc gaagctggtc ggcggcacca cggcagtggt catcggagcc    540
ggtggtctcg ggcatgtcgg gatccaactg cttcgccacc tgaccccgtc ccgggtgatc    600
gctctcgacg tgagcgacga caagctcgcg ttcgcgcgcg aggtcggggc tcacgaggtg    660
gtgctctccg acgccgatgc cgtcgcgaac gtccgcaaga tcaccggcaa cgatggtgcg   720
accgccgtct tcgacttcgt cgggctgcaa cccacgctcg acatcgcgat gggcgtcgtc   780
gggaccatgg gtgacgtggt gatcgtgggc atcggtgaca tggtcgccac ggcgaaggtc   840
ggcttcttca cccagcccta cgaggtgtcg gtacgcgcgc cgtactgggg ggcgcgcgac   900
gaactcatcg aggtgctgga tctcgcacgc gatggggttc tcgaggtggc ggtcgaacga   960
ttctcactcg atgacggcgt cgaggcctac cggcgactgg ccgccaatga ccttcgaggg  1020
cgagcagtcg tggtgcctga ctga                                         1044
<210>15
<211>1020
<212>DNA
<213>Pichia trehalophila
<220>
<221>基因
<222>(1)..(1020)
<400>15
atgtgtactt ctcaatctgg ctacgtttat cattctggta gaccactttt aactaaagaa     60
gaactttcaa ttcccgaacc aaaaggctct gaaattgttc taaaagttcg tgcagctggt    120
ttatgttcat cagatgttca tgttctaaac agcagtttac cattgactta cccaaacagt    180
tttgctatgg gtcatgaaat tgccggtgaa atttataagc ttggtccaaa cgttgacgct    240
gataaatatt caattggaga tggatatgca gttcatggtt tgaactcctg tggtgattgt    300
tccttctgta aggttggtag tcaaaacctg tgtaccgata acaattcaac ttggtacggt    360
ttaggtaaga atggtggtta tgaacagtac gttttagtta aaagtgttca tgacttaatt    420
aaaattccag aaggtgttag tttctcagag gccgcagttg cttcagatgc tgttttaact    480
ccatatcatg ctatcagcac ctgtaacttg aaggcaactt ccaaagtttt agttattggt    540
tgtggtgggt taggtacctg tgctttacaa atcatcaaat tgtacagtgc atatgttgtc    600
tgtgttgact ccaaagcaga attagaagaa cttgctaaag aatatggcgc tgatgaattc    660
tacaccgatt tatcaaaatc cagcgttccc aaaatgtcat ttgattgtgt ttttgatttt    720
gttgccattc agccaacttt caccatttct caaaattacg tcaagagcgg tggtatcatc    780
aaacctgttg gcttaggtgc tcctagctta acatttagtt tattggactt aggttgtaga    840
gacgttaaga tcattggctc tttctggggt acacaagctg aacaaaaaga ctgtatggaa    900
ctaattcaaa gaggtttagt caagccatta attacaagtt tcacttttga tgaatttcct    960
caagcttatg aattgttgtc gactgggaaa tccaagggta gattggttat cagtcaatag   1020
<210>16
<211>765
<212>DNA
<213>Candida nemodendra
<220>
<221>基因
<222>(1)..(765)
<400>16
atgggttaca acttaatcaa caaagttgca gtcgtcacag gaggctgctc cggaattggt     60
ctcgcagtga ccaaaaaata tcttgaactg ggagcaaaag tggtcatagg agatgtatcc    120
actaaagaga agtttaacga ggtatcctcg gaactcaaag ttgcaggcct aaatgtaaac    180
aatttaaact ttgtttcagc agacagtagc aaagaagacg acaacaaacg tttagttgac    240
gaagcaatca agaactttgg tggtcttgat attgtgtgtg ctaatgccgg tatcggtagc    300
atgattccat tccatgaaat gacatttgaa gcatggagaa agttactcgc agtaaacctt    360
gatggtgtgt tcttgctaga cagattcgca attgattact ggttaaagaa tagcaaacct    420
ggtgttatcg tcaacatggg ttcaatccac tctttcgtcg ctgctccagg attagcacat    480
tactctgctt ccaagggagg tgtcaaacta ttgaccgaag ctcttgctct agagtactcg    540
tccaagggta ttagagtaaa ttctgtgaat cctgcatata ttcaaacctc attgctagaa    600
ttccttccag aagacaaaat gaatgccttg aaggcggtgc accctattgg ccgtttaggt    660
aaaccagaag aagtagccaa tgctgtcgca ttcctcagtt ccgatgaagc aaccttcata    720
catggtactt ctcttctagt tgatggaggt tacaccgctc aataa    765
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>粘质红酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>17
Met Pro Ala Thr Leu Arg Leu Asp Lys
1                5
<210>18
<211>13
<212>PRT
<213>粘质红酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(13)
<400>18
Gln Ala Leu Ala Ala Pro Ser Asn Leu Ala Pro Lys Ala
1                5                    10
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>粘质红酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>19
Val Glu Ile Ile Lys Thr Gln Val Gln Asp
1                5                    10
<210>20
<211>14
<212>PRT
<213>粘质红酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(14)
<400>20
Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Ala Ser Gly Ile Gly Leu
1                5                    10
<210>21
<211>8
<212>PRT
<213>粘质红酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(8)
<400>21
Ser Cys Tyr Val Thr Pro Glu Gly
1                5
<210>22
<211>8
<212>PRT
<213>粘质红酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(8)
<400>22
Thr Asp Phe Lys Val Asp Gly Gly
1                5
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>粘质红酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>23
Val Met Phe Asn Asn Ala Gly Ile Met His
1                5                    10
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>粘质红酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>24
Val His Ala Arg Glu Gly Ile Arg Ile Asn
1                5                    10
<210>25
<211>10
<212>PRT
<213>粉状毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>25
Met Ala Tyr Asn Phe Thr Asn Lys Val Ala
1                5                    10
<210>26
<211>12
<212>PRT
<213>粉状毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(12)
<400>26
Thr Thr Leu Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
1                5                    10
<210>27
<211>9
<212>PRT
<213>粉状毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>27
Glu Tyr Lys Glu Ala Ala Phe Thr Asn
1                5
<210>28
<211>16
<212>PRT
<213>粉状毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(16)
<400>28
Asn Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Ile Ser Gly Ile Gly Leu Ala
1                5                    10                  15
<210>29
<211>9
<212>PRT
<213>粉状毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>29
Asp Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Ser
1                5
<210>30
<211>9
<212>PRT
<213>粉状毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>30
His Tyr Cys Ala Ser Lys Gly Gly Val
1                5
<210>31
<211>8
<212>PRT
<213>粉状毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(8)
<400>31
Asn Cys Ile Asn Pro Gly Tyr Ile
1                5
<210>32
<211>9
<212>PRT
<213>粉状毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>32
Leu His Pro Met Gly Arg Leu Gly Glu
1                5
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>33
Met Ser Ile Pro Ala Thr Gln Tyr Gly Phe Val
1                5                    10
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>34
Ser Ala Tyr Glu Gly Arg Val Val Phe Lys Pro
1                5                    10
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>35
Cys His Ser Asp Leu His Ala Ile Tyr
1                5
<210>36
<211>9
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>36
Gly Tyr Gln Gln Tyr Leu Leu Val Glu
1                5
<210>37
<211>9
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>37
Thr Phe Asp Thr Cys Gln Lys Tyr Val
1                5
<210>38
<211>8
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(8)
<400>38
Leu Leu Thr Pro Tyr His Ala Met
1                5
<210>39
<211>9
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>39
Leu Val Ser Lys Gly Lys Val Lys Pro
1                5
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>40
Gly Ala Gly Gly Leu Gly Val Asn Gly
1                5
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>41
Ile Gln Ile Ala Lys Ala Phe Gly Ala Thr
1                5                    10
<210>42
<211>8
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(8)
<400>42
Leu Gly Ser Phe Trp Gly Thr Ser
1                5
<210>43
<211>10
<212>PRT
<213>肉色明串珠菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>43
Met Thr Asp Arg Leu Lys Asn Lys Val Ala
1                5                    10
<210>44
<211>12
<212>PRT
<213>肉色明串珠菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(12)
<400>44
Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Leu Ala Gln
1                5                    10
<210>45
<211>9
<212>PRT
<213>肉色明串珠菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>45
Val Val Ile Thr Gly Arg Arg Ala Asn
1                5
<210>46
<211>9
<212>PRT
<213>肉色明串珠菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>46
Gly Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser
1                5
<210>47
<211>8
<212>PRT
<213>肉色明串珠菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(8)
<400>47
Thr Gln Thr Pro Met Gly His Ile
1                5
<210>48
<211>10
<212>PRT
<213>肉色明串珠菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>48
Gly Tyr Ile Lys Thr Pro Leu Val Asp Gly
1                5                    10
<210>49
<211>11
<212>PRT
<213>微杆菌属
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>49
Met Lys Ala Leu Gln Tyr Thr Lys Ile Gly Ser
1                5                    10
<210>50
<211>14
<212>PRT
<213>微杆菌属
<220>
<221>肽
<222>(1)..(14)
<400>50
Leu Ala Ala Gly Thr Val Arg Gly Arg Ala Val Ile Val Pro
1                5                    10
<210>51
<211>12
<212>PRT
<213>微杆菌属
<220>
<221>肽
<222>(1)..(12)
<400>51
Cys His Ser Asp Glu Phe Val Met Ser Leu Ser Glu
1                5                    10
<210>52
<211>10
<212>PRT
<213>微杆菌属
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>52
Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Arg Cys
1                5                    10
<210>53
<211>13
<212>PRT
<213>微杆菌属
<220>
<221>肽
<222>(1)..(13)
<400>53
Val Ser Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His Ala
1                5                    10
<210>54
<211>12
<212>PRT
<213>微杆菌属
<220>
<221>肽
<222>(1)..(12)
<400>54
Leu Arg Ala Val Ser Ala Ala Thr Val Ile Ala Leu
1                5                    10
<210>55
<211>9
<212>PRT
<213>微杆菌属
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>55
Asp Phe Val Gly Ala Asp Pro Thr Ile
1                5
<210>56
<211>8
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(8)
<400>56
Met Lys Ala Ile Gln Ile Ile Gln
1                5
<210>57
<211>10
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>57
Asp Leu Arg Gly Arg Ala Val Val Val Pro
1                5                    10
<210>58
<211>9
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>58
Thr Ala Ala Gly Ala Cys His Ser Asp
1                5
<210>59
<211>11
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>59
Thr Pro Tyr His Ala Ile Lys Pro Ser Leu Pro
1                5                    10
<210>60
<211>8
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(8)
<400>60
Asp Phe Val Gly Leu Gln Pro Thr
1                5
<210>61
<211>8
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(8)
<400>61
Val Tyr Gly Ala Trp Gly Cys Gly
1                5
<210>62
<211>8
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(8)
<400>62
Asp Asp Ala Arg His Leu Val Pro
1                5
<210>63
<211>8
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(8)
<400>63
Met Thr Leu Gly His Glu Gly Ala
1                5
<210>64
<211>14
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(14)
<400>64
Gly Gly Leu Gly His Val Gly Ile Gln Leu Leu Arg His Leu
1                5                    10
<210>65
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<400>65
caggaaacag ctatgacc    18
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>粘质红酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>66
Val Ala Thr Ala Val Glu Thr Phe Gly Arg
1                5                    10
<210>67
<211>9
<212>PRT
<213>粘质红酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(9)
<400>67
Phe Gly Glu Ala Val Glu Gln Ala Arg
1                5
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<400>68
ccraaytcva cvgcvgtsgc    20
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<400>69
gcctgytcga cvgcytcrcc    20
<210>70
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<400>70
ctccgaggtg ttgagcgcat tg    22
<210>71
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<400>71
gacgaggttc ttgatgtcgt cctcc    25
<210>72
<211>12
<212>PRT
<213>粉状毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(12)
<400>72
Leu Leu Thr Gln Thr Leu Ala Leu Glu Gln Ala Lys
1                5                    10
<210>73
<211>14
<212>PRT
<213>粉状毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(14)
<400>73
Tyr Asn Phe Thr Asn Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Ile
1                5                    10
<210>74
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>n是a，c，g，或t
<400>74
ytgytcyaan gcyaadgtyt g    21
<210>75
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>n是a，c，g，或t
<400>75
chaayaargt ngchathaty achgg    25
<210>76
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<400>76
caacgttctg aagagatgac ttatg    25
<210>77
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<400>77
ggtggagtga agttattgac    20
<210>78
<211>23
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<400>78
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<210>79
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<400>79
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<210>80
<211>7
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(7)
<400>80
Ala Asp Gln Val Leu Leu Lys
1                5
<210>81
<211>11
<212>PRT
<213>树干毕赤酵母
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>81
Ile Ser Phe Asn Leu Gly Asp Leu Ala Leu Arg
1                5                    10
<210>82
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>n是a，c，g，或t
<400>82
gcygaycarg tnttrttraa r    21
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<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
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<222>(1)..(21)
<400>83
ctyaargcya artcdccyaa r    21
<210>84
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
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<400>84
ctaccatgcc atgagattag    20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
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gctgtagacg tcgctaagag    20
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
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<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
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<222>(1)..(20)
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<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<400>88
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
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<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
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<400>90
cggcaagctt attacgcctt gggagccaag ttg    33
<210>91
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
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<400>91
ggaaattcca tatggcctat aacttcacta ac    32
<210>92
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(33)
<400>92
cactgcatgc tgatggccta taacttcact aac    33
<210>93
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
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cgcaagctta ttactgggct gtatatcctc    30
<210>94
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(33)
<400>94
ggaaattcca tatgatgtct attcctgcta cac    33
<210>95
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(31)
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cactgcatgc gaatgtctat tcctgctaca c    31
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<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<400>96
cccaagctta tcatggtttg aacacgactc tac    33
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<211>10
<212>PRT
<213>肉色明串珠菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>97
Ile Glu Glu Thr Thr Tyr Glu Asp Trp Lys
1                5                    10
<210>98
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(27)
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>n是a，c，g，或t
<400>98
gacagawmgw ttnaarggwa argthgc    27
<210>99
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(29)
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>n是a，c，g，或t
<400>99
gcbgtrtawc cnccrtcdac dacraaytc    29
<210>100
<211>23
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<400>100
ctaagccaat accaagtgta cca    23
<210>101
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(27)
<400>101
gaacaaatcg tgctactgat tcatcac    27
<210>102
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<400>102
gaagaagccc aatcacaaag aactc    25
<210>103
<211>23
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<400>103
ggcagtctat ttagctagtg aag    23
<210>104
<211>14
<212>PRT
<213>微杆菌属
<220>
<221>肽
<222>(1)..(14)
<400>104
Met Lys Ala Leu Gln Tyr Thr Lys Ile Gly Ser His Pro Glu
1                5                    10
<210>105
<211>11
<212>PRT
<213>微杆菌属
<220>
<221>肽
<222>(1)..(11)
<400>105
Ala Tyr Glu Ala Leu Ala Ala Gly Thr Val Val
1                5                    10
<210>106
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<400>106
ctscartaca cvaagatcgg    20
<210>107
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<400>107
gcbgcsagbg cytcrtabgc    20
<210>108
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<400>108
tcctcgctga ggctcatcac    20
<210>109
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<400>109
gcttctcgat ctcgacgact tc    22
<210>110
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(19)
<400>110
gcgcagcgaa ctgatcgag    19
<210>111
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<400>111
gatccagcgc tactcactcg ac    22
<210>112
<211>10
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(10)
<400>112
Met Lys Ala Ile Gln Ile Ile Gln Pro Gly
1              5               10
<210>113
<211>13
<212>PRT
<213>深红戈登氏菌
<220>
<221>肽
<222>(1)..(13)
<400>113
Val Gly Phe Phe Thr Gln Pro Tyr Glu Val Ser Val Arg
1                5                    10
<210>114
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(26)
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a，c，g，或t
<400>114
atgaargcna tycaratyat ycarcc    26
<210>115
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>n是a，c，g，或t
<400>115
cytcrtangg ytgngtraar aa    22
<210>116
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<400>116
gaggacgaag tcgtccgaat g    21
<210>117
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<400>117
gccgtcacct tcagcaacac c    21
<210>118
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<400>118
ctcgacgtga gcgacgacaa g    21
<210>119
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<400>119
gcaagatcac cggcaacgat g    21
<210>120
<211>37
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(37)
<400>120
catatggcta gcatgacaga tcggttaaag aataaag    37
<210>121
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(35)
<400>121
gcgcggatcc atgacagatc ggttaaagaa taaag    35
<210>122
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(29)
<400>122
cccaagcttc ttattgtgcc aaatagccg    29
<210>123
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(31)
<400>123
ggaaattcca tatgaaggca ctccagtaca c    31
<210>124
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(32)
<400>124
cactgcatgc tgatgaaggc actccagtac ac    32
<210>125
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<400>125
cccaagctta acgtcagggg acgatgac    28
<210>126
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(33)
<400>126
cactgcatgc gaatgaaggc cattcagatc atc    33
<210>127
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(33)
<400>127
cccaagctta ttagtcaggc accacgactg ctc    33
<210>128
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<400>128
tgtaaaacga cggccagt    18
<210>129
<211>336
<212>PRT
<213>Lodderomyces elongisporus
<400>129
Met Ser Ile Pro Thr Thr Gln Tyr Gly Phe Val Tyr Asn Lys Ser Ser
1                5                    10                   15
Gly Leu Thr Leu Asn Lys Ser Ile Pro Val Ala Ser Ala Gly Val Gly
            20                    25                   30
Gln Leu Leu Met Lys Val Asp Ser Val Gly Leu Cys His Ser Asp Leu
        35                   40                   45
His Val Ile Tyr Glu Gly Leu Asp Cys Gly Asp Asn Tyr Val Met Gly
    50                   55                   60
His Glu Ile Ala Gly Thr Val Val Asp Val Gly Pro Glu Val Asp Arg
65                   70                   75                   80
Trp Asn Val Gly Asp Arg Val Ala Ala Val Gly Pro Asn Gly Cys Gly
                 85                   90                   95
Gly Cys Arg Ala Cys Arg Asp Gly Ile Glu Asn Val Cys Lys His Ser
            100                  105                  110
Phe Gly Asn Trp Tyr Gly Leu Gly Ser Asp Gly Gly Tyr Gln Gln Tyr
        115                  120                  125
Leu Leu Val Gln Lys Pro Arg Asn Leu Val Lys Ile Pro Asp Asn Val
    130                  135                  140
Pro Ser Asp Val Ala Ala Ala Ser Thr Asp Ala Val Leu Thr Pro Tyr
145                  150                  155                 160
His Ala Ile Lys Met Ala Gly Val Gly Pro Thr Ser Lys Val Leu Ile
                165                  170                  175
Val Gly Ala Gly Gly Leu Gly Cys Asn Ala Val Gln Val Ala Lys Ala
            180                  185                  190
Phe Gly Ala His Val Thr Ile Leu Asp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Ala
        195                  200                  205
Glu Ala Val Lys Phe Gly Ala Asp Val Ala Tyr Glu Ser Leu Pro Leu
    210                  215                  220
Ser Thr Glu Pro Gly Ser Phe Asp Ala Cys Leu Asp Phe Val Ser Val
225                  230                 235                  240
Gln Ala Thr Phe Gly Ile Cys Gln Lys Phe Cys Ala Pro Lys Gly Cys
                245                  250                  255
Ile Ile Pro Ala Gly Leu Gly Ala Pro Lys Leu Thr Leu Asp Leu Ala
            260                  265                  270
Asp Leu Asp Leu Arg Glu Ile Arg Ile Leu Gly Thr Phe Trp Gly Thr
        275                  280                  285
Ala Thr Asp Leu Glu Glu Val Phe Asp Leu Val Gly Lys Gly Leu Val
    290                  295                  300
Lys Pro Met Val Arg Ala Ala Lys Leu Glu Glu Leu Pro Asp Tyr Ile
305                  310                  315                  320
Glu Lys Leu Arg Lys Asn Glu Tyr Glu Gly Arg Ile Val Phe Asn Pro
                325                   330                 335
<210>130
<211>1012
<212>DNA
<213>Lodderomyces elongisporus
<220>
<221>基因
<222>(1)..(1011)
<400>130
atgtcaattc caactaccca atatggtttt gtttacaata agtcgtctgg cttaacattg     60
aacaagagta tacctgttgc ctcggcaggt gtgggtcaat tgcttatgaa ggttgactct    120
gttggattgt gccactcgga cctccatgtg atttacgaag gtttggattg tggtgataac    180
tatgtcatgg gccatgagat tgccggtacc gtggttgatg ttggtccaga ggttgataga    240
tggaatgttg gtgatagagt tgccgctgtg ggtccaaatg gttgtggtgg ttgcagagcc    300
tgtcgcgacg gaattgaaaa tgtatgtaaa cactcttttg gtaattggta tggcttgggc    360
tcagatggcg gataccaaca atatttgctt gtgcaaaaac cacgcaattt ggttaagatt    420
cctgacaatg ttccttcgga tgtagctgca gcctcgactg acgctgtatt gacaccatac    480
cacgcaatca agatggctgg tgtggggcca acatcaaagg tgctcattgt tggcgctggt    540
ggcttgggct gcaatgccgt gcaagttgcc aaggcatttg gtgctcatgt cactattttg    600
gacaagaagg aacgcgcgcg cgctgaagct gtcaagtttg gtgccgacgt tgcctatgag    660
agcttaccac tgagcaccga gccaggctca tttgatgcat gtttggattt tgtttctgtg    720
caagcaacgt ttggcatttg ccaaaagttt tgtgcaccaa aaggttgcat catccccgcg    780
gggctcggtg caccaaagtt gacgcttgat ttggcagatt tggatttgcg cgaaattcgt     840
attttgggta ctttttgggg aaccgcgacc gatttggagg aggtgtttga cttggttgga     900
aagggacttg ttaagcccat ggtgcgtgca gccaagttgg aggaattgcc agactatatt     960
gaaaagttga gaaagaatga atatgaaggt agaattgtct ttaatccata ag            1012

Claims (4)

1. 用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在辅因子的情况下用氧化还原酶还原，
其特征在于
使用具有氨基酸序列的氧化还原酶，在所述氨基酸序列中
(a)至少70％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8之一的氨基酸，或
(b)至少55％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：2的氨基酸，或
(c)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：3的氨基酸，或
(d)至少75％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：4的氨基酸，或
(e)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：5的氨基酸，或
(f)至少50％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：7的氨基酸，或
(g)至少72％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：129的氨基酸。
2. 根据权利要求1的方法，其特征在于所述酮基化合物具有通式I
R1-C(O)-R2(I)
其中所述R1代表以下部分之一
1)-(C1-C20)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，
2)-(C2-C20)-烯基，其中所述烯基是直链或支链的，并任选含有最多达四个双键，
3)-(C2-C20)-炔基，其中所述炔基是直链或支链的，并任选含有最多达四个三键，
4)-(C6-C14)-芳基，
5)-(C1-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基，
6)-(C5-C14)-杂环，其是未取代的或被-OH、卤素、-NO2和/或-NH2取代一次、两次或三次，或
7)-(C3-C7)-环烷基，
其中在1)到7)中的上述部分是未取代的或相互独立地被-OH、卤素、-NO2和/或-NH2取代一次、两次或三次，
R2代表以下部分之一
8)-(C1-C6)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，
9)-(C2-C6)-烯基，其中所述烯基是直链或支链的，并任选含有最多达三个双键，
10)-(C2-C6)-炔基，其中所述炔基是直链或支链的，并任选含有两个三键，或
11)-(C1-C10)-烷基-C(O)-O-(C1-C6)-烷基，其中所述烷基是直链或支链的，并且是未取代的或被-OH、卤素、-NO2和/或-NH2取代一次、两次或三次，其中在8)到11)中的上述部分是未取代的或相互独立地被-OH、卤素、-NO2和/或-NH2取代一次、两次或三次。
3. 用于通过对映体选择性酶促还原将酮基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法，其中所述酮基化合物在存在辅因子的情况下用氧化还原酶还原，
其特征在于
使用的氧化还原酶
(a)由选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：130的核酸序列编码，或
(b)由核酸序列编码，该核酸序列的互补链在高度严格条件下与(a)中所述核酸序列之一杂交。
4. 用于根据权利要求1到3任一项的方法的氧化还原酶，其特征在于它具有氨基酸序列，在所述氨基酸序列中
(a)至少70％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8之一的氨基酸，或
(b)至少55％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：2的氨基酸，或
(c)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：3的氨基酸，或
(d)至少75％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：4的氨基酸，或
(e)至少65％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：5的氨基酸，或
(f)至少50％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：7的氨基酸，或
(g)至少72％的氨基酸相同于氨基酸序列SEQ ID NO：129的氨基酸。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108441433A (zh) * 2018-03-31 2018-08-24 湖南科技大学 胶红酵母nq1及在制备手性醇中的应用

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT501928B1 (de) 2004-10-27 2010-09-15 Iep Gmbh Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen
EP2066788B1 (en) 2006-10-02 2014-07-23 Codexis, Inc. Compositions and methods for producing stereoisomerically pure statins and synthetic intermediates therefor
ATE518946T1 (de) * 2007-02-08 2011-08-15 Codexis Inc Ketoreduktasen und anwendungen davon
WO2009029554A2 (en) 2007-08-24 2009-03-05 Codexis, Inc. Improved ketoreductase polypeptides for the stereoselective production of (r)-3-hydroxythiolane
CN101855342B (zh) 2007-09-13 2013-07-10 科德克希思公司 用于还原苯乙酮的酮还原酶多肽
TWI601825B (zh) * 2007-09-27 2017-10-11 Ｉｅｐ有限公司 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法
JP2010539948A (ja) 2007-09-28 2010-12-24 コデクシス， インコーポレイテッド ケトレダクターゼポリペプチドおよびその使用
JP5646328B2 (ja) 2007-10-01 2014-12-24 コデクシス， インコーポレイテッド アゼチジノンの生産のためのケトレダクターゼポリペプチド
WO2010025287A2 (en) * 2008-08-27 2010-03-04 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
HUE026181T2 (en) * 2008-08-27 2016-05-30 Codexis Inc Ketoreductase polypeptide for the preparation of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from 3-aryl-3-ketopropanamine
SI2329014T1 (sl) 2008-08-29 2015-01-30 Codexis, Inc. Polipeptidi ketoreduktaze za stereoselektivno produkcijo (4s)-3(5s)-5(4-fluorofenil)-5-hidroksipentanoil)-4-fenil-1,3-oksazolidin -2-ona
EP2226386A1 (de) * 2009-03-05 2010-09-08 IEP GmbH Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen Reduktion von Ketoverbindungen
WO2010150946A1 (en) 2009-06-22 2010-12-29 Sk Holdings Co., Ltd. Method for preparation of carbamic acid (r)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
SG10201405022PA (en) 2009-08-19 2014-10-30 Codexis Inc Ketoreductase polypeptides for the preparation of phenylephrine
US8404461B2 (en) 2009-10-15 2013-03-26 SK Biopharmaceutical Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
US20120285816A1 (en) * 2009-11-24 2012-11-15 Basf Se Method for isolating an alkanol from an aqueous biotransformation mixture
EP2566497B1 (en) 2010-05-04 2015-07-29 Codexis, Inc. Biocatalysts for ezetimibe synthesis
CA2874055A1 (en) 2012-06-18 2013-12-27 Laboratorio Chimico Internazionale S.P.A. Enzymatic reduction
WO2014086702A2 (de) * 2012-12-03 2014-06-12 Basf Se Enzymatische reduktion von hydroxymethylfurfuralen
DE102013104418B4 (de) 2013-04-30 2018-09-27 Cambrex Iep Gmbh Biokatalytisches Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol
CA2958211C (en) * 2014-08-25 2023-09-26 Hli Cellular Therapeutics, Llc Extracellular matrix compositions
CN108753851B (zh) * 2018-05-28 2022-05-20 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶生物催化生产手性1,2-二醇类化合物
EP3985109A4 (en) * 2019-06-13 2023-02-08 Asymchem Laboratories (Tianjin) Co., Ltd KETOREDUCTASE MUTANT AND PROCESS FOR THE PRODUCTION OF CHIRAL ALCOHOLS

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03127998A (ja) 1989-10-13 1991-05-31 Taunzu:Kk 尿素の定量法
DE4014573C1 (zh) 1990-05-07 1991-10-10 Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De
US5200355A (en) 1990-12-10 1993-04-06 Samsung Electronics Co., Ltd. Method for manufacturing a mask read only memory device
US5385833A (en) 1992-02-26 1995-01-31 The Scripps Research Institute Pseudomonas sp. ATCC No. 49794 alcohol dehydrogenase
CA2117482C (en) 1992-03-13 2005-02-15 Maria-Regina Kula New ketonic ester reductases, its preparation and use for enzymatic redox reactions
JP3574682B2 (ja) * 1993-09-24 2004-10-06 ダイセル化学工業株式会社 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法
US5523233A (en) * 1995-05-03 1996-06-04 Merck & Co., Inc. Enzymatic hydrolysis of 3,3-diethyl-4-[(4-carboxy)phenoxy]-2-azetidinone esters
DE19610984A1 (de) 1996-03-21 1997-09-25 Boehringer Mannheim Gmbh Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen
WO2001005996A1 (fr) * 1999-07-21 2001-01-25 Kaneka Corporation Procede d'obtention de derives optiquement actifs du pyridineethanol
TWI275645B (en) * 2000-02-16 2007-03-11 Daicel Chemical Industries Ltd. (R)-2-octanol dehydrogenases, methods for producing the enzymes, DNA encoding the enzymes, and methods for producing alcohols using the enzymes
DE10037101A1 (de) * 2000-07-27 2002-02-07 Degussa Rekombinant hergestellte Enzyme mit verbesserter NAD(H)-Akzeptanz
DE10119274A1 (de) * 2001-04-20 2002-10-31 Juelich Enzyme Products Gmbh Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen
JP2005520517A (ja) * 2002-03-18 2005-07-14 チバ　スペシャルティ　ケミカルズ　ホールディング　インコーポレーテッド 高い溶媒および温度安定性を有するアルコールデヒドロゲナーゼ
DE10218689A1 (de) * 2002-04-26 2003-11-20 Degussa ADH aus Rhodococcus erythropolis
DE10300335B4 (de) * 2003-01-09 2008-06-26 Iep Gmbh Oxidoreduktase
US20050037946A1 (en) * 2003-01-13 2005-02-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cardiovascular disease using 1722, 10280, 59917, 85553, 10653, 9235, 21668, 17794, 2210, 6169, 10102, 21061, 17662, 1468, 12282, 6350, 9035, 1820, 23652, 7301, 8925, 8701, 3533, 9462, 9123, 12788, 17729, 65552, 1261, 21476, 33770, 9380, 2569654, 33556, 53656, 44143, 32612, 10671, 261, 44570, 41922, 2552, 2417, 19319, 43969, 8921, 8993, 955, 32345, 966, 1920, 17318, 1510, 14180, 26005, 554, 16408, 42028, 112091, 13886, 13942, 1673, 54946 or 2419
DE10327454A1 (de) 2003-06-18 2005-01-20 Juelich Enzyme Products Gmbh Oxidoreduktase aus Pichia capsulata
JP2007502111A (ja) * 2003-08-11 2007-02-08 コデクシス， インコーポレイテッド ４−置換３−ヒドロキシ酪酸誘導体およびビシナルなシアノ，ヒドロキシ置換カルボン酸エステルの生成のための酵素的プロセス
US7629157B2 (en) * 2003-08-11 2009-12-08 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides and related polynucleotides
JP2005095022A (ja) * 2003-09-22 2005-04-14 Daicel Chem Ind Ltd 光学活性アルコールの製造方法
EP1731618A1 (en) 2005-06-07 2006-12-13 Prodotti Chimici E Alimentari Spa Process for the selective oxydation of colic acid
AT503486B1 (de) * 2006-04-11 2008-05-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108441433A (zh) * 2018-03-31 2018-08-24 湖南科技大学 胶红酵母nq1及在制备手性醇中的应用
CN108441433B (zh) * 2018-03-31 2021-08-20 湖南科技大学 胶红酵母nq1及在制备手性醇中的应用

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