KR20060030478A

KR20060030478A - 피키아 캡슐라타 유래의 산화환원효소

Info

Publication number: KR20060030478A
Application number: KR1020057024246A
Authority: KR
Inventors: 안트예 구프타; 안케 지메르; 마리아 보브코바
Original assignee: 이에페 게엠베하
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2004-05-28
Publication date: 2006-04-10
Also published as: CA2529583A1; KR101085424B1; SI1633779T1; HK1095336A1; JP4845729B2; DE502004011781D1; CA2529583C; DE10327454A1; ATE484518T1; JP2007523617A; EP1633779B1; US7575909B2; CN1839153A; JP2011244829A; WO2004111083A3; EP1633779A2; ES2357113T3; CN100567321C; PT1633779E; WO2004111083A2

Abstract

본 발명은 효모, 예컨대 피키아 속의 효모, 보다 상세하게는 피키아 캡슐라타로부터 수득한, NADH-의존적 산화환원효소에 관한 것이다. 상기 산환환원효소는, 피키아 캡슐라타 유래 재조합에 의해 과다 발현시킨 분리된 산화환원효소를 이용하여, 유기 케토화합물의 해당 (S)-하이드록시 화합물로의 거울상 이성질체의 선택적 환원을 위한 효소적 방법 및 2상 시스템에서의 (S)-하이드록시 화합물의 거울상 이성질체의 선택적 제조를 위한 효소적 방법에 사용된다.

거울상 이성질체 선택성, 산화환원효소

Description

피키아 캡슐라타 유래의 산화환원효소{OXIDOREDUCTASE FROM PICHIA CAPSULATA}

본 발명은 산화환원효소, 카르보닐 화합물의 해당 (S)-하이드록시 화합물로의 거울상 이성질체 선택적인 환원 방법, 및 키랄(R)-하이드록시 화합물의 수득 방법에 관한 것이다.

광학적으로 활성인 하이드록시 화합물은 약리학적으로 활성인 화합물, 방향족 물질, 페로몬, 농약 또는 효소 저해제의 합성에 광범위하게 사용될 수 있는 유용한 키랄 성분이다.

동시에, 생촉매 작용에 대규모로 적용가능하며 충분한 양을 저가로 이용할 수 있는, 카르보닐 환원효소의 수는 매우 제한적이다. 아래 NADH-의존적 S-특이적 카르보닐 환원효소가 알려져 있다: 말의 간에서 유래된 알코올 디하이드로게나제(HLADH)(Enzyme Engineering, Vol 6, 1982, page 107), 효모 유래 알코올 디하이드로게나제(YADH)(알코올 다하이드로게나제: The Enzymes, (1963), pages 25-83. New York: Academic Press), 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis) 유래 카르보닐 환원효소(CPCR)(US 5,523,223 및 US 5,763,236), 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) 유래 카르보닐 환원효소(RECR)(US 5,523,223), 노르카 르디아 푸스카(Norcardia fusca) 유래 카르보닐 환원효소(Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10) (1999), pages 1721-1729), 칸디다 보이디니(Candida boidinii) 유래 알코올 디하이드로게나제(Biochim., Biophys. Acta 716, (1982), pages 298-307) 또는 설폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 유래 알코올 디하이드로게나제(FEMS Microbiology Letters, 170(1999), pages 31-39).

전술한 카르보닐 환원효소 모두 지금까지 대규모로 사용된 적이 없다. 그 주된 이유는, 기질스펙트럼이 매우 좁거나 효소의 거울상 이성질체 선택성(enantioselectivity)이 낮아, 상기 효소들의 이용가능성이 없기 때문이다. 지금까지, 전술한 효소 대부분은 충분한 양 및 저가 제공이 불가능하다.

전술한 카르보닐 환원효소의 적용에 있어 또다른 문제점은, 보조인자(cofactor)인 NADH 또는 NADPH의 재생이다. 알려진 방법으로 기질, 예컨대 2-프로판올과 커플링된 조효소(coenzyme)의 재생 또는 효소, 예컨대 포르메이트 디하이드로게나제와 커플링된 조효소의 재생중 어느 하나를 채택한다.

포르메이트 디하이드로게나제를 이용한 효소 커플링된 조효소 재생의 문제점은, 이의 특이적 활성이 낮으며(4 내지 10 U/mg), 재조합 포르메이트 디하이드로게나제는 상당히 비싸다는 것이다(J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, pages 187-193).

이소프로판올을 이용한 기질 커플링된 조효소 재생의 문제점은, 이소프로판올과 같은 조기질(cosubstrate)에 대한 효소 안정성이 불충분하고, 비우호적인 평형 상태(unfavourable equilibrium position)가 형성된다는 것이다.

본 발명은 광범위의 기질 스펙트럼, 거울상 이성질체에 대한 높은 선택성 및 유기용매에 대한 높은 안정성을 특징으로 하는, 산화환원효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적은 NADH 및 물 존재하에 카르보닐 화합물을 해당 (S)-하이드록시 화합물로 환원시키는 방식의 산화환원효소에 의해 이루어진다.

종래 기술의 전술한 문제점들은 새로운 산화환원효소을 사용함으로써 해결할 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 피키아 또는 칸디다 속의 효모, 특히 피키아 캡슐라타(Pichia capasulata)로부터 수득가능한 산화환원효소에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 8에 기재된 DNA 서열 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 가지는 피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소에 관한 것이다. 이들 서열은 첨부된 서열목록에 기재되어 있다.

일 예로, 본 발명은 아미노산 서열이 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상 상동하며, 에틸-4-클로로-3-옥소부타노익산의 (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부타노익산으로의 반응을 기준으로 단백질 1 mg 당 1 μmol 이상의 비활성(specific activity)을 가지는, 산화환원효소에 관한 것이다. 산화환원효소의 아미노산은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 내지 99.5%, 특히 90% 내지 99.5%, 특히 99% 내지 99.5% 상동하다. 서열번호 9에 따른 산화환원효소 또는 하기 이의 유도체 또는 유사체들의 비활성은, 실시예 1에 기재된 테스트 시스템으로 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 산화환원효소는, 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 한화환원효소에 비해 1 내지 40개의 아미노산이 추가되거나 또는 1 내지 40개의 아미노산이 적으며, 에틸-4-클로로-3-옥소부타노익산의 (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부타노익산으로의 반응을 기준으로 단백질 1 mg 당 1 μmol 이상의 비활성을 가지는 것으로 특징된다. 바람직하게는, 산화환원효소는 서열번호 9의 아미노산 서열에 비해 1 내지 25개의 아미노산이, 특히 2 내지 20개이 아미노산이, 또는 바람직하게는 3 내지 10개의 아미노산이 많거나 적게 존재한다.

또한, 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지며 수용성 폴리머에 의해 1회, 2회, 3회, 4회 또는 5회 변형되며, 이의 비활성이 에틸-4-클로로-3-옥소부타노익산의 (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부타노익산으로의 반응을 기준으로 단백질 1 mg 당 1 μmol 이상의 비활성을 나타내는, 산화환원효소에 관한 것이다. 수용성 폴리머는 예컨대 폴리에틸렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜의 결합은, 바람직하기로는 서열번호 9에 기재된 단백질의 N 말단에서 이루어진다. 서열번호 9에 기재된 산화환원효소는 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 다당류, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유사체와 같은 고형체(solid body)에 결합될 수 있다.

또한 본 발명은 단편당 5 내지 30개의 아미노산을 가지며 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열의 단편을 나타내는, 단백질 단편에 관한 것이다. 6 내지 25개의 아미노산, 8 내지 20개의 아미노산, 10 내지 18개의 아미노산, 특히 서열번호 10의 아미노사니을 가지는, 서열번호 9의 단편이 바람직하다. 상기 단편은, 예컨대 피키아 캡슐라타 또는 다른 미생물 유래의 산화환원효소 발견에 사용될 수도 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9의 아미노산 서열의 단편을 가지며, N-말단 또는 카르복시 말단에 추가적인 폴리펩티드가 펩티드 결합을 통해 연결된 5 내지 30개의 아미노산을 가지는 산화환원효소로 표시되는, 융합 단백질에 관한 것이다. 예컨대, 융합 단백질은 다른 단백질로부터 쉽게 분리하거나 또는 세포에서 다량 발현시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 10에 따른 산화환원효소에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 상기 항체의 생산은 적절한 포유류의 면역화 및 이후 항체를 수득하는 공지 방법에 따라 이루어진다. 상기 항테는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 9 및 서열번호 10에 따른 산화환원효소를 코딩하는 분리된 핵산 서열에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 NADH 및 물 존재하에 카르보닐 화합물의 해당 (S) 하이드록시 화합물로의 환원을 촉매하는 산화환원효소의 분리된 DNA 서열에 관한 것으로, 상기 DNA 서열은 하기 군으로부터 선택된다:

a) 서열번호 8, 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 각각에 상보적인 가닥을 가지는 DNA 서열,

b) 엄격한 조건하에 이루어지는 혼성화 반응에서, a)에 따른 하나 이상의 DNA 서열 또는 이의 상보적인 가닥에 혼성화하는 DNA 서열,

c) 유전자 코드의 겹침(degeneracy)의 결과로서 a) 또는 b)에 따른 하나 이상의 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질을 코딩하는, DNA 서열.

혼성화에 유효한 조건들은, Sambrok and Russel, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Vol 1, Chapter 1, Protocol 30-32에 개시되어 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 8 또는 이의 상보적인 가닥에 따른 DNA 서열과 핵산 서열이 70% 이상 상동하며, 에틸-4-클로로-3-옥소부타노익산의 (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부타노익산으로의 반응을 기준으로 단백질 1 mg 당 1 μmol 이상의 비활성을 가지는, DNA 서열에 관한 것이다. DNA 서열은, 바람직하기로는, 서열번호 8에 따른 DNA 서열과 80% 내지 99.5%, 특히 90% 내지 99.5%, 특히 99% 내지 99.5% 상동하다.

또한, 본 발명은 서열번호 8 또는 이의 상보적인 가닥에 따른 DNA 서열의 일부 또는 여러 부분에 해당되는 서열을 가지는, 10 내지 50개의 핵산 염기를 가지는 핵산 서열에 관한 것이다. 핵산 서열은 전술한 DNA 서열의 15 내지 45개의 핵산 염기, 특히 20 내지 40개의 핵산 염기 또는 30 내지 40개의 핵산 염기를 가지는 것이 바람직하다. 전술한 핵산 서열은 중합효소 연쇄 반응(PCR)용 프라이머나, 분자 탐침자로 적합하다.

또한, 본 발명은 전술한 하나 이상의 핵산 또는 DNA 서열을 포함하는 클로닝 벡터에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은, 발현 조절 서열에 적절한 방식으로 연결된 전술한 하나 이상의 핵산 또는 DNA 서열을 포함하는, 세균, 곤충, 식물 또는 포유류 세포내에 위치된 발현 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 섹균, 효모, 곤충, 식물 또는 포유류 세포이며, 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된, 숙주 세포에 관한 것이다.

기언급한 DNA 서열 또는 기언급한 아미노산 서열의 상동성은, 각 단백질 또는 DNA 서열의 일부 서열과 상동한 아미노산 또는 핵산 염기 수를 합하고, 아미노산 또는 핵산 염기의 총 수로 상기 합계를 나눈 다음, 백을 곱하여 계산한다.

적합한 클로닝 벡터로는, 예컨대, ppCR-Script, pCMV-Script, pBluescript(Stratagene), pDrive 클로닝 벡터(Quiagen, Hilden, Germany), pS Blue, pET Blue, pET LIC-벡터(Novagen, Madison, USA) 및 TA-PCR 클로닝 벡터(Invitrogen, Karisnihe, Germany)가 있다.

적합한 발현 벡터로는, 예컨대, pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC3O, pRM1/pRM9, pTrxFus, pAS1, pGEx, pMAL 또는 pTrx가 있다.

적합한 발현 조절 서열로는, 예컨대, trp-lac(tac)-프로모터, trp-lac(trc) 프로모터, lac-프로모터, T7-프로모터 또는 λpL-프로모터가 있다.

피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소는, SDS-젤 확인에서는 34 + 2 kDa, 겔 투과 크로마토그래피를 이용한 확인에서는 140 + 10 kDa의 분자량을 가지는 동질사량체(homotetramer)이다. 산화환원 효소의 최적 온도는 40 내지 45 ℃이고, 환원 반응의 최적 pH는 6.5 내지 7.0이고, 산화반응의 최적 pH는 7.8 내지 8.2이다. 피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소는 우수한 온도 및 pH 안정성을 나타내며, pH 5.5 내지 8.5 및 15 내지 40 ℃에서 5시간 동안 안정하며, 또한 유기용매내에서 우수한 안정성을 나타낸다.

상기 효소는 피키아 속의 효모로부터 특히 분리할 수 있으며, 적당한 기질, 예컨대 에틸-4-클로로-3-옥소부티레이트 또는 2-부탄온 존재하에 NADH 감소를 통한 340 nm에서의 스펙트로포토미터 테스트로 검정할 수 있다.

본 발명의 피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소를 클로닝하였고, 1,000 내지 10,000 U/g(E. coli 습중량)의 활성을 가지는 형태로 E. coli에서 과발현시킬 수 있었다. 상기 효소는 저렴하여 다량 이용할 수 있다. 데이타베이스를 이용한 서열 비교에서, 본 발명에 따른 피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소가 아연 의존적 카르보닐 환원효소인 것으로 확인되었다.

또한 본 발명은 피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소의 수득 방법에 관한 것이다. 이를 위해, 피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소를 코딩하는 DNA는, 예컨대 적합한 원핵 또는 진핵 미생물내에서 발현시킨다. 바람직하기로는, 피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소를 E. coli 균주로 형질전환시키고, 특히 E. coli BL21star(DE3) 세포에서 발현시킨다.

피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소는, 예컨대 전술한 재조합 E. coil 세포를 배양하고 산화환원효소 발현을 유발한 다음, 10 내지 18시간 후에 초음과 처리 또는 글로브 밀(Retsch GmbH, Haan, Germany, 10 mm, 24 Hz)에서 유리 비드를 이용한 습식 파쇄로 세포를 분해하여, 수득할 수 있다. 수득한 세포 추출물은 직접 사용하거나 또는 추가적으로 정제하여 사용할 수 있다. 이를 위해. 세포 추출물은 예컨대 원심분리하고, 상층액은 예컨대 Q-세파로스 Fast Flow^® 장치(Pharmacia)상의 이온 교환 크로마토그래피로 이온 교환 크로마토그래피를 수행한다.

또한 본 발명은 카르보닐 화합물의 해당 (S)-하이드록시 화합물로의 거울상 이성질체 선택적 환원 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기한 특징을 가진다:

a) 청구항1 내지 9항중 하나 이상에 기재된 산화환원효소, NADH 및 물 존재하에 카르보닐 화합물을 (S)-하이드록시 화합물로 환원시키는 단계; 및

b) 형성된 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계.

본 발명에 따른 방법은, 높은 유효 수명, 생산된 키랄 (S)-하이드록시 화합물의 95% 이상의 거울상 이성질체 순도, 공급된 카르보닐 화합물의 함량 대비 고수율을 가진다.

용어 "NADH"는, 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드이다. 용어 "NAD"는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드이다. 용어 "카르보닐 화합물"은 예컨대 식 I의 화합물이다:

R1-C(O)-R2 (I)

모이어티 R1은 예컨대,

1) -(C₁-C₂₀)-알킬, 상기 알킬은 직쇄 또는 분지쇄임,

2) -(C₂-C₂₀)-알케닐, 상기 알케닐은 쇄 길이에 따라 1, 2, 3 또는 4개의 이중 결합을 포함하는, 직쇄 또는 분지쇄임,

3) -(C₂-C₂₀)-알키닐, 상기 알키닐은 1, 2, 3 또는 4개의 삼중 결합을 포함하는, 직쇄 또는 분지쇄임,

4) -(C₆-C₁₄)-아릴,

5) -(C₁-C₈)-알킬-(C₆-C₁₄)-아릴,

6) 할로겐, 하이드록시, 아미노 또는 질소로 1 내지 3회 치환되거나 치환되지 않은 -(C₅-C₁₄)-헤테로사이클, 또는

7) -(C₃-C₇)-사이클로알킬이며,

1) 내지 7)의 R1 모이어티는, 각각 독립적으로 a) -OH, b) F, Cl, Br 또는 I와 같은 할로겐, c) -NO₂또는 d) -NH₂로 1, 2, 3 또는 4회 치환되거나 비치환된다.

모이어티 R2는, 예컨대,

1) -(C₁-C₆)-알킬, 상기 알킬은 직쇄 또는 분지쇄임,

2) -(C₂-C₆)-알케닐, 상기 알케닐은 쇄 길이에 따라 1, 2 또는 3개의 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지쇄임,

3) -(C₂-C₆)-알키닐, 상기 알키닐은 1 또는 2개의 삼중 결합을 선택적으로 포함하는 직쇄 또는 분지쇄임, 또는

4) -(C₀-C₁₀)-알킬-C(O)-O-(C₁-C₆)-알킬, 상기 알킬은 할로겐, 하이드록시, 아미노 또는 질소로 1 내지 3회 치환되거나 비치환된 직쇄 또는 분지쇄이며,

1) 내지 4)의 R2 모이어티는, 각각 독립적으로 a) -OH, b) F, Cl, Br 또는 I와 같은 할로겐, c) -NO₂또는 d) -NH₂로 1, 2 또는 3회 치환되거나 비치환된다.

용어 키랄 "(S)-하이드록시 화합물"은 예컨대 식 II의 화합물이며,

R1-C(OH)-R2 (II).

-OH-기는 일반적으로 결합된 탄소 원자에 대해 (S) 배위로 위치하며, R1 및 R2는 식 I와 동일하다.

그러나, 카르보닐기 또는 할로겐 원자가 알코올에 근접하게 위치하는 경우, 명명이 바뀌어 거울상 이성질체 선택적 알코올은 이후 (R)-알코올로 언급된다. 그러나, 이는 주로 명명의 문제로서, 본 발명에 따른 산화환원효소가 환원을 수행하는, 입체선택적(stereoselective) 방식을 변이시키진 않는다.

용어 "아릴"은, 고리에 6 내지 14개의 탄소 원자를 포함하는 방향족 탄소 모이어티이다. -(C₆-C₁₄) 아릴 모이어티는, 예를 들면, 페닐, 나프틸, 1-나프틸, 2-나프틸, 바이페닐릴, 2-바이페닐릴, 3-바이페닐릴 및 4-바이페닐릴, 안트릴 또는 플루오레닐이다. 바람직한 아릴 모이어티는 바이페닐릴 모이어티, 나프틸 모이어티 및 특히 페닐 모이어티이다. 용어 "할로겐"은, F, Cl, Br 및 I 계열의 인자이다. 용어 "-(C₁-C₂₀) 알킬"은, 탄소수 1 내지 20개를 포함하는, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥실, 논에닐 또는 데카닐을 포함하는 직쇄 또는 분지쇄의 탄소 쇄인, 탄화수소 모이어티이다. 용어 "-C₀알킬"은 공유 결합이다.

용어 "-(C₃-C₇) 사이클로알킬"은, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 사이클로헵틸과 같은 고리형의 탄화수소이다.

용어 "-(C₅-C₁₄) 헤테로사이클"은 일부 또는 전체가 포화된 모노사이클 또는 바이사이클의 5원환 내지 14원환 헤테로사이클 고리이다. N, 0 및 S는 헤테로원자의 예이다. 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 테트라졸, 1,2,3,5-옥사티아디아졸-2-옥사이드, 트리아졸론, 옥사디아졸론, 이속사졸론, 옥사디아졸리딘디온, F, -CN, -CF₃또는 -C(O)-O-(C₁-C₄) 알킬로 치환된 트리아졸, 3-하이드록시피로-2,4-디온, 5-옥소-1,2,4-티아디아졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 인돌, 이소인돌, 인다졸, 프탈라진, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 시놀린, 상기 헤테로사이클의 카르볼린-어넬레이티드(carboline-anellated), 벤즈-어넬레이티드, 사이클로펜타 어넬레이티드, 사이클로헥사 어넬레이티드, 또는 사이클로헵타 어넬레이티드 유도체로부터 유래된 모이어티들은, 용어 "-(C₅-C₁₄) 헤테로사이클"의 예이다. 모이어티, 2- 또는 3-피롤릴, 4- 또는 5-페닐-2-피롤릴, 2-푸릴, 2-티에닐, 4-이미다졸릴, 메틸이미다졸릴과 같은 페닐피롤릴, 예컨대 1-메틸-2-, -4-, 또는 -5-이미다졸릴, 1,3-티아졸-2-일, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-, 3- 또는 4-피리딜-N-옥사이드, 2-피라지닐, 2-, 4- 또는 5-피리미디닐, 2-, 3- 또는 5-인돌릴, 치환된 2-인돌릴, 예컨대, 1-메틸, 5-메틸, 5-메톡시-, 5-벤질록시-, 5-클로로- 또는 4,5-디메틸-2-인돌릴, 1-벤질-2- 또는 -3-이돌릴, 4,5,6,7-테트라하이드로-2-인돌릴, 사이클로헵타[b]-5-피롤릴, 2-, 3- 또는 4-퀴놀릴, 1-, 3- 또는 4-이소퀴놀릴, 1-옥소-1,2-디하이드로-3-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 2-벤조퓨라닐, 2-벤조-티에닐, 2-벤즈옥사졸릴 또는 벤조티아졸릴 또는 디하이드로피리니딜, 피롤리디닐, 예컨대, 2- 또는 3-(N-메틸피롤리디닐), 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 테트라하이드로티에닐 또는 벤조디옥솔라닐이, 특히 바람직하다.

식 I의 바람직한 화합물은, 예컨대, 에틸-4-클로로아세토아세테이트, 메틸아세토아세테이트, 에틸-8-클로로-6-옥소옥타노익산, 에틸-3-옥소발레리에이트, 4-하이드록시-2-부탄온, 에틸-2-옥소발레리에이트, 에틸-2-옥소-4-페닐부타노익산, 에틸 피루베이트, 에틸 페닐 글리옥실레이트, 1-페닐-2-프로판온, 2,3-디클로로아세토페논, 아세토페논, 2-옥탄온, 3-옥탄온 또는 2-부탄온이 있다.

대응하여 형성된 S-알코올의 예로는, (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부타노익산, 에틸-(S)-2-하이드록시-4-페닐부타노익산, (S)-2-옥탄올 또는 (R)-에틸-8-클로로-6-하이드록시옥타노익산이 있다.

적합한 산화환원효소는, 예컨대 피키아 캡슐라타로부터 유래된다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, 산화환원효소는 완전하게 정제된 상태나 또는 일부 정제된 상태로 사용될 수 있다. 상기 방법은 본 발명에 따른 산화환원효소를 이용하여 수행되거나, 또는 본 발명에 따른 산화환원효소를 포함하는 세포를 이용하여 수행된다. 이 경우, 사용되는 세포는 천연 상태, 투과화된 상태(permeabilized state) 또는 용해된 상태(lyzed state)로 제공될 수 있다. 바람직하기로는 서열번호 9에 기재된 클로닝된 산화환원효소가 사용된다.

사용되는 산화환원효소의 용적 활성(volume activity)는 100 단위/ml(U/ml) 내지 5,000 U/ml이며, 바람직하기로는 약 500 U/ml이다.

반응되는 식 I의 화합물의 kg 당 5,000 내지 2,000,000 U의 산환원환효소, 바람직하기로는 약 10,000 - 200,000 U의 산화환원효소를 사용한다. 효소의 단위 1 U은 분(min)당 식 I의 화합물 1 μmol이 반응하는데 필요한 효소 함량에 해당한다.

또한, 본 발명은 카르보닐 화합물의 해당 (S)-하이드록시 화합물로의 거울상 이성질체 선택적 환원 방법에 관한 것으로,

a) 카르보닐 화합물을 본 발명의 산화환원효소, NADH 및 물 존재하에 해당 (S)-하이드록시 화합물로 환원시키는 단계;

b) 산화환원효소에 의해 형성된 NAD를 조기질(cosubstrate)을 이용하여 NADH로 환원시키는 단계; 및

c) 형성된 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계를 포함한다.

사용되는 카르보닐 화합물 및 산화환원효소의 함량은, 기재된 방법의 전술한 함량과 동일하다. 본 발명에 따른 방법에 적합한 조기질은, 에탄올, 2-프로판올(이소프로판올), 2-부탄올, 2-펜탄올 또는 2-옥탄올과 같은 알코올이다. 이러한 조기질은 본 발명의 산화환원효소 및 NAD에 의해 해당 케톤류 및 NADH로 반응된다. 따라서, NADH가 재생된다.

NAD의 NADH로의 재생을 위한, 이소프로판올과 같은 조기질의 t량은 총 부피를 기준으로 5% 내지 50%이며, 바람직하기로는 8% 내지 20%이고, 특히 10% 내지 15%이다.

또한, 본 발명은 (S)-하이드록시 화합물의 거울상 이성질체 선택적 회수 방법에 관한 것으로,

b) 산화환원효소에 의해 형성된 NAD를 디하이드로게나제 및 조기질을 이용하여 NADH로 환원시키는 단계; 및

적절한 디하이드로게나제의 예로는, 빵 효모, 칸디다 보이디니 또는 칸디다 파랍실로시스 유래 NADH-의존적 알코올 디하이드로게나제이다. 알코올 디하이드로게나제 사용에 적절한 조기질로는, 에탄올, 2-프로판올(이소프로판올), 2-부탄올, 2-펜탄올 또는 2-옥탄올과 같은 알코올이다.

또한 NAD 환원 역시 포르메이트 디하이드로게나제에 의해 수행될 수 있다(Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase). 포르메이트 디하이드로게나제의 적합한 조기질의 예로는, 포름산암모늄, 포름산나트륨 또는 포름산칼슘와 같은 포름산의 염이 있다.

기질-커플링된 조효소 재생에, 에탄올, 2-프로판올(이소프로판올), 2-부탄올, 2-펜탄올 또는 2-옥탄올과 같은 2급 알코올을 이용하는 것이 바람직하다. 따라서, 방법은 부가적인 디하이드로게나제 없이 수행되는 것이 바람직하다.

바람직하기로는, pH 5 내지 10의, 바람직하기로는 pH 6 내지 9의 완충액, 예컨대 포타슘 포스페이트, 트리스/HCl 또는 트리에탄올아민 완충액을 상기 방법에 사용되는 물에 첨가한다. 완충액 농도는 10 mM 내지 150 mM이다.

또한, 완충액은 효소 안정화성 또는 활성화성 이온, 예컨대 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함할 수 있다.

온도는 예컨대, 10 ℃ 내지 60 ℃, 바람직하기로는 30 ℃ 내지 55 ℃이다.

b) 유기용매 존재하에 반응을 수행하는 단계; 및

바람직한 유기용매의 예로는, 디에틸에테르, tert-부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산 또는 사이클로헥산이 있다.

추가 용매를 사용하는 경우, 반응 배치는 수상과 유기상으로 이루어진다. 유기상은 기질이 용해된 상태로 존재하는 적합한 용매에 의해, 또는 수불용성 기질 자체에 의해 형성된다.

유기상은 총 반응 부피의 5 내지 80%를, 바람직하기로는 10%내지 40%를 차지한다.

본 발명에 따른 2상 시스템에서, 물은 하나의 액체 상을 형성하며, 유기용매는 제2의 액체 상을 형성한다. 또한 완전히 용해되지 않은 산화환원효소 및/또는 첨가된 효소 또는 카르보닐 화합물로부터 기인된, 고형물 또는 다른 액체 상을 선택적으로 제공할 수 있다. 그러나, 고형 상이 없는 액체 2상이 바람직하다. 바람직하기로는, 액체 2상은 기계적으로 혼합하여 액체 2상사이에 넓은 표층을 형성시킨다.

보조인자 NADH 농도는 수 상을 기준으로 0.01 mM 내지 1 mM이며, 특히 0.05 mM 내지 0.2 mM이다.

본 발명의 방법에 있어서, 카르보닐 화합물은 총 부피 기준으로 3% 내지 30%이며, 바람직하기로는 5% 내지 15%, 특히 10%이다.

b) 유기용매 존재하에 반응을 수행하는 단계;

c) 산화환원효소에 의해 형성된 NAD를 조기질(cosubstrate)을 이용하여 NADH로 환원시키는 단계; 및

d) 형성된 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계를 포함한다.

카르보닐 화합물 및 산화환원효소의 함량은 전술한 방법과 동일하다. 방법에 적합한 조기질은, 에탄올, 2-프롼올(이소프로판올), 2-부탄올, 2-펜탄올 또는 2-옥탄올과 같은 알코올이다. 이러한 조기질은 산화환원효소 및 NAD에 의해 해당 케톤류 및 NADH로 반응한다. 따라서, NADH가 재생된다.

NAD의 NADH로 재생시 이소프로판올과 같은 조기질의 함량은, 총 부피 기준으로 5% 내지 50%이며, 바람직하기로는 8% 내지 20%, 특히 10% 내지 15%이다.

b) 산화환원효소에 의해 형성된 NAD를 디하이드로게나제 및 조기질을 이용하여 NADH로 동시에 환원시키는 단계;

c) 유기용매 존재하에 반응을 수행하는 단계; 및

바람직하기로는, 알코올 디하이드로게나제를 위한 추가 안정화제를 본 발명의 방법에 사용한다. 적합한 안정화제의 예로는, 글리세롤, 소르비톨, 1,4-DL-디티오트레이톨(DTT) 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 있다.

본 발명에 따른 방법은, 예컨대 유리 또는 금속으로 제작된 밀폐된 반응 용기내에서 수행된다. 이를 위해, 성분들은 반응 용기내로 개별적으로 이동되며, 예컨대 질소 또는 공기의 대기하에 교반한다. 사용되는 기질 및 카르보닐 화합물에 따라, 반응 시간은 1 시간 내지 48시간, 특히 2 시간 내지 24시간 소요된다.

이후, 반응 혼합물은 재처리된다. 이를 위해, 수상(aqueous phase)은 분리하고, 유기상(organic phase)은 여과한다. 선택적으로, 수상을 다시 한번 추출할 수 있으며, 유기상처럼 추가적으로 재처리할 수 있다. 이후, 여과한 유기 상으로부터 용매를 선택적으로 증발시킨다. 이 경우, 산물 (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부타노익산은, 99% 이상의 거울상 이성질체 순도로 수득되며, 에틸-4-클로로아세토아세테이트 유리체(educt)가 실질적으로 존재하지 않는다. 산물 증류 후, 방법의 총 수율은 사용한 유리체의 함량 기준으로 50% 내지 95%이다.

또한, 본 발명은 상기 정의된 모이어티 R1 및 R2를 포함하는 식 II의 키랄 (S)-하이드록시 화합물의 회수 방법에 관한 것이다.

Rl-C(OH)-R2 (II)

상기 방법에서,

a) 식 II의 라세믹 화합물을 포함하는 혼합물을 본 발명의 산화환원효소, NAD 및 물과 같이 반응시키는 단계; 및

b) 잔류하는 식 II의 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계를 포함한다.

따라서, 식 II의 (S)-하이드록시 화합물은 해당 케톤성 화합물 및 NADH로 반응한다.

또한, 본 발명은 식 II의 키랄 (R)-하이드록시 화합물의 회수 방법에 관한 것으로,

b) 산화환원효소에 의해 형성된 NADH를 조기질을 이용하여 NAD로 산화시키는 단계; 및

c) 잔류하는 식 II의 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계를 포함한다.

b) 산화환원효소에 의해 형성된 NADH를 조기질 및 디하이드로게나제를 이용하여 NAD로 산화시키는 단계; 및

다른 예로, 본 발명은 식 II의 키랄 (R)-하이드록시 화합물의 회수 방법에 관한 것으로,

b) 유기용매 존재하에 반응을 수행하는 단계; 및

본 발명에 따른 식 II의 키랄 (R)-하이드록시 화합물의 또다른 회수 방법은,

b) 유기용매 존재하에 반응을 수행하는 단계;

c) 산화환원효소에 의해 형성된 NADH를 조기질 및 디하이드로게나제를 이용하여 NAD로 산화시키는 단계; 및

d) 잔류하는 식 II의 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계를 특징으로 한다.

반응 조건은 기본적으로 전술한 식 I의 케톤 화합물의 거울상 이성질체 특이적 환원 방법과 동일하다. 그러나, 식 II의 화합물의 라세믹 혼합물로부터 식 I의 케톤성 화합물의 거울상 이성질체의 선택적 환원 대신, 식 II의 (S)-하이드록시 화합물만을 해당 케톤성 화합물로 거울상 이성질체에 선택적으로 산화시킨다. 따라서, 식 II의 (R)-하이드록시 화합물만이 남게되어 분리할 수 있다.

또한, 에탄올, 2-프로판올(이소프로판올), 2-부탄올, 2-펜탄올 또는 2-옥탄올과 같은 조기질로서 사용된 알코올 대신에, 아세톤과 같은 이들의 케톤 화합물을 NAD 재생 방법에 사용한다. 아세톤 및 NADH는 예컨대 본 발명에 따른 산화환원효소 또는 부가적인 디하이드로게나제를 이용하여 NAD 및 이소프로판올로 반응한다. 사용되는 케톤 함량은 총 부피를 기준으로 5% 내지 50%, 바람직하기로는 8% 내지 20%, 특히 10% 내지 15%이다.

이하, 본 발명은 실시예로 예시된다.

실시예 1: 효모에서 S-특이적 알코올 디하이드로게나제 스크리닝

스크리닝을 위해, 다수의 여러가지 효모 균주를 하기 배지(모든 데이타는 g/l임)에서 배양하였다: 효모 추출물(3), 말트 추출물(3), 펩톤(5) 및 글루코스(10). 배지는 121℃에서 멸균하고, 추가적인 pH 조절없이 25 ℃에서 160 rpm 교반기에서 효모를 배양하였다. 이후, 세포 125 mg을 분해 완충액(100 mM 트리에탄올아민(TEA), pH = 7.0) 800 ㎕에 재현탁하고 유리 비드 1 g을 첨가하여 글로브 밀(Retsch)에서 10분간 4 ℃에서 분해하였다. 12,000 rpm에서 2분간 원심분리하여 수득한 상층액(용해물)을 하기 활성 스크리닝 및 거울상 이성질체의 순도(enantiomeric excess)(ee-value) 측정에 사용하였다. 에틸-4-클로로아세토아세테이트 및 2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-온을 기질로 사용하였다.

활성 스크리닝 배치:

860 ㎕ 0.1 M KH₂PO₄/K₂P0₄pH = 7.0 1 mM MgC1₂

20 ㎕ NADPH 또는 NADH (10 mM)

20 ㎕ 세포 용해물

100 ㎕ 해당 기질(100 mM)

반응은 340 nm 파장에서 1분간 수행하였다.

ee-값 측정 배치:

20 ㎕ 세포 용해물

100 ㎕ NADH 또는 NADPH (50 mM)

60 ㎕ 기질(에틸-4-클로로아세토아세테이트 100 mM)

24시간 후, ee-측정용 배치를 클로로포름으로 추출하고 거울상 이성질체 순 도를 가스 크로마토그래피(GC)로 측정하였다.

거울상 이성질체의 순도는 다음과 같이 계산하였다:

ee(%) = ((R-알코올 - S-알코올)/(R-알코올 + S-알코올)) x 100.

DSMZ No. 미생물 명 에틸4-클로로아세토아세테이트

활성U/g 세포 숙주 생물

NADH NADPH ee-값 ee-값

NADH NADPH

1345 야로이와 리폴리티카 0 15 70%S

3434 클루이베로마이세스 0 6 -- ---

써모톨레란스

3435 메트스니코이와 조벨리 0 12 -- ---

3795 클루이베로마이세스 락티스 0 15 80% S 90% S

70130 피키아 아노말라 0 9 68% S 90% S

70169 피키아 멤브랜팩시엔스 0 8 -- ---

70277 피키아 안구스타 13 4.5 라세메이트 30% S

70382 피키아 파스토리스 16 16 64% S 81% S

70638 칸디다 마그놀리아 2.5 10 --- 80% R

70125 칸디다 파랍실로시스 25 11 52% R 70% S

2147 피키아 메타놀리카 18 27 84% S 90% S

칸디다 메틸리카 8 13 94% S 94% S

70260 피키아 캡슐라타 50 5 100% R

DSMZ는 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig이다.

효소 단위의 정의: 1 U은 분당 기질 1 μmol에 반응하는데 필요한 효소 함량이다.

실시예 2: 피키아 캡슐라타 유래 NADH-의존적 (S)- 특이적 산화환원효소의 분리

피키아 캡슐라타 유래 NADH-의존적 산화환원효소를 분리하기 위해, 실시예 1과 같이 미생물을 배양하였다. 정체기에 도달하면 세포를 회수하고, 원심분리로 배지를 제거하였다. 유리 비드를 이용한 습식 파쇄에 의해 효소를 효과적으로 분리시켰으며, 또한 그외 분해 방법으로 효소를 분리시킬 수도 있다. 이를 위해, 피키아 캡슐라타 100 g을 분해 완충액(100mM 트리에탄올아민, 1 mM MgCl₂, pH = 7.0) 400 ml에 현탁하고 프렌치 프레스(French press)로 균질화하였다.

원심분리(7000 rpm)후 수득한 조추출물을 이후 더욱 정제하고 FPLC(fast protein liquid chromatography)로 재처리하였다.

본 발명의 산화환원효소는 Q-세파로스 패스트 플로우(Messrs. Pharmacia) 및 Uno Q(Biorad, Munich, Germany)상의 이온 교환 크로마토그래피를 통한 연속적인 2단계로 정제하였다. 이를 위해, 원심 분리후 수득한 세포 용해물을 직접 50 mM 인산칼륨 완충액 pH = 7.0으로 평형화시킨 Q-세파로스 FF-컬럼에 적용하고, 염 농도 증가에 따른 직선 구배로 용출하였다. 이때, 산화환원효소는 0.2 내지 0.3 M NaCl로 용출시켰다. 산화환원효소 함유 분획을 조합하고, 한외여과(ultrafiltration)(배제 한계 10 kDa)로 적정 부피로 농축하였다. 이후, 농축된 산화환원효소 분획을 재처리하고 상기 동일한 완충액을 이용하여 Uno Q로 더욱 정제하였다. 효소는 0.1M NaCl에서 용출되었다.

수득한 정제 산화환원효소이 분자량은 젤 여과를 통해 결정하였다(Superdex 200 HR; Pharmacia, 100 mM 트리에탄올아민, pH = 7, 0.15 M NaCl).

카탈라제(232 kDa), 알돌라제(158 kDa), 알부민(69.8 kDa) 및 오발부민(49.4 kDa)을 분자량 표준물질로 사용하였다.

하기 표 2는 결과를 요약한 것이다.

표 2:

정제 단계	부피(ml)	활성(U/ml)	총 활성(U)	특이활성(U/mg)	수율
조추출물	360	2.0	752	0.07	100%
Q-세파로스	67	5.3	358	5	47%
Uno Q	3.5	14	50	41	6.6%

산화환원효소의 효소 활성은 실시예 1에 따른 테스트 시스템(배치 활성 스크리닝)으로 결정하였고, 단백질 함량 결정은 라우리 등의 Journal of Biological Chemistry, 193(1951): 265-275 또는 피터슨 등의 Analytical Biochemistry, 100(1979): 201-220에 따라 수행하였다. 단백질 함량에 대한 효소 활성 비가 비활성이며, 분당 1 μmol을 변환하는 것이 1 unit(U)이다.

젤 여과로 결정한, 본 발명에 따른 산화환원효소의 분자량은 천연 상태에서 140 + 10 kDa이었다.

실시예 3: 본 발명에 따른 산화환원효소의 N-말단 서열의 결정

젤 투과 후, 실시예 2에 따른 효소 조제물을 10% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 젤상에서 분리한 다음 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브래인(PVDF-맴브레인)상에 이동시켰다.

약 35 내지 45 kDa의 뚜렷한 밴드는 에드만 분해(Procise 492(PE-Biosystems))을 통해 N-말단 서열분석을 수행하였다. 하기 N-말단 서열을 확인하였다.

서열번호: 10

KTQAGYIFKKGA

실시예 4: 피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소의 클로닝

진핵 미생물 피키아 캡슐라타는 사카로마이세타세아(Saccharomycetacea) 과에 속한다. 상기 생물의 게놈 구조는 엑손-인트론 배열을 나타낸다. 따라서, 거울상 이성질체 선택적 산화환원효소를 코딩하는 유전자 서열을 확인하기 위해, cDNA 라이브러리를 피키아 캡슐라타의 활성형 세포로부터 제조하였다.

4.1 피키아 캡슐라타 세포로부터 총 RNA 준비

피키아 캡슐라타의 신선한 세포 600 mg을 차가운 LETS 완충액(10 mM tris-HC1, pH = 7.4, 10 mM EDTA, 100 mM LiCl, 0.2% SDS) 2.5 ml에 현탁하였다. 유리 비드 5 ml(약 20 g)을 질산으로 세척하여 페놀(pH 7.0) 3 ml로 평형화시킨 다음 상기 세포 현탁액에 첨가하였다. 이후, 전체 배치를 30초간 교차하여 교반(Vortex Genie 2, Scientific Industries Inc., New York, USA)한 다음, 30초간 얼음 위에서 냉각시키는 과정을 총 10분간 실시하였다. 다음으로, 차가운 LETS 완충액 5 ml을 추가로 첨가하였다. 세포 현탁액은 4 ℃에서 5분간 11,000 g로 원심분리하였다. 수상을 옮기고, 여기에 페놀:클로로포름:3-메틸-1-부탄올(24:24:1)을 동일 부피배로 가하여 2회 추출하였다. 이후 클로로포름으로 추출하였다. 최종 추출후, 1/10 부피배의 5M LiCl을 첨가함으로써 수득한 총 RNA를 -20 ℃에서 4시간동안 침전시켰다.

분리된 RNA 1 mg을 올리고-dT 셀룰로스(mRNA PrepKit, Qiagen)에 의한 mRNA 회수에 사용하였다.

침전 후, mRNA 5 ㎍을 cDNA 합성(pBluescript IIXR eDNA Library Construction Kit, Stratagene)에 사용하였다. 제조사의 안내서에 따라 제조한 라이브러리를 XL-10 Gold E.coli로 형질전환시키고 (S)-ADH 활성에 대해 조사하였다.

두개의 클론(2/1 및 2/2)을 동정하여, 보조인자인 NADH 및 기질인 에틸-4-클로로아세토아세테이트를 이용한 소멸 감소(extinction decrease )를 토대로 분리하였다. 프라이머 T7(서열번호 3) 및 프라이머 T3(서열번호 4)를 이용하여 각 클론에 함유된 플라스미드의 다중 클로닝 부위를 통하여 1175 bp(서열번호 1)의 단편을 서열분석하였다. 상기 단편은 366개의 아미노산(서열번호 2)를 포함하는 융합 단백질을 코딩하며, 본 발명에 따른 산화환원효소 서열과 베타-갈락토시다제의 단편으로 이루어져 있다.

4.2 PCR(중합효소 연쇄 반응)을 통한 피키아 캡술라타로부터 (S)-ADH를 코딩 하는 전장 전사체 합성

서열번호 1을 기초로, 적정 발현 시스템내로 전장 전사체를 클로닝하기 위한, 특이 프라이머를 제조하였다. 이때, 5'-프라이머는 NdeI(또는 SphI 각각) 인지 서열을 가지도록, 3'-프라이머는 HindIII 인지 서열을 가지도록 변형하였다(서열번호 5, 6, 7).

올리고 1 -Nde I: 5'-GGAATTCCATATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-3'

올리고 2-Sph I: 5'-CACTGCATGCTGATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-3'

올리고 3-Hind III: 5'-CCCAAGCTTTCATGGAAGCATAACCAATCTT-3'

PCR에 주형으로 제공된 피키아 캡슐라타의 발현 라이브러리의 2/1 클론으로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다. 증폭은 PCR 완충액(10 mM 트리스-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO₄; 1 mM dNTP 혼합물(N은 염기 A, T, C 또는 G임); per 30 pMol의 프라스미드 및 2.5 U의 Platinum Pfx DNA-중합효소(Invitrogen))하에서, 주형 50 ng 및 하기 온도 주기로 수행하였다:

주기 1: 94℃, 2 분

주기 2 x 30 : 94℃, 15 초

58℃, 30 초

68℃, 75 초

주기 3: 68℃, 7분

4℃, ∞

정제후, PCR 산물은 1 % 아가로스 젤에서 엔도뉴클레아제 NdeI 및 HindIII 또는 엔도뉴클레아제 SphI 및 HindIII로 절단하여, 동일한 엔도뉴클레아제가 처리된 벡본인 pET21(Novagen) 또는 pQE3O(Qiagen)에 삽입하였다. 이를 E.coli Top 10 F' 세포(Invitrogen)에 형질전환시킨 다음, 암피실린 내성 콜로니의 플라스미드 DNA를 엔도뉴클레아제 NdeI 및 HindIII 또는 엔도뉴클레아제 SphI 및 HindIII를 이용한 제한 효소 분석으로, 1,100 bp의 삽입체 존재를 확인하였다. 발현 구조체 pET21-PC#10의 서열을 분석하였다. 본 발명의 산화환원효소를 코딩하는 피키아 캡슐라타 유래 전사체는, 하나의 ORF를 가지며 341개의 아미노산(서열번호 9)에 상응하는 총 1026 bp(서열번호 8)이다.

4.3 Star BL21(De3) E. coli 세포에서의 피키아 캡슐라타 유래 본 발명의 산화환원효소의 발현

컴피턴트(Competent) E. coli StarBL2l(De3) 세포(Invitrogen)에, 본 발명의 산화환원효소를 코딩하는 발현 구조체 pET21-PC#10를 형질전환시켰다. 형질전환된 균주를 암피실린(50 ig/ml)이 함유된 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1 % NaCl)에서 OD₅₀₀이 0.5가 될때까지 배양하였다. 재조합 산화환원효소 단백질의 생산은 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)를 최종 농도 1 mM로 첨가함으로써 개시하였다. 유도 배치는 25 ℃에서 15시간동안 220 rpm으로 더욱 배양하였다.

수득한 효소 활성은 약 6000 U/g(습식중량)이었다.

4.4 RB79l E. coli 세포에서의 피키아 캡슐라타 유래 본 발명의 산화환원효 소의 발현

컴피턴트 E. coli RB791 세포에, 본 발명의 산화환원효소를 코딩하는 발현 구조체 pQE30-PC#12를 형질전환시켰다. 형질전환된 균주를 암피실린(50 ig/ml)이 함유된 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1 % NaCl)에서 OD₅₀₀이 0.5가 될때까지 배양하였다. 재조합 산화환원효소 단백질의 생산은 IPTG를 최종 농도 0.1 mM로 첨가함으로써 개시하였다. 유도 배치는 25 ℃에서 15시간동안 220 rpm으로 더욱 배양하였다. 수득한 효소 활성은 약 1000 U/g(습식중량)이었다.

실시예 5: 피키아 캡슐라타 유래 재조합 산화환원효소의 특성화

5.1 최적 pH

표 3의 완충액을 준비하였다. 각 경우에서의 각 완충액 구성성분들의 농도는 50 mM이었다.

표 3:

pH 값	완충액 시스템	pH 값	완충액 시스템
4	Na-아세테이트/아세트산	7.5	KH₂PO₄/K₂PO₄
4.5	Na-아세테이트/아세트산	8	KH₂PO₄/K₂PO₄
5	Na-아세테이트/아세트산	8.5	KH₂PO₄/K₂PO₄
5.5	KH₂PO₄/K₂P0₄	9	글리신/NaOH
6	KH₂PO₄/K₂P0₄	9.5	글리신/NaOH
6.5	KH₂PO₄/K₂P0₄	10	글리신/NaOH
7	KH₂PO₄/K₂P0₄	11	글리신/NaOH

배치 측정(30℃):

870 ㎕ 표 3의 각 완충액 시스템

20 ㎕ NADH 10 mM (8.6 mg/ml 물)

10 ㎕ 희석 효소

약 2 내지 3분간 배양하고, 이후 기질 용액(100 mM 에틸-4-클로로-3-옥소부타노익산) 100 ㎕을 첨가하였다.

최적 pH를 결정하기 위해, 표 3의 각 완충액에서 효소 반응을 결정하였다. 산화 반응에 대한 최적 pH를 결정하기 위해, NADH를 보조인자로 사용하였고, (S)-메틸-3-하이드록시부타노익산을 기질로 사용하였다. 본 발명에 따른 효소의 경우, 환원반응의 최적 pH는 6.5 내지 7이며, 산화 반응의 최적 pH는 7.8 내지 8.2로 확인되었다.

5.2 pH 안정성

재조합 산화환원효소의 활성 결정은 표 3의 완충액 시스템내에 보관하여 측정하였다. 이를 위해, 여러가지 완충액(50 mM)을 pH 4 내지 11 범위로 준비하고, 실시예 4에 따라 생산한 산화환원효소를 여기에 희석하였다. 30, 60 및 300분간 반응시킨 후 배치에서 10 ㎕를 취하여 실시예 1에 따른 활성 테스트에 사용하였다.

50 mM의 인산칼륨 완충액 pH=70에 효소를 희석(1:20)한 후 즉시 측정한 수치를 초기 값으로 하였다. 주어진 조건에서, 상기 값은 약 0.70/분의 소멸 변화에 해당되며 이를 100%로 설정하였고, 이후 측정한 모든 값은 상기 값에 상대적으로 정하였다.

피키아 캡슐라타 유래 재조합 산화환원 효소는 pH 5.5 내지 8.5에서 안정하며, 활성의 실질적인 감소없는 상태로 적어도 5시간 이상 방치할 수 있는 것으로 확인되었다. pH9.0 이상 및 5.0 이하에서 배양시, 효소는 즉각적으로 비활성화되 었다.

5.3 최적 온도

최적 테스트 온도를 결정하기 위해, 15 ℃ 내지 70 ℃의 온도 범위에서 표준 측정 배치내의 효소 활성을 측정하였다. 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 효소는 45 ℃에서 최대 활성에 도달하고, 이후 빠르게 감소한다.

표 4

온도(℃)	희석되지 않은 효소의 활성, U/ml	온도(℃)	희석되지 않은 효소의 활성, U/ml
15	73	45	176
20	83	50	122
25	128	55	45
30	135	60	0
35	163	65	0
40	170	70	0

5.4 온도 안정성

온도 안정성을 실시예 5.2에 기술된 바와 유사한 방법으로 15 ℃ 내지 70 ℃에서 측정하였다. 이를 위해, 정제한 산화환원효소의 1:20 희석물을 각각의 온도에서 60분 및 180분간 두었고, 상기 테스트 배치를 이용하여 이후 30 ℃에서 측정하였다. 또한 모든 경우에서, 정제한 산화환원효소를 50 mM 인산칼륨 완충액, pH = 7.0에 희석한 후 바로 측정한 값을 초기 값으로 하였다. 상기 값은 본 실험에서 100%로 설정하였다. 효소는 15 ℃ 내지 40 ℃에서 매우 안정적이며, 3시간 방치후에도 활성가 거의 소실되지 않았다. 55 ℃에서, 30분후 효소 활성은 더이상 검출되지 않았다.

5.5 기질 스펙트럼/거울상 이성질체 순도

본 발명에 따른 산화환원효소의 기질 스펙트럼을, 이의 다수 케톤류, 옥소산 및 에스테르를 이용하여 효소 활성을 측정함으로써 결정하였다. 이를 위해, 실시예 5.1에 따른 표준 측정 배치를 여러가지 기질과 함께 사용하였다. 에틸-4-클로로아세토아세테이트를 이용한 활성은 100%로 두고, 그외 모든 기질들은 이에 상대적으로 정하였다.

100 ㎕ NADH (50 mM)

60 ㎕ 기질(100 mM)

본 발명에 따른 산화환원효소의 +1 내지 2 U

ee-결정용 배치를 24시간후 클로로포름으로 추출하고, 수득되는 알코올의 거울상 이성질체 순도를 GC로 결정하였다.

표 5

기질	상대 활성 %	입체-선택성	기질	상대 활성%	입체-선택성
케톤류			3-옥소산 에스테르
1-페닐-2-프로판온	24	97%S	에틸-4-클로로아세토아세테이트	100	99%R
2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-온	21	100%R	메틸아세토아세테이트	150	97%S
아세토펜온	4	n.d.	에틸-8-클로로-6-옥소옥타노익산	20	100%R
카프릴로펜온	0	n.d.	디메틸-3-옥소-1,8-옥탄디오익산	3.5	n.d.
2-옥탄온	88	100%S	에틸-3 옥소발레리에이트	67	n.d.
3-옥탄온	30	n.d.	에틸아세토아세테이트	100	99%S
2-부탄온	99	50%S	2-옥소발레릭산	0	n.d.
4-하이드록시-2-부탄온	99	90%S	2-옥소-3-페닐 프로온산	0	n.d.
에틸-2-옥소발레리에이트	41	97%S	2-옥소부타노익산	0	n.d.
에틸-2-옥소-4-페닐부타노익산	76	95%S
에틸피루베이트	10	100%S
에틸페닐 글리옥실레이트	5.2	100%R

n.d. : 검출안됨

표 5에서 확인된 바와 같이, 2- 및 3-옥소산 에스테르류와 방향족 및 지방족 케톤류는 본 발명에 따른 산화환원효소의 입체 선택성을 감소시켰다.

5.5 용매 안정성

피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소의 안정성을 유기용매 존재하에 조사하였다. 이를 위해, 지정된 용매 혼합물(수분산성 유기용매인 경우)로 산화환원효소를 1:20으로 각각 희석하였고, 상온(20 ℃ 내지 24 ℃, RT)에 두었다. 이후 효소액 10 ㎕를 표준 테스트 배치에 사용하였다. 또한, 실험에서, 초기 값은 완충액(인산칼륨 완충액(KFP) 100 mM, pH = 7.0)에 희석 후 100%로 하였고, 그외 다른 값은 상기 초기 값에 상대적으로 정하였다.

불수용성 용매의 경우, 인산칼륨 완충액으로 희석하고 동일 부피의 유기용매를 배치에 첨가한 다음 배치는 170 rpm의 써모믹서(thermomixer)에서 상온하에 두었다. 활성은 수상에서 측정하였다. 표 6은 그 결과를 나타낸다.

표 6

활성	8시간	24시간	활성	8시간	24시간
완충액 KPP 100 m pH=7	100%	100%	에틸아세테이트	2	0
1 mM MgCl₂
5% 이소프로판올	77%	77%	부틸아세테이트	53%	28%
10% 이소프로판올	72%	72%	디에틸 에테르	100%	100%
20% 이소프로판올	46%	46%	메틸 tert-부틸 에테르	100%	100%
30% 이소프로판올	18%	18%	디이소프로필 에테르	100%	100%
5% 에탄올	77%	77%	클로로포름	51%	0%
10% 에탄올	77%	77%	헥산	60%	20%
20% 에탄올	100%	100%	헵탄	74%	43%
30% 에탄올	64%	64%	사이클로헥산	85%	70%
10% 디메틸설폭사이드	42%	45%
20% 디메틸설폭사이드	30%	30%

표 6에서 확인된 바와 같이, 피키아 캡슐라타 유래 산화환원효소는 유기용매에서 현저한 안정성을 나타낸다. 기존의 원칙과는 대조적으로, 본 발명에 따른 산화환원효소는 순수 완충액에 두었을때와 유사하게 유기 수용성 용매 및 유기 수불용성 용매에서 안정하다. 따라서, 본 발명에 따른 산화환원효소는 DE 101 19274 A1에 개시된 바와 같이 2상 시스템에 사용될 수 있다.

5.7 예비 변환

5.7.1 에틸-4-클로로아세토아세테이트의 에틸(R)-4-클로로-3-하이드록시부타노익산으로의 환원

예비 배치로, 완충액(100 mM TEA, pH = 7, 1 mM ZnC1₂, 10% 글리세롤) 34 L, 이소프로판올 4 L, 4-클로로아세토아세테이트 4 L, NAD 4 g 및 피키아 캡슐라타 유래 재조합 산화환원효소 3.6 mU 혼합물을, 일정한 혼합하에 상온에서 24시간 두었다. 24시간 후, 4-클로로아세토아세테이트 99%가 환원되었다. 이후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 용매는 회전식 증발기로 제거한 다음, 조산물을 증류하였다. 이러한 방식으로, 거울상 이성질체 순도가 99%인 에틸-(R)-4-클로로-3-하이드록시부타노익산 2.8 L(3.4kg)을 회수하였다. 이는 사용한 유리체를 기준으로 70%의 수율이다.

5.7.2 2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-온의 (R)-2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-올로의 환원

예비 배치로, 완충액(100mM TEA, pH = 7, 1 mM ZnCI₂, 20% 글리세롤) 164 ml, 이소프로판올 16 ml, 메틸 tert-부틸 에테르(MTBE) 20 ml에 용해된 2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-온 20 g, NAD 10 mg 및 피키아 캡슐라타 유래 재조합 산화환원효소 20,000 U의 혼합물을, 일정한 혼합하에 상온에서 24시간 두었다. 24시간 후, 2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-온의 96%가 환원되었다. 이후, 반응 혼합물은 에틸 아세테이트로 추출하고, 용매는 회전 증발기에서 제거하였다. 그 결과, 거울상 이성질체 순도가 100%인 (R)-2-클로로-1-(3-클로로페닐)에틴-1-올 15 g이 회수되었다. 이는 사용한 유리체 기준 77%의 수율에 해당된다.

서열목록제출서에 첨부하여 제출

Claims

NADH 및 물 존재하에 카르보닐 화합물을 해당 (S)-하이드록시 화합물로 환원시키는 것을 특징으로 하는 산화환원효소.
제 1항에 있어서, 피키아(Pichia) 또는 칸디다(Candida) 속에 속하는 효모, 특히 피키아 캡슐라타(Pichia capsulate)로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 산화환원효소.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 서열번호 8에 기재된 DNA 서열 및 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 산화환원효소.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 있어서, 아미노산 서열이 서열번호 9의 아미노산 서열과 70% 이상 상동하고, 에틸-4-클로로-3-옥소부타노익산의 (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부타노익산으로의 반응을 기준으로 단백질 1 mg 당 1 μmol 이상의 비활성(specific activity)을 가지는 것을 특징으로 하는 산화환원효소.
제 4항에 있어서, 아미노산 서열이 서열번호 9의 아미노산 서열과 80% 내지 99.5%, 특히 90% 내지 99.5%, 특히 99% 내지 99.5% 상동한 것을 특징으로 하는 산화환원효소.
제 1항 내지 제 5항중 어느 한항에 있어서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 산화환원효소에 비해 1 내지 40개의 아미노산 서열이 더욱 추가되거나 또는 1 내지 40개의 아미노산이 적으며, 에틸-4-클로로-3-옥소부타노익산의 (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부타노익산으로의 반응을 기준으로 단백질 1 mg 당 1 μmol 이상의 비활성을 가지는 것을 특징으로 하는 산화환원효소.
제 4항에 있어서, 서열번호 9의 아미노산 서열에 비해 1 내지 25개의 아미노산이, 특히 2 내지 20개의 아미노산이, 또는 3 내지 10개의 아미노산이 적거나 많게 존재하는 것을 특징으로 하는 산화환원효소.
제 1항 내지 제 6항중 어느 한항에 있어서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지며, 수용성 폴리머에 의해 1, 2, 3, 4 또는 5회 변형되며, 에틸-4-클로로-3-옥소부타노익산의 (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부타노익산으로의 반응을 기준으로 단백질 1 mg 당 1 μmol 이상의 비활성을 가지는 것을 특징으로 하는 산화환원효소.
제 8항에 있어서, 상기 수용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 산화환원효소.
서열번호 9에 기재된 아미노산 서열의 단편들로 표시되며, 단편 당 5 내지 30개의 아미노산으로 이루어진, 단백질 단편.
제 10항에 있어서, 상기 단편은 6 내지 25개의 아미노산, 특히 8 내지 20개의 아미노산, 또는 10 내지 18개의 아미노산, 특히 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 서열번호 9의 아미노산 서열의 단편인 것을 특징으로 하는 단백질 단편.
N-말단 또는 카르복시 말단에 추가적인 폴리펩티드가 폴리펩티드 결합을 통해 연결된 5 내지 30개의 아미노산을 가지며, 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9의 아미노산 서열의 단편을 가지는 산화환원효소를 포함하는 융합 단백질.
서열번호 9 또는 서열번호 10에 따른 산화환원효소에 특이적으로 결합하는 항체.
서열번호 9 또는 서열번호 10에 따른 산화환원효소를 코딩하는 분리된 핵산 서열.
a) 서열번호 8, 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 각각에 상보적인 가닥을 가지는 DNA 서열;

b) 엄격한 조건하에 이루어지는 혼성화 반응에서, a)에 따른 하나 이상의 DNA 서열 또는 이의 상보적인 가닥에 혼성화하는 DNA 서열; 및

c) 유전자 코드의 겹침(degeneracy)의 결과로서 a) 또는 b)에 따른 하나 이상의 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택되며,

NADH 및 물 존재하에 카르보닐 화합물의 해당 (S)-하이드록시 화합물로의 환원을 촉매하는 산화환원효소의, 분리된 DNA 서열.
서열번호 8 또는 이의 상보적인 가닥에 따른 DNA 서열과 핵산 염기의 70% 이상이 상동하며, 에틸-4-클로로-3-옥소부타노익산의 (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부타노익산으로의 반응을 기준으로 단백질 1 mg 당 1 μmol 이상의 비활성을 가지는 산화환원효소를 코딩하는, DNA 서열
제 16항에 있어서, 상기 핵산 염기가 서열번호 8에 따른 DNA 서열과 80% 내지 99.5%, 특히 90% 내지 99.5%, 특히 99% 내지 99.5% 상동한 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
서열번호 8 또는 이의 상보적인 가닥에 따른 DNA 서열의 일부 또는 여러 부분에 해당되는 서열을 가지며, 10 내지 50개의 핵산 염기를 가지는 DNA 서열.
제 18항에 있어서, 15 내지 45개의 핵산 염기, 특히 20 내지 40개의 핵산 염 기 또는 30 내지 40개의 핵산 염기를 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 14항 내지 제 19항중 어느 한항에 따른 핵산 또는 DNA 서열 1종 이상을 포함하는 클로닝 벡터.
제 14항 내지 제 19항중 어느 한항에 따른 핵산 또는 DNA 서열 1종 이상을 포함하며, 발현 조절 서열에 적절한 방식으로 연결된 발현 벡터.
세균, 효모, 곤충, 식물 또는 포유류 세포이며, 제 21항에 기재된 발현 벡터로 형질감염 또는 형질전환된, 숙주 세포.
a) 제 1항 내지 제 9항중 한항 이상에 따른 산화환원효소, NADH 및 물 존재하에 카르보닐 화합물을 해당 (S)-하이드록시 화합물로 환원시키는 단계; 및

b) 형성된 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계;

를 포함하는, 카르보닐 화합물의 해당 (S)-하이드록시 화합물로의 거울상 이성질체 선택적(enantioselective) 환원 방법.
제 23항에 있어서, 카르보닐 화합물로서 하기 모이어티 R1 및 모이어티 R2를 포함하는 식I의 화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 환원 방법:

R1-C(O)-R2 (I)

모이어티 R1은

1) -(C₁-C₂₀)-알킬, 상기 알킬은 직쇄 또는 분지쇄임;

2) -(C₂-C₂₀)-알케닐, 상기 알케닐은 쇄 길이에 따라 1, 2, 3 또는 4개의 이중 결합을 포함하는, 직쇄 또는 분지쇄임;

3) -(C₂-C₂₀)-알키닐, 상기 알키닐은 1, 2, 3 또는 4개의 삼중 결합을 포함하는, 직쇄 또는 분지쇄임;

4) -(C₆-C₁₄)-아릴;

5) -(C₁-C₈)-알킬-(C₆-C₁₄)-아릴;

6) 할로겐, 하이드록시, 아미노 또는 질소로 1 내지 3회 치환되거나 치환되지 않은 -(C₅-C₁₄)-헤테로사이클; 또는

7) -(C₃-C₇)-사이클로알킬이며;

1) 내지 7)의 R1 모이어티는, 각각 독립적으로 a) -OH, b) F, Cl, Br 또는 I와 같은 할로겐, c) -NO₂또는 d) -NH₂로 1, 2, 3 또는 4회 치환되거나 비치환되며,

모이어티 R2는,

1) -(C₁-C₆)-알킬, 상기 알킬은 직쇄 또는 분지쇄임;

2) -(C₂-C₆)-알케닐, 상기 알케닐은 쇄 길이에 따라 1, 2 또는 3개의 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지쇄임;

3) -(C₂-C₆)-알키닐, 상기 알키닐은 1 또는 2개의 삼중 결합을 선택적으로 포함하는 직쇄 또는 분지쇄임; 또는

4) -(C₀-C₁₀)-알킬-C(O)-O-(C₁-C₆)-알킬, 상기 알킬은 할로겐, 하이드록시, 아미노 또는 질소로 1 내지 3회 치환되거나 비치환된 직쇄 또는 분지쇄이며;

1) 내지 4)의 R2 모이어티는, 각각 독립적으로 a) -OH, b) F, Cl, Br 또는 I와 같은 할로겐, c) -NO₂또는 d) -NH₂로 1, 2 또는 3회 치환되거나 비치환된다.
제 23항 또는 24항에 있어서,

a) 카르보닐 화합물을 제 1항 내지 제 9항중 한항 이상에 따른 산화환원효소, NADH 및 물 존재하에 해당 (S)-하이드록시 화합물로 환원시키는 단계;

b) 산화환원효소에 의해 형성된 NAD를 조기질(cosubstrate)을 이용하여 NADH로 환원시키는 단계; 및

c) 형성된 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 환원 방법.
제 23항 또는 제 24항에 있어서,

a) 카르보닐 화합물을 제 1항 내지 제 9항중 한항 이상에 따른 산화환원효소, NADH 및 물 존재하에 해당 (S)-하이드록시 화합물로 환원시키는 단계;

b) 산화환원효소에 의해 형성된 NAD를 디하이드로게나제(dehydrogenase) 및 조기질을 이용하여 NADH로 환원시키는 단계; 및

c) 형성된 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 환원 방법.
제 23항 또는 제 24항에 있어서,

a) 카르보닐 화합물을 제 1항 내지 제 9항중 한항 이상에 따른 산화환원효소, NADH 및 물 존재하에 해당 (S)-하이드록시 화합물로 환원시키는 단계;

b) 유기용매 존재하에 반응을 수행하는 단계; 및

c) 형성된 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 환원 방법.
제 23항 또는 제 24항에 있어서,

a) 카르보닐 화합물을 제 1항 내지 제 9항중 한항 이상에 따른 산화환원효소, NADH 및 물 존재하에 해당 (S)-하이드록시 화합물로 환원시키는 단계;

b) 유기용매 존재하에 반응을 수행하는 단계;

c) 산화환원효소에 의해 형성된 NAD를 조기질을 이용하여 NADH로 환원시키는 단계; 및

d) 형성된 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 환원 방법.
제 23항 또는 제 24항에 있어서,

a) 카르보닐 화합물을 제 1항 내지 제 9항중 한항 이상에 따른 산화환원효소, NADH 및 물 존재하에 해당 (S)-하이드록시 화합물로 환원시키는 단계;

b) 산화환원효소에 의해 형성된 NAD를 디하이드로게나제 및 조기질을 이용하여 NADH로 동시에 환원시키는 단계;

c) 유기용매 존재하에 반응을 수행하는 단계; 및

d) 형성된 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 환원 방법.
제 25, 26, 28 또는 29항중 어느 한항에 있어서, 상기 조기질은 에탄올, 2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올 또는 2-옥탄올인 것을 특징으로 하는 환원 방법.
제 26항 또는 제 29항에 있어서, 상기 디하이드로게나제로 칸디다 보이디니(Candida boidinii) 또는 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis)의 빵 효모를 사용하는 것을 특징으로 하는 환원 방법.
제 26항 또는 제 29항에 있어서, 상기 디하이드로게나제는 NADH-의존적 포르메이트 디하이드로게나제이고, 상기 조기질은 포름산암모늄, 포름산나트륨 또는 포름산칼슘와 같은 포름산의 염인 것을 특징으로 하는 환원 방법.
제 27항 또는 제 29항에 있어서, 상기 유기용매는 디에틸에테르, tert-부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산 또는 사이클로헥산인 것을 특징으로 하는 환원 방법.
제 27항 또는 제 29항에 있어서, 상기 유기용매는 총 반응 부피의 5% 내지 80%, 바람직하기로는 10% 내지 40%인 것을 특징으로 하는 환원 방법.
a) 식 II의 라세믹 화합물을 포함하는 혼합물을 제 1항 내지 제 9항중 한항 이상에 따른 산화환원효소, NAD 및 물과 같이 반응시키는 단계; 및

b) 잔류하는 식 II의 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 모이어티 R1 및 모이어티 R2를 포함하는 식 II의 키랄(R)-하이드록시 화합물의 회수 방법:

R1-C(OH)-R2 (II)

모이어티 R1은

1) -(C₁-C₂₀)-알킬, 상기 알킬은 직쇄 또는 분지쇄임;

2) -(C₂-C₂₀)-알케닐, 상기 알케닐은 쇄 길이에 따라 1, 2, 3 또는 4개의 이중 결합을 포함하는, 직쇄 또는 분지쇄임;

3) -(C₂-C₂₀)-알키닐, 상기 알키닐은 1, 2, 3 또는 4개의 삼중 결합을 포함하는, 직쇄 또는 분지쇄임;

4) -(C₆-C₁₄)-아릴;

5) -(C₁-C₈)-알킬-(C₆-C₁₄)-아릴;

6) 할로겐, 하이드록시, 아미노 또는 질소로 1 내지 3회 치환되거나 치환되지 않은 -(C₅-C₁₄)-헤테로사이클; 또는

7) -(C₃-C₇)-사이클로알킬이며;

1) 내지 7)의 R1 모이어티는, 각각 독립적으로 a) -OH, b) F, Cl, Br 또는 I와 같은 할로겐, c) -NO₂또는 d) -NH₂로 1, 2 또는 3회 치환되거나 비치환되며,

모이어티 R2는,

1) -(C₁-C₆)-알킬, 상기 알킬은 직쇄 또는 분지쇄임;

2) -(C₂-C₆)-알케닐, 상기 알케닐은 쇄 길이에 따라 1, 2 또는 3개의 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지쇄임;

3) -(C₂-C₆)-알키닐, 상기 알키닐은 1 또는 2개의 삼중 결합을 선택적으로 포함하는 직쇄 또는 분지쇄임; 또는

4) -(C₀-C₁₀)-알킬-C(O)-O-(C₁-C₆)-알킬, 상기 알킬은 할로겐, 하이드록시, 아미노 또는 질소로 1 내지 3회 치환되거나 비치환된 직쇄 또는 분지쇄이며;

상기 1) 내지 4)의 R2 모이어티는, 각각 독립적으로 a) -OH, b) F, Cl, Br 또는 I와 같은 할로겐, c) -NO₂또는 d) -NH₂로 1, 2 또는 3회 치환되거나 비치환된 다.
제 35항에 있어서,

a) 식 II의 라세믹 화합물을 포함하는 혼합물을 제 1항 내지 제 9항중 한항 이상에 따른 산화환원효소, NAD 및 물과 같이 반응시키는 단계;

b) 산화환원효소에 의해 형성된 NADH를 조기질을 이용하여 NAD로 산화시키는 단계; 및

c) 잔류하는 식 II의 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 회수 방법.
제 35항에 있어서,

a) 식 II의 라세믹 화합물을 포함하는 혼합물을 제 1항 내지 제 9항중 한항 이상에 따른 산화환원효소, NAD 및 물과 같이 반응시키는 단계;

b) 산화환원효소에 의해 형성된 NADH를 디하이드로게나제 및 조기질을 이용하여 NAD로 산화시키는 단계; 및

c) 잔류하는 식 II의 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 회수 방법.
제 35항에 있어서,

a) 식 II의 라세믹 화합물을 포함하는 혼합물을 제 1항 내지 제 9항중 한항 이상에 따른 산화환원효소, NAD 및 물과 같이 반응시키는 단계;

b) 유기용매 존재하에 반응을 수행하는 단계; 및

c) 잔류하는 식 II의 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 회수 방법.
제 35항에 있어서,

a) 식 II의 라세믹 화합물을 포함하는 혼합물을 제 1항 내지 제 9항중 한항 이상에 따른 산화환원효소, NAD 및 물과 같이 반응시키는 단계;

b) 유기용매 존재하에 반응을 수행하는 단계;

c) 산화환원효소에 의해 형성된 NADH를 디하이드로게나제 및 조기질을 이용하여 NAD로 산화시키는 단계; 및

d) 잔류하는 식 II의 키랄 (S)-하이드록시 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 회수 방법.
제 36항, 제 37항 또는 제 39항중 어느 한항에 있어서, 상기 조기질은 아세톤인 것을 특징으로 하는, 회수 방법.